KR20080071950A - Puma의 암 침윤 또는 전이 표적으로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Puma 단백질을 유효성분으로 함유하는 암세포 전이 또는 침윤 억제용 약학 조성물, Puma 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 키트, Puma 단백질을 인식하는 항체 또는 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 마이크로어레이, 상기 Puma의 발현 수준을 측정하여 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하는 방법 및 상기 약학 조성물을 이용한 위암 전이 또는 침윤 억제 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, Puma가 암세포 전이 또는 침윤을 억제할 수 있으며, 또한 Bcl-w가 MMP-2의 발현과 활성을 유도하여 암세포 침윤을 촉진하는 기능을 Puma가 방해할 수 있다.
Puma, Bcl-w, Bcl-2, 암, 침윤, 전이, MMP

Description

Puma의 암 침윤 또는 전이 표적으로서의 용도{Use of Puma as target for cancer invasion or metastasis}
본 발명은 암의 예후 예측 및 치료에 활용하기 위한 새로운 표적의 발굴에 관한 것으로, 구체적으로는 암세포 침윤을 억제하는 Puma의 새로운 기능에 관한 것이다. 더욱 더 구체적으로는, Puma 단백질을 유효성분으로 함유하는 암세포 전이 또는 침윤 억제용 약학 조성물, Puma 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 키트, Puma 단백질을 인식하는 항체 또는 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 마이크로어레이, 상기 Puma의 발현 수준을 측정하여 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하는 방법 및 상기 약학 조성물을 이용한 위암 전이 또는 침윤 억제 방법에 관한 것이다.
대부분의 암환자는 현존하는 여러가지 치료방법(수술, 항암제, 방사선처리)을 이용하여도 암 전이(metastasis)의 발생 결과로서 주로 사망하게 된다. 암 전이가 일어나기 전에 1차 종양이 관찰된 환자의 대부분은 치료 가능성이 상당히 높지만 이런 환자는 쉽게 발견하기 어려우며, 대부분의 환자에서는 1차 종양이 관찰된 시점에서 이미 암의 전이가 발견된다. 대부분의 암의 전이는 다발성, 전신성이며, 그 존재 여부의 판정도 어렵기 때문에 현재의 암 치료방법으로는 치료효능이 만족스럽지 못하다. 하지만 암 전이는 1차 종양을 구성하는 암세포의 극히 일부분만이 전이과정의 여러 단계를 성공적으로 마치고 전이암으로 되는 비효율적인 과정이다. 따라서, 전이 과정을 잘 이해하고, 임상적, 생물학적으로 유용한 치료표적을 발굴하고 이를 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하면 암 전이에 의한 사망을 효과적으로 제어할 수 있는 유용한 치료법의 개발이 가능하게 된다.
암의 전이는 1차 종양에서의 신생혈관 형성을 수반한 성장, 1차 종양 내부로부터 혈관 및 림프관으로의 전이성 암세포의 침윤, 혈관 내에서의 암세포의 생존, 원격지로의 이동 및 침윤, 그리고 새로운 미세전이암이 신생혈관의 형성을 통해 전이암으로 성장하는 과정을 포함하는 복잡한 과정이다(Chambers et al., Nat. Rev. Cancer, 2: 563-572, 2002). 이론적으로, 이들 중 어느 단계를 억제하여도 전이의 성공적인 차단이 가능하다.
암 치료가 어려운 이유는 암세포가 정상세포와는 달리 주변조직에서 떨어져 나와 침윤해 가다가 결국은 다른 조직이나 장기로 전이됨에 있다. 이로 인하여 1차 암 덩어리를 수술로 제거하여도 다른 곳에 숨어 있던 전이 암이 재발하는 심각한 국면에 처하게 되는 것이다.
암세포 침윤은 전이에 반드시 필요한 핵심 사안임으로 암세포 침윤의 기전을 밝히는 것이 시급하며, 특히 암은 유전자의 변이 혹은 유전자의 발현 이상으로 초래된다는 관점에서 암세포 침윤에 관련된 유전자와 유전자의 발현체인 단백질을 발 굴하는 것이 침윤 및 전이 방지용 표적 확보에 필요하다.
Bcl-2 계열의 단백질은 세포사멸을 조절하는 대표적인 인자로 알려져 있다. 이들 중에는 세포사멸을 억제하는 pro-survival 멤버도 있고, 그 반대로 세포사멸을 촉진하는 pro-apoptotic 멤버도 있다. 즉, 세포사멸을 조절함에 있어서 pro-survival 멤버와 pro-apoptotic 멤버들은 서로 길항적으로 작용한다는 것이다. Pro-survival 멤버로는 Bcl-2, Bcl-w, Bcl-XL이 대표적이고, pro-apoptotic 멤버들로는 Bax, Bak, Puma, Noxa 등이 알려져 있다.
최근에 와서는 Bcl-2 계열의 pro-survival 멤버들이 세포사멸을 억제할 뿐만 아니라 암세포의 침윤을 촉진하는 또 다른 기능이 있음이 밝혀졌다. 일예로 Bcl-w는 위암에서 발현되어 위암세포의 사멸을 억제하기도 하지만 세포외간 물질 분해효소인 MMP-2(metalloproteinase-2)의 발현유도를 통하여 위암세포의 침윤도 촉진하는 추가적인 기능이 있음이 근래에 확인되었다 (Bae IH et al. Cancer Res 66:4991-4995, 2006). 따라서 Bcl-w를 발현하는 위암 환자는 그렇지 않은 환자보다도 암이 침윤성으로 발전해 나갈 확률이 아주 높다는 것이다 (Lee HW et al. Cancer Res 63:1093-1100, 2003).
Bcl-2 계열의 pro-apoptotic 멤버들이 pro-survival 멤버들의 세포사멸 억제 기능에 길항적으로 작용하지만 암세포 침윤성 촉진 기능에도 그렇게 하는지는 전혀 알려진 바가 없다. 즉, pro-apoptotic 멤버들이 암세포의 침윤성에 영향을 미칠 수 있는지, 만약 그렇다면 어떤 기전과 양상으로 그렇게 하는지에 대한 연구 결과는 아직까지 보고되지 않고 있다.
한국특허공개 제2006-0095114호에는 인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법이 기재되어 있으나, 본 발명의 Puma에 대한 기재는 없다.
따라서, 본 발명자들은 Puma가 MMP-2의 발현과 활성 증가를 통하여 암세포 침윤을 촉진하는 Bcl-w에 결합하여 Bcl-w의 작용을 억제하는 암세포 침윤 억제 인자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 Puma 단백질을 유효성분으로 함유하는 암세포 전이 또는 침윤 억제용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 Puma 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 Puma 단백질을 인식하는 항체 또는 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 Puma의 발현 수준을 측정하여 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 약학 조성물을 이용한 위암 전이 또는 침윤 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Puma 단백질을 유효성분으로 함유하는 암세포 전이 또는 침윤 억제용 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 Puma 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 암은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암 등일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 암은 위암이다.
본 발명은 암 침윤 또는 전이의 예측과 방지를 위한 표적으로 Bcl-2 계열의 단백질 (Bcl-2 family protein)인 Puma의 새로운 용도에 관한 것이다. Bcl-2 계열의 단백질 중에서 Bcl-w는 위암환자의 암 조직에서 발현되어 MMP-2(metalloproteinase-2)의 발현을 유도함으로써 암세포의 침윤을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 Bcl-w의 이러한 기능을 Puma라는 또 다른 Bcl-2 계열의 단백질이 억제함을 밝혔다.
Puma는 pro-apoptotic 멤버들 중의 하나이다. 본 발명에서는, pro-apoptotic Bcl-2 멤버들이 암세포 침윤에 미치는 영향을 조사하기 위하여 SNU-484 위암 세포주에 Puma, Noxa, Bax, Bak을 각각 트랜스펙션 방법으로 도입하여 과발현시키고 메트리젤 필터를 사용한 침윤분석법으로 세포의 침윤성을 비교하였다. 그 결과, Puma를 과발현하였을 때 SNU-484 세포의 침윤성은 약 70% 정도로 감소되었다 (도 1, 왼쪽 대조군 부문 참고). Noxa와 Bax를 과발현하였을 때도 미세한 침윤성의 감소를 보였으나, Puma에 비해서는 그 효과가 적었고, Bak을 과발현하였을 때는 침윤성이 감소되지 않았다. 따라서 Puma가 위암세포 침윤성을 감소시키는 유용한 인자임이 확인되었다.
SNU-484 세포에 Bcl-w를 과발현하면 침윤성이 증가한다고 보고되어 있는데 (Bae IH et al. Cancer Res 66:4991-4995, 2006), 실제로 1.75 배 가량의 증가가 확인되었다 (도 1, 오른쪽 Bcl-w 부문 참고). 이때, Bcl-w와 함께 Puma도 과발현하면 Bcl-w에 의한 침윤성의 증가가 관찰되지 않았으나 Noxa, Bax, Bak을 과발현했을 때는 Bcl-w의 침윤 증가 기능이 여전히 관찰되어, Puma가 Bcl-w의 침윤성 증가 기능에 가장 길항적으로 작용함이 확인되었다.
이상을 종합하면 Puma가 위암 세포의 침윤성을 감소시킬 수 있고, 특히 Bcl-w의 암세포 침윤 촉진 기능에 길항적으로 작용함이 확인되었다.
본 발명의 일 구현예에 따른 약학 조성물은 Puma 단백질의 BH3 도메인을 유효성분으로 함유할 수 있다. Puma의 BH3 도메인은 Bcl-w와의 결합을 통해 암세포 전이 또는 침윤을 억제할 수 있다.
Puma는 자신의 BH3 도메인을 통하여 Bcl-w에 직접 결합하는 것으로 알려져 있으므로 (Willis SN and Adams JM. Curr Opin Cell Biol 17:617-625, 2005), 이러한 결합이 Puma의 암세포 침윤 억제 기능에 필요한지 조사하였다. 즉, BH3 도메인만을 잘라낸 Puma 변이종 (-BH3 Puma)을 위암 세포에 과발현하였을 때는 위암세포 침윤성 감소도 되지 않았고, Bcl-w에 대한 길항적 효과도 나타나지 않았다 (도 2 참고). 따라서, 본 발명은 Puma가 Bcl-w에 결합을 통하여 위암 세포의 침윤을 억제함을 확인하였다.
MMP(metalloproteinase)는 암세포 침윤과 전이에 필요한 세포외질 분해효소이며 사람에서는 23 종류가 발견되었다 (Visse R and Nagase H. Circ Res 92:827-839, 2003). 이중에서 Bcl-w는 MMP-2의 발현과 활성 증가를 통하여 암세포의 침윤성을 촉진한다고 알려져 있고 (Bae IH et al. Cancer Res 66:4991-4995, 2006), 이는 웨스턴 블롯팅과 자이모그래피(zymography) 방법으로 다시 확인되었다 (도 3 참고). 그러나 Bcl-w의 이러한 특성이 Puma를 과발현하였을 때는 발휘되지 않았으며, -BH3 Puma를 과발현하였을 때는 여전히 발휘되었다. 따라서, 본 발명은 Puma가 MMP-2의 발현과 활성을 유도하는 Bcl-w의 기능에 길항적으로 작용함을 확인하였다.
결론적으로, Bcl-w는 MMP-2의 발현과 활성 증가를 통하여 암세포 침윤을 촉진한다고 알려져 있으나, 본 발명은 Puma가 Bcl-w에 결합하여 이러한 작용을 억제하는 암세포 침윤 억제인자임을 밝혔다 (도 4 참고).
본 발명의 약학적 조성물은 Puma 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 함유할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"이란 생리적으로 허용되며 사람에게 투여했을 때 구토, 현기증 등과 같은 알레르기 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 일반적으로 야기하지 않는 조성물 및 분자 실체를 의미한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 비히클 또는 운반체를 의미한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면 물 및 오일, 예를 들면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 그 예로는 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함한다. 물 또는 수용액, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액의 담체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약학적 담체에 대해서는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 개시되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 경피 등의 투여용으로 제조할 수 있다. 약학 조성물은 주사용 제제의 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조성물은 특히 멸균된 등장성 식염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물)이거나 또는 적당한 때 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하면 주사용 용액이 만들어질 수 있는 무수, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다. 바람직한 멸균 주사용 제제는 비독성의 비경구적으로 허용성인 용매 또는 희석제 중의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클의 예로는 식염수, 완충 식염수, 등장성 식염수(예, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물), 링거액, 덱스트로스, 물, 멸균수, 글리세롤, 에탄올 및 이의 혼합물이 있다. 바람직하게는, 1,3-부탄디올 및 멸균 고정화 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 비롯하여 임의 상표의 고정화 오일이 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산 역시 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
투여시 사용되는 단독물 또는 벡터에 혼입된 상태의 본 발명에 개시된 핵산의 투여량은 여러 매개 변수, 특히 사용되는 투여 방식, 해당하는 병리상태, 발현시키고자 하는 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 또는 경점막, 예를 들면 경구, 비측 또는 직장 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여는 비경구, 예를 들면 정맥내 주사이며, 예를 들면, 소동맥내, 근육내, 피내, 경피, 복강내, 심실내 및 두개내 투여를 포함하고, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 경피성 투여 경로로 전달할 수 있다. 또는, 적당하게 조제된 조성물은 비측 또는 경구 투여로 투여할 수 있다. 생물학적 물질의 일정 공급은 일정한 간격, 예를 들면 1일, 매 12시간 등으로 치료적 유효 투여량(즉, 피검체의 대사적 변화를 유도하기에 효과적인 투여 량)을 제공함으로써 얻을 수 있다. 이 매개 변수는 치료받는 질병 상태의 정도, 실시되는 다른 작용, 예를 들면 식이 변화, 체중, 연령 및 피검체의 성별, 및 다른 기준에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 표준 우수 의약 처방에 따라 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 생물학적 물질이 투여되는 유기체는, 사람인 것이 바람직하나, 모든 동물일 수도 있다. 즉, 당업자라면 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이 본 발명의 약학 조성물은 특히 포유동물, 비제한적으로 가축, 예를 들면 고양이과, 개과 피검체, 사육 동물, 예를 들면 비제한적으로 소, 말, 염소, 양 및 돼지 피검체, 야생 동물(야생 또는 동물원 동물에 관계없음), 연구용 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등, 조류 종, 예를 들면 병아리, 칠면조, 명금류 등, 즉 수의용의 모든 동물에 투여하기에 특히 적합하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Puma 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 키트를 제공한다. 즉, 암이 의심되는 환자 시료에 존재하는 Puma 단백질에 대해 Puma 단백질을 인식하는 항체를 이용하여 정량한 결과, Puma 단백질이 상대적으로 많이 존재하면 암세포 전이 또는 침윤 가능성은 낮아질 수 있는 것이며, Puma 단백질이 상대적으로 적게 존재하면 암세포 전이 또는 침윤 가능성은 높아질 수 있다는 것을 예측할 수 있는 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 Puma 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 서열에 제한되지 않는다.
또한, 상기 암은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암 등일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 암은 위암이다.
상기 키트는 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 암세포 전이 또는 침윤 가능성 예측용 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 상기 Puma 단백질을 코딩하는 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 PCR 산물의 생성 정도를 정량하여 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측할 수 있는 것이다. 즉, 암이 의심되는 환자 시료에 존재하는 Puma 단백질에 대한 유전자에 대해 Puma 단백질을 코딩하는 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시한 결과, PCR 산물이 상대적으로 많이 존재하면 암세포 전이 또는 침윤 가능성은 낮아질 수 있는 것이며, PCR 산물이 상대적으로 적게 존재하면 암세포 전이 또는 침윤 가능성은 높아질 수 있다는 것을 예측할 수 있는 것이다. 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 서열은 당업자라면 Puma 단백질에 대한 유전자만 결정되면 용이하게 디자인할 수 있는 것이다. 또한, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 상기 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측할 수 있는 것이다. 즉, 암이 의심되는 환자 시료에 존재하는 Puma 단백질에 대한 유전자에 대해 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시한 결과, 혼성화 강도가 상대적으로 높으면 Puma 단백질을 코딩하는 유전자가 상대적으로 많아 암세포 전이 또는 침윤 가능성은 낮아질 수 있는 것이며, 혼성화 강도가 상대적으로 낮으면 Puma 단백질을 코딩하는 유전자가 상대적으 로 적어 암세포 전이 또는 침윤 가능성은 높아질 수 있다는 것을 예측할 수 있는 것이다. 상기 프로브 서열은 당업자라면 Puma 단백질에 대한 유전자만 결정되면 용이하게 디자인할 수 있는 것이다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Puma 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
상기 암은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암 등일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 암은 위암이다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 항체 또는 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 항체 또는 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 상기 Puma 단백질을 인식하는 항체 또는 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 항체 또는 프로브가 커플링될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 세포로부터 Puma 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
즉, 암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 Puma 유전자의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 Puma 유전자의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 암 세포 유래의 Puma 유전자의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 낮다면 암세포 전이 또는 침윤 가능성이 높을 수 있다고 예측할 수 있는 것이다.
상기 암은 자궁경부암, 난소암, 간암, 유방암, 폐암, 뼈암, 신장암, 췌장암, 위암, 및 대장암 등일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 암은 위암이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 약학 조성물을 위암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 위암 전이 또는 침윤 억제 방법을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물을 위암 환자에게 투여하면, 체내로 도입된 Puma가 Bcl-w의 작용을 억제하여 위암 전이 또는 침윤을 억제할 수 있는 것이다. 본 발명의 방법은 인간뿐만 아니라, 비인간 포유동물 등에도 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
본 발명의 약학 조성물에 의하면, 암세포 전이 또는 침윤을 억제할 수 있으며, 또한 Bcl-w가 MMP-2의 발현과 활성을 유도하여 암세포 침윤을 촉진하는 기능을 방해할 수 있다.
본 발명의 키트에 의하면, 암의 침윤, 전이 가능성을 예측할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측할 수 있으며, 또한 위암 전이 또는 침윤을 억제할 수 있다.
이용된 발현 벡터
사람의 암 세포주에 원하는 단백질을 과발현하기 위하여 Bcl-w, Puma, Noxa, Bax, Bak의 cDNA와 BH3 도메인이 제거된 Puma (-BH3 Puma) (Yu J et al. Mol Cell 7:673-682, 2001)를 하기 표에 정리된 발현 벡터의 제한효소 자리에 클로닝하여 트 랜스펙션 또는 인펙션 (infection)에 이용하였다.
cDNA 발현 벡터(공급자 혹은 판매회사) 클로닝에 사용한 제한효소
Bcl-w MFG(Richard Mulligan 교수, 하바드 대학) Nco I/Bgl II
Puma pCEP4(Invitrogen, Carlsbad, CA) Kpn I/BamH I
Noxa pEF(Tsukasa Shibue 교수, 동경대학) Xba I/EcoR I
Bax pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA) EcoR I/Xho I
Bak pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA) EcoR I/Kpn I
-BH3 Puma pCEP4(Invitrogen, Carlsbad, CA) Kpn I/BamH I
세포 배양과 인펙션 트랜스펙션
SNU-484 위암 세포주 배양에는 10% 소태아혈청 (FBS)과 0.1% 겐타마이신이 함유된 RPMI 1640 배양액을 사용하였고, 레트로바이러스 벡터인 MFG의 패키지 세포 (package cell)로 사용된 H29D 세포주 배양에는 10% FBS, 2 mM Gluta Max (Gibco; Grand Island, New York), 0.1% 겐타마이신, 1 ug/ml 테트라사이클린, 2 ug/ml 퓨로마이신, 0.3 mg/ml 네오마이신이 함유된 DMEM을 사용하였다. 이 세포들은 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하며 유지되었다.
MFG 벡터를 패키지하기 위하여, H29D 세포를 60 mm 디쉬 당 3x106 개로 준비하여 밤새 배양하였다. 다음날, DMEM에 10% FBS, 2 mM Gluta Max, 0.1% 겐타마이신을 첨가하여 트랜스펙션 용액을 만들고, 이 용액 0.3 ml에 4 ug의 MFG 또는 Bcl-w가 클로닝된 MFG를 넣고 혼합하였다. 이와 별도로 0.3 ml의 트랜스펙션 용액에 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen; Carlsbad, CA)을 25 ul 첨가하여 혼합하였다. 그런 후, MFG(또는 MFG/Bcl-w)가 들어간 트랜스펙션 용액 0.3 ml과 LipofectamineTM 2000을 첨가한 트랜스펙션 용액 0.3 ml을 합하여 0.6 ml의 혼합물로 만들고 30-40 분간 상온에서 방치하였다. 여기에 트랜스펙션 용액 2.4 ml을 다시 첨가하여 3 ml의 혼합물을 완성하였다. 이 혼합물 2 ml을 PBS로 잘 세척한 H29D 세포에 골고루 뿌려주고 37℃ 배양기에 8 시간 놓아두며 벡터의 트랜스펙션을 유도하였다. 세포에 뿌려준 혼합물은 8 시간 배양 후에 제거하고 10% FBS가 첨가된 DMEM 4 ml을 공급하여 2-3일 정도 배양하였다. 이 세포 배양액 (conditioned media)을 취득하여 폴리브렌(polybrene)을 8 mg/ml 농도로 첨가한 후, 0.2 um 필터로 여과하고 1 ml로 분액하여 -80℃에 보관하였다.
패키지된 바이러스 벡터를 인펙션시키기 위하여 SNU-484 세포를 100 mm 디쉬 당 1.2x106 개로 준비하여 밤새 배양하였다. 이 세포를 RPMI 1640 배양액으로 세척한 다음, -80℃에 보관하던 MFG/H29D, 혹은 Bcl-w/H29D 세포의 조절된 배지를 녹여서 세포에 뿌려주고 15분마다 잘 흔들면서 세포가 마르지 않도록 하였다. 3 시간 후에 RPMI 1640 배양액 9 ml를 첨가하여 배양하다가 다음날 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배양액으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 그리고는 퓨로마이신을 1 ug/ml 농도로 첨가하여 인펙션된 세포를 선별하였다.
인펙션된 세포에 추가적인 트랜스펙션을 실시하기 위해서는, MFG/SNU-484 혹은 Bcl-w/SNU-484 세포를 6 웰 플레이트의 웰 당 1.2x106 개로 준비하여 밤새 배양하였다. 추가적인 트랜스펙션에는 LipofectamineTM 2000을 사용하였고 이 시약의 제조회사인 Invitrogen이 제시하는 프로토콜을 사용하여 Puma, Noxa, Bax, Bak, -BH3 Puma의 발현 벡터를 MFG/SNU-484 혹은 Bcl-w/SNU-484 세포에 도입하였다. 그리고는 48시간 후에 이 세포들을 이용하였다.
실시예 1: Puma 의 암세포 침윤성 감소 효과
다양한 조합으로 트랜스펙션된 SNU-484 세포들의 침윤성을 비교하기 위하여, 이 세포들이 메트리젤 (matrigel)로 코팅된 폴리카보네이트 필터를 통과하는 능력을 트랜스웰(transwell) 챔버 (Corning; Acton, MA)를 사용하여 비교하였다. 우선, 0.1% 겐타마이신을 함유한 RPMI 1640 배양액에 1 mg/ml로 메트리젤을 녹인 후, 이 용액 20 ul로 인서트 웰의 필터 안쪽을 코팅하였다. 코팅된 인서트 웰은 뒤집은 상태에서 상온에서 1-2 시간 건조시켰다. RPMI 1640/0.1% 겐타마이신 배양액에 0.1% BSA를 녹이고 이 용액에 분석하고자 하는 세포를 5x105/ml로 준비하였다. 이 세포 현탁액 0.2 ml을 코팅된 인서트 웰의 안쪽, 즉 메트리젤 상단에 바르고 바깥 챔버는 RPMI 1640/0.1% 겐타마이신/0.1% BSA 용액 1 ml로 채웠다. 이것을 37℃ 배양기에서 24 시간 방치한 후 인서트 웰을 꺼내어 배양액을 제거하고 Hemacolor 염색액 (Merck; Darmstadt, Germany)으로 제조사의 프로토콜에 따라 필터를 염색하였다. 이것을 건조한 후, 메트리젤 상단에 남아있는 세포를 면봉으로 제거하고 메트리젤을 통과하여 필터 하단으로 이동한 세포를 현미경과 디지털 카메라로 분석하였다. 그 결과, Puma를 과발현하였을 때 SNU-484 세포의 침윤성은 약 70% 정도로 감소되었다 (도 1, 왼쪽 대조군 부문). Noxa와 Bax를 과발현하였을 때도 미세한 침윤성의 감소를 보였으나, Puma에 비해서는 그 효과가 적었고, Bak을 과발현하였을 때 는 침윤성이 감소되지 않았다. 따라서 Puma가 위암세포 침윤성을 감소시키는 유용한 인자임을 확인하였다.
SNU-484 세포에 Bcl-w를 과발현하면 침윤성이 증가한다고 보고되어 있는데 (Bae IH et al. Cancer Res 66:4991-4995, 2006), 실제로 1.75 배 가량의 증가가 확인되었다 (도 1, 오른쪽 Bcl-w 부문). 이때 Bcl-w와 함께 Puma도 과발현하면 Bcl-w에 의한 침윤성의 증가가 관찰되지 않았으나 Noxa, Bax, Bak을 과발현했을 때는 Bcl-w의 침윤 증가 기능이 여전히 관찰되어, Puma가 Bcl-w의 침윤성 증가 기능에 가장 길항적으로 작용함이 확인되었다.
이상을 종합하면, Puma가 위암세포의 침윤성을 감소시킬 수 있고, 특히 Bcl-w의 암세포 침윤 촉진 기능에 길항적으로 작용함이 확인되었다.
실시예 2: Puma 의 작용에 대한 BH3 도메인의 필요성
Puma는 자신의 BH3 도메인을 통하여 Bcl-w에 직접 결합하는 것으로 알려져 있으므로 (Willis SN and Adams JM. Curr Opin Cell Biol 17:617-625, 2005), 이러한 결합이 Puma의 암세포 침윤 억제 기능에 필요한지 조사하였다. 즉, -BH3 Puma (Yu J et al. Mol Cell 7:673-682, 2001)를 위암 세포에 과발현하고 침윤성 분석을 실시한 결과, Puma를 과발현하였을 때와는 달리 위암세포의 침윤성도 감소되지 않았고, Bcl-w에 대한 길항적 효과도 나타나지 않았다 (도 2). 따라서 본 발명은 Puma가 암세포 침윤을 억제하고 Bcl-w에 길항적으로 작용하기 위해서는 Puma의 BH3 도메인이 필요함을 확인하였다. 즉, Puma는 Bcl-w와 결합을 통하여 암세포의 침윤을 억제함을 제시한다.
실시예 3: Puma 에 의한 MMP -2 발현 억제
MMP는 암세포 침윤과 전이에 필요한 세포외질 분해효소이며 사람에서는 23 종류가 발견되었다 (Visse R and Nagase H. Circ Res 92:827-839, 2003). 이 중에서, Bcl-w는 MMP-2의 발현과 활성 증가를 통하여 암세포의 침윤성을 촉진한다고 알려져 있다 (Bae IH et al. Cancer Res 66:4991-4995, 2006). Puma가 Bcl-w의 이러한 작용에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위하여, 대조군 pCEP4, pCEP4/Puma, 혹은 pCEP4/-BH3 Puma를 트랜스펙션한 SNU-484 세포를 ~80%의 밀집도로 배양하다가 그 배양액 (conditioned media)를 취득하여 여기에 함유된 MMP-2의 단백질 양을 웨스턴 블롯팅 방법으로 비교하였다. 즉, 조절 배지(conditioned media)의 단백질 정량분석을 한 후, 동량을 취하여 10% SDS-PAGE로 분리하고, 분리된 단백질들을 전기력 (250 mA, 1 시간)을 이용하여 Immobilon 막(Millipore; Bedford, MA)으로 이동시켰다.
상기 막을 5% 탈지분유와 0.1% Tween-20이 함유된 PBS에 담가서 1 시간 동안 흔들어주다가 MMP-2 항체 (Oncogene; La Jolla, CA)를 1:1000 비율로 희석해 넣어주고 4℃에서 밤새 흔들어주었다. 다음날, 이 막을 0.1% Tween-20이 함유된 PBS로 3회 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다제가 부착된 MMP-2 항체에 대한 2차 항체(1:5000)에 담가서 1 시간 동안 흔들어주었다. 그런 다음 0.1% Tween-20이 함유된 PBS로 또다시 3회 세척하고 화학발광법 (ECL Plus kit; Amersham; Piscataway, NJ)으로 MMP-2의 발현 양을 비교하였다. 이 방법으로 Bcl-w에 의한 MMP-2의 발현 양 증가가 또다시 확인되었고, 이때 Puma를 과발현하면 Bcl-w의 이러한 효과가 감 소되었다 (도 3, 윗부분). 이러한 효과가 -BH3 Puma를 도입하였을 때는 관찰되지 않아서 Puma는 BH3 도메인을 통하여 Bcl-w에 의한 MMP-2의 발현 유도를 방해함이 확인되었다.
이와 같은 효과가 MMP-2의 활성에도 반영되는지를 조사하기 위하여 젤라틴 자이모그래피를 실시하였다. 우선, 대조군 pCEP4, pCEP4/Puma, 혹은 pCEP4/-BH3 Puma를 트랜스펙션한 SNU-484 세포를 12-웰 플레이트에 웰 당 1.2x106 개로 분주하고 ~80% 정도의 밀집도가 되도록 배양하였다. 이들을 0.1% 겐타마이신이 함유된 RPMI 1640 배양액으로 세척한 후, 이 배양액 0.5 ml을 첨가하여 37℃에서 24 시간 배양하였다.
그런 후 이 배양액 즉, 조절 배지(conditioned media)를 취하여 4℃에서 10,000 rpm으로 5 분간 원심분리하고 상층액을 취하여 단백질 정량분석을 하였다. 동량의 조절 배지(conditioned media)를 0.1% 젤라틴이 함유된 10% SDS-PAGE로 분리하고 이 겔을 2.5% Triton X-100 용액에 담구어서 1-2 시간 동안 상온에서 흔들어주었다. 그런 후, 겔을 20 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 uM ZnCl2, 0.1% NaN3가 함유된 Tris-Cl 완충액(50 mM, pH 7.5)으로 옮기고 상온에서 30 분간 흔들어 주었다. 상기 용액을 새것으로 교체하고 37℃에서 24 시간 더 흔들어 준 후, 겔을 10% 메탄올, 10% 아세트산, 0.5% 쿠마시 블루 용액으로 옮겨서 상온에서 30분간 염색하였다. 염색된 겔을 25% 에탄올, 8% 아세트산 용액으로 탈색하여 밴드를 확인하였다. 그 결과, Bcl-w의 과발현이 MMP-2 활성을 증가시킴이 확인되었으며, 이러한 효과가 Puma의 과발현으로는 감소되었으나 -BH3 Puma의 과발현으로는 그러하지 못했다 (도 3, 아랫부분). 따라서 본 발명은 Puma가 BH3 도메인을 통하여 Bcl-w에 의한 MMP-2의 활성 증가를 방해함을 확인하였다.
이상의 모든 결과를 종합하면, Bcl-w는 MMP-2의 발현과 활성 증가를 통하여 암세포 침윤을 촉진할 수 있으나, Bcl-w의 이러한 기능을 Puma가 자신의 BH3 도메인을 통하여 억제할 수 있음이 확인되었다 (도 4).
도 1은 SNU-484 위암 세포주에 Bcl-w, Puma, Noxa, Bax, Bak와 같은 Bcl-2 계열 유전자를 표시된 조합으로 트랜스펙션 방법으로 도입한 후, 세포의 침윤성을 메트리젤(Matrigel) 필터를 이용한 방법으로 분석한 결과이다.
도 2는 SNU-484 위암 세포주에 Bcl-w, Puma, 및 BH3 도메인이 제거된 Puma (-BH3 Puma)를 표시된 조합으로 트랜스펙션 방법으로 도입하고, 세포의 침윤성을 메트리젤 필터를 이용한 방법으로 분석한 결과이다.
도 3은 도 2에서 확립된 세포에서 MMP-2의 발현과 활성을 각각 웨스턴 블롯팅과 자이모그래피(zymography) 방법으로 분석한 것이다.
도 4는 본 발명에서 확인된 Puma의 새로운 기능, 즉 Puma가 Bcl-w에 의한 MMP-2 발현과 이에 따른 암세포 침윤을 억제하는 현상을 도식적으로 표시한 것이다.
<110> Korea atomic energy research institute <120> Use of Puma as target for cancer invasion or metastasis <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Ala Arg Gln Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Arg Asp Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro 20 25 30 Ser Ala Val Ser Cys Gly Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Ala Pro Thr Leu Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala 50 55 60 Pro Pro Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly 65 70 75 80 Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gln Pro Ser 85 90 95 Leu Ser Leu Ala Glu Gln His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro 100 105 110 Gly Ala Leu Ala Gly Gly Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gly Val Arg Gly 115 120 125 Glu Glu Glu Gln Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met 130 135 140 Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gln Tyr Glu Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln 145 150 155 160 Gln Arg His Arg Pro Ser Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met 165 170 175 Gly Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro 180 185 190 Asn

Claims (6)

  1. Puma 단백질 활성을 갖는 암세포의 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 마커.
  2. Puma 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산을 선택적으로 인식하는 작용제를 포함하는, 암의 전이 또는 침윤 가능성을 예측하기 위한 키트로서, 상기 작용제는 Puma 단백질을 선택적으로 인식하는 항체, Puma 단백질을 코딩하는 유전자의 센스 또는 안티센스 프라이머, 및 Puma 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적인 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Puma 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 암세포로부터 Puma 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암세포 전이 또는 침윤 가능성을 예측하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암세포는 위암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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