KR20070091602A - ｐ53-의존성 및 비의존성 종양 억제 매개체로서의ＡＲＦ-ＢＰ1 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ARF에 의해 매개되는 세포 성장 억제의 기전에 관한 것이다. ARF-BP1은 신규한 유비퀴틴 리가제이며 인간 세포에서 ARF-함유 핵 복합체의 주 성분인 것으로 확인되었다. 본 발명은 ARF에 의해 매개되는 p53 활성화의 새로운 기전 및 ARF-BP1이 ARF의 p53-비의존성 및 p53-의존성 종양 억제 기능 둘 다에 대한 중요한 매개체임을 개시한다. 정상 세포에서 ARF-BP1의 불활성화는 p53을 안정화하고 p53-의존성 아폽토시스를 유도한다. p53-야생형 세포에서 Mdm2가 아닌 ARF-BP1의 불활성화는 ARF 도입의 연상 방식으로 세포 성장 저해를 촉진한다. ARF-BP1은 p53에 직접 결합하여 이를 유비퀴틴화시키며, 내인성 ARF-BP1의 불활성화는 Mdm2-널 세포에서 ARF에 의해 매개되는 p53 안정화에 중요하다. ARF-BP1은 p53 상태에 상관없이 종양 세포 성장을 억제하기 위한 표적으로서 Mdm2 보다 유리하다.

Description

ｐ53-의존성 및 비의존성 종양 억제 매개체로서의 ＡＲＦ-ＢＰ1 및 그의 용도{ARF-BP1 AS MEDIATOR OF P53-DEPENDENT AND INDEPENDENT TUMOR SUPPRESSION AND USES THEREOF}
관련 참조문헌
본 출원은 전체를 본 원에 참고로 포함하는 2004년 9월 15일 출원된 미국 가출원 제 60/610,506호의 이점을 청구한다.
정부의 권리행사
본 발명은 NIH 허가번호 CA097403으로 정부로부터 일정 부분 지원을 받았다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 ARF에 의해 매개되는 세포 성장 억제의 기전 및 보다 구체적으로 ARF의 p53/Mdm2-비의존성 기능에 관한 것이다.
발명의 배경
신생물 형성(neoplasia)은 신생물로 알려진 세포 성장의 이상 증식을 특징으로 하는 질환이다. 신생물은 백혈병 또는 종양의 형태로 발현될 수 있으며, 양성이거나 혹은 악성일 수 있다. 악성 신생물은 특히, 생명을 위협할 수도 있는 심각한 질환 상태를 초래할 수 있기도 하다. 화학요법제를 비롯하여, 신생물 형성으로 고통받는 환자를 치료하는데 효과적인 항신생물에 대한 조처를 밝히는데 예의 연구 성과와 방편이 있었다. 효과적인 항신생물제는 신생물과 관련된 세포의 급속 증식을 저해하거나 제어하는 것, 신생물을 퇴행 또는 완화시키는 것 및 일반적으로 신생물 형성으로 고통받는 환자의 생존을 연장시키는 것을 포함한다. 악성 신생물 형성 또는 암의 성공적인 치료는 일차 부위에서 발견되거나, 국소/국부 영역으로 확장되거나 또는 다른 신체 부위로 전이되었거나를 막론하고, 모든 악성 세포의 제거를 필요로 한다. 신생물 형성을 치료하는데 주요 요법은 수술 및 방사선치료(국소 및 국소/국부 신생물의 경우) 및 화학요법(전신 부위의 경우)이다.
암의 검출, 진단 및 치료를 위한 다양한 방법에도 불구하고, 암은 모든 사회 곳곳에서 횡행하고 있으며, 치명적인 경우가 빈번하다. 명백히, 암 환자의 생존율을 개선하기 위하여 검출(초기 단계에 신생물 형성을 확인할 수 있는 마커의 개발을 포함하여) 및 치료를 위한 다른 전략이 요망되는 것이 사실이다. 특히, 종양 억제인자 및 종양-억제 경로를 보다 잘 이해하는 것이 새로운 검출, 진단 및 치료 요법의 개발에 초석이 될 수 있다.
p53 종양 억제인자는 다양한 형태의 스트레스에 반응하여 성장 정지, 아폽토시스(apoptosis) 및 세포 노화를 비롯한 항증식 효과를 발휘한다(Levine, A.J., Cell 88:323-31, 1997; Oren, M., J. Biol. Chem. 274:36031-034, 1999). p53은 DNA 손상 반응(예: ATM/ATR 활성화), 비정상적 종양 유발 이벤트(예: Myc 또는 Ras 활성화) 및 일상의 세포 과정(예: 성장 인자 자극)을 비롯하여 다양한 출처로부터 의 시그널링 경로를 모니터하는 조절 회로의 중심절로 고려되는 경우가 있다. p53 돌연변이가 모든 인간 종양의 반 이상에서 이미 입증(Hollstein et al., Mutat Res. 431:199-209, 1999)되어 있는 반면, p53 경로의 다른 성분, 예컨대 ARF 종양 억제인자의 결핍이 야생형 p53을 보유하는 종양 세포에서 관찰되고 있다(Sherr, C.J., Nat Rev Mol Cell Biol 2:731-737, 2001; Sharpless, N.E., DePinho, R.A., J. Clin Invest 113:160-8, 2004). p53 경로의 활성화는 인간 암의 공통적이지 않더라도 보편적인 특징인 것으로 나타난다.
p53 활성화 기전이 완전히 알려지지 않았지만, 일반적으로 유비퀴틴화(ubiquitination), 포스포릴화 및 아세틸화 등의 해독후 변형을 수반하는 것으로 판단된다. p53의 유비퀴틴화는 유두종-감염 세포에서 최초로 관찰되었으며, 여기에서는 p53 분해가 E6-AP로 불리는 유비퀴틴 리가제를 함유하는 HECT-도메인 및 바이러스 E6 단백질에 의해 매개된다(Munger, K., Howley, P.M., Virus Res 89:213-228, 2002). 정상 세포에서, Mdm2는 악성적으로 활성화되는 경우 p53의 종양 억제인자 활성을 방해할 가능성이 있는 p53에 특이적인 E3 유비퀴틴 리가제로 작용한다. p53을 조절하는데 있어서 Mdm2의 중요한 역할이 Mdm2 기능 상실로 야기된 배자 치사율을 완전히 구조한 것으로 나타난 마우스에서 실시된 p53의 불활성화 조사로 입증되었다(Montes de Oca Luna, R., Wagner, D.S., Lozano, G., Nature 378:203-206, 1995).
초기 연구가 Mdm2가 p53 안정성을 조절하는데 주요 인자라고 제시하고 있지만, p53 분해는 원래 예상했던 것 보다 훨씬 복잡하다. 본 발명자들은 Mdm2가 p53 의 모노유비퀴틴화 및 폴리유비퀴틴화를 용량-의존 방식으로 차별적으로 촉매화함을 발견하였다(Li, M., Brooks, C.L., Wu-Baer, F., Chen. D., Baer, R., Gu, W., Science 302:1972-1975, 2003). 저수준의 Mdm2 활성은 p53의 모노유비퀴틴화 및 핵 외수송을 유도하는 반면, 고수준은 p53의 폴리유비퀴틴화 및 핵 분해를 촉진한다. 이들 기전은 상이한 생리적 환경에서 이용된다. 한편으로, Mdm2에 의해 매개된 폴리유비퀴틴화 및 핵 분해는 Mdm2가 악성적으로 과발현되거나 DNA 손상 반응의 후기동안 p53 기능 억제에 중요한 역할을 담당할 수 있다. 다른 한편으로, p53의 Mdm2에 의해 매개된 모노유비퀴틴화 및 후속한 세포질 전위가 비스트레스 세포에서 p53 조절에 중요한 수단일 수 있으며, 이때 Mdm2은 저수준으로 유지된다(Li et al., 2003, 상기 참조). 또한, 특히 내인성 Mdm2 활성이 p53 폴리유비퀴틴화를 직접 촉매화하기에 충분하지 않은 경우에는, 추가의 세포 인자가 p53 분해 촉진을 위해 필요할 수도 있다. 유비퀴틴 리가제 COP1 및 Pirh2가 p53 분해에 직접 관여한다는 사실이 최근에 보고되었다(Dornan, D., Wertz, L, Shimizu, H., Arnott, D., Frantz, G.D., Dowd, P., O'Rourke, K., Koeppen, H., Dixit, V.M., Nature 429:86-92, 2004). 따라서, Mdm2가 p53 기능의 주요 조절인자이지만, p53 분해는 생체내에서 Mdm2-의존성 및 Mdm2-비의존성 경로 둘 다로 작용한다.
ARF(인간에 있어서 p14ARF 및 동물에 있어서 p19ARF로 공지)가 시클린-의존성 키나제의 p16Ink4a 저해제를 코딩하는 유전자로서 ARF 종양 억제인자 자리인 Ink4a의 다른 전사물로서 확인되었다. 그의 유일한 제 1 엑손으로 인해, ARF 전사물은 p16Ink4a와 관련이 없는 단백질을 코딩한다. 그럼에도, p14ARF-결핍 마우스의 종양 감수성 표현형으로 입증된 바와 같이, ARF는 p16Ink4a와 마찬가지로 종양 억제 기능을 나타낸다. ARF는 적어도 부분적으로 p53 경로를 유도하여 종양 유발 유전자 활성화에 반응하여 이상 세포 성장을 억제한다(Sherr, et al, 2001, 상기 참조). 과발현된 ARF가 Mdm2와 직접 반응하여 p53 분해를 촉진하는 능력을 억제하기 때문에, p53의 ARF 유도는 Mdm2에 의해 매개되는 것으로 나타났다(Zhang, Y., Xiong, Y., Yarbrough, W.G., Cell 92:125-34, 1998). ARF가 Mdm2/p53 경로를 조절하는 기전은 Mdm2에 결합하여 포획함으로써 p53을 안정화시키고 Mdm2의 유비퀴틴 리가제 활성을 직접 저해하여 p53 기능을 활성화시킴으로써 복잡한 것으로 드러났다.
흥미롭게도, ARF는 또한 p53 또는 Mdm2에 비의존성인 종양 억제인자 기능을 가진다. 예를 들어, ARF가 기능성 p53 유전자(Normand, G., Hemmati, P.G., Verdoodt, B. et al, J Biol Chem 280:7118-30, 2005) 또는 p53의 주요 전사 표적인 p21 시클린-의존성 키나제 저해제를 코딩하는 유전자가 결핍된 종양 세포에서 세포 성장 정지를 유도할 수 있을 지라도, ARF는 또한 Mdm2 및 p53 둘 다가 결핍된 MEF의 증식도 억제할 수 있다. 이러한 결과와 일치하는 것으로, ARF, p53 및 Mdm2가 결핍된 삼중 녹아웃(knockout) 마우스의 종양 감수성은 이들 임의 유전자중 하나만이 단독으로 결핍된 마우스의 경우보다 훨씬 크다. ARF가 p53-의존성 및 p-53 비의존성 두 경로를 통해 마우스 피부 암종의 성장, 진행 및 전이를 억제한다는 것이 최근에 밝혀졌다(Kelly-Sprat, K.S., Gurley, K.E., Yasui, Y., Kemp, C.J., PLoS Biol. 2:E242, 2004). ARF의 p53-비의존성 기능을 매개하는 상이한 하류 인자가 존재할 수 있다. ARF에 의해 p53-비의존성 종양 억제를 매개한다는 이들 인자 및 기전에 대해서는 알려지지 않았다. 따라서, p53 경로 조절은 매우 유용하고 암을 진단 및 치료하는데 잠재적인 수단을 제공하지만, 이러한 경로와 ARF의 p53 비의존성 기능을 매개하는 인자 및 기전을 보다 많이 숙지하는 것이 새로운 진단 및 치료방법을 개발하는데 한층 유용한 토대를 마련할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 불활성화되는 경우, p53 널(null) 세포에서 세포 성장 저해 및 p53 야생형 세포에서 p53-의존성 아폽토시스를 유도하는 신규 단백질인 ARF-BP1의 발견을 기초로 한다. 이러한 발견은 신생물 형성, 특히 p53 관련 암의 진단, 모니터 및 치료와 상당한 관련이 있다.
본 발명에 따라, 놀랍게도 ARF-BP1의 불활성화가 p53 널 세포에서 세포 성장 정지를 유도함에 따라 ARF-BP1이 p53-비의존성 종양 억제 경로의 중요한 매개체임이 밝혀졌다. p53-널 세포에서 Mdm2가 아닌 내인성 ARF-BP1의 불활성화는 세포 성장 억제를 ARF 유도의 연상(reminiscent) 방식으로 유도한다. p53 양성 세포에서 ARF-BP1의 불활성화는 p53 안정화를 유도하고 p53-의존성 아폽토시스 반응을 활성화한다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 ARF의 p53-비의존성 및 p53-의존성 종양 억제인자 기능 둘 다의 매개에 ARF-BP1를 연루시킨 새로운 조절 방식을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 펩티드 발현에 대해 분석하 는 단계를 포함하는, 대상이 신생물 형성에 결렸는지를 결정하는 방법으로서, ARF-BP1 발현의 검출로서 대상이 신생물 형성으로 진단되는 방법을 제공한다.
본 발명은 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 펩티드 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 신생물 형성전 및 암종에 대한 유전 소인을 스크리닝하는 방법으로서, ARF-BP1 발현의 검출로서 대상이 신생물 형성전 및 암종에 대한 유전 소인으로 진단되는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 신생물 형성에 대한 치료를 받았거나 받고 있는 대상에서 신생물 형성 치료 요법의 효능을 평가하는 방법으로서, 진단 샘플에서 감소 또는 정상의 ARF-BP1 발현이 성공적인 치료 지표가 되고, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1 발현은 신생물 형성을 치료하기 위해 지속적인 치료를 요하는 지표가 되는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 신생물 형성에 걸린 대상의 예후를 평가하는 방법으로서, 진단 샘플에서 ARF-BP1의 발현 감소가 대상의 예후를 개선한 것이고, 진단 샘플에서 ARF-BP1의 발현 증가가 대상의 예후를 악화시킨 것인 방법이 제공된다.
본 발명은 또한
(a) ARF-BP1과 반응성이 있는 약제; 및
(b) ARF-BP1의 발현을 검출하는데 적합한 시약을 포함하는, 신생물 형성을 검출하는데 사용하기 위한 키트가 제공된다.
또한, 본 발명은 대상에서 ARF-BP1의 활성을 감소시켜 치료를 요하는 대상에서 신생물 형성을 치료하는 방법을 제공한다. 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 조성물이 투여되는 대상에서 신생물 형성을 치료하기에 유효한 양으로 ARF-BP1 단백질 또는 ARF-BP1 발현 저해제를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 p53을 탈유비퀴틴화하기에 유효한 양으로 세포를 ARF-BP1과 접촉시켜 세포에서 p53을 탈유비퀴틴화하는 방법을 제공한다. 대상의 세포에서 p53을 탈유비퀴틴화하여 치료를 요하는 대상에서 신생물 형성을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
또한, 본 발명은 (a) 후보 약제를 ARF-BP1의 존재하에서 p53과 접촉시키는 단계; 및 (b) ARF-BP1-p53 상호작용을 억제할 수 있는 후보 약제의 능력을 평가하는 단계에 의해 p53과 반응성이 있는 약제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 임의로, 본 발명의 방법은 (c) 후보 약제를 p53을 함유하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계; 및 (d) 약제가 하나 이상의 세포에서 p53-관련 생물학적 사건에 효과가 있는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 대상에서 p53-관련 증상을 치료하기에 유효한 양의 ARF-BP1 저해제를 치료를 요하는 대상에 투여하여 치료를 요하는 대상에서 p53-관련 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면으로, ARF-BP1은 ARF와 직접 결합하며, 그의 유비퀴틴 리가제 활성은 ARF에 의해 강력하게 저해된다. 따라서, 본 발명은 또한 ARF 및 ARF-BP1을 포함하는 복합체, 및 ARF-BP1 아미노산 서열을 포함한 돌연변이 ARF-BP1을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 게놈이 그의 내인성 ARF-BP1 유전자 파괴를 포함하고 야생형에 비해 기능성 ARF-BP1 단백질의 발현이 감소된 트랜스제닉(transgenic) 비인간 동물에 관한 것이다.
본 발명에 따라, ARF-BP1은 p53-널 인간 세포로부터 ARF를 함유하는 단백질 복합체의 주요 성분인 것으로 확인되었다. 특히, 본 발명은 ARF-BP1, HECT(E6-AP-C-말단에 상동성)-함유 유비퀴틴 리가제를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면에 따라 ARF 및 p53 둘 다와 각각 반응하나, Mdm2와는 반응하지 않는 ARF-BP1이 제공된다. ARF-BP1은 Mdm2 널에서 ARF-매개 p53 안정화를 위해 필요하다.
본 발명은 p53 상태와 관계없이 종양에서 치료 중재를 위한 실용 방법을 제공하며, 여기서는 ARF-BP1이 보편적인 표적으로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라 ARF-BP1은 광범하게 발현되고 일반적으로 단백질 유비퀴틴화에 관련되는 시그니처 모티프(signature motif)(HECT 및 UBA)를 함유한다. ARF-BP1은 p53-야생형 세포에서 p53의 시험관내 유비퀴틴화 및 내인성 ARF-BP1의 RNAi-매개 불활성화를 촉매화하고, p53을 안정화시키며, p53 기능을 활성화한다.
본 발명의 추가의 측면은 이후 설명으로부터 알 수 있을 것이다.
도 1A-C는 ARF-BP1이 인간 세포에서 ARF-관련 핵 복합체의 주요 성분으로 확 인되었음을 나타낸다. 도 1A는 HA-ARF-Flag-단백질의 개략도이다. 도 1B는 항-ARF 항체를 이용하여 부모 H1299 세포주(레인 1), ARF-안정 세포주 클론 #1(레인 2) 및 ARF-안정 세포주 클론 #2(레인 3)로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석하여 얻은 ARF-안정 세포주에서 HA-ARF-Flag 및 내인성 ARF의 발현 수준을 나타낸다. 도 1C는 HA-ARF-Flag/H1299 안정 세포주의 핵 추출물로부터 친화성-정제된 ARF-복합체(레인 2) 및 부모 H1299 핵 세포 추출물로부터의 대조 용출물(레인 1)의 은(silver) 염색 결과를 나타낸다. 특이적 ARF-상호작용 단백질 밴드를 질량 분광계로 분석하고, p500/ARF-BP1 및 B23/NPM[뉴클레오포스민(Nucleophosmin)] 펩티드 서열(도 1C의 상부에서 하부까지 서열 번호 3 내지 6)을 나타내었다.
도 2A-C는 ARF-BP1이 시그니처 HECT-모티프 및 UBA 도메인을 함유하고 있음을 보여준다. 도 2A는 ARF-BP1 폴리펩티드의 개략도이다. 도 2B는 마우스 ARF-BP1(서열 번호 8) 및 인간 E6-AP(서열 번호 9)와 함께 인간 ARF-BP1(서열 번호 7)의 HECT 도메인 정렬 상태를 나타내며, 여기서 상동성 아미노산 잔기는 윤곽으로 강조되고 음영으로 표시되었다. 도 2C는 상이한 타입의 인간 조직에서 ARF-BP1의 발현을 나타낸다. 다중 조직 노던 필터가 ARF-BP1(상부) 또는 액틴(하부) cDNA 프로브와 하이브리드화되었다.
도 3은 ARF-BP1의 아미노산 서열을 나타내며, 서열 번호 2로 표시되었다.
도 4는 인간 ARF-BP1(서열 번호 10), 마우스 ARF-BP1(서열 번호 11), 효모 rad23(서열 번호 12), 인간 HHR23A(서열 번호 13), 인간 Cb1(서열 번호 14) 및 Cb1-b(서열 번호 15) 및 윤곽으로 강조되고 음영으로 표시된 상동성 아미노산 잔기 가 정렬된 ARB-BP1의 UBA 도메인 존재를 나타낸다.
도 5A-D는 ARF와 ARF-BP1이 시험관내 및 생체내에서 상호작용하고 ARF-BP1-매개 유비퀴틴 리가제 활성이 ARF에 의해 저해됨을 나타낸다. 도 5A는 시험관내 해독 35S-표지 ARF-BP1(1015-4374)(레인 1-6) 또는 시험관내 해독 35S-표지 ARF-BP1(1-1014)(레인 7-9) 중의 어느 하나에 의한 풀-다운(pull-down) 어세이에서 야생형 GST-ARF 전장 단백질(GST-ARF)(레인 3, 9), 돌연변이 GST-ARF(GST-ARF(GST-ARF △1-14))(레인 4), ARF 단백질의 N 말단(1-64)(레인 5), ARF의 C 말단(65-132)(레인 6) 또는 GST 단독(레인 2, 8)을 이용한 ARF-BP1과 GST-ARF의 직접 상호작용을 예시한다. 도 5B는 항-ARF 모노클로날 항체(하부) 또는 항-ARF-BP1 항체(상부)에 의한, 제시된 전 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석하여 얻은 ARF와 H1299 세포로부터의 ARF-BP1의 공면역침전(레인 1) 및 ARF-BP1-특이적 항체(레인 3) 또는 대조 IgG(레인 2)의 면역침전을 나타낸다. 도 5C는 ARF-BP1-특이적 항체(하부) 또는 항-ARF 모노클로날 항체(상부)에 의한, 제시된 전 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석하여 얻은 ARF-BP1와 H1299 세포로부터의 ARF의 공면역침전(레인 1) 또는 항-ARF 폴리클로날 항체(레인 3) 또는 대조 항혈청(레인 2)의 면역침전을 나타낸다. 도 5D는 항-GST 항체에 의한 유비퀴틴 콘쥬게이트의 웨스턴 블롯 분석으로 ARF-BP1의 유비퀴틴화 활성이 ARF에 의해 저해됨을 나타낸다. 시험관내 유비퀴틴화 어세이는 GST-ARF-BP1(3760-4374)을 E1, E2(His-UBCH5a) 및 유비퀴틴(레인 2)과 인큐베이션하거나, 또는 각각 GST-ARF(레인 3), GST-NARF(레인 4) 또는 GST-CARF(레인 5)의 존재하에 서 설정되었다.
도 6A-E는 Mdm2가 아닌 내인성 ARF-BP1의 불활성화가 p53-널 H1299 세포에서 세포 성장 정지를 유도함을 예시한다. 도 6A는 ARF-BP1, Mdm2, p21 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 대조 RNAi(GFP-RNAi)(레인 1), Mdm2 RNAi(레인 2) 또는 ARF-BP1 RNAi #1(레인 3)으로 처리된 H1299 세포의 세포 추출물을 웨스턴 블롯으로 분석한, RNAi에 의한 내인성 ARF-BP1 및 Mdm2 단백질의 제거를 나타낸다. 도 6B는 siRNA 처리 3일후 크리스탈 바이올렛으로 염색한 것으로, 대조 RNAi(GFP-RNAi), Mdm2 RNAi 또는 ARF-BP1 RNAi #1으로 처리된 H1299 세포의 전 세포 성장을 나타낸다. 도 6C는 RNAi 처리 하루후 세포를 표지 및 염색한 것으로, 대조 RNAi(GFP-RNAi), Mdm2 Nai 또는 ARF-BP1 RNAi #1으로 처리된 H1299 세포의 BrdU 도입 결과를 나타낸다. 도 6D는 ARF-BP1의 RNAi-매개 제거가 p53 널 SaoS-2 세포에서 세포 성장 저해를 유도하고 대조 RNAi, Mdm2-RNAi 또는 ARF-BP1-RNAi로 형질감염시키고(transfected) 24시간후 BrdU 양성 세포의 백분율을 보여주는 막대 그래프로서, 여기서 세포는 세개의 독립적인 실험을 계수하여 평균을 낸 것이다. 도 6E는 ARF-BP1의 RNAi-매개 제거가 p53 널 SaoS-2 세포에서 세포 성장 저해를 유도하고 대조 RNAi, Mdm2-RNAi 또는 ARF-BP1-RNAi로 처리된 후 Saos2 세포수를 보여주는 막대 그래프로서, 여기서 세포는 세개의 독립적인 실험을 계수하여 평균을 낸 것이다.
도 7A-D는 Mdm2가 아닌 내인성 ARF-BP1의 불활성화가 p53-널 H1299 세포에서 세포 성장 정지를 유도하고 U2OS 세포에서 p53을 안정화시킴을 예시한다. 도 7A는 RNAi에 의한 내인성 ARF-BP1 및 Mdm2 단백질의 제거를 나타내고, ARF-BP1, Mdm2, p21 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 대조 RNAi(GFP-RNAi)(레인 1), Mdm2 RNAi(레인 2) 또는 ARF-BP1 RNAi #2(레인 3)로 처리된 H1299 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다. 도 7B는 대조 RNAi(GFP-RNAi), Mdm2 RNAi 또는 ARF-BP1 RNAi #2로 처리된 H1299 세포의 성장 곡선을 나타내는 선 그래프이다. 상이한 타입의 siRNA로 처리한 후, 세포를 신선한 배지에서 플레이트당 2×106 세포로 시딩하고, 매일 계수하였다. 도 7C는 대조 RNAi(GFP-RNAi), Mdm2 RNAi 또는 ARF-BP1 RNAi #2로 처리된 H1299 세포의 전 세포 성장을 나타내며, 여기서 세포는 siRNA로 처리하고 3일후 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 도 7D는 인간 U2OS 세포에서 RNAi에 의해 제거된 내인성 ARF-BP1을 예시하며, ARF-BP1, p53, p21, 백스(bax) 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 자연 U2OS 세포(레인 1), 대조 RNAi(GFP-RNAi)로 처리된 U2OS 세포(레인 2) 또는 ARF-BP1 RNAi#2(레인 3)의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 8A-B는 ARF-BP1의 불활성화가 ARF의 과발현과 유사하게, H1299 세포에서 G2M 정지를 유도함을 보여준다. 도 8A는 대조 바이러스 처리 (i)를 병행한 대조 RNAi, ARF-BP1 RNAi (ii), 아데노바이러스-ARF 처리 (iii) 및 아데노바이러스-ARF 처리를 병행한 ARF-BP1 RNAi의 세포 사이클 프로필을 나타낸다. 도 8B는 H1299 세포에서 G2M 정지를 보여주는 막대 그래프이다.
도 9A-E는 ARF-BP1의 불활성화가 p53을 안정화하고 p53-의존성 아폽토시스를 유도함을 보여준다. 도 9A는 인간 U2OS 세포에서 RNAi에 의한 내인성 ARF-BP1의 녹 다운(knockdown)을 도시하고, ARF-BP1, p53, p21, 백스 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 자연 U20S 세포(레인 1), 대조 RNAi(GFP-RNAi)로 처리된 U2OS 세포(레인 2), 또는 ARF-BP1 RNAi(레인 3)의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다. 도 9B는 ARF-BP1의 불활성화가 내인성 p53 단백질의 반감기를 연장시킴을 보여주고, 항-p53(DO-1) 항체를 이용하여 시클로헥사미드(CHX) 처리후 지정된 시점(분)에 수거한, ARF-BP1-RNAi로부터의 세포 추출물 또는 대조-RNAi-형질감염 세포에 대해 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다. 도 9C는 ARF-BP1의 불활성화가 아폽토시스를 유도함을 보여준다. ARF-BP1-RNAi 또는 대조-RNAi 중 어느 하나로 형질감염된 U20S 세포에서 DNA 함량(PI 염색)에 따라 아폽토시스 세포(sub-Gl)에 대해 분석하였다. 도 9D는 ARF-BP1 RNAi-매개 p53 상향조절의 소멸로서 ARF-BP1(R)의 재도입을 보여주며, ARF-BP1, p53, p21 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 대조-RNAi(GFP-RNAi)(레인 1), ARF-BP1-RNAi #2(레인 2), 또는 ARF-BP1-RNAi #1과 ARF-BP1(R)의 조합(레인 3), ARF-BP1-RNAi #1 및 ARF-BP1M(R)(레인 4)로 처리된 U2OS 세포의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다. 도 9E는 ARF-BP1, Mdm2, p53, p21, Myc 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 대조 RNAi(레인 1, 3) 또는 ARF-BP1-RNAi(레인 2, 4) 중의 어느 하나로 처리된 부모 HCT116 세포(레인 1, 2) 또는 HCT116-p53-/- 세포(레인 3, 4)의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 대조 RNAi 또는 ARF-BP1 RNAi로 처리된 세포에서 p53 반감기 양을 나타내는 선 그래프이다.
도 11은 상이한 ARF-BP1 RNAi 올리고뉴클레오티드의 효과를 예시하며, 대조-RNAi(GFP-RNAi)(레인 1), ARF-BP1-RNAi #1(레인 2), ARF-BP1-RNAi#2(레인 3) 또는 ARF-BP1-RNAi#1 돌연변이(레인 4)로 처리된 U2OS 세포의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 항-ARF-BP1, 항-p53(DO-1), 항-Mdm2, 항-p21 및 항-액틴(AC-15) 항체로 면역블롯팅된 ARF-BP1-RNAi(레인 2, 4) 또는 대조-RNAi(레인 1, 3) 중 어느 하나로 처리된 인간 폐 선암종 A549(레인 1, 2) 또는 인간 유방암 MCF-7 세포(레인 3, 4)로부터의 전 세포 추출물로 보여진 바와 같이, ARF-BP1의 RNAi-매개 제거가 A549 및 MCF-7 세포에서 p53 활성화를 유도함을 보여준다.
도 13은 ARF-BP1의 RNAi-매개 제거가 정상 인간 섬유모세포(NHF-1)에서 p53 활성화를 유도함을 예시한다. 항-ARF-BP1, 항-p53(DO-1), 항-p21 및 항-액틴 항체에 의한 ARF-BP1-RNAi(레인 2) 또는 대조-RNAi(레인 1)로 처리된 정상 인간 섬유모세포(NHF-1)로부터의 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석 결과.
도 14A-D는 HECT 도메인이 ARF-BP1의 유비퀴틴 리가제 활성에 중요하고, ARF-BP1(R)의 재도입이 p53-널 H1299 세포에서 ARF-BP1 RNAi에 의한 세포 성장 정지를 소멸시킴을 보여준다. 도 14A는 ARF-BP1 돌연변이(ARF-BP1(M)), ARF-BP1#1 RNAi 저항성 작제물(ARF-BP1(R)) 및 그의 돌연변이(ARF-BP1M(R))에 대한 개략도이다. ARF-BP1(R) 및 ARF-BP1M(R) 둘 다에 대해 핵산 AATTGCTATGTCTCTG(서열 번호 16)은 AATTGATATCCTCTG(서열 번호 17)로 돌연변이되었다. 도 14B는 HECT 도메인의 고도로 보존된 Cys 잔기에서 ARF-BP1의 점 돌연변이가 항-GST 항체에 의한 유비퀴틴 콘쥬게이트의 웨스턴 블롯 분석에 따라 ARF-BP1의 유비퀴틴 리가제 활성을 제거한다는 것을 보여준다. 시험관내 유비퀴틴화 어세이는 GST-ARF-BP1(3760-4374)(레인 1, 2) 또는 GST-ARF-BP1-ca 돌연변이(레인 3, 4)를 E1, E2(His-UBCH5a) 및 유비퀴틴(레인 2, 4)과 인큐베이션하여 설정된다. 도 14C는 p53-널 H1299 세포에서 ARF-BP1(R)의 재도입을 통해 ARF-BP1 RNAi에 의한 세포 성장 정지를 나타내며, 여기서 세포는 siRNA 처리 3일후 크리스탈 바이올렛으로 염색된 것이다. 도 14D는 세개의 독립적인 실험 평균을 이용한 도 14C로부터의 상대적인 세포수 백분율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 ARF-BP1의 불활성화가 HCT116 세포에서 p53-의존성 아폽토시스를 유도함을 보여주는 막대 그래프이다. ARF-BP1-RNAi 또는 대조-RNAi(GFP-RNAi) 중의 하나로 처리된 HCT116 및 HCT116-p53(-/-) 세포로부터 아폽토시스 세포에 대한 정량으로서, 아폽토시스 세포는 FACS 분석(SubGl)에 의해 계수되고 세개의 독립적인 실험의 평균이다.
도 16A-D는 ARF-BP1이 p53에 결합하여 유비퀴틴화하고, p53의 ARF-BP1-매개 유비퀴틴화가 ARF에 의해 저해됨을 나타낸다. 도 16A는 ARF-BP1이 GST-p53과 직접 상호작용함을 나타낸다. GST-p53 단백질(레인 3, 7), GST-Mdm2(레인 4, 8) 또는 GST 단독(레인 2, 6)이 시험관내 해독된 35S-표지 ARF-BP1(1015-4374)(레인 1-4) 또는 ARF-BP1(1-1014)(레인 5-8)와 함께 GST 풀-다운 어세이에 사용되었다. 도 16B는 U2OS 세포로부터의 ARF-BP1과 p53의 공면역침전을 나타낸다. p53 모노클로날 항체 DO-1(하부) 또는 ARP-BP1 특이적 항체(상부)에 의한 전 세포 추출물(WCE)의 웨스턴 블롯 분석 결과(레인 1) 또는 항-ARF-BP1 특이적 항체(레인 3) 또는 대조 IgG(레인 2)와의 면역침전. 도 16C는 U2OS 세포로부터의 p53과 ARF-BP1의 공면역침전을 나타낸다. 항-ARF-BP1 특이적 항체(하부) 또는 항-p53 DO-1 항체(상부)에 의한, 제시된 전 세포 추출물(WCE)의 웨스턴 블롯 분석 결과(레인 1) 및 p53 모노클로날 항체 DO-1(레인 3) 또는 대조 항체(레인 2)와의 면역침전. 도 16D는 p53의 ARF-BP1-매개 유비퀴틴화가 ARF에 의해 저해됨을 보여준다. Flag-p53을 E1, E2 및 유비퀴틴(HA-Ub)의 존재하에 GST-ARF-BP1(3760-4374)과 인큐베이션한 후, 생성된 유비퀴틴-콘쥬게이트를 Flag/M2 비드에 의해 면역침전시키고, 항-p53 DOl-항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 재조합 박테리아 발현 단백질 GST-ARF, NARF(1-64) 또는 CARF-(65-132)를 각각 레인 3, 4 또는 5의 반응에 첨가하였다.
도 17A-C는 ARF가 Mdm2-비의존 방식으로 p53 안정화를 유도하고 ARF-BP1이 Mdm2-널 세포에서 ARF-매개 p53 안정화에 중요하다는 사실을 보여준다. 도 17A는 ARF가 Mdm2-널 세포에서 p53을 안정화시킴을 나타낸다. p53 항체(DO-1)를 이용하여, ARF 및 p53의 발현 벡터로 형질감염된 MEF p53/Mdm2-이중 널 세포로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과. 도 17B는 ARF-BP1의 불활성화가 Mdm2-널 세포에서 p53을 안정화시킴을 보여준다. p53 항체(DO-1)를 이용하여, ARF-BP1 RNAi 또는 Mdm2 RNAi 중 어느 하나와 함께 p53 발현 벡터로 형질감염된 MEF p53/Mdm2-이중 널 세포로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과. 도 17C는 Mdm2-널 세 포에서 ARF-매개 p53 안정화에 ARP-BP1이 필요함을 보여준다. p53 항체(DO-1), 항-ARF, 항-ARF BP1 및 항-GFP 항체를 이용하여, ARF-BP1 RNAi 또는 Mdm2 RNAi 중 어느 하나와 함께 p53 및 ARF의 발현 벡터로 형질감염된 MEF p53/Mdm2-이중 널 세포로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과.
도 18A-B는 ARF-BP1의 불활성화가 형질감염된 p53 단백질의 반감기를 연장시킴을 보여준다. 도 18A는 시클로헥사미드(CHX) 처리후 지정된 시점(시)에 수거한 ARF-BP1-RNAi 또는 대조 RNAi로 형질감염된 MEF p53/Mdm2-이중 널 세포로부터의 세포 추출물을 항-p53(DO-1) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸다. 왼쪽 패널(레인 1-4)의 노출 시간이 오른쪽 패널(레인 5-8)의 노출 시간보다 길어서 0 시점에서 대조 RNAi 및 ARF-BP1 RNAi 간의 p53의 베이스 강도는 유사하다. 도 18B는 도 18A에 도시된 바와 같은 대조 RNAi 또는 ARF-BP RNAi로 처리된 MEF p53/Mdm2-이중 널 세포에서 p53 반감기 양을 나타내는 선 그래프이다.
도 19A-C는 ARF-BP1이 ARF 종양 억제인자 기능의 중여한 매개체임을 보여준다. 도 19A는 Mdm2, COP1, Pirh2를 비롯하여 p53에 대한 공지 리가제와 비교하였을 때, ARF-BP1의 감소가 p53 수준에 가장 현저한 효과를 가짐을 나타낸다. ARF-BP1, Mdm2, Pirh2, p53, p21, Bax 및 액틴에 대한 항체를 이용하여, 대조 RNAi(레인 1), Mdm2 RNAi(레인 2), COP1 RNAi(레인 3), Pirh2 RNAi(레인 4) 및 ARF-BP1 RNAi(레인 5)로 처리된 U20S로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과. 도 19B는 ARF-BP1 및 Mdm2에 의한 ARF의 p53-의존성 및 p53-비의존성 기능에 대한 협동 조절 모델이다. 도 19C는 유방암 세포주에서 ARF-BP1 발현을 보여준다. 항-ARF-BP1 특이적 항체 및 항-액틴 항체에 의한 정상 인간 섬유모세포 NHF 세포주뿐 아니라 정상 유방 세포주 MCF-10A와 비교하여 나타낸 다수의 유방암 세포주로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과.
도 20은 ARF, Mdm2, p53, p21, Bax 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 아데노바이러스-GFP(레인 1) 또는 아데노바이러스-ARF(레인 2)로 형질감염된 U20S로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과에 따라, ARF의 과발현이 p53 및 다른 전사 인자(p21, Mdm2, Bax)를 활성화시킴을 보여준다.
도 21은 ARF-BP1이 NPM/B23 단백질을 분해에 대한 표적으로 하지 않고 NPM/B23 단백질이 ARF-BP1 유비퀴틴 리가제 활성의 효소 표적이 아님을 나타낸다. 항-p53(DO-1) 및 항-GFP 항체에 의해, ARF-BP1 RNAi(레인 3, 5) 또는 Mdm2 RNAi(레인 2, 4) 중 어느 하나와 함께 p53 및 ARF(레인 2, 4)의 발현 벡터로 형질감염된 MEF p53/Mdm2-이중 널 세포로부터의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 프로테아좀 저해는 ARF 또는 ARF-BP1 RNAi에 의해 이룰 수 있는 수준 이상으로 p53을 안정화시켰다.
도 22A-D는 ARF-BP1이 생체내 및 시험관내에서 B23과 상호작용하나, B23을 유비퀴틴화하여 분해시키지 않음을 보여준다. 도 22A는 ARF-BP1이 시험관내에서 B23과 상호작용함을 보여준다. GST-B23 단백질(레인 3) 또는 GST 단독(레인 2)이 시험관내 해독된 35S-표지 ARF-BP 1(1015-4374)(레인 1-3) 또는 ARF-BP1(1-1014)(레인 4-6)과 함께 GST 풀-다운 어세이에 사용되었다. 도 22B는 ARF-BP1이 생체내에서 B23과 상호작용함을 보여준다. 항-ARF-BP1 특이적 항체에 의한 전 세포 추출물(레인 1 및 2)의 웨스턴 블롯 분석 결과 또는 FLAG-B23으로 안정하게 형질감염된 세포로부터의 항-FLAG M2 비드(IP/M2)(레인 2 및 4) 또는 형질감염시키지 않은 대조군(레인 1 및 3)과의 면역침전(레인 3 및 4). 도 22C는 ARF-BP1이 B23 유비퀴틴화를 매개하지 않음을 보여준다. GST-B23을 E1, E2 및 유비퀴틴(HA-Ub)의 존재하에서 GST-ARF-BP1과 인큐베이션한 후, 반응을 항-B23-항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 22D는 ARF-BP1의 제거가 B23 수준에 영향을 미치지 않음을 보여준다. ARF-BP1, p53, B23 및 액틴에 대한 항체를 이용하여 대조 RNAi(GFP-RNAi)(레인 25 5), ARF-BP1 RNAi(레인 3, 6)로 처리되거나 처리되지 않은(레인 1, 4) SJSA(레인 1-3) 또는 U2OS 세포(레인 4-6)의 세포 추출물을 웨스턴 블롯 분석한 결과.
ARF는 Mdm2-비의존 방식으로 p53을 안정화시킬 수 있고 ARF-BP1의 불활성화가 직접 p53 활성화로 이어지기 때문에, 본 발명은 일차 표적이 Mdm2일 것이라는 가정하에 ARF가 생체내에서 p53을 활성화하는 방식에 대한 현재의 견해를 수정하였다. 또한, ARF-BP1의 불활성화가 p53 널 세포에서 세포 성장 저해 및 p53-야생형 세포에서 p53-의존성 아폽토시스를 유도한다면, ARF-BP1은 p53의 상태에 관계없이 종양의 치료 중재에 보편적 표적이 된다.
p53 단백질 조절 및 세포 증식 조절의 응용에 사용하는 것 외에, 본 발명의 ARF-BP1 펩티드는 또한 치료제(예: 항신생물제), 종양 또는 신생물 형성전의 병리 이상 및 유전적 질환의 진단 및 치료를 위한 시험관내 스크리닝 방법에 유용하다.
ARF-BP1의 확인에 따라 p53 활성화시에 ARF-매개 효과의 새로운 양상이 밝혀졌다.
ARF 폴리펩티드는 INK4a 자리의 선택적인 판독 프레임 산물로서 진정한 종양 억제인자인 것으로 널리 받아들여지고 있다(Sherr et al, 2001, 상기 참조; Sharpless, N.E., DePinho, R.A., 2004, 상기 참조). p53 경로를 활성화하는데 ARF에 대한 제 1 단서는 p53 안정화가 ARF-매개 기능에 결정적임을 보여주는 조직 배양 실험으로부터 유래한다(Kamijo, T., et al, Cell 91:649-659, 1997). 이로부터, p53의 유비퀴틴화 및 분해에 있어서 Mdm2의 역할이 밝혀졌다(Haupt et al., Nature 387:296-299, 1997; Honda, R., Tanaka, H., Yasuda, H., FEBS Lett 420:25-27, 1997; Kubbutat, M.H., Jones, S.N., Vousden, K.H., Nature 387:299-303, 1997). 주로, 과발현 세팅으로부터 유래된 결과에 기초하여, ARF와 Mdm2 간의 이와 같은 표면적인 명백한 관계가 ARF-매개 p53 활성화에 대한 주요 경로인 것으로 즉각 받아들여졌으며(Sherr et al, 2001, 상기 참조), 이러한 경로에 다른 인자가 관여할 수 있다는 여지를 남기지 않았다.
그러나, p53의 ARF-매개 활성화가 단순한 ARF-Mdm2 모델보다 훨씬 복잡하다는 다수의 증거가 존재한다. 예를 들어, ARF-Mdm2 상호작용이 과발현 세팅에서 발견되었다. 그러나, 정상 세포에서 Mdm2의 발현 수준은 낮으며; 내인성 ARF가 정상 세포내 내인성 Mdm2와 상호작용하는지의 여부가 해결되지 않고 남아 있다. 또한, 정상 세포에서 일반적으로 발견되는 저수준의 Mdm2는 p53의 모노유비퀴틴화를 우선적으로 촉매화한다(Li et al, 2003, 상기 참조); 그러나, 흥미롭게도, 레인(Lane) 그룹으로부터의 최근 연구는 ARF가 p53의 폴리유비퀴틴화를 봉쇄할 수 있으나, 세포에서 p53의 Mdm2-매개 모노유비퀴틴화를 저해할 수 없다고 제시하였다(Xirodimas, D.P., Stephen, C.W., Lane, D.P., Oncogene 20:4972-83, 2001). 이들 연구는 "ARP가 Mdm2의 수준이 낮은 세포에서 어떻게 p53을 안정화시킬 수 있을까?" 라는 중요한 의문점을 제기한다. p53 분해에 있어서 Pirh2 및 COP1의 중요한 역할을 보여주는 최근의 연구는 p53의 안정화가 생체내 상이한 경로를 통해 작용할 수도 있다는 생각을 추가로 뒷받침한다(Leng, R.P., Lin, Y., Ma, W., et al, Cell 112:779-91, 2003; Dornan, D. et al, Nature 429:86-92, 2004).
본 발명은 p53의 ARF-매개 활성화에 대한 새로운 Mdm2-비의존성 경로를 발견하였다. 본 발명은 ARF-BP1이 시험관내 및 생체내에서 p53과 직접적으로 상호작용하여 Mdm2-비의존 방식으로 p53의 유비퀴틴화를 촉매화함을 발견하였다. 또한, p53의 ARF-BP1-매개 유비퀴틴화는 ARF에 의해 현저히 저해되며, 내인성 ARF-BP1의 불활성화는 Mdm2-널 세포에서 ARF-매개 p53 안정화에 중요하다. 따라서, ARF-매개 p53 안정화는 Mdm2-의존 및 Mdm2-비의존 방식 둘 다에 의해 작용할 수 있다.
본 발명은 ARF에 의해 p53에 대한 ARF-BP1- 및 Mdm2-매개 조절에서의 관계를 밝힌다. ARF-BP1은 생화학적 정제를 통해 ARP에 대한 주요 표적이고 ARF 단백질이 정상 세포에서 쉽사리 검출된 것으로 확인되었기 때문에, 정상 세포에서 ARF-매개 p53 활성화는 적어도 부분적으로 생체내 ARF-BP1 기능 저해를 통해 작용한다. 따라서, ARF-BP1 및 Mdm2 양자에 대한 ARF-매개 조절은 p53의 안정성을 공조하여 조절할 수 있으며, 보다 효과적으로 p53-매개 기능을 활성화한다. 예를 들어, 내인성 Mdm2 수준이 높은 경우, p53은 주로 Mdm2-매개 폴리유비퀴틴화에 의해 분해될 수 있다. 따라서, ARF-Mdm2 상호작용은 p53 활성의 상향조절에 중요할 수 있다. 이에 반해, 내인성 Mdm2 수준이 낮은 경우, ARF-BP1의 ARF-매개 조절은 p53을 활성화하는데 주요 인자가 될 수도 있다(도 19). 최근의 다수 연구가 p53 분해가 생체내 Mdm2-의존 및 Mdm2-비의존 경로에 의해 매개된다는 견해를 지지해 준다(Leng et al, 2003, 상기 참조; Dornan et al, 2004, 상기 참조). RNAi 녹다운 방법을 이용하여, p53의 공지된 각 E3 리가제에 의한 p53 안정화에 대한 상이한 효과를 평가하였다. 예상했던 바와 같이, Mdm2의 불활성화는 p53 안정화를 촉진하였고, COP1 또는 Pirh2 중 어느 하나의 불활성화가 또한 p53를 적절히 안정화시켰다. 분명히, ARF-BP1의 불활성화는 p53 안정화를 현저히 유도하고 p53-매개 전사를 활성화하였다(도 8); ARF-BP1 RNAi에 의해 유도된 p21 및 Bax 도입 수준은 p53에 대한 다른 타입의 E3 siRNA에 의해 유도된 수준보다 높았으며(도 19A), ARF 과발현에 의한 효과와 매우 밀접하였다(도 20). 이들 데이터는 ARP-BP1이 인간 세포내 p53의 주요 유비퀴틴 리가제중의 하나이며, 보다 중요하게는 ARF-매개 종양 억제인자 기능에 대한 주요 표적임을 제안한다.
ARF-매개 p53 활성화에 대한 두개의 상이한 경로 존재(이중 하나는 ARF-BP1 유비퀴틴 리가제에 기초하고 다른 하나는 Mdm2 유비퀴틴 리가제에 기초함)는 p53 기능을 보다 다양하게 조절할 수 있도록 하지만(도 19B), 또한 이들의 생물학적 유의성에 대한 의문점을 제기하기도 한다. 예를 들어, 종양형성에 있어서 Mdm2의 중요한 역할이 이미 정립되었다. Mdm2의 유전자 증폭 및 단백질 과발현이 다양한 타입의 종양에서 확인되었다(Michael, D. and Oren, M., Semin Cancer Biol 13:49-58, 2003). 따라서, ARF-Mdm2 상호작용은 고수준의 Mdm2를 발현하는 세포에서 특히 중요할 것이다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 ARF-BP1이 유방암 주에서 80%(16/20)로 고도로 발현되는 반면, 정상 유방 세포(MCF-1OA)에서 ARF-BP1의 발현 수준은 낮다는 것을 알아냈으며(도 19C), 이는 유방암 종양형성에 ARF-BP1이 한 역할을 담당할 수 있을 것임을 제안한다.
ARF-BP1의 ARF-매개 저해는 P53-비의존성 세포 성장 조절에 중요하다
p53의 안정화 및 활성화에 있어서 ARF의 역할이 익히 용인되었지만, ARF는 또한 기능성 p53이 결핍된 종양에서 돌연변이화되거나 하향조절되는 것으로 밝혀졌으며(Sherr et al, 2001, 상기 참조), 이는 ARF 매개 p53-비의존성 기능이 또한 그의 종양 억제 기능에 중요하다는 것을 제안한다. 이러한 개념과 일치하는 것으로, 다수의 연구가 ARF가 p53-비의존성 세포 성장 억제를 유도할 수 있다고 제시하였다(Weber, J.D., et al, Genes Dev. 14:2358-65, 2000; Rocha, S., Campbell, KJ., Perkins, N.D., Mol Cell, 12:15-25, 2003). ARF-BP1이 p53-널 세포에서 ARF의 주요 결합 파트너라는 본 발명의 관찰결과에 기초하여, 본 발명자들은 ARF-BP1이 ARF-매개 p53-비의존성 기능에 주요 표적임을 제안한다. 이는 p53-널 세포에서 Mdm2가 아닌 ARF-BP1의 불활성화가 ARF 도입의 연상 방식으로 세포 성장 억제를 유도한다는 사실로 뒷받침된다.
ARF-BP1의 ARF-매개 조절이 p53-비의존성 세포 성장 정지로 이어질 수 있는 정확한 기전은 미래의 연구 과제이다. ARF-BP1은 진정한 유비퀴틴 리가제이기 때문에, ARF-BP1의 확인되지 않은 기질의 조절로 ARP-매개 p53-비의존성 기능이 작용할 수 있다(도 19). 뉴클레오플라스민/B23 및 리보좀 서브유닛이 ARF-매개 리보좀 RNA 과정에 관여함을 보여주는 최근 연구에 비추어(Itahana, K et al, Mol Cell 12:1151-64, 2003; Bertwistle, D, Sugimoto, M. Sherr, C.J., Mol Cell Biol 24:985-96, 2004), ARF-BP1이 B23 기능 또는 리보좀 RNA 과정 조절에 직접 관여하는지가 조사되었다. 본 발명은 ARF-BP1이 생체내 및 시험관내에서 B23과 상호작용하나, B23을 유비퀴틴화하여 분해시키지 않는지를 결정하였다(도 22B). ARF-BP1은 B23 유비퀴틴화를 매개하지 않았고(도 22C), ARF-BP1 제거는 B23 수준에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 B23이 ARF-BP1 유비퀴틴 리가제 활성에 대한 표적이 아님을 제시한다. 또한, ARF 경로는 생체내 종양 유전자 활성화와 밀접한 관련이 있기 때문에(Sherr, 2001, 상기 참조; Nilsson, J.A. Cleveland, J.L. Oncogene 22:9007-21, 2003; Sharpless and Depinho, 2004, 상기 참조), 종양 유전자 활성화 또는 세포내 다른 타입의 스트레스시에 ARF-BP1과 ARF 상호작용뿐 아니라 ARF-BP1의 유비퀴틴 리가제 활성이 조절될 수 있다.
암 치료시 잠재성 내포
p53 경로 활성화는 암 발생에 있어서 중요하고도 경우에 따라서는 필수적인 단계이다. 디수의 연구에 따라 p53 활성화가 많은 암 치료제의 기능에 중요하며 p53-의존성 기능이 이들 약제의 임상적 효능에 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다(Lane and Fisher, Nature 427:789-90, 2004; Lowe et al, 1994; Chresta and Hickman, Nature Medicine 2:745-6, 1996; Lutzker and Levine, Cancer Treat Rep, 87:345-56, 1996). p53과 관련된 신약 개발에 대한 최근 연구도 이러한 문제에 초점을 맞추었다. 예를 들어, p53 유전자 요법이 암 치료를 위해 승인을 받았다(Surendran, A., Nature Medicine, 10:9, 2004). p53-Mdm2 상호작용을 봉쇄하는 소형 분자인 누틀린(Nutlin)은 p53 경로를 활성화하여 생체내에서 종양 세포를 효과적으로 살해하는 것으로 밝혀졌다(Vassilev L.T. et al, Science 303:844-8, 2004). 그러나, p53 유전자는 인간 종양의 50% 이상에서 돌연변이화하고 다수의 종양으로부터 유래된 p53 점 돌연변이조차도 상당한 부정적인 영향을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Vogelstein et al, Nature 408:307-310, 2000). p53 경로를 특이적으로 표적화한 약물은 기능성 p53이 결핍된 종양 세포를 살해하는데 곤란함을 겪을 수 있다.
몇몇 측면에서, ARF-BP1 단백질은 종양의 치료 중재에 적절한 후보 표적이다. 종양 세포를 발현하는 야생형 p53에서 ARP-BP1의 불활성화는 p53 안정화를 도모하고 p53-매개 아폽토시스를 유도한다. 중요하게도, 기능성 p53이 결핍된 종양 세포에서 ARF-BP1 저해는 세포 성장 저해를 유도한다. ARF-BP1은 또한 효소이며, 그의 유비퀴틴 리가제 활성은 그의 매개 기능에 중요하다. 따라서, 그의 효소 활성 저해제에 대한 약물 스크리닝은 종양에서 치료 중재를 보장하는 전략일 것이다. Mdm2와 같은 p53 기능을 특이적으로 저해하는 단백질을 표적으로 하는 것에 반해, ARF-BP1 저해제는 p53 상태에 무관하게 종양 세포 성장을 방지하는데 효과적이어야 한다.
전술한 설명에 따라, 본 발명은 대상이 신생물 형성을 보유하는지를 결정하는 방법을 제공한다. 본 원에 사용된 "대상"은 소, 개, 인간, 원숭이, 마우스, 돼지 또는 래트가 예시되나 이들에 한정되지 않는 포유동물이다. 대상이 인간인 것이 바람직하다. 본 발명자들은 본 원에서(참조예: 도 16A-D), DNA 손상된 세포에서 정상(비손상) 세포에 비해 ARF-BP1 상호작용의 유의적인 증가 및 ARF-BP1의 발현 증가가 검출됨을 입증하고 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하며, 이때 ARF-BP1 발현이 정상 보다 높게 검출되면 대상에서 신생물이 형성된 것으로 진단된다.
본 원에 사용된 "ARF-BP1"은 "보존성 치환"을 포함하여, ARF-BP1 단백질 및 ARF-BP1 유사체 모두를 포함한다. 달리 언급이 없으면, "단백질"은 단백질, 단백질 도메인, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함할 것이다. 본 원에 또한 사용된 ARF-BP1 단백질은 도 3에 제시된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 갖는다.
본 원에 사용된 "ARF-BP1 유사체"는 ARF-BP1 단백질과 아미노산 서열이 60% 이상(바람직하게는 70% 이상) 일치하며 ARF-BP1 생물학적 활성을 가지는 ARF-BP1 단백질의 기능성 변이체이다. ARF-BP1 "유사체"는 동일한 삼차원 구조를 가지는 ARF-BP1 단백질 변이체를 포함한다. ARF-BP1 및 ARF-BP1 유사체는 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있거나, 자연 세포로부터 분리될 수 있다. ARF-BP1은 통상적인 기술 및 ARF-BP1을 코딩하는 cDNA(서열 번호 1)를 사용하여 재조합적으로 생성되는 것이 바람직하다.
본 원에 사용된 "보존성 치환"은 유사한 극성 또는 입체적 배열을 가지거나, 치환된 잔기와 동일한 부류에 속하기 때문에(예: 소수성, 산성 또는 염기성), 치환된 아미노산 잔기와 기능적으로 동등한 아미노산 치환이다. 본 원에 정의된 바와 같은 "보존성 치환" 이라는 용어는, 특히 p53 저해제의 확인 및 설계, 분자 치환 분석 및/또는 상동성 모델링에 상호작용이 적용되는 경우, p53과 상호작용할 수 있는 ARF-BP1 능력에 결정적인 영향을 미치지 않는 치환을 포함한다.
본 발명의 방법은 대상이 신생물 형성에 결렸는지를 결정하여 대상에서 신생물 형성을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 본 원에 사용된 "신생물 형성" 이란 신생물(즉, 종양 세포와 같은 신생물 형성 세포)이 정상 세포의 증식을 유도하지 않거나 정지시킬 수 있는 조건하에서 세포 증식을 제어할 수 없는 정도로 진행시킴을 말한다. 신생물 형성에 의해 본 원에서 새로운 이상 증식, 특히 조직의 새로운 성장으로 정의된 "신생물" 상태가 초래되며, 여기에서는 세포 성장이 제어할 수 없는 정도로 진행된다. 따라서, 신생물 형성은 본 원에서 정상 조절의 상실로 비조절 성장, 분화 결핍, 국소 조직 침범 및/또는 전이를 초래하는 독특한 특성을 가지는 신생물 형성 세포의 증식으로 일컬어지는 "암"을 포함한다.
본 원에 사용된 신생물은 동일 타입의 조직에서 정상적인 증식에 비해 대상의 조직에서 세포 증식이 병적일 뿐 아니라 대상의 조직에서 형태가 불규칙적인 것을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 신생물은 침습성이거나 혹은 비침습성인 양성 종양 및 악성 종양(예: 유방 종양)도 포함한다. 악성 신생물은 역형성 정도, 또는 세포의 분화 및 배향 상실이 더 크고, 침습성이면서 전이성을 가진다는 점에서 양성과 구분된다. 본 원에 개시된 본 발명에 따라 평가, 검출, 진단, 모니터 또는 치료될 수 있는 신생물 또는 신생물 형성의 예로서 암종, 특히 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 뇌, 신장, 폐, 목, 난소, 전립선 및 위 암종; 림프구성 백혈병, 특히 급성 림프모구 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병, 특히 급성 단핵구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병 및 만성 골수구성 백혈병; 악성 림프종, 특히 버킷(Burkitt) 림프종 및 비호지킨(non-Hodgkin) 림프종; 악성 흑색종; 골수증식 질환; 육종, 특히 유잉(Ewing) 육종, 혈관육종, 카포시(Kaposi) 육종, 지방육종, 말초 신경상피종 및 윤활막 육종; 및 혼합 형태의 신생물 형성, 특히 암육종 및 호지킨 질환이 포함되나, 이들에만 한정되는 것은 아니다(Beers and Berkow(eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 973-74, 976, 986, 988, 991).
상술한 바와 같이, 모든 암 사례에 있어서 50%가 넘게 p53 돌연변이와 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로, 본 발명의 방법 및 조성물은 p53 경로 결손과 관련된 신생물 형성을 포함하여, p53-관련 신생물 형성의 평가, 검출, 진단, 모니터 및 치료에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예로, 본 발명의 방법 및 조성물은 유방암, 결장암, 백혈병, 폐암, 악성 흑색종, 난소암 또는 전립선암의 평가, 검출, 진단, 모니터 및 치료에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 본 발명의 방법 및 조성물은 p53 경로 결손과 관련이 없는 신생물 형성을 포함하여, p53-비의존성 신생물 형성의 평가, 검출, 진단, 모니터 및 치료에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예로, 본 발명의 방법 및 조성물은 유방암, 결장암, 백혈병, 폐암, 악성 흑색종, 난소암 또는 전립선암의 평가, 검출, 진단, 모니터 및 치료에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 대상의 진단 샘플은 시험관내 또는 생체내로 평가될 수 있다. 분석이 시험관내로 수행되는 경우, 대상으로부터의 진단 샘플은 표준 기술을 이용하여 제거할 수 있다. 진단 샘플은 표준 생검으로 제거할 수 있는 임의의 뼈, 뇌 조직, 유방 조직, 결장 조직, 근 조직, 신경 조직, 난소 조직, 전립선 조직, 망막 조직, 피부 조직 또는 연 조직을 비롯한 조직일 수 있다. 또한, 진단 샘플은 뇌척수액, 심장막액, 복막액, 타액, 혈청 및 소변을 포함한 체액일 수도 있다. 또한, 진단 샘플은 대상 또는 환자로부터 취해질 수도 있으며, 예를 들어, 신생물을 보유한 것으로 알려진 임의 조직, 신생물을 보유할 것으로 예상되는 임의 조직 또는 신생물을 보유하지 않을 것으로 판단되는 임의 조직일 수 있다.
단백질은 조직으로부터 추출(예: 단백질을 용해시키는 세정제 이용)후, 필요에 따라 컬럼 크로마토그래피(예: FTLC 및 HPLC) 상에서 친화성 정제, 면역침전(예: ARF-BP1에 대한 항체 이용) 및 침전(예: 이소프로판올 및 트리아졸(Trizol)과 같은 시약 이용)이 예시되나 이들에 한정되지 않는 당 업계에 공지된 일반적인 방법을 이용하여 본 발명의 진단 샘플로부터 단리 및 정제될 수 있다. 단백질의 단리 및 정제는 전기영동(예: SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 수행)에 의할 수 있다. 당 업계에 공지된 일반적인 방법을 이용하여 핵산이 진단 샘플로부터 단리될 수도 있다.
본 발명의 방법에 따라, 대상에서의 신생물 형성은 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1의 발현에 대해 분석하고, ARF-BP1의 발현이 정상보다 높으면 신생물 형성 증상이 있는 것으로 진단할 수 있다. 본 원에 사용된 "발현"은 유전자가 적어도 하나의 mRNA 전사물로 전사되었거나, 적어도 하나의 mRNA가 단백질로 해독된 것을 의미한다. 예를 들어, "ARF-BP1의 발현"이란 상기 정의된 바와 같이, ARF-BP1 유전자가 적어도 하나의 mRNA 전사물로 전사되었거나, 적어도 하나의 mRNA가 ARF-BP1 단백질로 해독된 것을 의미한다. 따라서, ARF-BP1 단백질, ARF-BP1 cDNA 또는 ARF-BP1 mRNA를 분석하여 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수 있다. 적절한 형태의 ARF-BP1은 본 원에 논의된 특정 기술로부터 알 수 있을 것이다.
또한, 진단 샘플은 대상 또는 환자가 신생물 형성에 결렸는지를 결정하기 위하여, 임의 또는 모든 형태(전구체, 내단백질분해(endoproteolytically) 처리된 형태 및 해독후 변형된 기타 형태)의 ARF-BP1 단백질 발현에 대해 분석될 수 있음이 구상된다. 본 원에 기술된 바와 같이, p53-ARF-BP1 상호작용 증가를 검출하여 진단 샘플이 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현에 대해 분석될 수 있는 것도 또한 구상된다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로, 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 상호작용의 검출로 ARF-BP1 발현이 정상보다 높은 것으로 검출된다.
본 원에 사용된 "정상보다 높은" 이란 용어는 성이 동일하고 연령이 유사한 질환에 걸리지 않은 대상 또는 환자(즉, 신생물 형성을 갖지 않음)로부터 취한 동일 타입의 진단 샘플에 대해 예상되는 수준보다 상당히 높은 수준(예: ARF-BP1의 발현, p53-ARF-BP1 상호작용, ARF-BP1-ARF 상호작용 등의 수준)으로 검출됨을 의미한다. 본 원에 사용된 "상당히 높은" 이란 것은 정상보다 높은 수준(예: ARF-BP1의 발현, p53-ARF-BP1 상호작용, ARF-BP1-ARF 상호작용 등의 수준)과 예상(정상) 수준(예: ARF-BP1의 발현, p53-ARF-BP1 상호작용 등의 수준)의 차가 통계적으로 유의적인 것을 의미한다.
바람직하게, 정상보다 높은 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)은 예상되는 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용) 수준보다 적어도 10% 큰 수준의 ARF-BP1의 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)이다. 특정 대상 또는 환자로부터 취한 특정 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)이 없을 것으로 예상되는 경우, 그 대상 또는 환자에 대해 정상 수준의 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)은 존재하지 않는다. 특정 대상 또는 환자로부터 취한 특정 진단 샘플이 낮은 수준의 구성 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)을 가지는 경우, 이러한 낮은 수준은 그 대상 또는 환자에 대해 정상 수준의 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)이다.
특정 대상 또는 환자로부터 취한 특정 진단 샘플에 대해 예상되거나 정상 수준의 ARF-BP1 발현은 연령이 유사하고 성이 동일한 질환에 걸리지 않은 대상을 분석하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 25 내지 80세 연령의 적어도 30명의 건강한 정상 남성으로부터 진단 샘플을 얻어 남성에 대한 정상양의 ARF-BP1 발현을 결정할 수 있다. 여성에 대한 ARF-BP1 발현을 결정하기 위하여 동일 절차가 수행될 수 있다. 필요하거나 바람직한 샘플이 얻어지면, 남성 및 여성에 대한 정상양의 ARF-BP1 발현을 일반적인 정량 분석, 예컨대 후술하는 바와 같이, 단백질 양을 측정하기 위한 유세포 분석, 웨스턴-블롯 분석 또는 ELISA를 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, ELISA를 각 샘플에 대해 이중으로 실시하고, ARF-BP1 단백질 양의 평균 및 표준편차를 결정할 수 있다. 필요에 따라, 정상양의 ARF-BP1 발현을 정량하기 전에 추가의 대상이 보충될 수도 있다. 유사한 타입의 절차를 이용하여 대상 또는 환자로부터 취한 특정 진단 샘플에 대한 p53-ARF-BP1 상호작용의 예상 또는 정상 수준을 결정할 수도 있다.
본 발명의 방법에 따라, 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)에 대해 분석하고, 당업계에 공지된 기술(예: 면역학적 기술, 하이브리드화 분석, 형광 영상화 기술 및/또는 방사선 검출 등) 뿐만 아니라 본 원에 기재된 임의 분석 및 검출 방법(예: 면역침전, 웨스턴-블롯 분석 등)을 이용하여 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)을 검출할 수 있다. 예를 들어, ARF-BP1 저해제를 이용하여 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수 있다. 본 원에 사용된 "저해제"란 해당 표적(예: ARF-BP1)에 결합하거나, 이를 저해하거나 이를 지향하는 친화성을 가지는 약제를 의미한다. 본 원에 사용된 "약제"는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 분자, 화합물, 항생제, 약물 및 이들의 임의 조합을 포함할 것이다. Fab 단편은 파파인 소화에 의해 생성되는 항체의 일가 항원-결합 단편이다. F(ab')2 단편은 파파인 소화에 의해 생성되는 항체의 이가 항원-결합 단편이다. 바람직하게, 본 발명의 약제는 검출가능한 마커 또는 라벨로 표지된다.
본 발명의 일 구체예로, ARF-BP1 저해제는 항체이다. 본 원에 사용된 본 발명의 항체는 폴리클로날 혹은 모노클로날일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 당업자들에 공지된 기술로 생성될 수도 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 정제된 단백질(예: ARF-BP1)로 마우스, 토끼 또는 래트를 면역화하여 생성시킬 수 있다. 이어서, 면역화 마우스로부터 비장을 제거하고, 비장 세포를 골수종 세포에 융합하여 하이브리도마를 형성한 후, 배지에서 증식시켜 모노클로날 항체를 생성할 수도 있다.
본 원에 사용된 항체는 검출가능한 마커 또는 라벨로 표지될 수 있다. 항체의 표지는 퍼옥시다제, 당업계에 공지된 화학발광 표지 및 당업계에 공지된 방사능 라벨을 비롯한 다양한 표지 방법중 한 방법으로 실시될 수 있다. 본 발명의 검출가능한 마커 또는 라벨은, 예를 들어, 당업계에 공지된 형광 및 다른 영상화 기술로 검출될 수 있는 비방사능 또는 형광성 마커, 예컨대 비오틴, 플루오레세인(FITC), 아크리딘, 콜레스테롤 또는 카복시-X-로다민일 수 있다. 또한, 검출가능한 마커 또는 라벨은 예를 들어, 방사성 동위원소를 포함한 방사능 마커일 수 있다. 방사성 동위원소는 검출가능한 방사선을 방출할 수 있는 임의의 동위원소, 예컨대 35S, 32P, 125I, 3H 또는 14C일 수 있다. 방사성 동위원소에 의해 방출된 방사능은 당업계에 널리 공지된 기술로 검출할 수 있다. 예를 들어, 감마 영상화 기술, 특히 섬광조영 영상화를 이용하여 방사성 동위원소로부터의 감마 방출을 검출할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 약제는 검출가능한 마커 또는 라벨로 표지된 고친화성 항체(예: α-ARF-BP1)이다.
본 발명의 약제가 ARF-BP1과 반응성이 있는 항체인 경우, 대상으로부터 취한 진단 샘플은 고체 지지체, 예컨대 비드, 겔 또는 플레이트 형태의 불용성 유기 중합체에 부착된 리간드로서 ARF-BP1 항체(예: α-ARF-BP1)를 함유하는 친화성 컬럼에 통과시켜 정제할 수 있다. 고체 지지체에 부착된 항체는 컬럼 형태로도 사용될 수 있다. 적합한 고체 지지체의 예로 아가로스, 셀룰로즈, 덱스트린, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 세파로스 또는 다른 불용성 유기 중합체가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 필요에 따라, ARF-BP1 항체(예: α-ARF-BP1)를 스페이서 분자를 통해 고체 지지체에 추가로 부착시킬 수도 있다. 항체 및 약제의 결합을 확인하기 위한 적절한 결합 조건(예: 온도, pH 및 염 농도)은 당업자들이 용이하게 결정할 수 있다. 바람직한 구체예로, ARF-BP1 항체(예: α-ARF-BP1)는 Sepharose 4B와 같은 세파로스 컬럼에 부착된다.
약제가 항체인 경우, 표준 면역학적 검출 기술과 함께 ARF-BP1과 면역반응성이 있는 하나 이상의 항체를 이용한 결합 연구를 이용하여 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수 있다. 예를 들어, 친화성 컬럼으로부터 용출된 ARF-BP1 단백질을 ELISA 어세이, 웨스턴-블롯 분석, 유세포 분석 또는 항원-항체 상호작용을 이용하는 임의의 다른 면역염색 방법에 적용할 수 있다. 바람직하게, 진단 샘플은 웨스턴 블롯팅을 이용하여 ARF-BP1 발현에 대해 분석될 수 있다.
또한, 대상으로부터 취한 진단 샘플로부터 추출한 핵산을 하이브리드화 분석하여 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수도 있다. 이러한 본 발명의 방법에 따라, 하이브리드화 분석을 mRNA의 노던-블롯 분석으로 수행할 수 있다. 이 방법은 또한 ARF-BP1을 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 하나 이상의 핵산 프로브를 이용하여 DNA의 서던-블롯 분석으로도 수행할 수 있다. 핵산 프로브는 ARF-BP1 핵산의 제한 효소 소화; 및 상업적으로 입수가능한 올리고뉴클레오티드 합성기, 예컨대 Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA 합성기를 이용하여 ARF-BP1 핵산의 뉴클레오티드 서열의 선택 부분에 상응하는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 자동 합성하는 방법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 당업자들에게 공지된 다양한 기술로 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 또는 ARF-BP1-ARF 상호작용)의 검출에 이어 대상의 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현 정도를 측정하거나 정량하기 위한 분석이 수행될 수도 있다. 이러한 분석은 당업자들에게 널리 공지되었으며, ARF-BP1 단백질의 양을 측정하기 위한 면역조직화학/면역세포화학, 유세포 분석, 질량 분석, 웨스턴-블롯 분석 또는 ELISA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역조직화학 분석을 이용하기 위하여, 조직의 조직학적(파라핀-함침) 섹션을 슬라이드에 놓고 ARF-BP1에 대한 항체와 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 슬라이드를 염료 또는 비색 시스템(예: 플루오로크롬, 방사능 약제 또는 고전자 주사능이 있는 약제)으로 표지된 제 2 항체(제 1 항체에 대한 것)와 인큐베이션하여 이 섹션에 존재하는 ARF-BP1이 가시화하도록 할 수 있다.
본 발명에서 진단 샘플은 대상 또는 환자에 의하지 않거나, 자문 의사에 의하지 않거나, 실험실 기술자 또는 기타 임상의에 의하지 않은 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용)에 대해 분석될 것으로 구상된다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상 또는 환자의 자문 의사에게 대상 또는 환자의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하여 얻은 결과 보고서를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
유사하게, 본 발명은 대상이 신생물 형성에 결렸는지를 결정하는 방법으로서, 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하여 진단 대상에서 정상보다 높은 ARF-BP1 발현의 검출로서 대상이 신생물 형성으로 진단되는 방법을 제공한다. 상기 논의한 바와 같이, 암은 ARF-BP1, Mdm2 및/또는 p53 결손을 포함하여, p53 경로 결손과 관련된 암을 포함한다. 따라서, 일례로, 본 발명의 방법 및 조성물은 p53-관련 신생물 형성의 평가, 검출, 진단, 모니터 및 치료에 관한 것이다. 다른 구체예로, 본 발명의 방법 및 조성물은 p53 의존성 신생물 형성의 평가, 검출, 진단, 모니터 및 치료에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 상술한 바와 같이, ARF-BP1 단백질, ARF-BP1 cDNA, 또는 ARF-BP1 mRNA에 대해 분석하여 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수도 있다. 대상 또는 환자로부터 취한 특정 진단 샘플에 대해 예상되거나 정상 수준의 ARF-BP1 발현은 ARF-BP1과 관련하여 상술한 바와 같이, 연령이 유사하고 성이 동일한 질환에 걸리지 않은 대상을 분석하여 용이하게 결정할 수 있다.
대상 또는 환자가 신생물 형성에 결렸는지를 결정하기 위하여, 임의 또는 모든 형태(전구체, 내단백질분해 처리된 형태 및 해독후 변형된 기타 형태)의 ARF-BP1 단백질 발현에 대해 진단 샘플이 분석될 수 있음이 구상된다. p53-ARF-BP1 상호작용 증가를 검출하여 진단 샘플이 정상보다 높은 p53 및 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현에 대해 분석될 수 있는 것도 또한 구상된다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로, 진단 샘플에서 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 상호작용의 검출로, 정상보다 높은 p53의 발현 및 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현이 진단 샘플에서 검출되는 것이 또한 구상된다. 또한, ARF-ARF-BP1 상호작용의 증가 검출에 의해 정상보다 낮은 ARF 및 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현에 대해 진단 샘플이 분석될 수 있는 것도 구상된다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로, 진단 대상에서 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 상호작용의 검출에 의해, 진단 샘플에서 정상보다 높은 p53 및 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현이 검출된다. 본 발명의 다른 구체예로, 진단 대상에서 정상보다 높은 ARF-ARF-BP1 상호작용의 검출에 의해, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF의 발현 및 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현이 검출된다.
대상의 진단 샘플이 본 원에 개시된 방법에 따라 ARF, ARF-BP1 발현 및/또는 p53-ARF-BP1 상호작용에 대해 분석될 수 있다. 당업계에 공지된 방법으로 용이하게 결정되는 분석 및 검출 방법 및 본 원에 개시된 임의의 분석 및 검출 방법을 이용하여 진단 샘플에서 p53 발현, ARF-BP1 발현 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용을 또한 검출할 수도 있다.
예를 들어, 대상으로부터 취한 진단 샘플로부터 추출한 핵산을 하이브리드화 분석하여 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수도 있다. 이 방법은 바람직하게는 ARF-BP1을 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 프로브를 이용한다. 일례로, 핵산 프로브는 검출가능한 마커 또는 라벨로 표지된다. 달리, ARF-BP1과 반응성이 있는 약제를 이용하여 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수도 있다. 바람직하게, 본 발명의 약제는 검출가능한 마커 또는 라벨로 표지된다. 본 발명의 일 구체예로, ARF-BP1과 반응성이 있는 약제는 항체(예: 항-ARF-BP1 모노클로날 항체)이다.
본 발명의 약제가 ARF-BP1과 반응성이 있는 항체인 경우, 대상으로부터 취한 진단 샘플은 ARF-BP1을 검출하기 위한 상술된 기술에 따라, 고체 지지체, 예컨대 비드, 겔 또는 플레이트 형태의 불용성 유기 중합체에 부착된 리간드로서 항-ARF-BP1 항체를 함유하는 친화성 컬럼에 통과시켜 정제할 수 있다. 또한, 약제가 항-ARF-BP1 항체인 경우, ARF-BP1과 관련하여 본 원에 기술된 바와 같이, 표준 면역학적 검출 기술과 함께 ARF-BP1과 면역반응성이 있는 하나 이상의 항체를 이용한 결합 연구를 이용하여 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석할 수 있다.
본 발명의 방법에서 ARF-BP1 발현 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용 및/또는 p53-ARF-BP1 상호작용의 검출에 이어 대상의 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현 및/또는 ARF-ARF-BP1 또는 p53-ARF-BP1 상호작용 정도를 측정하거나 정량하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대상 또는 환자의 자문 의사에게 대상 또는 환자의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현, ARF-ARF-BP1 상호작용 및/또는 p53-ARF-BP1 상호작용에 대해 분석하여 얻은 결과 보고서를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 신생물 형성에 대한 치료를 받았거나 받고 있는 대상에서 신생물 형성 치료 요법의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 대상 또는 환자의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하여 정상 수준의 ARF-BP1 발현이 신생물 형성을 치료하는데 성공적인 요법의 지표가 되고, 정상보다 높은 ARF-BP1 발현은 신생물 형성을 치료하기 위해 지속적인 치료를 요하는 지표가 되는 방법을 포함한다. 본 발명의 일 구체예로, 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 또는 ARF-ARF-BP1 상호작용이 검출됨으로로써 ARF-BP1 발현이 정상보다 높은 것으로 검출된다. 신생물 형성은 p53-의존성 및 p53-비의존성 신생물 형성을 포함하여 상술된 임의의 것일 수 있다. 진단 샘플은 상술된 바와 같이 조직 또는 체액일 수 있으며, 시험관내 또는 생체내로 ARF-BP1의 발현(또는 p53-ARF-BP1 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)에 대해 분석될 수 있다. 또한, 진단 샘플은 다양한 모든 분석법 및 상술된 검출 및 정량 방법을 이용하여 ARF-BP1의 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)에 대해 분석될 수 있다. 이러한 본 발명의 방법은 대상 또는 환자로부터 취한 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준을 정기적으로 평가하여 신생물 형성 치료 요법의 효능을 모니터하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라, 신생물 형성 치료 요법을 개시한 후 임의 시점에 대상 또는 환자의 진단 샘플이 분석될 수 있고, ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)의 수준이 평가될 수도 있다. 예를 들어, 대상 또는 환자가 신생물 형성의 치료를 받고 있는 중에도 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준이 평가될 수 있다. 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 검출된 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준이 정상 보다 높은 수준으로 유지되는 경우, 의사는 대상 또는 환자에 대한 신생물 형성 치료를 계속할 수도 있다. 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 분석된 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준이 연속 평가를 통해 감소되는 경우, 이는 신생물 형성에 대한 치료가 수행되어 치료를 감소시킬 수 있거나 심지어 중단할 수도 있는 지표가 될 수 있다. 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 분석된 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준이 연속 평가를 통해 신속히 감소되지 않는 경우, 이는 신생물 형성에 대한 치료가 수행되지 않아 치료를 계속하여야 한다는 지표가 될 수 있다. 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)이 정상보다 높은 수준으로 더 이상 검출되지 않으면, 의사는 신생물 형성에 대한 치료가 성공적이었고 이러한 치료를 중단할 수 있다고 판단할 수 있다.
신생물 형성이 대상 또는 환자에서 재발되었는지를 결정하기 위하여, 신생물 형성에 대한 대상 또는 환자의 치료 종결후 ARF-BP1 발현 수준을 평가하는 것이 본 발명의 범주에 속한다. 따라서, 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준 평가는 신생물 형성으로 진단된 환자를 추적 조사하는데 편리한 방법을 제공하기도 한다. 또한, 임상 또는 병리 단계의 결정 수단, 대상 또는 환자에서 신생물 형성 정도를 결정하기 위한 수단 및 적절한 치료를 선택하기 위한 수단으로서, 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준 평가를 이용하는 것도 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명은 또한 신생물 형성에 대한 치료를 받았거나 받고 있는 대상에서 신생물 형성 치료 요법의 효능을 평가하는 방법으로서, 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하여 진단 샘플에서 정상의 ARF-BP1 발현 검출이 신생물 형성을 치료하는데 성공적인 요법의 지표가 되고, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1 발현은 신생물 형성을 치료하기 위해 지속적인 치료를 요하는 지표가 되는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구체예로, 진단 샘플에서 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 상호작용의 검출로 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현이 정상보다 높은 것으로 검출된다. 신생물 형성은 p53-의존성 및 p53-비의존성 신생물 형성을 포함하여 상술된 임의의 것일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 진단 샘플, 분석법, 검출 및 정량 방법은 상술된 바와 같다.
일반적으로 종양 적재량과 암에 걸린 환자의 생존율에는 상관관계가 있다. 따라서, 본 발명에서는 대상의 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 것이 신생물 형성에 걸린 대상 또는 환자의 예후에 대한 정보를 제공하는데 유용한 수단일 수 있음이 또한 구상된다. 따라서, 본 발명은 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 것을 포함하여, 신생물 형성에 걸린 대상의 예후를 평가하는 방법을 추가로 포함하며, 여기에서는 대상의 진단 샘플에서 ARF-BP1의 발현 감소가 대상의 예후를 개선한 것이고, 진단 샘플에서 ARF-BP1의 발현 증가가 대상의 예후를 악화시킨 것이다. 본 발명의 일 구체예로, 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 상호작용의 검출에 의해 ARF-BP1 발현이 정상보다 높은 것으로 검출된다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 진단 샘플, 분석법, 검출 및 정량 방법은 상술된 바와 같다. 본 발명의 방법은 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준에 기초해 신생물 형성으로 진단된 대상 또는 환자의 예후를 결정하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라, 대상 또는 환자에서 신생물 형성의 진단동안 또는 진단후 임의 시점에 대상 또는 환자의 진단 샘플을 분석하고 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준을 평가할 수 있다. 예를 들어, 대상 또는 환자의 초기 예후를 결정하기 위하여, 대상 또는 환자가 신생물 형성에 대한 치료를 받기 전에 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준을 평가할 수 있다. 또한, 치료 과정중에 대상 또는 환자의 예후가 보다 호전되었는지 혹은 악화되었는지를 결정하기 위하여, 대상 또는 환자가 신생물 형성에 대한 치료를 받고 있는 동안에 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준을 평가할 수도 있다.
예로서, 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 검출된 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용) 수준이 상당히 높은 수준으로 유지되는 경우, 의사는 대상 또는 환자의 예후가 호전되지 않았다고 판단할 수 있다. 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)이 연속 평가를 통해 감소한 경우, 이는 대상 또는 환자의 예후가 개선되었다는 지표일 수 있다. 대상 또는 환자의 분석 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)이 연속 평가를 통해 유의적으로 감소되지 않은 경우, 이는 대상 또는 환자의 예후가 개선되지 않았다는 지표일 수 있다. 마지막으로, 대상 또는 환자의 진단 샘플에서 ARF-BP1 발현(또는 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)이 낮거나 정상이라면, 의사는 대상 또는 환자의 예후가 호전되었다고 판단할 수 있다.
ARF-BP1이 신생물 형성을 발현하는 세포에서 검출될 수 있다는 발견은 신생물 형성에 걸린 환자를 확인하기 위한 수단을 제공하며, 신생물 형성 진단용의 형태로 상용화시킬 수 있다는 잠재성을 제공한다. 이러한 시험 개발이 일반적인 스크리닝 절차를 제공할 수 있었다. 이러한 절차는 신생물 형성, 신생물 형성전 또는 신생물 형성을 위한 유전 소인의 초기 검출 및 진단에 유용할 수 있으며, 정상 수준보다 높게 상승한 ARF-BP1 발현(p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용 포함)이 검출된 환자를 추적 조사하는 방법을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 ARF-BP1과 반응성이 있는 약제 및 ARF-BP1의 발현(및 p53-ARF-BP1 상호작용 및/또는 ARF-ARF-BP1 상호작용)을 검출하는데 적합한 시약을 포함하는 신생물 형성의 분석에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 (a) ARF-BP1과 반응성이 있는 적어도 하나의 약제; 및 (b) ARF-BP1의 발현을 검출하는데 적합한 시약을 포함하는, 신생물 형성을 검출하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 시약은 상술한 임의의 것일 수 있으며, ARF-BP1 발현, p53-ARF-BP1 상호작용 및 ARF-ARF-BP1 상호작용을 검출 또는 정량하기 위한 상술한 임의의 분석 또는 방법에 이용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 적어도 하나의 약제는 검출가능한 마커 또는 라벨로 표지된다.
상술한 바와 같이, 모든 암 사례에 있어서 50%가 넘게 p53 돌연변이와 관련이 있다. 따라서, p53은 많은 암을 치료하는데 중요하며, p53 경로가 특히 관심의 대상이다. p53은 일반적으로 안정하지 않은 단백질이다; 그의 반감기는 약 20분이며, 유비퀴틴화(유비퀴틴 결합)후 단백질-분해 경로에서 프로테오좀에 의해 매우 신속히 분해된다. p53의 안정화가 종양 억제인자로서 단백질 효능에 중요하다.
p53 경로 결손과 관련이 있는 일부 암은 p53 결핍에 의하지 않으며, 돌연변이화된 ARF-BP1(예: 코딩 영역에서 유전자 변형으로 야기된 돌연변이) 및/또는 발현 수준에 대한 ARF-BP1 조절 결핍(예: ARF-BP1 유전자의 프로모터 영역에서 유전자 변형으로 초래된 결핍)에 의한다. 상술한 내용에 비추어, 세포에서 ARF-BP1의 수준 조절은 p53의 종양 억제인자 기능을 증대시키고 이 기능에 ARF-BP1 자신의 종양 억제인자 활성을 보충하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 대상에서 ARF-BP1의 활성을 감소시키는 것을 포함하여, 치료를 요하는 대상에서 신생물 형성을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 신생물 형성은 p53 비의존성 및 p53-의존성 신생물 형성을 포함하여 상술한 임의의 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, ARF-BP1을 직접 표적으로 하여 대상에서 ARF-BP1의 활성을 감소시킬 수도 있다. 또한, 대상에서 ARF-BP1의 기능 또는 수준을 조절 또는 변조하는 효소 또는 다른 내인성 분자를 표적으로 하여 대상에서 ARF-BP1의 활성을 간접적으로 감소시킬 수도 있다. 본 발명의 방법에서 대상내 ARF-BP1 활성을 적어도 10% 까지 감소시키는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, ARF-BP1 활성은 적어도 20% 까지 감소된다.
예를 들어, 대상에서 ARF-BP1의 활성은 대상내 ARF-BP1의 하나 이상의 기능을 직 간접적으로 탈활성화, 저해, 결합 또는 중화(예: ARF-BP1과 상호작용하는 단백질의 변조 또는 조절에 의함)시킴으로써 감소시킬 수도 있다. 본 원에 사용된 "저해" 라는 용어는 대상에서 ARF-BP1의 기능, 특히 유비퀴틴화를 감소 또는 소멸시킴에 따라 p53를 탈안정화시킴을 의미한다. 본 발명의 방법에서, 예를 들어, 대상에 상기 정의된 바와 같은 ARF-BP1을 저해하거나 ARF-BP1과 반응성이 있는 소형 분자 또는 단백질 모방체를 투여하여 대상에서 ARF-BP1을 저해할 수 있다.
대상에서 ARF-BP1의 활성은 대상내 ARF-BP1 발현의 상향조절을 직 간접적으로 방해, 억제 또는 저해하여 감소시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로, 대상에서 신생물 형성을 치료하기에 유효한 양으로 ARF-BP1 발현 저해제를 대상에 투여하여, 대상의 ARF-BP1의 활성을 감소시킨다. 본 원에 사용된 "발현 저해제" 란 특정 단백질 발현시에 길항(저해) 또는 작용(도모) 효과를 제공하는 임의 약제 또는 약제 배합물일 수 있다. 따라서, 발현 조절제는 작용제 또는 길항제일 수 있다. 본 발명의 조절제는 임의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 분자, 화합물, 항생제, 약물 및 단백질 발현을 저해하거나 하향조절하는 대상 단백질(예: ARF-BP1)과 반응성이 있는 약제일 수 있다.
ARF-BP1 저해제는 간단한 스크리닝 분석으로 확인할 수 있다. 예를 들어, ARF-BP1의 후보 저해제를 스크리닝하기 위하여, 인간 폐 암종 세포(H1299)를 미량역가판에 플레이팅하고, 약물 라이브러리와 접촉시킬 수 있다. 그후, ELISA를 포함하여, 당업계에 공지된 핵산 하이브리드화 및/또는 면역학적 기술을 이용하여 ARF-BP1 발현의 임의 감소 또는 하향 조절을 검출할 수 있다. 당업계에 널리 공지되었거나 본 원에 기술된 스크리닝 절차를 이용하여 추가의 ARF-BP1 발현 저해제를 확인할 수도 있다. ARF-BP1 저해제는 ARF-BP1의 발현을 방해하거나 하향조절하는 약물일 것이다. 이러한 방식으로, 신생물내 세포 분열 또는 세포 성장 비율이 감소되거나 중지된 지표로서 후보 저해제가 또한 ARF-BP1 발현을 이용하여 신생물의 증식을 저해할 수 있는지에 대해서도 스크리닝될 수 있다.
신생물 형성 치료 효능을 증가시키고, 표적 효능을 증가시키며, p53 탈유비퀴틴화의 효능을 증가시키기 위하여, ARF-BP1 발현 저해제를 다른 약제에 결합시키거나, 다른 약제, 예컨대 항신생물 형성 약물 또는 리보자임과 함께 투여하는 것이 본 발명의 범주에 속한다. ARF-BP1 발현 저해제가 결합할 수 있는 항신생물 형성 약물의 예로서 카보플라틴, 시클로포스파미드, 독소루비신, 에토포사이드 및 빈크리스틴이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
대상내 ARF-BP1의 활성은 또한 대상내 ARF-BP1의 수준을 생체내에서 직 간접적으로 감소시킴으로써 대상에서 감소될 수도 있다. 예로서, 대상에서 신생물 형성을 치료하기에 유효한 양으로 ARF-BP1 결합-단백질을 대상에 투여하여 대상내 ARF-BP1의 수준을 감소시킬 수도 있다.
본 발명의 방법에 따라, ARF-BP1 저해제는 신생물 형성에 걸린 대상에 단독으로 혹은 신생물 형성을 치료하기 위해 사용되는 하나 이상의 항신생물 형성 약물과 함께 투여될 수 있다. ARF-BP1 결합 단백질이 결합할 수 있는 항신생물 형성 약물의 예로서 카보플라틴, 시클로포스파미드, 독소루비신, 에토포사이드 및 빈크리스틴이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서, ARF-BP1 발현 저해제, ARF-BP1 단백질 또는 ARF-BP1을 코딩하는 핵산 서열이 대상에서 신생물 형성을 치료하기에 유효한 양으로 신생물 형성에 걸린 대상에 투여된다. 본 원에 사용된 "신생물 형성을 치료하기에 유효한" 이라는 문구는 신생물 형성으로 초래된 임상적 장애 또는 증상을 개선하거나 최소화하기에 유효함을 의미한다. 예를 들어, 대상이 겪고 있는 임의 통증 또는 불쾌감을 감소시키거나; 대상의 생존율을 이러한 치료를 수행하지 않을때 예상되는 것보다 연장시키거나; 신생물 형성의 발생 또는 확산을 저해 또는 방지하거나; 신생물내 세포의 돌연변이 및 증식을 제한, 중단, 중지 또는 제어함으로써 신생물 형성의 임상적 장애 또는 증상을 개선시키거나 최소화할 수 있다. 대상에서 신생물 형성을 치료하기에 유효한 ARF-BP1 발현 저해제, ARF-BP1 단백질 또는 ARF-BP1을 코딩하는 핵산의 양은 신생물 형성 타입, 신생물 형성 단계, 대상의 체중, 대상 증상의 중증도 및 투여 방법을 비롯한 각 사례의 특정 인자에 따라 달라질 것이다. 이들 양은 당업자들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, ARF-BP1 발현 저해제, ARF-BP1 단백질 또는 ARF-BP1을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물 대상에 경구 투여, 비경구 투여(예: 근막외, 낭내, 피내, 피부내, 근육내, 안와내, 복막내, 척수내, 복장내, 혈관내, 정맥내, 실질(parenchymatous) 또는 피하 투여), 경피 투여 및 삼투 펌프에 의한 투여를 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지된 절차에 따라 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방법은 비경구 투여, 정맥내 또는 피하 주사이다.
경구 투여의 경우, ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산 제형은 캅셀제, 정제, 산제, 과립제 또는 현탁물로 존재할 수 있다. 제형은 통상적인 첨가제, 이를테면 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분을 포함할 수도 있다. 제형은 또한 결합제, 이를테면 결정성 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아라비아 고무, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 함께 존재할 수도 있다. 또한, 제형은 붕해제, 이를테면 옥수수 전분, 감자 전분 또는 소듐 카복시메틸셀룰로스와 함께 존재할 수 있다. 제형은 또한 이염기성 무수 인산칼슘 또는 소듐 전분 글리콜레이트와도 존재할 수 있다. 마지막으로, 제형은 윤활제, 이를테면 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 함께 존재할 수도 있다.
비경구 투여의 경우, ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산은 대상의 혈액과 등장성인 것이 바람직한 무균 수용액과 배합될 수 있다. 이러한 제형은 고형 활성 성분을 생리 조건과 상용성인 완충 pH를 가지며 생리적으로 상용성인 물질, 예컨대 염화나트륨, 글리세린 등을 포함하는 물에 용해시켜 수용액을 제조한 후, 이 용액을 무균 상태로 만들어 제조할 수 있다. 제형은 단위 또는 다중 투여 용기, 예컨대 밀봉 앰풀 또는 바이얼로 제공될 수 있다. 제형은 또한 상술한 임의의 것을 비롯하여, 임의 주사 형태로 전달될 수도 있다.
경피 투여의 경우, ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산은 조절제, 단백질 또는 핵산의 피부 침투성을 증가시키고 조절제, 단백질 또는 핵산이 피부를 통해 혈류로 침투하도록 하는 피부 침투 증강제, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이소프로판올, 에탄올, 올레산, N-메틸피롤리돈 등과 배합될 수 있다. 증강제와 조절제, 단백질 또는 핵산의 조성물은 또한 조성물을 겔 형태로 제공하기 위하여 중합 물질, 예컨대 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 에틸렌/비닐 아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈 등과 더 배합될 수도 있으며, 용매, 예컨대 메틸렌 클로라이드에 용해후, 소정 점도가 되도록 증발된 다음, 지지 재료에 도포되어 패치제를 제공할 수 있다. 저해제, 단백질 또는 핵산은 대상의 신생물이 편재된 근처 또는 부위에 경피적으로 투여될 수도 있다. 달리, 저해제, 단백질 또는 핵산은 전신 효과를 이루기 위하여 비환부 영역에 경피적으로 투여될 수도 있다.
본 발명의 ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산은 또한 삼투성 미니-펌프 또는 다른 시-방출 장치로부터 방출되거나 전달될 수도 있다. 방출 오리피스에 배치된 미소다공성 신속 응답 겔로 기본 삼투성 미니-펌프로부터의 방출율을 조절할 수 있다. 삼투성 미니-펌프가 저해제, 단백질 또는 핵산의 방출을 조절하고 전달을 표적화하는데 유용할 것이다.
본 발명의 방법에서, ARF-BP1 발현 저해제가 단백질이거나, ARF-BP1 단백질이 선택한 치료제인 경우, 단백질을 코딩하는 핵산을 충분한 수의 대상 세포에 단백질이 대상에서 발현될 수 있는 방식으로 도입하여 단백질을 또한 대상에 투여하거나 도입할 수도 있다. 치료 단백질을 코딩하는 핵산의 양은 상술된 바와 같이 대상에서 신생물 형성을 치료하기에 유효한 양으로 단백질을 생산할 양이다. 이러한 양은 당업자들이 용이하게 결정할 수 있다.
ARF-BP1 발현의 임의 뉴클레오티드 조절제 뿐 아니라 ARF-BP1 단백질 또는 ARF-BP1 발현 저해제를 코딩하는 핵산은 모두 전기천공, DEAE 덱스트란 형질감염, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션, 단일양이온성 리포좀 융합, 다중양이온성 리포좀 융합, 프로토플라스트(protoplast) 융합, 생체내 전기장 발생, DNA-코팅 미소분출성 충격, 재조합 복제-결핍 바이러스 주입, 상동성 재조합, 생체내 유전자 요법, 생체외 유전자 요법, 바이러스 벡터 및 네이키드(naked) DNA 전달 또는 이들의 임의 조합이 예시되나 이들에 한정되지 않는 당업계에 공지된 통상적인 절차를 이용하여 대상에 도입될 수 있다. 유전자 요법에 적합한 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스, HSV, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 세밀리키 포레스트(Semiliki Forest) 바이러스, 거대세포바이러스 및 우두 바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터 유래된 벡터를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
ARF-BP1 발현 저해제를 코딩하거나 ARF-BP1 단백질 자체를 코딩하는 핵산을 통상적인 절차를 이용하여 시험관내로 적절한 세포에 도입하여 세포에서 치료 단백질의 발현을 제공할 수 있는 것이 본 발명의 범주에 포함된다. 이어서, ARF-BP1 단백질 또는 ARF-BP1 발현 저해제를 발현하는 세포를 대상에 도입하여 생체내에서 신생물 형성을 치료할 수 있다. 이와 같은 생체외 유전자 요법에서는, 세포를 대상으로부터 제거하여 치료 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하기 위한 DNA 기술에 적용한 후, 대상에 재도입하는 것이 바람직하다.
ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산을 함유하는 제제를 제약적으로-허용가능한 담체와 추가로 배합하여 제약 조성물을 포함하는 것도 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 따라서, 본 발명은 또한 ARF-BP1 발현 저해제, 또는 ARF-BP1을 코딩하는 핵산 서열 또는 ARF-BP1 단백질 및 제약적으로-허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물도 제공한다. 제약적으로-허용가능한 담체는 조성물의 다른 성분들과 상용성이고 그의 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능" 하여야 한다. 허용가능한 제약 담체의 예로는 다른 것 중에서도 특히 카복시메틸 셀룰로스, 결정성 셀룰로스, 글리세린, 아라비아 고무, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 메틸 셀룰로스, 분말, 염수, 알긴산나트륨, 수크로스, 전분, 활석 및 물이 포함된다. 제약 조성물의 제형은 편의상 단위 투여형으로 존재할 수 있다.
본 발명의 제형은 제약계에 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산을 담체 또는 희석제와 현탁물 또는 용액으로 배합할 수 있다. 임의로, 하나 이상의 보조 성분(예: 완충제, 향미제, 계면활성제 등)이 또한 첨가될 수도 있다. 담체의 선택은 투여 경로에 따른다. 제약 조성물은 신생물 형성을 치료하기 위해 본 발명의 ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산을 대상에 투여하는데 유용한 것이다. ARF-BP1 저해제, 단백질 또는 핵산은 제약 조성물이 투여되는 대상에서 신생물 형성을 치료하는데 유효한 양으로 제공된다. 이러한 양은 상술한 바와 같이 당업자들이 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 대상에서 p53 활성을 증가 또는 증진시켜 대상에서 신생물 형성을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서는 대상에서 ARF-ARF-BP1 또는 p53-ARF-BP1 상호작용을 저해함으로써 p53의 활성이 대상에서 증가되거나 증진된다. 바람직하게, 본 발명의 방법에서 대상내 p53 활성은 적어도 10% 까지 증가 또는 증진된다. 보다 바람직하게, p53 활성은 적어도 20% 까지 증가 또는 증진된다. 신생물 형성은 p53 상태와 무관하게 상술한 임의 것일 수 있다.
본 원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 ARF-BP1이 p53에 결합하여 유비퀴틴화하는지를 결정하기 위하여 친화성-정제된 p53-관련 인자를 질량 분석한다. ARF-BP1 저해는 과량의 Mdm2 존재하에서도 p53을 강력히 활성화시키며, p53-의존성 및 p-53 비의존성 세포 성장 억제 및 아폽토시스를 유도한다. 유의적으로, ARF-BP1은 시험관내 및 생체내 양자에서 p53을 특이적으로 유비퀴틴화하는 고유 효소 활성을 가진다. 이에 반해, 세포내 촉매적으로 불활성화된 ARF-BP1 점 돌연변이의 발현은 p53 유비퀴틴화의 감소된 수준을 증가시키고, p53을 안정화시킨다. 이러한 발견은 직접적인 탈유비퀴틴화에 의해 안정화될 수 있는 p53의 중요한 기전을 나타낸다. 전술한 내용에 비추어, 본 발명은 p53을 함유하는 세포에서 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 세포를 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화에 유효한 양으로 ARF-BP1 저해제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 대상에서 시험관내 또는 생체내로 p53을 탈유비퀴틴화하거나, p53으로부터 유비퀴틴을 제거하기 위해 사용될 수 있다. p53의 탈유비퀴틴화는 본 원에 기술된 임의 방법, 분자 절차 및 분석법을 비롯하여 공지된 절차로 검출할 수 있다. p53의 탈유비퀴틴화를 조절하기 위한 ARF-BP1 저해능은 상술한 바와 같이, ARF-BP1을 신생물 형성, 특히 p53-관련 신생물 형성 치료하는데 특히 유용하게 만든다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로, 대상은 신생물 형성에 걸린 인간이며, ARF-BP1이 저해됨에 따라 신생물 형성이 치료된다.
본 발명의 방법은 대상에서 시험관내 또는 생체내로 p53의 탈유비퀴틴화를 조절(즉, p53으로부터 유비퀴틴을 제거하거나, p53에 유비퀴틴을 첨가함으로써)하기 위해 사용될 수도 있다. 본 원에 개시된 바와 같이, p53의 탈유비퀴틴화가 증가하는 경우, p53 안정성도 또한 증가할 것이다. p53의 유비퀴틴화 및 탈유비퀴틴화는 본 원에 기술된 임의 방법, 분자 절차 및 분석법을 비롯하여 공지된 절차로 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 ARF-BP1-p53 상호작용을 억제할 수 있는 후보 약제의 능력을 평가하여 p53과 반응성이 있는 약제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 달리 명시되지 않으면, "p53"은 보존성 치환을 포함하는 p53 단백질(유전자은행 수탁번호 제CAA38095로) 및 p53 유사체 둘 다를 포함한다. "p53 유사체" 는 p53 단백질과 아미노산 서열이 60% 이상(바람직하게는 70% 이상) 일치하며 p53 생물학적 활성을 가지는 p53 단백질의 기능성 변이체이다. 본 원에 또한 사용된 "p53 생물학적 활성" 이란 친화성이 p53의 것과 상이하더라도, 본 원에 개시된 분석 조건하에서 ARF-BP1과 검출가능한 결합(즉, 음성 대조군의 백그라운드 결합에 약 2배, 보다 바람직하게는 약 5배 높은 결합)을 보이는 단백질 또는 펩티드 활성을 말한다.
일례로, 경쟁 결합 분석에서, p53에 대한 결합에 ARF-BP1을 대체하거나 치환하여 ARF-BP1과 p53의 상호작용을 저해하기 위한 후보 약제의 능력을 평가하는데 표준 방법론이 이용될 수 있다. 이러한 경쟁 결합 분석에서, 후보 약제는 p53과 결합하기 위하여 ARF-BP1과 경쟁하며, 일단 p53에 결합하면 p53에 대한 ARF-BP1의 결합을 입체적으로 방해할 수 있어서 ARF-BP1에 의한 p53의 유비퀴틴화를 방해하고, 달리말해 p53을 안정화시키게 된다. 경쟁 결합 분석은 p53 및 ARF-BP1을 함유하는 조 추출물의 사용을 가능하게 하기 때문에, ARF-BP1-p53 상호작용의 저해를 평가하기 위한 편리한 방법일 수 있다.
따라서, 본 발명은 (c) 후보 약제를 ARF, ARF-BP1 또는 p53을 함유하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계; 및 (d) 약제가 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 ARF, ARF-BP1- 또는 p53-관련 생물학적 사건에 효과가 있는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 본 원에 사용된 "ARF-BP1-관련 생물학적 사건"은 ARF-BP1 활성이 연루되는 생화학적 또는 생리적 과정을 포함한다(예: 신생물 형성). 본 발명의 일 구체예로, 예를 들어, 방법은 (c) 후보 약제를 하나 이상의 신생물 세포(종양 세포)와 접촉시키는 단계; 및 (d) 약제가 신생물 형성 세포 증식에 효과가 있는지를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 본 원에 또한 사용된 "ARF-BP1을 포함하는" 세포는 ARF-BP1, 또는 그의 유도체 또는 동족체가 자연 발현되거나 자연 발생하는 세포이다.
하기 재료 및 방법이 본 원에 개시된 데이터를 생성하는데 사용되었다.
플라스미드 및 항체
ARF-BP1의 cDNA를 클로닝하기 위하여, Marathon-Ready HeLa cDNA(Clontech, BD)로부터 전장 ARF-BP1을 커버하는 다섯개의 중복 cDNA 서열을 PCR로 증폭시키고, pcDNA3.1/V5-His-Topo 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 서열 확인후, cDNA 서열을 어셈블링하고, 발현 벡터에 추가로 클로닝하였다. 돌연변이 작제물(ARF-BP1(M), ARF-BP1(R), ARF-BP1M(R))의 작제를 위해, 상술한 작제물로부터 상이한 영역에 상응하는 cDNA 서열을 QuikChange 부위-지정 돌연변이 유발 키트(Stratagene)를 이용하여 PCR로 증폭시키고, 특이적 제한 효소를 이용하여 전장 ARF-BP1에 서브클로닝하였다. HA-ARF-Flag 작제물의 경우, HA 및 Flag 서열을 PCR에 의해 N 말단 및 C 말단 ARF에 각각 도입하고, pCIN4 벡터에 서브클로닝하였다. Flag-p53, GST-ARF 및 GST-Mdm2 벡터를 작제하기 위하여, 다른 발현 벡터로부터의 전장 단백질에 상응하는 cDNA 서열을 PCR로 증폭시키고, 박테리아 발현을 위해 pET-Flag 또는 pGEX(GST) 벡터중 어느 하나에 서브클로닝하였다(Li et al., 2003, 상기 참조). GST-ARF 돌연변이 작제물의 작제를 위해, ARF(wt) 작제물로부터 상이한 영역에 상응하는 cDNA 서열을 PCR로 증폭시켰다. 아데노바이러스-ARF의 작제를 위해, cDNA ARF를 먼저 pShuttle-IRES-hrGFP-1 벡터(Stratagene)에 클로닝하였다. 이어서, 얻은 플라스미드를 아데노바이러스 백본 플라스미드 pAdEasy-1을 함유하는 E. coli 균주 BJ5183에 재조합되도록 형질전환시켰다. 재조합 아데노바이러스 ARF의 증폭을 위해 AD-293 세포가 사용되었다.
ARF-BP1 항혈청의 제조를 위해, ARF-BP1의 191 아미노산(잔기 3435-3626)에 상응하는 DNA 서열을 PCR로 증폭시키고, pGEX-2T에 서브클로닝하였다(Luo, J. et al, Cell 107:137-48, 2001). 토끼에서 정제한 GST-ARF-BP1(3435-3626) 융합 단백질(Covance)에 대한 α-ARF-BP1 항혈청을 유도하고, 항원 컬럼에서 추가로 친화성-정제하였다. p53-특이적 모노클로날(DO-1) 및 폴리클로날(FL-393) 항체, 항-p21 폴리클로날, 항-Mdm2(SMP40) 모노클로날 항체, Myc 폴리클로날 항체는 산타 크루즈사(Santa Cruz)로부터 구입하였다. 항-GFP 모노클로날 및 항-GST 모노클로날 항체는 클론테크사(Clontech)로부터 구입하였다. 항-V5 모노클로날 항체는 인비트로겐사(Invitrogen)로부터 구입하였다. 마우스 모노클로날(4C6/4) p14ARF 및 토끼 폴리클로날 p14ARF(ab470) 항체는 앱캠사(Abcam)로부터 구입하였다.
인간 세포로부터 ARF-복합체의 정제
인간 세포로부터 ARF-함유 단백질 복합체를 단리하기 위한 에피토프-표지 전략을 실질적으로 전술한 내용 일부를 변형하여 수행하였다(Luo, J. et al., Nature 408:377-81, 2000; Nikolaev, A.Y. et al, Cell 112:29-40, 2003). 요약하면, HA-ARF-Flag 발현 세포주를 수득하기 위하여, p53 널 H1299 세포를 pCIN4-HA-ARF-Flag로 형질감염시키고, 1 mg/ml G418(GIBCO)에서 2주간 선별하였다. 표지된 ARF 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 검출하였다. H1299 세포내 이소 ARF 단백질의 발현 수준이 내인성 단백질 수준과 매우 밀접하다는 사실에 기초해, 안정한 세포주를 선택하여 복합체 정제를 위해 팽창시켰다. 이에 따라, 세포를 10% 소태아 혈청을 첨가한 DMEM에서 배양하고, 컨플루언스(confluence) 시점에 수거하였다. 세포 펠렛을 완충액(10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, ImM DTT, 0.5 mM PMSF 및 단백질 저해제 혼합물[Sigma])에 재현탁시켰다. 세포를 얼음상에서 15분간 팽창시킨 후, 10% NP 40(Fluka)을 최종 농도가 0.5%가 될 때까지 첨가하였다. 튜브를 1분동안 격렬히 와동시켰다. 균질물을 4,000 rpm에서 10분동안 원심분리하였다. 핵 펠렛을 빙냉각 완충액 C(20 mM HEPES pH 7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF 및 단백질 저해제 혼합물)에 재현탁시키고, 튜브를 4℃에서 45분동안 격렬히 흔들어 주었다. 핵 추출물을 완충액 D(20 mM HEPES[pH 7.9], 1 mM EDTA)로 100 mM의 최종 NaCl 농도가 되도록 희석하고, 4℃에서 2시간동안 25,000 rpm으로 초원심분리하였다. 0.45 /㎛ 시린지 필터(NALGENE)로 여과한 후, 상등액을 항-FLAG 항체-콘쥬게이트 아가로스(Sigma)에 의한 M2 면역침전의 핵 추출물로 사용하였다. 결합된 폴리펩티드를 FLAG 펩티드로 용출시키고, 항-HA 항체-콘쥬게이트 아가로스(Sigma)에 의해 더 친화성 정제하였다. HA 펩티드를 가지는 HA-비드로부터의 최종 용출물을 은 염색 또는 콜로이드성-청염색 분석을 위해 4%-20% 구배 겔(Novex) 상에서 SDS-PAGE로 분할하였다. 겔로부터 특이적 밴드를 분리하여 질량 분석 펩티드 시퀀싱에 적용하였다.
P53-널 세포 및 p53 발현 세포에서 RNAI에 의한 내인성 ARF-BP1의 제거
p53-널 세포주(H1299 및 Saos-2) 및 p53-발현 세포(U2OS, MCF-7 및 A549)를 10% 소태아 혈청을 첨가한 DMEM 배지에서 유지시켰다. 비. 볼게스타인(B. Vogelstein) 실험실에서 HCT116 및 HCT116-p53(-/-) 세포주를 기꺼이 제공하였다. 내인성 ARF-BP1의 RNAi-매개 제거를 실질적으로 상술한 바와 같이 수행하였다(Elbashir, S.M. et al, Nature 411:494-498, 2001). ARF-BP1 mRNA(ARF-BP1 #1)[AAUUGCUAUGUCUCUGGGACA(서열 번호 18)] 또는 (ARF-BP1 #2)[AAGUAUCCCUACCACCUCAUG (서열 번호 19)]에 상응하는 3'dTdT가 돌출된 21-뉴클레오티드 siRNA 듀플렉스를 합성하였다(Dharmacon). 두개의 뉴클레오티드가 상이한[AAUUGCCAUGUAUCUGGGACA (서열 번호 20)] 동일 서열(ARF-BP1 #1 돌연변이)을 특이적 RNAi 대조군으로 사용하였다. 서열[AAGAGGACUCCGCUACUGACA (서열 번호 21)]을 MEF 세포에 대한 마우스 ARF-BP1 RNAi로 사용하였다. 서열 AAGGUGGGAGUGAUCAAAAGG(서열 번호 22)를 Mdm2 RNAi를 위해 사용하였다. RNAi 형질감염을 올리고펙타미드 시약(Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 24시간전에, 약 백만개의 세포를 10 cm 디쉬에 플레이팅하였다. 세포를 제조업자의 설명서(Invitrogen)에 따라 24-48 시간 간격으로 형질감염시켰다. 최소 3회 연속 형질감염시킨 후, 세포를 웨스턴 블롯 분석, 유세포 분석, 세포수 계수 또는 면역염색을 위해 수거하였다.
BRDU 표지
BrdU 도입 분석을 실질적으로 상술한 바와 같이 수행하였다(Yarbrough, W.G. et al, Cancer Res 62: 1171-7, 2002). 요약하면, 세포를 20 g의 BrdU(Calbiochem)를 함유하는 배지에서 2시간동안 배양하고, 70% 에탄올에 고정시켰다. DNA를 변성시키고, 세포를 2N HCl, 0.5% Triton X-100(Sigma)에 침투시킨 후, 0.1M Na2B4O7(pH 8.5)으로 중화시킨 다음, PBS중 1% BSA로 봉쇄하였다. 항-BrdU를 제조자의 설명서(Amersham)에 따라 첨가하였다. 1% BSA/PBS로 세척한 후, 세포를 Alexa488 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG(Molecular Probes)와 인큐베이션하였다. 마지막으로, 세포를 DAPI로 대조염색하여 핵을 가시화하였다.
시험관내 유비퀴틴화 반응을 위한 성분들의 단백질 정제
시험관내 유비퀴틴화 분석을 위한 정제된 성분들을 제조하기 위하여(Li et al, 2003, 상기 참조), Flag-p53, E3(GST-ARF-BP1 3760-4374) 및 GST-ARF를 Rosetta(DE3) pLys(Novagen) 세포에서 실온으로 유도하고, 단백질을 1% NP-40을 함유하는 완충액 BC500(20 mM Tris-HCl, pH 7.3, 0.2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mM DTT 및 0.5 mM PMSF)으로 추출한 후, 글루타치온-세파로스(Pharmacia) 또는 M2 비드(Sigma) 상에서 정제하였다. 토끼 E1을 칼비오켐사(Calbiochem)로부터 입수하였다. 토끼 E2 및 His-Ub는 어피니티사(Affinity Inc.)로부터 정제 단백질로서 입수하였다.
시험관내 유비퀴틴화 분석
시험관내 유비퀴틴화 분석을 상술한 내용을 일부 변형하여 수행하였다(Li et al, 2003, 상기 참조). 자가 유비퀴틴화 분석의 경우, 200 ng의 박테리아에 의해 생산된 GST-ARF-BP1(3760-4374) 또는 그의 ca 돌연변이를 10 ㎕의 반응 완충액(40 mM Tris, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 2 mM DTT, pH 7.6)에서 E1(10 ng), E2(His-UbcH5a, 100 ng) 및 5 ㎍의 His-유비퀴틴(친화성)을 포함하는 다른 성분들과 혼합하였다. 400 ng의 박테리아에 의해 생산된 GST-ARF 또는 GST-ARF 돌연변이 단백질을 저해제로 첨가하였다. 37℃에서 60분후 SDS 샘플 완충액을 첨가하여 반응을 중단시키고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 SDS-PAGE 겔로 분할하였다.
p53 유비퀴틴화의 경우에는, 20 ng의 박테리아에 의해 생산된 Flag-p53을 10 ㎕의 반응 완충액(40 mM Tris, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 2 mM DTT, pH 7.6)에서 E1(100 ng), E2(His-UbcH5a, 1 ㎍), E3(박테리아에 의해 생산된 GST-ARF-BP1(3760-4374)(400 ng) 및 20 ㎍의 박테리아에 의해 생산된 His-HA-유비퀴틴을 포함하는 다른 성분들과 혼합하였다. 1 ㎍의 박테리아에 의해 생산된 GST-ARF 또는 GST-ARF 돌연변이 단백질을 저해제로 첨가하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후, 500 ㎕의 Flag 용해 완충액 첨가에 이어 15 ㎕의 항-FLAG 항체-콘쥬게이트 아가로스를 첨가하고, 4℃에서 밤새 회전시켰다. 용출물을 항-p53(DO-1) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
본 발명이 이하 실시예로 보다 상세히 설명될 것이나, 이는 설명을 위한 것이며 한정적인 것으로 해석하여서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는 p-53-널 세포로부터의 ARF-관련 핵 복합체 주 성분으로 ARF-BP1이 확인된 것을 예시한다.
ARF-매개 기능에 대한 생체내 표적을 확인하기 위하여, 에피토프 표지 절차를 이용하여 인간 세포로부터 ARF-함유 단백질 복합체를 단리하였다. 이 방법은 HDACI 및 p53 복합체 등의 단백질 복합체를 정제하기 위해 본 발명자에 의해 개발되었으나(Gu, W., Malik, S., Ito, M., Yuan, C.X., Fondeil, J.D., Zhang, X., Martinez, E., Qin, J., Roeder, R.G., Mol Cell 3:97-108, 1999; Luo, J., Su, P., Chen, D., Shiloh, A., Gu. W. Nature 408:377-81, 2000; Nikolaev, A. Y., Li, M., Puskas, N., Qin, J., Gu, W., Cell 11:29-40, 2003); 단백질 복합체의 화학양론을 개선하도록 일부 변형이 이루어졌다. 특히, N-말단 HA- 및 C-말단 FLAG 에피토프를 함유하는 이중-표지된 인간 ARF 단백질을 안정하게 발현하는 인간 폐 암종 p53-널 H1299 세포주의 유도체가 생성되었다(HA-ARF-Flag(도 1A)). ARF를 과발현하는 세포에서 일어날 수도 있는 비생리적 상호작용을 방지하기 위하여, 내인성 ARF의 것과 유사한 수준으로 이소 ARF 단백질을 발현하는 H1299 유도체(도 IB)가 사용되었다. 따라서, 표지된 단백질 복합체는 내인성 ARF 복합체의 고유 상태를 나타내었다.
ARF를 함유하는 단백질 복합체를 단리하기 위하여, HA-ARF-Flag 발현 H1299 세포 및 대조 세포(부모 H1299)로부터의 핵 추출물을 먼저 M2(Flag 항체) 아가로스 비드상에서 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 결합 단백질을 FLAG 펩티드와 용출시키고, 용출물을 HA-친화성 컬럼상에서 크로마토그래피하였다. 마지막으로, 결합 단백질을 HA 펩티드를 이용하여 컬럼으로부터 용출시키고, SDS-PAGE에 의해 분획화한 후, 은 염색(도 1C)하여 가시화하였다. 복합체로부터 공지 ARF-결합 단백질인 B23/네클레오플라스민(NPM)이 확인되었다(도 1C). 예기치않게, ~500 kDa(p500)의 주 단백질 밴드가 또한 HA-ARF-Flag-발현 H1299 세포(레인 2)로부터 ARF와 공-정제되었으나, 부모 H1299 세포(레인 1)로부터는 정제되지 않았으며, 이는 이 단백질이 ARF의 특이적 결합 파트너임을 제시하는 것이다. 이 단백질을 ARF-BP1(ARF-결합 단백질 1)으로 지정하였다. 이들 복합체에서 웨스턴 블롯 분석에 의한 유의적인 수준의 Mdm2는 검출되지 않았으며, ARF와 공-정제된 추가의 소수 밴드를 질량 분석하였으나(도 1C) Mdm2 서열을 확인하지는 못했다. 따라서, 이들 데이터는 ARF-BP1이 상기 세포에서 ARF-관련 복합체의 주 성분임을 제시한다.
실시예 2
본 실시예는 신규 유비퀴틴 E3 리가제로서 ARF-BP1의 초기 특성화를 예시한다.
질량 분석에 의한 ARF-BP1 밴드의 펩티드 시퀀싱으로 유전자 은행 데이터베이스(수탁번호 Gi 22090626)내 단일 부분 cDNA 클론과 매치하는 두개의 펩티드 서 열을 밝혀냈다. UREB1으로 명명한 이 단백질의 소 단편(상류 개시제-유사 서열 결합 단백질 1)이 본 발명의 발명자에 의해 프레프로디노르핀 유전자 프로모터의 결합 단백질로서 최초 확인되었으나, 그의 생물학적 기능은 아직 공지된 바가 없다(Gu, J., Ren, K., Dubner, R. and Iadarola, M.J., Brain Res Mol Brain Res. 24:77-88, 1994).
전장 인간 ARF-BP1 cDNA를 RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭) 및 인간 데이터베이스내 부분 cDNA 서열과의 상동 정렬에 의해 어셈블링하였다. 인간 ARF-BP1 cDNA는 4374 아미노산 단백질을 코딩하고(도 2A 및 3), ARF-BP1의 전장 단백질은 공개된 UREB1 서열보다도 3000 아미노산이 더 길다(Gu et al, 1994, 상기 참조). 서열 번호 1은 인간 ARF-BP1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다(도 2A). 서열 번호 2는 인간 ARF-BP1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다(도 3).
ARF-BP1의 C-말단 서열은 다수의 유비퀴틴 E3 리가제에 공통되는 시그니처 모티프(HECT 도메인)를 가진다(도 2A 및 2B). 약 350개의 보존 아미노산을 공유하는 HECT 도메인은 Ub와 촉매적 티올 에스테르를 형성하는 Cys 잔기를 가지며, 진정한 E3 리가제 효소 모티프로 간주된다. ARF-BP1은 또한 DNA 복구 단백질 Rad23 또는 Cb1 유비퀴틴 리가제 등의 유비퀴틴화 경로에 연루된 다양한 단백질에서 발견되는 소형 서열 모티프로서 유비퀴틴 관련 도메인(UBA)(도 2 및 4)을 함유한다(Hicke, L. and Dunn. R., Annu Rev Cell Dev Biol 19:141-172, 2003; Buchberger, A., Trends in Cell Biol. 12:216-221, 2002). 노던 블롯 분석은 ARF-BP1 mRNA가 상이한 타입의 인간 조직에서 도처에 발현됨을 보여준다(도 2C).
실시예 3
본 실시예는 ARF-BP1이 시험관내 및 생체내 둘다에서 ARF와 상호작용함을 예시한다.
ARF와 ARP-BP1 사이의 물리적인 상호작용을 확인하기 위하여, ARF에 대한 ARP-BP1의 시험관내 결합을 평가하였다. ARF 폴리펩티드를 다음과 같은 두 주요 기능성 도메인으로 대략적으로 분할할 수 있다: ARF-매개 p53 활성화뿐 아니라 p53-비의존성 ARF 기능에 중요한, 유일 1β 엑손에 의해 코딩되는 N-말단 영역(N-ARF: 잔기 1-64) 및 인간과 마우스 대응물에서 보존되지 않고 기능이 불명확한 C-말단 영역(C-ARF:잔기 65-132). 도 5A에 예시된 바와 같이, ARB-BP1의 N-말단 1014 잔기를 포함하는 폴리펩티드인 35S-표지 ARF-BP1(1-1014)은 고정 GST-ARF(레인 7-9)와 연관되지 않는다. 그러나, 이에 반해, 35S-표지 ARF-BP1(1015-4574)은 전장 ARF(GST-ARF, 레인 3) 및 N-말단 ARF 도메인(GST-N-ARF, 레인 5) 둘 다에 강력히 결합하나, C-말단 ARF 도메인(GST-C-ARF, 레인 6) 또는 GST 단독(레인 2)에는 그렇치 않다. 흥미롭게도, ARF-BP1은 ARF 돌연변이에 약하게 결합하며(GST-ARF△1-14; (레인 4)), 이는 최초 14 아미노산 결실을 상당히 보상하나, ARF 및 ARF-BP1 상호작용을 완전히 제거하지는 못한다는 것을 나타낸다.
생체내 ARF와 ARF-BP1의 상호작용을 확인하기 위하여, 친화성-정제된 폴리클로날 항혈청을 공지된 임의 단백질과 상동성을 보이지 않는 영역인 ARF-BP1의 191 아미노산 세그먼트(잔기 3435-3626)에 대해 유도하였다. 웨스턴 블롯 분석시에, 이 항체는 인간 세포에서 ARF-BP1 폴리펩티드를 특이적으로 검출하였다(레인 1, 도 5B). 내인성 ARF-BP1 및 ARF 폴리펩티드의 상호작용을 조사하기 위하여, 자연 H1299 세포로부터의 세포 추출물을 α-ARF-BP1 또는 대조 IgG와 면역침전시켰다. 웨스턴 블롯 분석 결과는 이 항체가 내인성 ARF-BP1을 면역침전시킨 것으로 나타났다(레인 3, 상부 패널, 도 5B); 보다 중요하게, ARF는 명백히 α-ARF-BP1 항혈청으로 얻어진 면역침전에서 검출되었으나(레인 3, 하부 패널, 도 5B), 대조 IgG(레인 2, 하부 패널, 도 5B)에서는 검출되지 않았다. 반대로, 내인성 ARF-BP1은 ARF-특이적 항체와 신속하게 면역침전되나(레인 3, 도 5C), 대조 항체(레인 2, 도 5C)와는 그렇치 않다. 이들 데이터는 ARF 및 ARF-BP1이 시험관내 및 생체내에서 상호작용함을 제시한다.
실시예 4
본 실시예는 ARF-BP1의 HECT 도메인이 ARF에 의해 강력히 저해되는 유비퀴틴 리가제 활성을 가짐을 예시한다.
ARF는 Mdm2를 핵소체에 포획시켜 p53을 안정화시킬 수 있으며, 또한 Mdm2의 효소 활성을 직접 저해하여 p53을 안정화시킬 수도 있다. ARF가 또한 ARF-BP1의 유비퀴틴 리가제 활성을 저해할 수도 있는지를 조사하기 위하여, ARF-BP1을 정제 성분을 사용한 시험관내 분석에 따라 효소 활성에 대해 시험하였다. ARF-BP1의 HECT 도메인을 포함하는 GST-ARF-BP1(3760-4374) 폴리펩티드(도 3; 서열 번호 2)를 박테리아에서 발현시키고, 균질화에 가깝게 정제하였다. 도 5D에 예시된 바와 같이, GST-ARF-BP1(3760-4374)을 유비퀴틴, E1 및 E2(UbcH5c)의 존재하에 인큐베이션하는 경우 유비퀴틴-콘쥬게이트 형태의 ARF-BP1이 쉽사리 형성되었다(레인 2). 특히, 이러한 활성은 재조합 전장 ARF에 의해 강력히 나타났다(레인 3). 또한, 결합 결과와 일치하는 것으로(도 5A), C-말단 영역이 아닌, ARF의 진화적으로 보존된 N-말단 영역이 또한 ARF-BP1-매개 자동 유비퀴틴화를 저해하였다(레인 4, 5). 이들 데이터는 ARF가 ARF-BP1 유비퀴틴 리가제 활성의 강력한 저해제로 작용함을 제시한다.
실시예 5
본 실시예는 ARF-BP1의 불활성화가 p53-널 세포에서 세포 성장 억제를 유도함을 예시한다.
정상 세포에서는 ARF가 Mdm2 기능을 저해함으로써 p53을 안정화하고 활성화시키지만, ARF는 또한 p53-널 세포의 성장을 저해할 수도 있다. ARF가 ARF-BP1 기능을 저해하여 p53-비의존성 성장 억제를 유도하는지를 결정하기 위하여, 본 발명은 내인성 ARF-BP1의 불활성화가 또한 ARF 유도의 연상 방식으로 p53-널 세포에서 세포 성장을 억제하는지에 대해서도 조사하였다. p53-널 H1299 세포를 ARF-BP1-특이적(ARF-BP1-RNAi# 1) 또는 대조(GFP-RNAi) siRNA 중 어느 하나로 형질감염시켰다. 도 6A에 예시된 바와 같이, ARF-BP1-RNAi#1에 의한 3회 연속 형질감염후 내인성 ARF-BP1 폴리펩티드 수준이 현저히 감소하였다(상부 패널, 레인 3 vs. 레인 2). ARF-BP1 제거에 따라 p53의 두 전사 표적인 p21 및 Mdm2의 항정 상태 수준에는 변화가 없었다. 예기치 않게, ARF-BP1-RNAi 처리는 이들 세포의 성장 속도를 현저히 감소시켰으며(도 6B), 이는 ARF-BP1 불활성화가 세포 성장 억제를 유도함을 제시한다. 이들 세포에서 RNAi로 내인성 Mdm2 발현이 감소된 경우, 상기 세포는 다소 천 천히 성장하였다(도 6A, 6B). BrdU 도입을 모니터하여(도 6C), 본 발명자는 ARF-BP1 녹아웃이 p53-널 세포의 성장을 저해하나, Mdm2 녹다운은 이와 같은 성장을 적절히 촉진한다는 것을 알아냈다. 다른 p53-널 세포주(SaoS-2, 도 6D 및 6E) 및 상이한 영역의 ARF-BP1 mRNA를 인식하는 다른 siRNA(RNAi/ARF-BP1#2)(도 7A-D)에 의해 유사한 결과가 또한 얻어졌다. p53-널 세포에서 ARF-매개 세포 성장은 아직 특성화되지 않았으며, ARF 발현이 다수의 p53-널 인간 세포주에서 G2/M 정지를 유도한다는 증거가 있다(Normand, G. et al, 2005). H1299 세포에서 ARF-BP1 불활성화에 의해 매개되는 세포 성장 정지 특성을 분석하기 위하여, 이들 세포에서 ARF 발현 효과를 조사하였다. 도 8에 예시된 바와 같이, ARF 발현은 이들 세포의 G2/M 축적을 유도하나, 확실한 아폽토시스 세포(Sub-G1)는 관찰되지 않았다(iii vs i). 예기치 않게, 이들 세포에서 ARF-BP1 RNAi에 의한 ARF-BP1의 불활성화는 또한 유사한 수준으로 G2/M 정지를 야기한다(도 8). 이들 결과는 ARF-BP1의 불활성화가 이들 p53-널 세포의 성장을 ARF 도입 연상 방식으로 저해함을 보여준다.
실시예 6
본 실시예는 정상 세포에서 내인성 ARF-BP1의 불활성화가 p53을 안정화시키고 p53-의존성 아폽토시스를 유도함을 예시한다.
p53-양성 세포에서 ARF 및 ARF-BP1 상호작용의 역할을 추가로 밝히기 위하여, 야생형 p53을 발현하는 세포에서 ARF-BP1 불활성화의 작용 결과를 조사하였다. 인간 골육종 U20S 세포를 ARF-BP1-특이적 siRNA(ARF-BP1-RNAi#1) 또는 대조 siRNA (GFP-RNAi) 중 어느 하나로 형질감염시켰다. 예기치 않게, RNAi-매개 ARF-BP1 발현 녹다운은 내인성 p53의 항정 상태 수준을 증가시키고(도 9A), p53 폴리펩티드의 반감기를 연장시켰다(도 9B 및 10). ARF-BP1 불활성화에 의해 p53의 전사 표적인 p21 및 BAX의 발현이 강하게 유도되었다(도 9A). ARF-BP1 제거가 또한 세포 예정사를 유도하였으며; 도 9C에 도시된 바와 같이, ARF-BP1-RNAi#1로 처리된 U20S 세포의 32.3%가 아폽토시스를 입은 반면(II), 대조 형질감염 세포에서는 유의적인 아폽토시스가 관찰되지 않았다(I). 이들 데이터는 ARF-BP1의 불활성화가 p53을 안정화시키고, 그의 매개 기능을 활성화시킴을 보여준다.
Mdm2가 ARF-매개 p53 활성화에서 일차 표적으로 간주되면, 상기와 같은 결과는 기대할 수 없다. ARF-BP1 제거에 의해 유도되는 특이적 효과를 증명하기 위하여, 대조 실험을 행하였다.
상이한 영역의 ARF-BP1 mRNA를 인식하나(방법 참조), siRNA(ARF-BP1-RN Ai#1mut) 형태의 점 돌연변이를 갖지 않는(도 7D 및 11) 다른 ARF-BP1-특이적 siRNA(RNAi/ARF-BP1#2)를 사용하여, 내인성 ARF-BP1 단백질의 녹다운 수준을 평가하였다. 이들 세포에서 p53 수준이 상승하였다. MCF-7 인간 유방암종 세포(도 12), A549 인간 폐 선암종 세포(도 12) 및 정상 인간 섬유모세포(NHF-1)(도 13)를 비롯하여, 야생형 p53 기능을 소유하는 각종 상이한 세포주를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
ARF-BR-RN1-매개 효과의 특이성을 추가로 입증하기 위하여, 구조 실험을 실시하였다. RNAi#1 표적 영역에 점 돌연변이(ARF-BR1(R))를 함유하는 ARF-BP1에 대한 새로운 발현 벡터를 작제하였다(도 14). ARF-BP1 RNAi#1에 의한 효과를 위해 상 기 돌연변이를 면역화하였다. ARF-BP1의 유비퀴틴 리가제 활성에 대한 중요성을 밝히기 위해, HECT 도메인에서 보존 시스틴 잔기가 알라닌으로 대체된 다른 돌연변이(ARF-BP1 M(R))를 제조하였다(도 14A). 시험관내 유비퀴틴화 분석에 의해, HECT 도메인에서 상기 돌연변이가 ARF-BP1의 유비퀴틴 리가제 활성을 소멸시킨 것으로 확인되었다(도 14B).
"구조 실험"을 수행하기 위하여, ARF-BP1-RNAi#1에 의한 U2OS 세포내 RNAi 분석을 이용하였다. ARF-BP1 돌연변이(ARF-BP1(R)) 발현으로 구조를 시도하였다. 도 9D에 도시된 바와 같이, ARF-BP1 RNAi#1로 처리한 후, 내인성 p53은 안정화되었고, p21은 활성화되었다. ARF-BP1(R) 발현은 ARF-BP1 RNAi#1에 의해 유도된 p53 안정화 및 p21 유도 효과를 역전시켰다(레인 3 vs. 레인 2). 유사 수준으로 발현된 HECT 돌연변이 형태(ARF-BP1M(R))는 효과를 구조하는데 실패하였다(레인 4 vs. 레인 2)(도 9D). 이 접근법을 H1299 세포에서 p53-비의존성 기능을 위해 활용하였다. HECT 돌연변이 형태(ARF-BP1M(R))가 아닌 ARF-BP1(R)의 발현에 의해 ARF-BP1 RNAi#1 처리로 유도된 세포 성장 저해가 구조되었다. 이는 ARF-BP1-매개 기능에 ARF-BP1-RNAi 매개 효과의 특이성과 함께 유비퀴틴 리가제 활성의 중요성을 입증한다.
ARF-BP1의 상기 효과가 p53-의존성이라는 것을 확인하기 위하여, 야생형 p53을 발현하거나 발현하지 않는 한쌍의 유사 인간 직장결장 암종주에서 siRNA 분석을 수행하였다. 도 9E에 예시된 바와 같이, HCT116 부모 세포 및 HCT116 p53(-/-) 세포가 RNAi로 처리되는 경우, ARF-BP1 녹다운은 부모 세포에서 p53을 안정화시키고, p21을 유도하였으나, p53 널 세포에서는 그러하지 못했다. 이에 반해, c-Mye 및 액틴과 같은 대조 단백질 수준은 RNAi 처리에 영향을 받지 않았다. ARF-BP1 제거는 부모 HCT116 세포에서 아폽토시스를 유도하였으나, p53-널 HCT116 유도체에서는 그러하지 못했다(도 15). Mdm2가 p53의 전사 표적인 사실과 일치하여, 부모 세포에서 ARF-BP1의 불활성화로 Mdm2의 항정 수준이 또한 유도되었다. p53 널 세포에서 Mdm2 수준은 ARF-BP1 제거로 영향을 받지 않았으며(도 9E), 이는 ARP-BP1의 불활성화가 p53 안정화를 유도하나 Mdm2 안정화에는 효과가 없음을 제시한다. ARF-BP1 불활성화가 정상 세포에서 p53을 안정화시키고 활성화하는데 충분하다는 것이 입증됨으로써, 상기 데이터는 ARF/ARF-BP1 상호작용이 적어도 부분적으로 ARF에 유도된 p53 활성화에 기여함을 입증한다.
실시예 7
본 실시예는 ARF-BP1이 p53에 직접 결합하여 유비퀴틴화하고, p53의 ARF-BP1-매개 유비퀴틴화가 ARF에 의해 저해됨을 예시한다.
ARF-BP1이 ARF 부재하에 p53에 결합할 수 있는지를 결정하여 p53과 ARF-BP1 간의 기능 관계를 평가하였다. 도 16에 예시된 바와 같이, 35S-표지된 시험관내-해독된 ARF-BP1(1015-4374)은 고정 GST-p53 폴리펩티드에 강력히 결합하였으나, GST 단독에는 그러하지 못했다(레인 3 vs. 레인 2). 반대로, ARF-BP1 및 GST-Mdm2 사이에 유의적인 결합이 검출되지 않았다(레인 4).
인간 세포에서 내인성 p53과 ARF-BP1 단백질간의 상호작용을 조사하기 위하 여, U20S 세포로부터의 세포 추출물을 α-ARF-BP1 또는 대조 IgG 중의 어느 하나와 면역침전시켰다. 도 16B에 예시된 바와 같이, α-ARF-BP1 항혈청으로 얻은 면역침전물에서 항혈청 p53이 분명히 검출되었으나(레인 3), 대조 IgG와의 면역침전물에서는 검출되지 않았다(레인 2, 하부 패널). 반대로, 내인성 ARF-BP1은 p53-특이적 모노클로날 항체 DO-1과 용이하게 면역침전되었으나(레인 3, 도 17C), 대조 항체와는 그러하지 못했다(레인 2, 도 16C). 이 데이터는 p53이 직접 시험관내 및 생체내 둘 다로 ARF-BP1 단백질과 상호작용한다는 것을 보여준다.
ARF-BP1-매개 E3 유비퀴틴 리가제가 p53 분해에 관여하는지를 조사하기 위하여, Mdm2 부재하에서 p53 유비퀴틴화의 ARF-BP1 직접 유도를 모든 정제 성분을 사용하여 표준 시험관내 유비퀴틴화 분석으로 조사하였다. Flag-p53을 HA-표지 유비퀴틴(HA-Ub), E1 및 E2(UbcH5c)의 존재하에서 GST-ARF-BP1과 인큐베이션하였다. 반응의 유비퀴틴-콘쥬게이트된 p53 산물을 Flag/M2 비드로 면역침전시키고, p-53-특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 가시화하였다. 도 16D에 예시된 바와 같이, ARF-BP1에 의해 유비퀴틴화 p53가 고수준으로 생성되었다(레인 2). ARF의 존재하에서 ARF-BP1 매개 p53 유비퀴틴화가 강력히 억제되었다(레인 3). 도 5A에 예시된 결합 데이터와 일치하여, ARF(N-ARF)의 N-말단 영역은 ARF-BP1-매개 p53 유비퀴틴화를 완전히 저해한 반면, C-말단 영역(C-ARF)은 효과가 없었다(레인 4 및 5). 이들 데이터는 ARF-BP1이 p53에 대한 유비퀴틴 리가제이고, p53의 ARF-BP1 매개 유비퀴틴화가 ARF에 의해 억제됨을 입증한다.
실시예 8
본 실시예는 ARF-BP1이 Mdm2-널 세포에서 ARF-매개 p53 안정화에 중요하다는 것을 예시한다.
ARF-BP1은 Mdm2의 부재하에서 p53에 결합하여 유비퀴틴화시키기 때문에, ARF/BP1 상호작용이 p53을 Mdm2-비의존 방식으로 안정화시키는지를 평가하였다. ARF 발현이 Mdm2-널 세포에서 p53 안정화를 유도하는지를 결정하기 위하여, p53/Mdm2 이중-널 MEF 세포를 p53 단독, 또는 p53 및 ARF 둘 다를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 이들 세포에서 p53 단백질 수준이 ARF 과발현에 의해 유의적으로 상승하였으며(도 17A), 이는 ARF가 p53을 Mdm2-비의존 방식으로 안정화시킴을 제시한다.
ARF-BP1의 불활성화가 Mdm2-널 세포에서 p53을 안정화시키기에 충분한지를 조사하여 Mdm2의 부재하에서 p53 분해에 대한 내인성 ARF-BP1의 역할을 확인하였다. Mdm2/p53 이중 널 세포를 p53 발현 벡터 및 ARF-BP1 또는 Mdm2에 특이적인 siRNA로 공-형질감염시켰다. 세포에서 내인성 ARF-BP1 발현 제거는 p53를 현저히 안정화시켰다(도 17B 및 18A 및 B). Mdm2에 특이적인 siRNA는 Mdm2/p53-널 세포에서 p53 수준에 영향을 주지 않았으며(레인 3, 도 17B), 이는 ARF-BP1 불활성화에 의한 p53 안정화의 특이성을 입증하는 것이다.
ARF-BP1이 ARF에 의해 유도되는 Mdm2-비의존성 p53 안정화에 관여한다는 직접적인 증거를 제시하기 위하여, Mdm2-널 세포에서 ARF-매개 p53 안정화에 ARF-BP1이 필요한지를 조사하였다. p53/Mdm2 이중-널 세포를 ARF-BP1에 특이적인 siRNA 및 p53 및 ARF를 코딩하는 발현 벡터와 공-형질감염시켰다. 도 17C에 예시된 바와 같 이, ARF에 의해 유도된 p53 안정화가 ARF-BP1 녹다운 세포에서 감소된 것이 분명하였으며(레인 6-9), 이는 ARF-BP1이 이들 세포에서 ARF-매개 p53 안정화에 중요하다는 것을 보여준다. 이에 반해, ARF-매개 p53 안정화는 Mdm2 RNAi로 처리된 세포에서 그대로 남아 있었다(레인 2-5, 도 17C). 이러한 결과는 ARF-BP1이 p53의 ARF에 의해 매개된 Mdm2-비의존성 안정화에 중요하다는 사실을 제시한다.
실시예 9
본 실시예는 NPM/B23 단백질이 ARF-BP1 유비퀴틴 리가제 활성의 효소 표적이 아님을 예시한다.
최근의 몇몇 연구가 NPM/B23이 ARF에 의해 매개된 p53-비의존성 기능에 대한 주요 표적일 수도 있다고 제시하였다(Bertwistle et al., MCB 23:8097, 2004; Kuo et al., Genes Dev. 18:1862, 2004). 또한, 도 1C에 예시된 데이터는 NPM/B23이 ARF-관련 핵 복합체의 주요 성분임을 보여준다. ARF-BP1 상실이 p53 널 세포에서 세포 사이클을 어떤 방식으로 정지시키고, 그의 E3 활성에 다른 표적이 존재하는지, 그리고 ARF-BP1이 p53-비의존성 기능성 조절을 위해 NPM/B23의 분해를 유도하는지를 조사하기 위하여, 일련의 실험을 수행하였다. 결과를 도 21 및 22에 나타내었다. GST 풀-다운 어세이(도 22A)에 따라, NPM/B23은 ARF-BP1과 직접 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 공면역침전 분석을 이용하여 ARF-BP1과 NPM/B23 사이의 생체내 상호작용을 평가하여(도 22B), 웨스턴 블롯 분석에 따라 내인성 ARF-BP1이 B23으로 공면역 억제된 것으로 나타났다. Flag-B23의 발현 벡터를 293 세포에 형질감염시킨 후, B23 단백질을 M2-비드로 면역침전시켰다. NPM/B23이 ARF-BP1의 기질인 지를 조사하기 위하여, ARF-BP1의 효소 활성을 시험관내 분석으로 결정하였다. 박테리아에서 발현되고 균질화에 가깝게 정제된 NPM/B23 폴리펩티드를 유비퀴틴, E1 및 E2(UbcH5C)의 존재하에서 GST-ARF-BP1과 인큐베이션하였다. 도 22C에 예시된 바와 같이, 항-NPM/B23 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 NPM/B23의 유의적인 유비퀴틴화는 검출되지 않았다. 이들 결과는 ARF-BP1이 NPM/B23의 유비퀴틴화를 유도하지 못했음을 제시한다. 상기 결과와 일치하는 것으로, 도 22D에 예시된 바와 같이, 내인성 ARF-BP1의 RNAi-매개 녹다운은 내인성 NPM/B23의 안정성에 기여하지 않는다. 이러한 결과는 ARF-BP1이 NPM/B23 분해에 관여하지 않음을 제시하는 것이다. 이들 결과는 NPM/B23이 ARF-BP1 유비퀴틴 리가제 활성에 대한 효소 표적이 아님을 보여준다.
상술된 발명이 보다 명확한 이해를 도울 목적으로 다소 상세히 기술되었더라도, 당업자들은 본 발명의 내용에 비추어 해당 청구범위에 기술된 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변화가 형식상 세세하게 가해질 수 있음을 알 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of Columbia University in the City of New York GU, WEI <120> ARF-BP1 AS MEDIATOR OF P53-DEPENDENT AND INDEPENDENT TUMOR SUPPRESSION AND USES THEREOF <130> 19240-497WO1 <140> PCT/US2005/032835 <141> 2005-09-15 <150> 60/610,506 <151> 2004-09-15 <150> 11/118,524 <151> 2004-04-29 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13128 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3370)..(3372) <223> CODES FOR A PROLINE AS COMPARED TO A LEUCINE AT AMINO ACID RESIDUE 1124 OF SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <222> (7918)..(7920) <223> CODES FOR A LYSINE AS COMPARED TO A THREONINE AT AMINO ACID RESIDUE 2640 OF SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <222> (7921)..(7923) <223> CODES FOR A PHENYLALANINE AS COMPARED TO A LEUCINE AT AMINO ACID RESIDUE 2641 OF SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <222> (7924)..(7926) <223> CODES FOR A VALINE AS COMPARED TO A SERINE AT AMINO ACID RESIDUE 2642 OF SEQ ID NO:2 <220> <221> misc_feature <222> 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Arg Leu Pro Thr Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu 290 295 300 Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys Glu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly Phe Gly Met Leu 325 330 <210> 10 <211> 37 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Asn Gln Gln Gln Leu Gln Gln Leu Met Asp Met Gly Phe Thr Arg Glu 1 5 10 15 His Ala Met Glu Ala Leu Leu Asn Thr Ser Thr Met Glu Gln Ala Thr 20 25 30 Glu Tyr Leu Leu Thr 35 <210> 11 <211> 37 <212> PRT <213> mus musculus <400> 11 Asn Gln Gln Gln Leu Gln Gln Leu Met Asp Met Gly Phe Thr Arg Glu 1 5 10 15 His Ala Met Glu Ala Leu Leu Asn Thr Ser Thr Met Glu Gln Ala Thr 20 25 30 Glu Tyr Leu Leu Thr 35 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> saccharomyces cerevisiae <400> 12 Leu Ser Ser Glu Ile Glu Asn Leu Met Ser Gln Gly Tyr Ser Tyr Gln 1 5 10 15 Asp Ile Gln Lys Ala Leu Val Ile Ala Gln Asn Asn Ile Glu Met Ala 20 25 30 Lys Asn Ile Leu Arg Glu 35 <210> 13 <211> 38 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Variable amino acid 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18 aauugcuaug ucucugggac a 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 19 aaguaucccu accaccucau g 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 20 aauugccaug uaucugggac a 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 21 aagaggacuc cgcuacugac a 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide sequence <400> 22 aaggugggag ugaucaaaag g 21

Claims (64)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단리된 ARF-BP1 폴리펩티드.
  2. 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 대상이 신생물 형성(neoplasia)을 보유하는지를 결정하는 방법으로서, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현 검출로부터 대상이 신생물 형성을 보유하는 것으로 진단되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 신생물 형성이 암종, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식 질환, 육종 또는 혼합 형태의 신생물 형성인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 신생물 형성이 p53-의존성 또는 p53-비의존성 관련 신생물 형성인 방법.
  5. 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 대상이 신생물 형성전 상태 또는 신생물 형성에 대한 유전적 소인을 보유하는지를 결정하는 방법으로서, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현 검출로부터 대상이 신생물 형성전 상태 또는 신생물 형성에 대한 유전적 소인을 보유하는 것으로 진단 되는 것인 방법.
  6. 대상의 진단 샘플을 p53-ARF-BP1 상호작용에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 대상이 신생물 형성, 신생물 형성전 상태 또는 신생물 형성에 대한 유전적 소인을 보유하는지를 결정하는 방법으로서, 진단 샘플에서 정상보다 높은 p53-ARF-BP1 상호작용으로부터 대상이 신생물 형성, 신생물 형성전 상태 또는 신생물 형성에 대한 유전적 소인을 보유하는 것으로 진단되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 진단 샘플을 p53과 반응성이 있는 약제 및 ARF-BP1과 반응성이 있는 약제를 사용하여 분석하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 약제가 검출가능한 마커로 표지되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 약제가 항체인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 진단 샘플은 ARF-BP1을 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 프로브를 사용하여 분석하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 핵산 프로브가 DNA 또는 RNA인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 프로브가 검출가능한 마커로 표지되는 것인 방법.
  13. 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 신생물 형성에 대한 치료를 받았거나 받고 있는 대상에서 신생물 형성 치료 요법의 효능을 평가하는 방법으로서, 진단 샘플에서 정상 또는 감소된 ARF-BP1의 발현 검출은 신생물 형성을 치료하기 위한 성공적인 요법임을 나타내며, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1의 발현 검출은 신생물 형성을 치료하기 위한 요법을 지속해야 할 필요가 있음을 나타내는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1 상호작용을 검출함으로써 진단 샘플에서 정상보다 높은 ARF-BP1 발현을 검출하는 것인 방법.
  15. 대상의 진단 샘플을 ARF-BP1 발현에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 신생물 형성을 보유하는 대상의 예후를 평가하는 방법으로서, 진단 샘플에서 ARF-BP1의 발현 감소가 검출되면 대상의 예후가 개선되고, 진단 샘플에서 ARF-BP1의 발현 증가가 검출되면 대상의 예후를 악화되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 진단 샘플에서 p53-ARF-BP1 상호작용을 검출함으로써 진 단 샘플에서 ARF-BP1 발현을 검출하는 것인 방법.
  17. (a) p53과 반응성이 있는 적어도 하나의 약제;
    (b) ARF-BP1과 반응성이 있는 적어도 하나의 약제; 및
    (c) p53 발현 및 ARF-BP1 발현을 검출하기에 적합한 시약
    을 포함하는, 신생물 형성을 검출하는 데 사용하기 위한 키트.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 약제가 검출가능한 마커로 표지되는 것인 키트.
  19. 대상에서 p53의 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 대상에서 신생물 형성을 치료하는 방법으로서, p53의 활성은 대상에서 p53-ARF-BP1의 상호작용을 저해하는 것에 의해 대상에서 증가하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 신생물 형성이 암종, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식 질환, 육종 또는 혼합 형태의 신생물 형성인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 신생물 형성이 p53-의존성 또는 p53-비의존성 관련 신생물 형성인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 신생물 형성이 p53-비의존성 관련 신생물 형성인 방법.
  23. 제19항에 있어서, p53-ARF-BP1 상호작용은 대상에 p53-ARF-BP1 상호작용 저해제를 투여함으로써 대상에서 저해하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 저해제는 대상에 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 또는 피하 투여하는 것인 방법.
  25. p53을 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화시키기에 유효한 양의 ARF-BP1 저해제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포내 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화 방법.
  26. 제25항에 있어서, 접촉은 시험관내에서 수행하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 접촉은 대상의 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 접촉은 대상에 ARF-BP1 저해제를 투여함으로써 대상의 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, ARF-BP1 저해제는 대상에 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 또는 피하 투여하는 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 인간이 신생물 형성을 보유하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 신생물 형성이 암종, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식 질환, 육종 또는 혼합 형태의 신생물 형성인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 신생물 형성이 p53-의존성 또는 p53-비의존성 ARF-BP1 관련 신생물 형성인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 신생물 형성이 p53-비의존성 관련 신생물 형성인 방법.
  35. 제31항에 있어서, ARF-BP1 저해제가 대상에서 신생물 형성을 치료하는 것인 방법.
  36. p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하기에 유효한 양의 ARF-ARF-BP1 상호작용 저해제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포내 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성의 조절 방법.
  37. 제36항에 있어서, 세포에서 p53의 탈유비퀴틴화를 증가시키고 p53의 안정성을 증가시키는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, ARF-BP1 상호작용 저해제가 세포 성장 정지를 유도하는 것인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 접촉은 시험관내에서 수행하는 것인 방법.
  40. 제36항에 있어서, 접촉은 대상의 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 접촉은 대상에 저해제를 투여함으로써 대상의 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 인간이 신생물 형성을 보유하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 신생물 형성이 암종, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식 질환, 육종 또는 혼합 형태의 신생물 형성인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 신생물 형성이 p53-의존성 또는 p53-비의존성 관련 신생물 형성인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 신생물 형성이 p53-관련 신생물 형성인 방법.
  47. 제43항에 있어서, p53-ARF-BP1 상호작용 저해제가 대상에서 신생물 형성을 치료하는 것인 방법.
  48. (a) p53 및 ARF-BP1을 포함하는 시험관내 시스템을 수득하거나 생성하는 단계;
    (b) 시험관내 시스템을 후보 저해제와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 후보 저해제가 시험관내 시스템에서 p53-ARF-BP1 상호작용을 저해하는지를 결정하는 단계
    를 포함하는, p53-ARF-BP1 상호작용 저해제의 확인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 단계 (c)에서의 결정은 단계 (b)의 시험관내 시스템에서의 p53-ARF-BP1 상호작용을, 후보 저해제의 부재하에 p53 및 ARF-BP1을 포함하는 제2 시험관내 시스템에서의 p53-ARF-BP1 상호작용과 비교하여 수행하는 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 단계 (c)에서의 결정은 단계 (b)의 시험관내 시스템에서의 p53-ARF-BP1 상호작용을, p53, ARF-BP1, 후보 저해제 및 항-p53 또는 항-ARF-BP1 항체 또는 길항제를 포함하는 제2 시험관내 시스템에서의 p53-ARF-BP1 상호작용과 비교하여 수행하는 것인 방법.
  51. 제48항의 방법에 의해 확인된 저해제.
  52. 대상에서 ARF-, ARF-BP1- 또는 p53-관련 병태를 치료하기에 유효한 양의 제51항의 저해제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 ARF-, ARF-BP1- 또는 p53-관련 병태를 치료하는 방법.
  53. 신생물 형성의 치료 방법에 있어서 ARF-ARF-BP1 상호작용 저해제의 용도.
  54. 신생물 형성의 치료 방법에 있어서 p53-ARF-BP1 상호작용 저해제의 용도.
  55. 유효량의 p53-ARF-BP1 상호작용 저해제 및 제약적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  56. 유효량의 ARF-ARF-BP1 상호작용 저해제 및 제약적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  57. (a) ARF-BP1의 존재하에서 후보 약제를 p53과 접촉시키는 단계; 및
    (b) p53-ARF-BP1 상호작용을 저해할 수 있는 후보 약제의 능력을 평가하는 단계
    를 포함하는, p53과 반응성이 있는 약제의 확인 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    (c) 후보 약제를 ARF-BP1 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 약제가 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 ARF-BP1- 또는 p53-관련 생물학적 사건에 대해 효과를 나타내는지를 결정하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  59. 제58항의 방법으로 확인된 약제.
  60. (a) ARF의 존재하에서 후보 약제를 ARF-BP1과 접촉시키는 단계; 및
    (b) ARF-BP1-ARF 상호작용을 저해할 수 있는 후보 약제의 능력을 평가하는 단계
    를 포함하는, ARF-BP1과 반응성이 있는 약제의 확인 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    (c) 후보 약제를 ARF, ARF-BP1 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 약제가 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 ARF, ARF-BP1- 또는 p53-비의존성 또는 의존성 관련 생물학적 사건에 대해 효과를 나타내는지를 결정하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  62. 제60항의 방법으로 확인된 약제.
  63. ARF 및 ARF-BP1을 포함하는 복합체.
  64. p53 및 ARF-BP1을 포함하는 복합체.
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