KR20070049602A - Ｈａｕｓｐ-ｍｄｍ2 상호작용 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 진단, 종양 치료를 위한 요법의 효능 평가, 종양을 보유하는 피험체의 예후 평가, 및 종양 치료를 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 종양을 검출하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명은 세포내에서 Mdm2의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화, 및 세포내에서 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하기 위한 방법을 더 제공한다. 추가로, 본 발명은 Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제를 동정하는 방법을 제공한다. 또한 이 방법에 의해 동정된 조절제, 그 조절제를 포함하는 약제학적 조성물, 및 종양 치료 방법에서 조절제의 용도를 제공한다. 본 발명은 Mdm2와 반응성인 제제 및 HAUSP와 반응성인 제제를 동정하는 방법을 더 제공한다. 또한 이들 방법에 의해 동정된 제제를 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 복합체를 제공한다.

Description

ＨＡＵＳＰ-ＭＤＭ2 상호작용 및 이의 용도{HAUSP-MDM2 INTERACTION AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2004년 3월 29일에 출원된 미국 일부 계속 특허 출원 제10/813,177호를 기초로 우선권을 주장하며, 상기 10/813,177호 출원은 2002년 3월 30일에 출원된 미국 특허 출원 제10/113,732호에 기초한 우선권 주장 출원이다. 상기 두 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 인용한다.
정부 권리에 관한 진술
본 발명은 NIH 인가 번호. RO1-CA85533하에 정부 지원으로 수행된 것이다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
종양(neoplasia)은 신생물(neoplasm)로 알려진 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질병이다. 신생물은 백혈병 또는 종양(tumor)의 형태로 나타나며, 양성 또는 악성일 수 있다. 특히, 악성 신생물은 생명을 위협할 수 있는 심각한 질환 상태를 초래할 수 있다. 종양을 앓고 있는 환자의 치료에 효과적인 화학 요법제를 비롯하여, 항종양성 측정의 해명을 향해 상당한 연구 노력 및 자원이 진행되어왔다. 효과적인 항종양제는 신생물과 관련된 세포의 빠른 증식을 억제 또는 제어하는 것, 신생물의 퇴화 또는 경감에 효과적인 것, 및 종양을 앓는 환자의 생존을 일반적으로 연장시키는 것을 포함한다. 악성 종양, 또는 암의 성공적인 치료는 초기 위치에서의 발견, 또는 국소/국부 영역으로의 연장, 또는 신체의 다른 부분으로의 전이의 여부에 상관없이 모든 악성 세포의 제거가 필요 하다. 종양 치료의 주요 요법은 외과 및 방사선 요법(국소 및 국부 신생물에 대하여) 및 화학 요법(전신 부위에 대하여)이 있다(Beers and Berkow(eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17판(Whitehouse Station, NJ: Merck Research Laboratories, 1999)973-74, 976, 986, 988, 991).
암을 검출, 진단, 및 치료하기 위한 다양한 방법에도 불구하고, 이들 질환은 사회의 모든 부분에 만연되어 있으며 종종 치명적이다. 명백히, (초기 단계의 종양을 확인할 수 있는 마커의 개발을 포함하는) 검출에 대한 대안적인 전략 및 치료가 암 환자의 생존을 향상시키기 위해 필요하다. 특히, 종양 억제자, 및 종양 억제 경로의 더 우수한 이해는 새로운 검출, 진단, 및 치료 요법이 개발될 수 있는 기준을 제공할 것이다.
p53 종양 억제자는 다양한 형태의 스트레스에 응하여, 성장 정지, 아톱포시스, 및 세포 노화를 포함하는 항 증식 효과를 발휘한다(Levine, A.J., p53, the cellular gatekeeper for growth and division, Cell, 88:323-31, 1997; Giaccia and Kastan, The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes Dev., 12:2973-83, 1998; Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999; Oren, M., Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol . Chem., 274, 36031-034, 1999; Vogelstein 등, Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000; Michael and Oren, The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system. Semin . Cancer Biol., 13:49-58, 2003). p53은 50% 초과의 종양이 p53에서 약간의 변경을 나타내는, 인간 암에서 가장 통상적으로 돌연 변이된 유전자이다(Hollstein 등, Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell lines, Nucleic Acids Res., 22:3551-55, 1994; Hollstein 등, New approaches to understanding p53 gene tumor mutation spectra. Mutat . Res., 431:199-209, 1999).
야생형 p53은 손상된 세포를 완전히 제거하는 아톱포시스 경로를 개시하거나, 손상 복구를 위한 G1 상에서 세포를 포획함으로써 DNA 손상 또는 체크 포인트 실패에 응답함으로써, 게놈의 보호자로 불리 운다(Lane, D.P., Nature, 358:15-16, 1992; Levine, A. J., p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, 88:323-31, 1997). p53은 또한 유전체 안정성, 비정상적 배수성, 유전자 증폭, 증가된 재조합, 및 중심체 조절 장애의 유지를 위해 중요하며- 이들 모두는 세포 결핍 기능 p53에서 관측된다(Donehower 등, Nature, 356:215-21, 1992). 이들 관측은 p53 기능의 폐기가 암의 종양 발생(tumorigenesis)에서 중요하다는 것을 시사한다. 추가로, 다양한 연구는 p53 경로의 불활성화가 유방암을 비롯한 모든 종류의 인체 암의 종양 발생에서 중추적인 현상임을 나타낸다(Vogelstein 등, Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000). 축적하는 증거는, 야생형 p53 을 보 유하는 세포에서, p53 경로의 다른 결함은 종양 형성에서 중요한 역할을 한다는 것을 더 나타낸다(Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999; Oren, M., Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol . Chem ., 274, 36031-034, 1999).
p53은 수명이 짧은 단백질이며, 이것의 활성은 정상 세포내의 낮은 수준으로 유지된다. 종양 억제를 위해 필요시 되는 p53의 분자 기능은 내인성 유전자 발현을 조절하는 전사 인자로서 작용하는 p53의 능력을 포함한다. 세포-성장 포획 또는 아톱포시스에서 결정적으로 포함된 다수의 유전자가 p21CIP1 / WAF1, Mdm2 (murine double minute 2), GADD45, 사이클린 G, 14-3-3σ, Noxa, p53AIP1, 및 PUMA(Kastan 등, A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell, 71:587-97, 1992; el-Deiry 등, WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 75:817-825, 1993; Wu 등, The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev., 7:1126-32, 1993; Barak 등, mdm2 expression is induced by wild type p53 activity. EMBO J., 12:461-68, 1993; Okamoto and Beach, Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. EMBO J., 13:4816-22, 1994; Oda 등, Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science, 288:1053-58, 2000a; Oda 등, p53AIP1, a potential mediator of p-53-dependent apotosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53. Cell, 102:849-62, 2000b; Nakano and Vousden, PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Molecular Cell, 7:683-94, 2001; Yu 등, PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Molecular Cell, 7:673-82, 2001)을 포함하는 p53 직접 표적으로 확인되었다. 더욱이, p53 자체의 빈틈 없는 조절은 정상 세포 성장의 유지 및 종양 발생에 대한 그의 영향에 필수적이다.
다수의 연구가 p53 안정화를 포함하는 다중 경로의 존재를 암시한다(Shieh 등, DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition MDM2. Cell, 91:325-34, 1997; Ashcroft 등, Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol . Cell Biol, 19:1751-58, 1999; Blattner 등, DNA damage induced p53 stabilization:no indication for an involvement of p53 phosphorylation. Oncogene, 18:1723-32, 1999; Dumaz and Meek, Serine15 phosphorylation stimulates p53 transactivation but does not directly influence interaction with HDM2. EMBO J., 18:7002-10, 1999; Ashcroft 등, Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol . Cell Biol., 20:3224-33, 2000; Appella and Anderson, Signaling to p53: breaking the posttranslational modification code. Pathol . Biol .( Paris ), 48:227-45, 2000). 이러한 다중 조절 경로에 의해 p53이 활성화되는 정확한 기전은 완전히 이해되어 지지 않는다. 일반적으로, 그러나, 이들은 유비퀴틴화, 인산화, 및 아세틸화를 포함하는, p53의 번역 후 변형(post-translational modifications)을 포함하는 것으로 생각된다(Giaccia and Kastan, The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes Dev., 12:2973-83, 1998; Appella and Anderson, Signaling to p53: breaking the posttranslational modification code. Pathol . Biol . ( Paris ), 48:227-45, 2000; Brooks and Gu, Ubiquitination, phosphorylation and acetylation: the molecular basis for p53 regulation. Curr. Opin . Cell Biol., 15:164-71, 2003). DNA 손상에 응하여, 예를 들어, p53은 다중 위치에서 인산화된다; 이들 인산화 결과는 Mdm2와의 결합을 방지함으로써 p53 안정화를 촉진하여, p53이 Mdm2-매개된 분해에 더 내성을 갖게한다(Shieh 등, DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition MDM2. Cell, 91:325-34, 1997; Appella and Anderson, Signaling to p53: breaking the posttranslational modification code. Pathol . Biol . ( Paris ), 48:227-45, 2000).
특이 세포 단백질 분해에 대한 신호로 작용함으로써, 단백질 유비퀴틴화(예컨대, 모노-유비퀴틴화, 폴리유비퀴틴화)는 많은 세포 과정의 생리적 조절에 중용한 역할을 한다(Laney and Hochstrasser, Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell, 97:427-30, 1999; Kornitzer and Ciechanover, Modes of regulation of ubiquitin-mediated protein degradation. J. Cell . Phys., 182:1-11, 2000; Hershko 등, The ubiquitin system. Nat . Med., 6:1073-81, 2000; Pickart, C.M., Back to the future with ubiquitin. Cell, 116:181-90, 2004). 폴리유비퀴틴화가 프로테아좀 의존 분해에 대한 신호로서 우선적으로 작용하지만, 모노 유비퀴틴화의 기능적인 결과는 단백질 트래피킹 및 기타 분해-의존 과정과 종종 연결된다(Hicke and Dunn, Regulation of membrane protein transport by ubiquitin and ubiquitin-binding proteins. Annu . Rev . Cell Dev . Biol ., 19:141-72,2003). 유비퀴틴 변성 단백질로부터 유비퀴틴 부분을 제거한 탈유비퀴틴화는 또한 중요한 조절 단계로 현재 인식된다(Wilkinson, K.D., Signal transduction: aspirin, ubiquitin and cancer. Nature, 424:738-39,2003; D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit . Rev . Biochem. Mol . Biol., 33:337-52, 1998).
p53의 유비퀴틴화는 유두종 바이러스 감염된 세포내에서 처음 발견되었으며, p53분해는 바이러스 E6 단백질에 의해 매개된다(Scheffner 등, The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as an ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell, 75:495-505, 1993). 정상 세포에서, p53 분해의 조절은 p53의 N-말단과 물리적으로 상호작용하고, 따라서 p53의 종양 억제자 활성과 반대 작용을 하는 종양 단백질인 Mdm2에 의해 주로 지배된다(Haupt 등, Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature, 387:296-99, 1997; Kubbutat 등, Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature, 387:299-303, 1997; Honda 등, Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53. FEBS Lett ., 420:25-27, 1997). p53 특이적 E3 리가제로서 작용함으로써, Mdm2는 p53의 분해에 중요하며, 또한 모노-유비퀴틴화 p53에 의해 p53의 핵 이출을 유도한다(Freedman 등, Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol . Life Sci., 55:96-107, 1999).
흥미롭게, Mdm2 유전자의 전사는 p53에 의해 활성화되며; 따라서, 증가된 Mdm2 생성은 다양한 세포 스트레스에 응하여 p53 도입을 제한하는 자동 조절 고리 이다.(Ashcroft and Vousden, Regulation of p53 stability. Oncogene, 18:7637-43, 1999). p53 조절에서 Mdm2의 중요한 역할은 마우스에서 수행된 연구에 의해 가장 잘 설명되며, 여기에서 p53의 불활성화는 Mdm2 기능의 손실에 의해 유발된 배아 치명율(embryonic lethality)을 완전히 해결하는 것으로 나타났다(Jones 등, Rescue of embryonic lethality in Mdm2-deficient mice by absence of p53. Nature, 378:206-08, 1995; Montes de Oca Luna 등, Rescue of early embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature, 378:203-06, 1995).
종양유전자 신호에 응답하여 일어나는 p53의 안정화는 Mdm2와 복합체를 형성할 수 있는 종양 억제 단백질인 p14ARF 의 도입으로부터 초래되는 것으로 여겨지며, 이와 같이 하여 생체내에서 p53 및 Mdm2 양자가 안정화한다(Lowe and Sherr, Tumor suppression by Ink4a-Arf: progress and puzzles. Curr . Opin . Genet . Dev., 13:77-83, 2003). p53 경로에서 p14ARF의 중요성은 p14ARF-결핍 마우스의 증가된 종양 감수성에 의해 이해된다(Kamijo 등, Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product p19ARF. Cell, 91:649-59, 1997; Sherr, C.J., The INK4a/ARF network in tumour suppression. Nat. Rev . Mol . Cell Biol., 2:731-37, 2001). Mdm2 패밀리의 한 구성원인 MdmX는 최근 p53 기능의 또 다른 중요 조절자로서 나타났다. Mdm2와는 대조적으로, MdmX 단독은 p53을 유비퀴틴화할 수 없다; 차라리, 그것은 p53 및 Mdm2 양자를 안정화한다(Stad 등, Mdmx stabilizes p53 and Mdm2 via two distinct mechanisms. EMBO Rep., 2:1029-34, 2001). 이를 기준으로, MdmX 및 Mdm2는 p53 안정성에 반대 효과를 갖는 것으로 제안되었다. Mdmx-무기능 마우스는 배아 치사이며, 치사율은 Mdm2-결핍 마우스의 회상(reminiscent) 방식으로- p53-무기능 배경에서 구할 수 있다 (Parant 등, Rescue of embryonic lethality in Mdm4-null mice by loss of Trp53 suggests a non-overlapping pathway with MDM2 to regulate p53. Nat . Genet., 29:92-95, 2001; Finch 등, Mdmx is a negative regulator of p53 activity in vivo. Cancer Res., 62:3221-225, 2002; Migliorini 등, Mdm4(Mdmx) regulates p53-induced growth arrest and neuronal cell death during early embryonic mouse development. Mol . Cell Biol., 22:5527-38, 2002). MdmX의 정확한 기능은 더 설명되어져야 하지만(de Graaf 등, Hdmx protein stability is regulated by the ubiquitin ligase activity of Mdm2, J. Biol . Chem., 278:38315-324, 2003; Kawai 등, DNA damage-induced MDMX degradation is mediated by MDM2, J. Biol . Chem., 278:45946-953, 2003; Pan and Chen, MDM2 promotes ubiquitination and degradation of MDMX, Mol . Cell Biol., 23:5113-21, 2003), 이들 연구는 p53 경로에서 MdmX 에 대하여 중요한 역할을 암시한다.
상술한 바와 같이, 증거물은 야생형 p53을 보유하는 세포내에서, p53 경로 내의 다른 결함은 종양 발생에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다. 현재까지, p53 경로를 표적화함으로써 암을 치료하는 적어도 하나의 방법이 개발되어 왔다. 이러한 치료는 Mdm2 매개 탈유비퀴틴화를 저해함으로써 p53의 안정화를 포함한다. 모든 종양의 경우, 15-30%가 Mdm2 과발현을 나타내는 것으로 추정된다. 그러 나, 이 효소는 저해하기가 어렵다는 것이 주지이다. 최근 연구는 또한 Mdm2- 매개 유비퀴틴화 경로가 손상되지 않을 때조차 기능할 수 있는 p53 안정화에 대한 대안적인 기전의 존재를 함축한다(Ashcroft 등, Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol . Cell Biol., 19:1751-58, 1999; Blattner 등, DNA damage induced p53 stabilization: no indication for an involvement of p53 phosphorylation. Oncogene, 18:1723-32, 1999; Dumaz and Meek, Serine 15 phosphorylation stimulates p53 transactivation but does not directly influence interaction with HDM2. EMBO J., 18:7002-10, 1999; Ashcroft 등, Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol . Cell Biol., 20:3224-33, 2000).
상술한 바를 근거로, p53 경로의 조절은 상당한 관심이 있으며, 암의 진단 및 치료의 가능한 수단이 존재한다. 그럼 에도 불구하고, 이러한 경로의 더 큰 이해 및 p53 유비퀴틴화 및 탈유비퀴틴화의 조절은 새로운 진단 및 치료 방법이 개발 될 수 있는 가치있는 기준을 제공할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 p53의 유비퀴틴화가 가역성이며, 유비퀴틴 가수분해 효소, HAUSP는 p53에 직접 결합하고, 탈유비퀴틴화 한다는 발견을 근거로 한다. 이러한 탈유비퀴틴화는 세포 p53을 활성화 및 안정화하는 효과를 가지며, 따라서 종양 억제 활성에 대하여 유용하도록 한다. 이러한 발견은 종양, 특히 p53과 관련된 암의 진단, 감시, 및 치료에서 광범위하게 연루되어 있다.
본 발명은 또한 RNAi에 의한 내인성 HAUSP 수준의 부분 저하가 p53을 불안정화하는 반면, HAUSP의 완전한 제거가 p53을 안정화하고 활성화한다는 발견을 근거로 한다. 본 발명자는 이러한 현상이 p53 조절에서 피드백 고리를 제공하는, p53-독립 방식으로 HAUSP가 Mdm2를 안정화 하기 때문에 일어나는 것으로 결정하였다. 정상 세포에서, HAUSP 는 Mdm2 안정성에 대하여 필요하며; HAUSP 제거된 세포에서, 자가 유비퀴틴화-Mdm2는 간접 p53 활성화를 초래하는, 극단적으로 불안정하게 된다. 이러한 피드백 조절은 Mdm2에 대하여 특이성이 있으며; HeLa 세포에서, p53이 바이러스 단백질 E6-의존 유비퀴틴화, p53을 활성화 하기 위한 HAUSP 고갈의 실패에 의해 바람직하게 분해된다. 따라서, 본 발명자들은 p53-Mdm2 경로에서 HAUSP 의 동적인 역할을 나타내는 탈유비퀴티나제(HAUSP)에 의해 직접 조절되는 유비퀴틴 리가제(Mdm2)의 예를 발견하였다.
따라서, 본 발명은 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현의 검출은 피험체가 종양을 보유하는 것으로 진단되는, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대하여 피험체의 진단용 샘플을 분석하는 것에 의해 피험체가 종양을 보유하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현은, 진단용 샘플 내에서 정상치보다 높은 Mdm2-HAUSP 상호작용의 검출에 의해 진단용 샘플 내에서 검출된다.
본 발명은 진단용 샘플에서 정상 Mdm2 발현 및 정상 HAUSP 발현의 검출이 종양 치료에 대한 성공적인 요법임을 나타내며, 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현의 검출이 종양 치료를 위해 계속적인 요 법이 필요함을 나타내는 것인 Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대하여 피험체의 진단용 샘플을 분석함으로써 종양 치료를 받았거나 치료 중인 피험체에서의 종양 치료에 대한 요법의 효능 평가 방법을 더 제공한다. 한 구현예에서, 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현은, 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2-HAUSP 상호작용 검출에 의해 진단용 샘플에서 검출된다.
본 발명은 또한 피험체의 예후(prognosis)가 진단용 샘플에서 Mdm2 발현의 감소 및 HAUSP 발현의 감소가 검출됨에 따라 개선되며, 피험체의 예후가 진단용 샘플에서 Mdm2 발현의 증가 및 HAUSP 발현의 증가가 검출됨에 따라 악화되는, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대하여 피험체의 진단용 샘플을 분석함으로써 종양을 보유하는 피험체의 예후를 평가하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현은, 진단용 샘플에서 Mdm2-HAUSP 상호작용 검출에 의해 진단용 샘플에서 검출된다.
추가적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 종양 검출에 사용하기 위한 키트를 제공한다: (a) Mdm2와 반응성인 하나 이상의 제제; (b) HAUSP와 반응성인 하나 이상의 제제; 및 (c) Mdm2의 발현 및 HAUSP의 발현을 검출하기에 적당한 시약.
본 발명은 p53의 활성이 피험체의 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절(modulating)에 의해 피험체에서 증가되는, 피험체에서의 p53의 활성을 증가시킴으로써 피험체의 종양을 치료하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 또한 Mdm2의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화에 유효한 양으로 HAUSP를 세포와 접촉시킴으로써, 세포내에서 Mdm2의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화 하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하기에 유효한 양으로 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제를 세포와 접촉시킴으로써, 세포내의 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 시험관내 시스템을 수득하거나 제조하는 단계; (b) 상기 시험관내 시스템과 후보 조절제를 접촉시키는 단계; 및 (c) 시험관내 시스템에서 상기 후보 조절제가 Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절하는지를 결정하는 단계에 의해, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제를 동정하는 방법을 더 제공한다. 한 구현예에서, 단계 (c)에서의 결정은 Mdm2, HAUSP, 후보 조절제, 및 항-Mdm2 또는 항-HAUSP 항체 또는 길항제를 포함하는 제2 시험관내 시스템에서의 Mdm2-HAUSP 상호작용과 단계 (b)의 시험관내 시스템에서의 Mdm2-HAUSP 상호작용을 비교하여 수행한다. 또한, 본 방법에 의해 동정된 조절제, 및 피험체에게 조절제를 투여함으로써 피험체의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명은 유효량의 Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 더 제공한다. 또한, 종양의 치료 방법에있어서의 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제의 용도가 제공된다.
추가적으로, 본 발명은 (a) HAUSP의 존재하에 Mdm2와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (b) Mdm2-HAUSP 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가하는 단계에 의해 Mdm2와 반응성인 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 임의로, 그 방법은 (c) Mdm2, HAUSP, 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 하나 이상의 세포내에서 하나 이상의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 생물학적 현상에 영향을 미치는지를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한 본 방법에 의해 동정된 제제가 제공된다.
본 발명은 (a) Mdm2의 존재하에 HAUSP와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (b) HAUSP-Mdm2 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가하는 단계에 의해 HAUSP와 반응성인 제제를 동정하는 방법을 더 제공한다. 임의로, 그 방법은 (c) Mdm2, HAUSP, 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 하나 이상의 세포내에서 하나 이상의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 생물학적 현상에 영향을 미치는지를 결정하는 단계를 더 포함한다. 또한, 이 방법에 의해 동정된 제제를 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 그 밖의 양태는 후술하는 상세한 설명을 참조하면 명백해질 것이다.
도 1A-1C는 HAUSP의 정제, 및 p53 및 HAUSP 간의 상호작용을 설명한다. (A) HAUSP는 지시된 컬럼으로부터 용출액을 함유하는 SDS-PAGE 겔의 은-염색 분석을 사용하여, p-53 결합 단백질로서 확인되었다. p135 단백질 밴드로부터 유도된 하기 펩티드 서열이 질량 분광법으로부터 수득되었다: YDAGEHGLQEAEK (서열 번호 1); DFEPQPGNMSHPR (서열 번호 2); KLYYQQLK (서열 번호 3); FMYDPQTDQNIK (서열 번호 4); 및 IQDYDVSLDK (서열 번호 5). (B) 항-p53 단일클론 항체, DO-1로 트랜스펙션된 세포로부터 전체 세포 추출물(WCE) 또는 면역침전물(IP/M2)의 웨스턴-블롯 분석을 사용하여, 세포내에서 p53이 HAUSP와 상호작용하는 것을 결정하였다. (C) 내인성 p53 및 HAUSP 단백질 간의 상호작용은 면역전 혈청으로 대조군 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석(레인 1, 상부), 또는 미처리 세포로부터 항-HAUSP 항체(IP/α-HAUSP)로 면역침전물(레인 3, 상부) 또는 DNA-손상 시약(에토포사이드(Etoposide))으로 처리된 세포(레인 2, 상부) 또는 프로테아좀 저해제(LLNL)로 처리된 H460 세포(레인 4, 상부)의 웨스턴-블롯 분석, 또는 항-p53(중앙 패널) 또는 항-액틴 단일클론 항체(하부 패널)에 의해 면역침전된 이들 다른 핵 추출물(NE)의 웨스턴-블롯 분석을 사용하여 설명되었다.
도 2A-2F는 생체내에서 HAUSP가 p53과 상호작용 및 안정화하는 것을 나타낸다. HAUSP는 항-p53 단일클론 항체, DO-1을 사용하여 p53 단독(레인 1, 3)으로 트랜스펙션하거나, 또는 p53 및 HAUSP(레인2, 4)로 동시-트랜스펙션된(co-transfected) H1299 세포로부터의 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석에 따라 p53(A)의 정상 상태 수준을 높이지만, p27(B)에 대하여는 그렇지않다. (A) 항-p27 단일클론 항체(B)를 사용하여 p27 단독(레인 1, 3)으로 트랜스펙션되거나, 또는 p27 및 HAUSP(레인 2,4)로 동시-트랜스펙션된 H1299 세포로부터의 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. (C) HAUSP에 의한 Mdm2-매개 분해로부터 p53의 보호는 항-p53 단일크론 항체, DO-1에 의해, p53(레인 1)으로 트랜스펙션하거나, 또는 p53 및 HAUSP(레인 2)로 동시- 트랜스펙션된, 또는 p53 및 Mdm2(레인 3)로, 또는 상이한 양의 HAUSP(레인 4-6)와 조합하여 동시-트랜스펙션된 세포로부터의 추출물의 웨스턴-블롯 분석을 사용하여 설명되었다. (D) HAUSP는 웨스턴-블롯 분석에 의해 각 단백질의 발현 수준에 대하여 분석되는, 의사-감염된(mock-infected) 및 pBabe-HAUSP-감염된 IMR-90 세포 양자로부터의 세포 추출물에서 나타낸 바와 같이 내인성 단백질의 발현 수준을 조절한다. (E) HAUSP에 의한 내인성 p53의 반감기의 조절. 시클로헥사미드(CHX)로 예비 처리 후 지시된 바와 같은 다른 시간 점에서 수확된 의사-감염된 및 pBabe-HAUSP-감염된 IMR-90 세포로부터의 세포 추출물은 항-p53 단일클론 항체(DO-1)로 웨스턴 블롯에 의해 p53 단백질 수준에 대하여 분석되었다. (F) HAUSP에 의한 내인성 p53의 유비퀴틴화 수준의 조절. 의사-감염된 세포, 및 4시간 동안 LLNL로 예비 처리된 pBabe-HAUSP-감염된 IMR-90 세포로부터의 세포 추출물은 항-p53 다중클론 항체로 맨처음 면역침전되며, 그 후 항-p53 단일클론 항체(DO-1)로 웨스턴 블롯에 의해 유비퀴틴화 수준에 대하여 분석되었다.
도 3A-3B는 p53-매개된 세포-성장 억제(A) 및 아톱포시스(B)에 대한 HAUSP의 효과를 묘사한다. (A) 한 쌍의 인체 폐 암종 세포(H1299 및H460) 및 한 쌍의 마우스 태아 섬유아세포(MEF p53(+/+) 및 MEF p53(-/-))를 pBabe-벡터, 또는 pBabe-HAUSP로 감염시켰다. 후-감염 24시간에, 세포는 배지 내에서 프로마이신으로 분열 및 유지되었으며, 생존 군락은 2주 후 계산되었다. (B) H1299 세포는 지시된 바와 같이 p53 단독 또는 HAUSP 단독으로 트랜스펙션하거나, 또는 p53 및 Mdm2 로 동시 트랜스펙션하거나, 또는 p53, Mdm2, 및 HAUSP 로 동시-트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후, 세포는 고정되었으며, FITC-컨쥬게이트 α-p53 항체에 의해 p53에 대하여 염색되었고, DNA 함량(PI 염색)에 따라 아톱포시스 세포(subG1)에 대하여 분석되었다.
도 4A-4C는 생체내 및 시험관내 양자에서 HAUSP에 의한 p53의 탈유비퀴틴화를 도시한다. (A) 생체내 p53 유비퀴틴화 수준의 조절. 항-p53 단일클론 항체, DO-1에 의해, Flag-p53(레인 1)으로 트랜스펙션하거나, 또는 Flag-p53 및 Mdm2(레인 2)로, 또는 나타낸 바와 같이 상이한 발현 백터와의 조합(레인3-5)으로 동시-트랜스펙션된 세포로부터 M2/Flag 항체를 사용한 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석. (B) HAUSP 돌연변이체에 의한 p53 안정성의 조절. 항-p53 단일클론 항체, DO-1에 의해 p53(레인 1)로 트랜스펙션하거나, 또는 p53 및 Mdm2(레인 2)로, 또는 지시된 바와 같이 상이한 발현 백터와의 조합(레인3-5)으로 동시-트랜스펙션된 세포로부터 H1299 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. CMV-GFP 발현 벡터는 각기 트랜스펙션 효율 제어를 위한 트랜스펙션에 포함되었으며, GFP의 수준은 항-GFP 단일클론 항체, JL-8(Clontech)로 검출되었다. (C) HAUSP에 의한 p53의 시험관내 탈유비퀴틴화. 정제된 유비퀴틴화된 p53 단백질은 HAUSP(레인 2) 또는 HAUSP-cs(레인 3)의 정제된 재조합 단백질로 인큐베이션되었다.
도 5A-5D는 인체 세포내에서 HAUSP-cs의 우성 음성(dominant negative) 효과를 설명한다. (A) 항-p53 단일클론 항체, DO-1에 의해, Flag-p53(레인 1)로 트랜스펙션하거나, 또는 Flag-p53 및 Mdm2(레인 2)로, 또는 지시된 바와 같이 HAUSP 및 HAUSP-cs와의 조합(레인3, 4)으로 동시-트랜스펙션된 세포로부터 M2/Flag 항체를 사용한 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석. 모든 세포는 수확 전에 4시간 동안 LLNL(50 mM)로 처리되었다. (B) 항-p53 단일클론 항체, DO-1에 의해 Flag-p53의 발현 벡터(레인 2, 4)로 트랜스펙션하거나, 또는 HAUSP-cs로 Flag-p53의 발현 벡터(레인 1, 3)로 동시-트랜스펙션된 인체 SJSA 세포로부터 M2/Flag 항체를 사용한 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석. CMV-GFP 발현 벡터는 트랜스펙션-효율 제어를 위해 각기 트랜스펙션되는 것을 포함하며, GFP의 수준은 항-GFP 단일클론 항체, JL-8(Clontech)로 검출되었다. (C) 항-p53 단일클론 항체(DO-1)에 의한 의사-감염되고 pBabe-HAUSP-cs-감염된 IMR-90 세포로부터의 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. 세포는 처리되지 않았거나(레인 1, 2), 또는 나타낸 바와 같이 1 시간 또는 2 시간 동안 20mM의 에토포사이드(레인 3-6)로 처리되었다. (D) Mdm2, HAUSP, 및 ARF 에 의한 p53 안정성의 조절에 대한 모델. ARF 종양 억제자가 Mdm2-매개 유비퀴틴 리가제 활성의 저해를 통해 p53 안정화를 유도하는 한편, p53은 Mdm2에 의해 유비퀴틴화 되며 26S 프로테아좀에 의해 후속하여 분해된다. HAUSP는 직접 p53 탈유비퀴틴화할 수 있으며, 분해로부터 유비퀴틴화된 p53을 구할 수 있다.
도 6은 인체 HAUSP(서열 번호 6)의 아미노산 서열을 밝힌 것이다.
도 7은 인체 HAUSP(서열 번호 7)의 cDNA 서열을 밝힌 것이다.
도 8A-8C는 생체내에서 HAUSP와 p53의 상호작용을 나타낸 것이다. (A) p53은 세포내에서 HAUSP와 상호작용한다. 나타낸 전체 세포 추출물(WCE)(레인 1, 3) 또는 F-HAUSP 및 항-p53 단일클론 항체(DO-1)로 p53 동시-트랜스펙션된 H1299 세포(레인 3, 4) 또는 p-53 단독 트랜스펙션된 세포(레인 1, 2)로부터 제조된 M2 항체(IP/M2)(레인 2, 4)와의 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석. (B) 내인성 p53 및 HAUSP 단백질 간의 상호작용. 지시된 핵 추출물(NE)(레인 1), 또는 면역전 혈청(레인 2)과의 대조군 면역 침전물, 또는 미처리(레인 4), 항-p53 단일클론 항체로 DNA-손상-처리, 또는 LLNL-처리된 H460 세포의 세포 추출물로부터 항-HAUSP 항체(IP/HAUSP)와의 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석. (c) DNA 손상 반응 동안 p53 및 HAUSP 간의 상호작용. H460 핵 추출물(NE)(레인 6), 또는 항-p53 단일클론 항체, DO-1으로 DNA-손상 처리 후 지시된 시간 점에서 수확된 H460 세포로부터 유도된 항-HAUSP 항체(IP/α-HAUSP)(레인 1-5)와의 면역침전물의 웨스턴-블롯 분석.
도 9A-9B는 HAUSP와 p53의 시험관내 상호작용을 도시한다. (A) GST 및 GST-p53 융합 단백질은 시험관내 번역된(translated) 35S- 표지 완전한 길이의 HAUSP(FL)(레인 1-3), 또는 HAUSP(1-248)의 N-말단 연장(레인 4-6), 또는 HAUSP(M)의 코어 영역(245-644)(레인 7-9), 또는 HAUSP의 C-말단 연장(637-1102)으로 GST 풀-다운 검사(pull-down assay)에서 사용되었다. (B) HAUSP-cs, HAUSP(Δ207-564), 및 USP11과 p53의 시험관내 상호작용. GST 및 GST-p53 융합 단백질은 시험관내에서 번역된 35S-표지 HAUSP-cs(레인 1-3), HAUSP(Δ207-564)(레인 4-6), 또는 USP11(레인 7-9)로 GST 풀-다운 검사에서 사용되었다.
도 10A-10E는 HAUSP에 의한 p53 및 Mdm2의 안정화를 도시한다. (A) NHF-1 세포 및 IMR90 세포내에서 HAUSP#1-RNAi의 1 회차 처리 후 전체 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. HAUSP#1은 AAUGUGGCCCUGAGUGAUGGA (서열 번호 8)이다. (B) HAUSP#1-RNAi의 3 회차 처리 후 IMR90 전체 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. (C) U2OS- HAUSP shRNA 안정한 계는 HAUSP#1-RNAi의 1 회차 처리로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 블롯은 항-HAUSP, 항-p53(DO-1), 및 항-액틴(AC-15) 항체로 프로브 되었다. (D) 항-p53(DO-1), 항-Mdm2, 항-HAUSP, 및 항-GFP 항체를 사용한 Flag-p53 단독(레인 1), Flag-p53 및 Mdm2(레인 2), 또는 Flag-p53, Mdm2, 및 HAUSP(레인 3)으로 트랜스펙션된 H1299 세포로부터의 전체 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. (E) MdmX 단독(레인 1), MdmX 및 Mdm2(레인 2), MdmX, Mdm2, 및 HAUSP(레인 3), 또는 MdmX 및 HAUSP(레인 4)로 트랜스펙션된 H1299 세포로부터 전체 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. 블롯은 항-MdmX, 및 항-GFP 단일클론 항체로 프로브 되었다.
도 11A-11E는 HAUSP가 p53의 부재하에 Mdm2와 상호작용하고 안정화하는 것을 나타낸다. (A) HAUSP 및 Mdm2 간의 시험관내 상호작용. GST(레인 2) 및 GST-Mdm2(레인 3)융합 단백질은 시험관내에서 번역된 35S-표지 완전한 길이 HAUSP로 GST 풀-다운 검사에 사용되었다. (B) 대조군 H1299 세포(레인 3)로부터의 투입물 및 면역 침전물(IP/M2)의 웨스턴 블롯 및 항-HAUSP 항체로 Flag-Mdm2 wt(레인 4)을 안정하게 발현하는 것에서 나타낸 바와 같이, HAUSP는 p53-무기능 세포내의 Mdm2와 상호작용한다. (C) IgG 대조를 사용한 대조군 면역 침전물(레인 2) 또는 항-HAUSP 항체를 사용한 면역침전물(레인 3)의 웨스턴-블롯 분석. (D) HAUSP에 의한 시험관내 Mdm2의 탈유비퀴틴화. 정제된 시험관내 유비퀴틴화 Mdm2 단백질(레인 2)은 HAUSP(레인 3) 또는 HAUSP-cs(레인 4)의 정제된 재조합 단백질로 인큐베이션 되었다. (E) HAUSP에 의한 Mdm2의 반감기의 조절. H1299 세포는 Mdm2, Mdm2 및 HAUSP, 또는 Mdm2 및 HAUSP-cs로 트랜스펙션되었다. 세포는 후-트랜스펙션 24 시간에서 1:4로 분할되었다. 후-트랜스펙션 48 시간에, 세포는 시클로헥산아미드로 예비처리 후, 나타낸 바와 같이 상이한 시간 점에서 수확되었고, 각기 항-Mdm2 및항-액틴(AC-15) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 Mdm2 및 액틴 단백질 수준에 대하여 분석되었다.
도 12A-12C는 HAUSP-고갈된 세포내에서 p53이 안정화되고 활성화되지만, Mdm2는 극단적으로 불안정하다는 것을 나타낸다. (A) 상이한 HAUSP RNAi 올리고뉴클레오타이드의 효과. 3 회차의 RNAi/HAUSP#1-돌연 변이(레인 1), RNAi/HAUSP#1(레인 2), RNAi/HAUSP#2(레인 3), 또는 RNAi/대조(GFP)(레인 4)로 처리된 U2OS 세포로부터 세포 추출물의 웨스턴-블롯 분석. HAUSP#2는 AAGUCUUUGUACAGGCGGAUG (서열 번호 9). 블롯은 항-HAUSP, 항-p53(DO-1), 및 항-액틴(AC-15) 항체로 프로브되었다. (B) HAUSP 제거는 p-21 발현을 활성화한다. 대조-RNAi(레인 1) 또는 HAUSP#1-RNAi(레인 2)로 처리된 U20S 세포의 전체 세포 추출물은 항-p21, 항-HAUSP, 및 항-액틴(AC-15) 항체로 면역블롯화 되었다. (C) HAUSP에 의한 내인성 Mdm2 및 p53의 반감기의 조절. 시클로헥사미드로 예비 처리 후, 나타낸 바와 같이 상이한 시간 점에서 수확된 HAUSP#1-RNAi(오른쪽 패널) 및 대조-RNAi(왼쪽 패널)U2OS 세포 양자로부터의 세포 추출물은 각기 항-p53(DO-1) 및 항-Mdm2 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의한 p53 및 Mdm2 단백질 수준에 대하여 분석되었다.
도 13A-13C는 p53의 HAUSP 매개 피드백 조절이 Mdm2에 특이적이라는 것을 나타낸다. (A) HAUSP(레인 2 및 3)이 없이 또는 HAUSP(레인 4 및 5)와, 항-p53(DO-1) 항체와의 E6의 양 증가 및 Flag-p53으로 트랜스펙션된 H1299 세포의 전체 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석. (B) 시험관내에서 HAUSP에 의한 p53의 탈유비퀴틴화. HeLa 세포로부터 정제된 유비퀴틴화된 Flag-p53 단백질(레인 1)은 HAUSP(레인 2) 또는 HAUSP-cs(레인 3)의 정제된 재조합 단백질로 인큐베이션 되었다. (C) 대조-RNAi(레인 1) 또는 HAUSP#1-RNAi(레인 2)로 처리된 HeLa 세포의 전체 세포 추출물이 항 p-53(DO-1), 항-HAUSP, 항-액틴(AC-15), 및 항-p21 항체로 면역 블롯화 되었다.
도 14는 HAUSP 가 U2OS 세포(상부 패널) 내에서 p53 및 Mdm2 양자를 안정화하고, Mdm2는 시험관내에서 HAUSP 에 의해 특이적으로 탈유비퀴틴화되지만, UBP11 은 아니다(중간 및 하부 패널). (상부 패널) 항-p53(DO-1), 항-Mdm2, 및 항-GFP 항체와 함께 Flag-p53 단독(레인 1), Flag-p53 및 Mdm2(lane 2), 또는 Flag-p53, Mdm2, 및 HAUSP(레인 3)으로 트랜스펙션된 U2OS 세포로부터 전체 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석. (중간 패널) 시험관내에서 정제된 유비퀴틴화된 Mdm2 단백질(레인 1)은 GST-UBP11(레인 2) 또는 GST-HAUSP(레인 3)의 정제된 재조합 단백질로 인큐베이션되고, 항-Mdm2 항체로 면역블롯화 되었다. (하부 패널)UBP11은 시험관내에서 활성 탈유비퀴나제이다. 폴리-유비퀴틴 사슬(Ub2-7)(Affiniti)는 GST(레인 2) 또는 GST-UBP11(레인 1)로 인큐베이션되고, 마우스 항-유비퀴틴 항체로 면역블롯화 되었다.
도 15는 HAUSP가 Mdm2에 대하여 특이적 탈유비퀴나제이지만, c-Myc에 대하여는 그렇지 않다(상부 패널)는 것을 나타내며; HAUSP 고갈은 c-Myc 및 p27과 같은 기타 불안정한 단백질 상에서 효과가 없다(중간 패널)는 것을 나타내고; Mdm2의 mRNA 수준은 상승되지만, p53의 mRNA 수준은 HAUSP 고갈에 의해서도 유지된다(하부 패널)는 것을 나타낸다. (상부 패널)Flag-Myc 및 HA-Ub 구조로 트랜스펙션된 293 세포는 항-Flag(M2) 면역정제를 수행하였다. 유비퀴틴화된 Flag-Myc 단백질은 그 후 시험관내에서 재조합 GST-HAUSP 단백질로 인큐베이션 되었다. 블롯은 항-HA(레인 1 및 2) 또는 항-Myc(C33)(레인 3 및 4) 항체로 프로브 되었다. (중간 패널) U2OS-HAUSP shRNA 안정한 계는 3 회차의 HAUSP#1-RNAi 처리로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 블롯은 항-HAUSP, 항-Myc(C33), 항-p53(DO-1), 항-액틴(AC-15), 및 항-p27 항체로 프로브 되었다. (하부 패널) RT-PCR은 Mdm2, p53, 및 액틴에 대하여 특이적인 프라이머를 사용하여- 각기 대조-RNAi 또는 HAUSP#1-RNAi의 추가 로 처리된- 대조-RNAi 또는 HAUSP#1-RNAi 안정한 계 상에서 수행되었다.
도 16A-16B는 p53의 과발현이 내인성 Mdm2 발현을 유도한다는 것을 나타낸다. (상부 패널) U2OS 세포는 5㎍의 Flag-p53(레인 2), 10㎍의 Flag-p53(레인 3), 또는 15㎍의 Flag-p53(레인 4)로 트랜스펙션하였다. 블롯은 항-Mdm2, 항-p53(DO-1), 및 항-GFP 항체로 프로브 되었다. (하부 패널)H1299 세포는 5㎍의 p53(레인 2), 10㎍의 p53(레인 3), 또는 15㎍의 p53(레인 4)로 트랜스펙션하였다. 블롯은 항-Mdm2, 항-p53(DO-1), 및 항-GFP 항체로 프로브 되었다.
도 17A-17B는 시험관내 HAUSP 및 인체 Mdm2 간의 상호작용을 설명한다. (상부 패널) GST(레인 2) 및 GST-Mdm2(레인 3) 융합 단백질은 시험관내에서 번역된 35S-표지 완전한 길이의 HAUSP로 GST 풀-다운 실험에서 사용되었다. Mdm2 상호작용 영역의 추가의 특징은 GST-Mdm2(1-110)의 N 말단(레인 4), GST-Mdm2(1-220)의 연장된 N 말단(레인 5), GST-Mdm2(110-220)(레인 6), 및 GST-Mdm2(110-280)(레인 7)로 인큐베이션된 시험관내에서 번역된 35S-표지 완전한 길이의 HAUSP를 사용하여 수행되었다. (하부 패널) 나타낸 단백질 결합 영역 및 Mdm2 보존 영역이 있는 여기에서 기술된 실험에 사용된 Mdm2 wt 단백질 및 단편의 도식적인 표시.
p53 종양 억제자는 Mdm2 매개된 유비퀴틴화 및 후속하는 단백질 분해에 의해 정상 세포내에서 낮은 수준으로 유지되는 짧은 수명의 단백질이다. p53의 안정화는 그의 종양 억제 기능 때문에 중요하다(Ashcroft and Vousden, Regulation of p53 stability. Oncogene, 18:7637-43, 1999; Oren, M., Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol . Chem., 274, 36031-034, 1999; Freedman et al., Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol . Life Sci., 55:96-107, 1999; Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999; Vogelstein et al., Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000). 그러나, 유비퀴틴화된 p53 수준이 생채 내에서 조절되는 정확한 기전은 완전하게 이해되어 지지 않았다.
친화성-정제된 p53-관련 인자의 질량 분광법에 의해 발명자들은 p53-상호작용 단백질로서 확인된 HAUSP(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease)를 갖는다(Everett 등, A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997). HAUSP는 과량의 Mdm2(murine double minute 2)의 존재하에서 조차 p53을 강하게 안정화하며, p53-의존성 세포 성장 억제 및 아톱포시스를 유발한다. 중요하게, HAUSP는 시험관내 및 생체내 양자에서 p53을 특이적으로 탈유비퀴틴화하는 고유 효소 활성을 갖는다. 반대로, 세포내에서 촉매적으로 불활성인 HAUSP 점 돌연변이의 발현은 p53 유비퀴틴화의 수준을 증가시키며 p53을 불안정화한다. 이러한 발견은 p53이 직접적인 탈유비퀴틴화에 의해 안정화될 수 있으며 또한 p53의 안정화를 통해, 생체내에서 종양 억제자로서의 HAUSP가 관련된다는 중요한 기전을 나타낸다.
여기에서 개시된 바와 같이 본 발명자들의 자료는 HAUSP 매개된 p53의 안정화는 고유 탈유비퀴틴화하는 효소 활성을 통해 작용한다는 것을 시사한다. 유비퀴틴-변성 단백질로부터 유비퀴틴 부분을 제거하는 탈유비퀴틴화는 현재 중요한 조절 단계로서 인지되어 있다(D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit . Rev . Biochem . Mol . Biol., 35:337-52, 1998; Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem . Biophys . Res . Commun., 266:633-40, 1999; Wilkinson, K.D., Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin . Cell Dev . Biol., 11:141-48, 2000). 존재하는 것으로 알려진 다수의 유비퀴틴 특이성 진행 프로테아제(UBPs)는 또한 이들 단백질이 특이 세포 단백질에 결합할 수 있으며 기질 특이성을 가질 수 있음을 시사한다. 증대하는 수의 UBP 상동체가 포유동물 세포내에서 확인되었지만(D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit . Rev . Biochem . Mol . Biol., 35:337-52, 1998; Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem . Biophys . Res . Commun., 266:633-40, 1999; Wilkinson, K.D., Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev . Biol., 11:141-48, 2000), 생체내에서 특이성 기질의 안정화에 대하여는 관련되지 않았다.
HAUSP는 특이 세포 인자(p53)를 직접적으로 탈유비퀴틴화하고 안정화할 수 있는 포유 동물 단백질의 최초의 예를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명자의 발견은 HAUSP의 잠재적인 종양-억제 기능에 대하여 중요한 관련성을 가지며, 또한 HAUSP와 같은 많은 UBP 패밀리 단백질이 탈유비퀴틴화 및 후속하는 단백질 안정화 양자에 대해, 생체내에서 상이한 기질과 상호작용할 수 있는 것을 예측한다.
선행 연구는 HAUSP가 허피스바이러스 단백질, Vmw110과 상호작용하고, HAUSP 단백질의 하위 집단 PML 핵체와 국소화 될 수 있음을 나타내었다(Everett 등, A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997). 게다가, 현재 ARF는 몇몇 형태의 종양유전자 스트레스에 의해 유발된 p53 활성화에 대해 없어도 된다는 것을 나타내는 증대하는 증거가 있다(Seavey 등, The E7 oncoprotein of human papillomavirus type 16 stabilizes p53 through a mechanism independent of p19(ARF). J. Virol., 73:7590-98, 1999; Tolbert 등, p19ARF is dispensable for oncogenic stress-induced p53-mediated apoptosis and tumor suppression in vivo . Mol . Cell Biol., 22:370-77,2002). 따라서, 본 발명자의 발견으로 함께 취하여 진 이들 초기 연구는 바이러스 감염, DNA 손상 반응, 및 기타 다른 형태의 스트레스 반응에서 p53-HAUSP 상호작용에 대한 잠재적인 조절을 더 시사한다.
p53의 안정화는 그의 세포 성장 억제 및 아톱포시스에 대한 그의 효과, 및 그의 종양 억제 기능을 위해 중요하다. 많은 연구가 다양한 형태의 스트레스에 반응하는 p53의 안정화가 Mdm2-p53 상호작용 및/또는 Mdm2- 매개된 유비퀴틴 리가제의 저해를 통해 성취될 수 있음을 제안하였다 (Ashcroft and Vousden, Regulation of p53 stability. Oncogene, 18:7637-43, 1999; Freedman et al., Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol . Life Sci., 55:96-107, 1999; Oren, M., Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol . Chem ., 274, 36031-034, 1999; Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999; Vogelstein et al., Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000; Sherr and Webber, The ARF/p53 pathway. Curr . Opin . Genet . Dev., 10:94-99, 2000). 본 발명자들의 발견은 p53의 유비퀴틴화가 생체내에서 동적인 과정이며, 유비퀴틴화된 p53은 직접적인 탈유비퀴틴화를 통해 HAUSP에 의해 분해로부터 벗어날 수 있다는 것을 나타낸다(도 5D). p53의 Mdm2-매개된 유비퀴틴화 및 p53의 HAUSP- 매개된 탈유비퀴틴화 간의 균형의 변화가 생체내에서 p53 안정화를 위해 중요하다는 것은 매우 가능성이 높다.
여기에서 기술된 바와 같이 본 발명자의 발견은 Mdm2 안정성의 조절에서 HAUSP 유비퀴틴 가수분해 효소에 대해 중요한 역할을 확립한다. 본 발명자들은 생체내에서 구조적으로 자가-유비퀴틴화되고 분해되는 내인성 Mdm2의 안정성을 위해 HAUSP가 필요하다는 것을 발견하였다. HAUSP의 부재하에, Mdm2는 극단적으로 불안정하며, HAUSP-고갈 세포내에서 p53의 간접적인 활성화를 초래하는 p53 분해가 실패한다. 이러한 연구는 유비퀴틴 리가제(Mdm2)의 안정성 및 기능의 유지에 기여하는 탈유비퀴티나제 활성(HAUSP)의 최초의 예를 제공한다. 본 발명자들은 또한 피드백-매개된 p53 안정화가 Mdm2-의존성임을 나타내었다: 내인성 HAUSP의 고갈은 HeLa 세포내에서 p53 안정화를 유도하는 데 실패하고, p53 분해는 주로 인체 유두종 바이러스 단백질, E6에 의해 유도된다. Mdm2를 포함하는 많은 E3 유비퀴틴 리가제는 그들 자체의 안정성을 조절하는 수단으로서 자가-유비퀴틴화(self-ubiquitination)을 수행한다.
p53 경로에서 HAUSP의 역할은 매우 독특한 것으로 나타난다. 한편, HAUSP의 과발현은 p53 및 Mdm2 양자를 안정화하고, 더 중요하게는, p53 기능을 활성화한다; 이들은 MdmX-매개된 효과와는 상이하지만, p14ARF-매개된 효과와 매우 유사하다. 반면, HAUSP 제거는 Mdm2 넉아웃(knockout) 세포내에서 관측되었던 것과 유사한 표현형을 생성하는, Mdm2를 불안정하게 하고 p53을 활성화한다(Jones 등, Rescue of embryonic lethality in Mdm2-deficient mice by absence of p53. Nature, 378:206-08, 1995; Montes de Oca Luna 등, Rescue of early embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature, 378:203-06, 1995). 정상 세포내에서 HAUSP 과발현의 순수 성과가 p53-의존 전사 및 세포 성장 억제 활성화를 제공하므로, p53은 생체내에서 우선적인 표적이 될 수 있다. 이러한 견해는 RNAi에 의한 내인성 HAUSP 수준의 부분적인 저하가 p53 불안정화를 유도한다는 관측에 의해 지지된다.
p53 및 Mdm2 양자의 기능을 조절하는 HAUSP의 놀라운 능력은 그의 생리적 목적의 가능성을 제기한다. 많은 연구에서 p53 기능의 조절에서 중요한 역할을 하는, 복잡한 p53-Mdm2 피드백 네트워크의 존재를 나타냈다. p53 및 Mdm2를 포함하는 중추 피드백 고리 이외에 (Freedman 등, Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol . Life Sci., 55:96-107, 1999), p53-Mdm2 경로의 조절은 또한 유사하게 그러나 명확하게, 피드백 기전을 통해 p14ARF 및 MdmX에 의해 영향을 받는다. 예를 들어 p53 및 Mdm2 양자는 pl4ARF 에 의해 안정화될 수 있다(Lowe and Sherr, Tumor suppression by Ink4a-Arf:progress and puzzles. Curr . Opin . Genet . Dev., 13:77-83, 2003), 한편 세포내에서 p14ARF의 수준은 p53 발현에 의해 하향 조절된다(Stott 등, The alternative product from the human CDKN2A locus, p14(ARF), participates in a regulatory feedback loop with p53 and MDM2. EMBO J., 17:5001-14, 1998).
MdmX는 초기에 p53을 안정화하는 것으로 발견되었다(Stad 등, Mdmx stabilizes p53 and Mdm2 via two distinct mechanisms. EMBO Rep., 2:1029-34, 2001). 그럼에도 불구 하고, 최근 연구는 또한 MdmX가 p53 분해에 명확하게 포함되는 것임을 나타내며(Gu 등, Mutual dependence of MDM2 and MDMX in their functional inactivation of p53. J. Biol . Chem., 277:19251-254, 2002; Linares 등, HdmX stimulates Hdm2-mediated ubiquitination and degradation of p53. Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 100:12009-014, 2003), 그리고 마우스 내에서 MdmX의 넉아웃은 p53 활성화를 초래한다는 것을 나타낸다(Parant 등, Rescue of embryonic lethality in Mdm4-null mice by loss of Trp53 suggests a non-overlapping pathway with MDM2 to regulate p53. Nat . Genet., 29:92-95, 2001; Finch 등, Mdmx is a negative regulator of p53 activity in vivo . Cancer Res., 62:3221-225, 2002; Migliorini 등, Mdm4(Mdmx) regulates p53-induced growth arrest and neuronal cell death during early embryonic mouse development. Mol . Cell Biol., 22;5527-38, 2002). 더욱이, Mdm2가 MdmX 발현에 의해 안정화될 수 있지만, MdmX는 또한 Mdm2의 기질이며, Mdm2-매개된 유비퀴틴화에 의해 분해되었다(de Graaf 등, Hdmx protein stability is regulated by the ubiquitin ligase activity of Mdm2. J. Biol . Chem., 278:38315-324, 2003; Kawai 등, DNA damage-induced MDMX degradation is mediated by MDM2. J. Biol . Chem., 278:45946-953, 2003; Pan and Chen, MDM2 promotes ubiquitination and degradation of MDMX Mol . Cell Biol., 23:5113-21, 2003). p53, p14ARF, Mdm2, 및 MdmX 중에서 다차원 신호방해(multi-dimensional cross-talk)은 생체내에서 p53이 다중 경로에 의해 활성화될 수 있지만 또한 엄밀한 제어하에 유지될 수 있는 명쾌한 피드백 네트워크를 제공한다. 여기에서 기술된 HAUSP-매개된 기능은 p53-Mdm2 네트워크에 피드백 조절의 관심 있는 층을 명백하게 첨가할 수 있다.
p53 및 Mdm2는 서로 기능적으로 길항 작용을 하기 때문에, 생체내에서 p53 또는 Mdm2를 안정화하는 HAUSP의 조절은 극단적으로 중요하게 된다. 발명자들은 생체내에서 p53 안정화와 매우 관련성이 있는, DNA 손상에 응하여 p53-HAUSP 상호작용이 향상된다는 것을 나타내었다. HAUSP는 초기에 허피스바이러스 유비퀴틴 리가제 ICP0-관련 세포 인자로서 확인되었다(Everett 등, A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:1519-30, 1997). 더 최근에, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)이 또한 HAUSP와 상호작용하고, 세포내에서 HAUSP에 결합하기 위해 p53과 경쟁할 수 있다는 것이 보고되었다(Holowaty 등, Protein interaction domains of the ubiquitin-specific protease, USP7/HAUSP. J. Biol . Chem., 278:47753-761, 2003; Holowaty 등, Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem., 278:29987-994, 2003). 본 발명자의 연구는 가역성 유비퀴틴화가 유비퀴틴 리가제 자체를 포함하는, 세포 인자의 기능 조절에 대한 일반적인 기전임을 암시한다. 종양 세포에서, 특이 HAUSP 돌연변이는 p53-HAUSP 상호작용만을 폐기하며, Mdm2-HAUSP 상호작용은 그렇지 않다는 것이 가능하다. 더욱이, p53, HAUSP, 및 Mdm2 간의 상호작용은 DNA 손상 또는 바이러스 감염에서 동적으로 조절될 수 있다.
상술한 관점에서, 본 발명은 피험체가 종양을 보유하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 여기에서 사용된 바의 "피험체"는 제한함이 없이, 소, 개, 인간, 원숭이, 마우스, 돼지, 또는 쥐를 포함하는 포유 동물이다. 바람직하게는, 피험체는 인간이다. 발명자들은 정상 (비손상된) 세포와 비교하여 DNA 손상된 세포내에서, 상당한 HAUSP-p53 상호작용의 향상 및 향상된 HAUSP 발현의 검출을 여기에서 나타내었다(도 8A-8C). 따라서, 본 발명의 방법은, 정상치보다 높은 HAUSP 발현의 검출이 피험체의 종양의 진단인, HAUSP의 발현에 대한 피험체의 진단용 샘플 검사를 포함한다.
여기에서 사용된 바의, "HAUSP" 는 HAUSP(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease) 단백질 및 HAUSP 유사체(analogue)을 포함한다. 다른 지시가 없다면, "단백질"은 단백질, 단백질 영역, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함한다. 여기에서 더 사용된 바의 HAUSP 단백질(USP7로도 알려짐)은 도 6에서 진술된 그의 보존적 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다(서열 번호 6; 참조, 또한, Everett 등, A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997; and GenBank Accession No. CAA96580 참조).
여기에서 사용된 바의 "HAUSP 유사체"는 HAUSP 단백질과 60% 이상(바람직하게는 70%이상) 아미노산 서열 상동성을 갖는 HAUSP 생물학적 활성을 갖는 HAUSP 단백질의 기능적인 변형체이다. HAUSP "유사체"는 유사성 3 차원 입체 형태를 갖는 HAUSP 단백질의 변형체를 포함한다. 여기에서 더 사용된 바의, 용어 "HAUSP 생물활성"은 친화성이 HAUSP와 상이할 수 있지만, 여기에서 기술된 바와 같이 p53 종양-억제 단백질과 물리적으로 관련된 능력(즉, 음성 대조의 배경 결합 위의 약 2배, 또는 더 바람직하게는 약 5배 결합)을 나타내는 단백질 또는 펩티드의 활성을 의미한다. HAUSP 및 HAUSP 유사체는 합성적으로 또는 재조합하여 생성될 수 있거나, 또는 원래의 세포로부터 단리될 수 있다. HAUSP는 바람직하게는 통상의 기술 및 HAUSP를 코딩하는 cDNA를 사용하여 재조합으로 생성된다 (서열 번호 7; 또한, Everett 등, A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997; and GenBank Accession No. Z72499 참조).
여기에서 사용된 바의 "보존적 치환"은 이들이 유사한 극성 또는 입체 배열을 갖기 때문에, 또는 이들이 동일 부류의 치환 잔기(예컨대, 소수성, 산성, 또는 염기성)에 속하기 때문에 치환된 아미노산 잔기와 기능적으로 동등한 아미노산 치환이다. 여기에서 기술된 바의 용어 "보존적 치환"은 특히, 분자 교체 분석, 및/또는 상동성 모델링에 대한 p53 저해제의 확인 및 고안을 위한 상호작용의 용도에 관하여, p53과 상호작용하는 HAUSP의 능력에 대한 모순적인 효과를 갖는 치환기를 포함한다.
본 발명의 방법은 피험체에서 이러한 종양의 진단을 허용함으로써, 피험체가 종양을 보유하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 여기에서 사용된 바의, "종양(neoplasia)"은 정상 세포의 증식을 중지하도록 하거나 또는 유도해 내지 않는 조건 하에, 신생물 세포(즉, 종양 세포와 같은 신생 세포)의 비제어된 및 점진적인 증식을 의미한다. 종양은 "신생물(neoplasm)"을 초래하며, 이것은 새롭고 비정상적인 성장, 특히 세포의 성장이 비제어되고 점진적인 조직의 새로운 성장으로 여기에서 정의된다. 따라서, 종양은 "암"을 포함하며, 여기에서는 비제어된 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침투, 및/또는 전이를 초래하는 정상 제어의 손실의 독특한 특징을 갖는 신생 세포의 증식을 의미한다.
여기에서 사용된 바의, 신생물은 동일 형태의 조직 내에서 정상 증식과 비교하여, 제한함이 없이, 피험체의 조직 내 세포의 형태학상의 불규칙성, 및 피험체의 조직 내 세포의 병적 증식을 포함한다. 추가로, 신생물은 침투적 또는 비침투적인 양성 종양 및 악성 종양(예컨대, 유방 종양)을 포함한다. 악성 신생물은 전자가 상당한 정도의 세포의 퇴화, 또는 세포의 분화 및 배향을 나타내며 침투 및 전이 성질을 가지므로 양성 신생물과 구분된다. 여기에서 기술된 발명에 따른 평가, 검출, 진단, 감시, 또는 치료될 수 있는 신생물 또는 종양의 예는, 제한함이 없이, 암종, 특히 방광, 유방, 후부(cervix), 결장, 머리, 신장, 폐, 목, 난소, 전립선, 및 위암; 림프성 백혈병, 특히 급성 림프모구성(lymphoblastic) 백혈병 및 만성 림프성 백혈병; 골수성(myeloid) 백혈병, 특히, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 전골수구성(promyelocytic) 백혈병, 및 만성 골수성(myelocytic) 백혈병; 악성 림프종, 특히 버키트(Burkitt's) 림프종 및 비호지킨(Non-Hodgkin's) 림프종; 악성 흑색종; 골수증식성 질환; 육종, 특히 유윙(Ewing's) 육종, 혈관육종, 카포시 육종, 지방육종, 말초 신경상피종(peripheral neuroepithelioma) 및 활막육종(synovial sarcoma); 및 종양의 혼합형태, 특히 암육종 및 호지킨 질환을 포함한다(Beers and Berkow (eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (Whitehouse Station, NJ:Merck Research Laboratories, 1999) 973-74, 976, 986, 988, 991).
상술한 바와 같이 모든 암의 경우 60% 이상이 p53 돌연변이와 관련된다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 p53 경로에서 결함과 관련된 종양을 포함하는 p53-관련 종양의 평가, 검출, 진단, 감시, 및 치료에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 유방암, 결장암, 백혈병, 폐암, 악성 흑색종, 난소암, 또는 전립선암의 평가, 검출, 진단, 감시, 및 치료에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 피험체의 진단용 샘플은 시험관내 또는 생체내에서 검사될 수 있다. 검사가 시험관내에서 수행되는 경우, 피험체로부터의 진단용 샘플은 표준 절차를 사용하여 제거될 수 있다. 진단용 샘플은 표준 생체 검사에 의해 제거될 수 있는, 뼈, 뇌조직, 유방 조직, 결장 조직, 근육 조직, 신경 조직, 난소 조직, 전립선 조직, 직장 조직, 피부 조직, 또는 연질 조직을 포함하는 조직일 수 있다. 게다가, 진단용 샘플은 뇌척수액, 심장막액(pericardial fulid), 복막액, 타액, 장액(serum), 및 소변을 포함하는 체액일 수 있다. 더욱이, 피험체 또는 환자로부터 취하여진 진단용 샘플은 예를 들어 신생물을 갖는 것으로 알려진 조직, 신생물을 갖는 것으로 의심되는 조직, 또는 신생물을 갖지 않는 것으로 여겨지는 조직일 수 있다.
단백질은, 제한함이 없이, 조직으로부터 추출(예컨대, 단백질을 가용화 하는 세제를 사용함)), 필요하다면, 그 후 컬럼 상에서 친화성 정제, 크로마토그래피(예컨대, FTLC 및 HPLC), 면역침전화(예컨대, HAUSP에 대한 항체), 및 침전(예컨대, 이소프로판올 및 트리졸과 같은 시약을 사용함)을 포함하는 당업계의 표준 방법을 사용하여 본 발명의 진단용 샘플로부터 단리 및 정제될 수 있다. 단백질의 단리 및 정제에 이어서 전기영동(예컨대, SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서)이 수행될 수 있다. 핵산은 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 진단용 샘플로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 피험체에서의 종양은 정상치보다 높은 HAUSP의 발현이 종양의 진단인, HAUSP의 발현에 대한 피험체의 진단용 샘플을 검사하여 진단될 수 있다. 여기에서 사용된 바의, "발현"은 하나 이상의 mRNA 전사체로의 유전자의 전사, 또는 단백질로의 하나 이상의 mRNA의 번역을 의미한다. 예를 들어, "HAUSP의 발현"은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 mRNA 전사체로의 HAUSP 유전자의 전사, 또는 HAUSP 단백질로의 하나 이상의 mRNA의 번역을 의미한다. 따라서, 진단용 샘플은 HAUSP 단백질, HAUSP cDNA, 또는 HAUSP mRNA에 대한 검사에 의해 HAUSP 발현에 대해 검사될 수 있다. HAUSP의 적당한 형태는 여기에서 논의된 특정 기술을 근거로 명백하게 될 것이다.
더욱이, 피험체 또는 환자가 종양을 보유하는지 여부를 결정하기 위해, 진단용 샘플은 (전구체, 엔도단백질분해 진행 형태(endoproteolytically-processed forms), 및 후-번역 변형으로부터 초래되는 기타 형태를 포함하는) HAUSP 단백질의 임의의 또는 모든 형태의 발현에 대해 검사될 수 있다는 것이 고려된다. 진단용 샘플은 여기에서 기술된 바와 같이 p53-HAUSP 상호작용의 증가를 검출함으로써 정상치보다 높은 HAUSP의 발현에 대해 검사될 수 있다고 또한 생각되어 진다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 정상치보다 높은 HAUSP 발현은 정상치보다 높은 p53-HAUSP 상호작용을 검출함으로써 검출될 수 있다.
여기에서 사용된 바의, 용어 "정상치보다 높은"은 동성 및 유사한 연령의 질환이 없는 피험체 또는 환자(즉, 종양을 갖지 않는 사람)로부터 취하여진 동일 형태의 진단용 샘플에 대해 기대되는 수준보다 상당히 더 큰 수준에서의 검출(예컨대, HAUSP의 발현, p53-HAUSP 상호작용, 등)을 의미한다. 여기에서 더 사용된 "상당히 큰"은 정상치보다 높은 수준(예컨대, HAUSP의 발현, p53-HAUSP 상호작용, 등), 및 기대되는 (정상) 수준(예컨대, HAUSP의 발현, p53-HAUSP 상호작용, 등) 간의 차이가 통계학상 중요한 것을 의미한다.
바람직하게는, 정상치보다 높은 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)은 기대되지 않는다면 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준보다 10% 이상 높은 수준에서의 HAUSP(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 발현이다. HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)이 특정 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플에서의 부재가 예상되는 경우, 피험체 또는 환자에 대한 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 정상 수준은 존재하지 않는다. 특정 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플이 낮은 수준의 구성 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)을 갖는 것으로 예상된다면, 낮은 수준은 피험체 또는 환자에 대하여 정상 수준의 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)이다. 여기에서 개시된 바와 같이, HAUSP-p53 상호작용, 및 HAUSP 발현은 일반적으로 DNA 손상을 함유하지 않는 세포내에서 낮은 수준으로 존재한다.
피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플에 대한 예상되는 또는 정상 수준의 HAUSP 발현은 유사한 연령 및 동성의 질환이 없는 피험체를 검사하여 용이하게 결정될 것이다. 예를 들어, 진단용 샘플은 남성의 HAUSP 발현의 정상적인 양을 결정하기 위해 25 내지 80 세의 건강한 정상 남성 30 명 이상으로부터 수득될 수 있다. 유사한 절차가 여성에서의 HAUSP 발현의 정상적인 양을 결정하기 위해 따라 할 수 있다. 필요하거나 요구되는 샘플이 얻어지면, 남성 및 여성의 HAUSP 발현의 정상적인 양이 하기에서 기술되는 바와 같이, 단백질 양을 측정하기 위해 유세포 측정법(flow cytometry), 웨스턴-블롯 분석, 또는 ELISA 와 같은 정량화를 위한 표준 검사를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, ELISA는 중복으로 각 샘플에 대하여 진행될 수 있으며, HAUSP 단백질의 양의 표준 편차가 결정될 수 있다. 필요하다면, 추가적인 피험체는 HAUSP 발현의 정상적인 정량이 정량화되기 전에 보충될 것이다. 유사한 형태의 절차가 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플에 대하여 예상되는 또는 정상 수준의 p53-HAUSP 상호작용을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 피험체의 진단용 샘플은 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)에 대하여 검사될 수 있으며, HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)은 공지 기술로부터 용이하게 결정된 검사 및 검출 방법(예컨대, 면역 기술, 하이브리드화 분석, 형광 이미지화 기술, 및/또는 방사선 검출 등), 및 여기에서 개시된 검사 및 검출 방법(예컨대, 면역침전화, 웨스턴-블롯 분석, 등)을 사용하여, 진단용 샘플 내에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 피험체의 진단용 샘플은 HAUSP와 반응성인 제제를 사용하여 HAUSP 발현을 위해 검사될 수 있다. 여기에서 사용된 바의, "반응성"은 제제가 관심의 표적(예컨대, HAUSP)에 대하여 통제되거나 결합되거나 친화성을 갖는 것을 의미한다. 여기에서 더 사용된 바의, "제제"는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 분자, 화합물, 항생물질, 약물, 및 그의 조합을 포함한다. Fab 단편은 항체의 일가 항원 결합 단편이며, 이것은 파파인 분해에 의해 생성된다. F(ab')2 단편은 항체의 이가 항원 결합 단편이며, 이것은 펩신 분해에 의해 생성된다. 바람직하게는, 본 발명의 제제는 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지된다.
본 발명의 한 구현예에서, HAUSP와 반응성인 제제는 항체이다. 여기에서 사용된 바의, 본 발명의 항체는 다클론 또는 단일클론일 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체는 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 다클론 항체는, 예를 들어, 정제된 단백질(예컨대, HAUSP)를 사용하여 마우스, 토끼, 또는 쥐를 면역화함으로써 생성될 수 있다. 단일클론 항체는 그 후 면역화된 마우스로부터 비장을 제거하고, 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 배양액에서 성장할 때 단일클론 항체를 생성하게 될 하이브리도마를 형성하여 생성될 수 있다.
여기에서 사용된 항체는 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지될 수 있다. 항체의 표지화는 퍼옥시다제, 당업계에 공지된 화학적 발광 표지, 및 당업계에 공지된 방사성 표지를 포함하는 다양한 표지화 기술중의 하나를 사용하여 성취될 수 있다. 본 발명의 검출 가능한 마커 또는 표지는 예를 들어, 비방사능 또는 형광 마커, 예컨대, 비오틴, 플루오레세인(FITC), 아크리딘, 콜레스테롤, 또는 카르복시-X-로다민일 수 있으며, 이것은 당업계에서 용이하게 알 수 있는 형광 및 기타 화상 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 검출 가능한 마커 또는 표지는 예를들어, 방사성 동위원소를 포함하는 방사성 마커일 수 있다. 방사성 동위원소는 35S, 32P, 125I, 3H, 또는 14C와 같은 검출 가능한 방사선을 방사하는 동위원소이다. 방사성 동위원소에 의해 방사된 방사능은 당업계에 공지된 기술에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 방사성 동위 원소로부터의 감마 방사는 감마 화상 기술, 특히 신티그래피 화상을 사용하여 검출될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 제제는 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지된 높은 친화성의 항체(예컨대, α-HAUSP)이다.
본 발명의 제제가 HAUSP와 반응성인 항체인 경우, 피험체로부터 취하여진 진단용 샘플은 비드, 겔, 또는 평판 형태로 불용성 유기 중합체와 같은 고체 지지체에 부착된 리간드로서 HAUSP 항체(예컨대, α-HAUSP)를 포함하는 친화성 컬럼을 통해 통과함으로써 정제될 수 있다. 고체 지지체에 부착된 항체는 컬럼의 형태로 사용될 수 있다. 적당한 고체 지지체의 예로는, 제한함이 없이, 아가로스, 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 세파로스, 또는 기타 불용성 유기 중합체를 포함한다. HAUSP 항체(예컨대, α-HAUSP)는 필요하다면, 스페이서 분자를 통해 고체 지지체에 더 부착될 수 있다. 제제 및 항체의 결합을 확보하기 위한 적당한 결합 조건(예컨대, 온도, pH, 및 염 농도)는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, HAUSP 항체(예컨대, α-HAUSP)는 세파로스(Sepharose) 4B와 같은 세파로스 컬럼에 부착된다.
제제가 항체인 경우, 피험체의 진단용 샘플은 표준 면역학적 검출 기술에 따라, HAUSP와 면역반응성인 하나 이상의 항체를 이용한 결합 연구를 사용하여 HAUSP 발현에 대하여 검사될 수 있다. 예를 들어, 친화성 컬럼을 통해 용리된 HAUSP 단백질은 ELISA 검사, 웨스턴-블롯 분석, 유세포 측정법, 또는 기타 항원-항체 상호작용을 사용한 면역염색 방법이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 진단용 샘플은 웨스턴 블롯화를 사용한 HAUSP 발현에 대해 검사되었다.
대안적으로, 피험체의 진단용 샘플은 피험체로부터 취하여진 진단용 샘플로부터 추출된 핵산의 하이브리드화 분석을 사용하여 HAUSP 발현에 대하여 검사될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 하이브리드화 분석은 mRNA 의 노던-블롯 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 또한 HAUSP를 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는, 하나 이상의 핵산 프로브를 사용하여 DNA의 서던-블롯 분석에 의해 수행될 수 있다. 핵산 프로브는, 제한함이 없이, 하기를 포함하는 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다: HAUSP 핵산의 제한 효소 소화; 및 어플라이드 바이오시스템스 모델(Applied Biosystems Model) 392 DNA/RNA 합성기와 같은 상업적으로 입수가능한 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여, HAUSP 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 선택된 부분에 상응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 자동화된 합성.
본 발명에서 사용된 핵산 프로브는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 그 길이는 약 8 뉴클레오타이드 내지 단백질을 코딩하는(예컨대, HAUSP-코딩하는) 핵산의 전체 길이로 다양할 수 있다. 프로브에 사용된 핵산은 인간을 포함하는 포유 동물로부터 유도될 수 있다. 인체 HAUSP에 대한 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다(see , e.g., Everett 등, A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997). 이러한 서열을 프로브로 사용하여, 예를 들어 당업자는 다른 종으로부터 상응하는 HAUSP cDNA를 용이하게 클론할 수 있다. 추가로, 본 발명의 핵산 프로브는 하나 이상의 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지될 수 있다. 핵산 프로브의 표지화는 다수의 당업계에 알려진 방법- 예컨대, 닉 번역(nick translation), 종단 표지화, 필-인 종단 표지화(fill-in end labeling), 폴리뉴클레오타이드 키나제 교환 반응, 랜덤 프라이밍(random priming), 또는 SP6 폴리머라제(리보프로브 제조를 위해)중의 하나를 사용하여- 다양한 표지-예컨대, 5S, 32P, 또는 3H와 같은 방사성 표지, 비오틴, 플루오레세인(FITC), 아크리딘, 콜레스테롤, 또는 카르복시-X-로다민(ROX)과 같은 비방사성 표지 중의 하나와 함께 성취될 수 있다. HAUSP 핵산의 상이하거나 또는 중복 영역에 상응하는 2 이상의 핵산 프로브(또는 프라이머)의 조합이 또한 예를 들어 PCR 또는 RT-PCR을 사용하여 HAUSP 발현을 위한 진단용 샘플을 검사하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 검출에 이어 피험체의 진단용 샘플 내에서 HAUSP 발현의 정도를 측정 또는 정량화하는 검사가 수행될 수 있다. 이러한 검사는 당업자에게 잘 알려져 있는 것이며, HAUSP 단백질의 양을 측정하기 위한 면역 조직 화학/면역 세포 화학, 유세포 측정법, 질량 분광법, 웨스턴-블롯 분석, 또는 ELISA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 조직 화학 검사를 사용하기 위해, 조직의 조직학적 (파라핀-포매) 구획을 슬라이드 상에 놓을 수 있으며, 그 후 HAUSP에 대한 항체로 인큐베이션할 수 있다. 슬라이드는 그 후 이차 항체(일차 항체에 대하여)로 인큐베이션할 수 있으며, 이것은 염료 또는 다른 표색계(예컨대, 플루오로크롬, 방사능 제제, 또는 높은 전자 주사능을 갖는 제제)에 태그되어 구획 내에 존재하는 HAUSP의 구상화를 허용한다.
본 발명의 진단용 샘플은 피험체 또는 환자, 또는 상담 의사에 의해서가 아니라 실험실 기술자 또는 기타 임상의에 의해 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)에 대하여 종종 검사될 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 피험체 또는 환자의 상담 의사에게 HAUSP 발현에 대한 피험체 또는 환자의 진단용 샘플을 검사하도록 하여 수득된 결과의 보고서를 제공하는 것을 더 포함한다.
유사하게, 본 발명은 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2 (murine double minute 2) 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현의 검출이 피험체의 종양 진단인, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현을 위한 피험체의 진단용 샘플을 검사함으로써, 피험체가 종양을 보유하는지 아닌지를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상술한 바와 같이, 암은 HAUSP, Mdm2, 및/또는 p53에서의 결함을 포함하는 p53 경로 내의 결함과 관련된다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 p53-관련 종양의 평가, 검출, 진단, 감시, 및 치료에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 Mdm2- 또는 HAUSP-관련 종양의 평가, 검출, 진단, 감시, 및 치료에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 진단용 샘플은 상술한 바와 같이 HAUSP 단백질, HAUSP cDNA, 또는 HAUSP mRNA를 위한 검사에 의해 HAUSP 발현에 대해 검사될 수 있다. 추가로, 진단용 샘플은 Mdm2 단백질, Mdm2 cDNA, 또는 Mdm2 mRNA에 대한 검사에 의해 Mdm2 발현에 대해 검사될 수 있다. Mdm2의 적당한 형태는 여기에서 기술된 특정 기술을 근거로 명백해 질 것이다. 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플에 대한 예상 되는 또는 정상 수준의 HAUSP 발현은 상기 기술된 방법에 따라 측정될 수 있다. 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플에 대한 예상 또는 정상 수준의 Mdm2 발현은 HAUSP와 연관되어 상술한 바와 같이 동일 연령 및 동성의 질환이 없는 피험체를 검사함으로써 용이하게 측정될 수 있다.
바람직하게는, 정상치보다 높은 Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용)은 다르게 예상되지 않는다면 Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용)의 수준보다 10% 이상 큰 수준의 Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용) 이다. Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용)은 특정 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플에서 부재되는 것으로 예상되는 경우, 피험체 또는 환자의 Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용)의 정상 수준은 없다. 특정 피험체 또는 환자로부터 취하여진 특정 진단용 샘플이 낮은 수준의 구성적인 Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용)를 갖는 것으로 예상된다면, 낮은 수준은 피험체 또는 환자에 대한 정상 수준의 Mdm2 발현(또는 HAUSP 발현, 또는 Mdm2-HAUSP 상호작용)이다.
피험체 또는 환자가 종양을 가졌는지 여부를 결정하기 위하여 진단용 샘플은 임의 또는 모든 형태의 Mdm2 및 HAUSP 단백질(전구체, 엔도단백질분해 진행 형태, 및 후-번역 변형으로부터 초래되는 기타 형태를 포함)의 발현에 대하여 검사될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 진단용 샘플은 Mdm2-HAUSP 상호작용의 증가를 검출함으로써 정상치보다 높은 Mdm2의 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP의 발현에 대해 검사될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 정상치보다 높은 Mdm2의 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현은 진단용 샘플 내에서 정상치보다 높은 Mdm2-HAUSP 상호작용을 검출함으로써 진단용 샘플내에서 검출된다.
피험체의 진단용 샘플은 여기에서 기술된 방법에 따라 Mdm2 발현, HAUSP 발현, 및/또는 Mdm2-HAUSP 상호작용에 대하여 검사될 수 있다. Mdm2 발현, HAUSP 발현, 및/또는 Mdm2-HAUSP 상호작용은 여기에서 개시된 검사 및 검출 방법뿐만 아니라 당업계의 공지 기술로부터 용이하게 결정되는 검사 및 검출 방법을 사용하여 진단용 샘플 내에서 또한 검출될 수 있다.
예를 들어, 피험체의 진단용 샘플은 피험체로부터 취하여진 진단용 샘플로부터 추출된 핵산의 하이브리드화 분석을 사용하여 Mdm2 발현에 대하여 검사될 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 Mdm2를 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 프로브를 이용한다. 한 구현예에서, 핵산 프로브는 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지된다. 대안적으로, 피험체의 진단용 샘플은 Mdm2와 반응성인 제제를 사용하여 Mdm2 발현에 대하여 검사될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 제제는 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지된다. 본 발명의 한 구현예에서, Mdm2와 반응성인 제제는 항체이다(예컨대, 항-Mdm2 단일클론 항체, 4b2).
본 발명의 제제가 Mdm2와 반응성인 항체일 때, 피험체로부터 취하여진 진단용 샘플은 HAUSP 검출에 대하여 상술한 기술에 따라, 비드, 겔, 또는 평판 형태로 불용성 유기 중합체와 같은 고체 지지체에 부착된 리간드로서 항-Mdm2 항체를 포함하는 친화성 컬럼을 통해 통과함으로써 정제될 수 있다. 추가로, 제제가 항-Mdm2 항체인 경우, 피험체의 진단용 샘플은 HAUSP와 관련하여 상기 기술된 바와 같은, 표준 면역학적 검출 기술에 따라, Mdm2와 면역반응성인 하나 이상의 항체를 이용한 결합 연구를 사용하여 Mdm2 발현에 대하여 검사될 수 있다.
본 발명의 방법에서 Mdm2 발현, HAUSP 발현, 및/또는 Mdm2-HAUSP 상호작용의 검출에 이어 피험체의 진단용 샘플에서 Mdm2 발현, HAUSP 발현, 및/또는 Mdm2-HAUSP 상호작용의 정도를 측정 또는 정량화하기 위한 검사가 수행될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 Mdm2 발현, HAUSP 발현, 및/또는 Mdm2-HAUSP 상호작용에 대하여 피험체 또는 환자의 진단용 샘플을 검사하였을 때 수득 되는 결과의 보고를 피험체의 또는 환자의 상담 의사에게 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 종양 치료를 받았거나 치료 중인 피험체 또는 환자에서 종양을 치료하기 위한 요법의 효능성을 평가하기 위한 방법을 더 제공한다. 본 발명의 방법은 HAUSP 발현의 정상 수준의 검출이 종양 치료 요법에 성공적인 것을 나타내며, 정상치보다 높은 HAUSP 발현의 검출은 종양 치료 요법이 계속적으로 필요함을 나타내는, HAUSP 발현에 대한 피험체 또는 환자의 진단용 샘플 검사를 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 정상치보다 높은 HAUSP 발현은 정상치보다 높은 p53-HAUSP 상호작용 검출에 의하여 검출된다. 종양은 p53-관련 종양을 포함하는 상술한 것일 수 있다. 진단용 샘플은 상술한 바와 같이 조직 또는 체액일 수 있으며, 시험관내 또는 생체내에서 HAUSP의 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)에 대하여 검사될 수 있다. 게다가, 진단용 샘플은 상술한 검출 및 정량화의 다양한 검사 및 방법 모두를 사용하여 HAUSP의 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)에 대하여 검사될 수 있다. 본 발명의 방법은 피험체 또는 환자로부터 취하여진 진단용 샘플 내에서 HAUSP의 발현 (또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준의 주기적 평가를 허용함으로써 종양 치료 요법의 효능성을 감시하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라, 피험체 또는 환자의 진단용 샘플을 검사하고, 종양 치료 요법의 개시에 이어 임의의 시간에서 HAUSP의 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 평가될 수 있다. 예를 들어 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 피험체 또는 환자가 종양에 대한 치료가 여전히 진행 중인 동안 평가될 수 있다. 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플 내에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 계속해서 정상치보다 높은 수준으로 남는 경우, 의사는 종양에 대한 피험체 또는 환자의 치료를 계속 하도록 선택할 수 있다. 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플 내에 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 계속적인 평가를 통해 감소 되는 경우, 종양에 대한 치료가 효과적이며 치료는 감소될 수 있거나 또는 심지어 중지된다는 것을 나타낼 수 있다. 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플 내의 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 계속적인 평가를 통해 신속하게 감소하지 않는 경우, 종양에 대한 치료가 효과적이지 않으며, 치료는 증가될 수 있음을 나타낼 수 있다. 정상치보다 높은 수준에서 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플 내에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)이 더 이상 검출되지 않는 경우, 의사는 종양에 대한 치료가 성공적이며, 이러한 치료가 중지될 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
종양이 피험체 또는 환자에게 재발하는지 여부를 결정하기 위해, 종양에 대한 피험체 또는 환자의 치료의 완결에 이어 HAUSP 발현 수준의 평가는 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 검사된 진단용 샘플 내의 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준의 평가는 종양으로 진단된 환자의 추적 조사의 행위에 대한 편리한 방식을 제공할 수 있다. 더욱이, 임상 또는 병리학적 단계의 도구로서, 피험체 또는 환자의 종양 형성의 정도를 결정하는 수단으로서, 및 적당한 치료 옵션을 확인하는 수단으로서, 검사된 진단용 샘플 내에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 평가된 수준의 사용은 본 발명의 범위 내이다.
본 발명은 또한 진단용 샘플에서 정상 Mdm2 발현 및 정상 HAUSP 발현의 검출이 종양 치료에 대한 성공적인 요법을 나타내며, 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현의 검출이 종양 치료에 대한 계속적인 요법이 필요함을 나타내는 Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대한 피험체의 진단용 샘플을 검사에 의해 종양 형성에 대한 치료가 진행되었거나 진행중인 피험체에서의 종양 치료에 대한 요법의 효능 평가방법을 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현이 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2-HAUSP 상호작용 검출에 의해 진단용 샘플에서 검출된다. 종양 형성은 p53-관련 종양 형성을 포함하는 상기 기술된 바의 것일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적당한 진단용 샘플, 검사, 및 검출 및 정량화 방법은 이미 기술되었다.
일반적으로 암을 갖는 환자의 종양 존재량 및 생존 간에 상관관계가 존재한다. 그러므로, HAUSP 발현에 대한 피험체의 진단용 샘플 검사는 종양 형성을 갖는 피험체 또는 환자의 예후에 관한 정보를 제공하는 유용한 수단이 될 수 있음이 본 발명에서 또한 고려되어진다 따라서, 본 발명은 피험체의 예후가 피험체의 진단용 샘플에서 HAUSP 발현의 감소로 개선되며, 피험체의 예후가 피험체의 진단용 샘플에서 HAUSP 발현의 증가으로 더 악화되는, HAUSP 발현에 대한 피험체의 진단용 샘플의 검사를 포함하는 종양 형성을 갖는 피험체의 예후의 평가 방법을 더 제공한다. 본 발명의 한 구현예에서, 정상치보다 높은 HAUSP 발현은 정상치보다 높은 p53-HAUSP 상호작용 검출에 의해 검출된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적당한 진단용 샘플, 검사, 및 검출 및 정량화 방법은 이미 기술되었다. 본 발명의 방법은 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플 내에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준을 근거로 하여 종양 형성을 갖는 것으로 진단된 피험체 또는 환자의 예후를 결정하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라, 피험체 또는 환자의 종양 형성의 진단 동안 또는 후의 임의의 시간에서, 피험체 또는 환자의 진단용 샘플이 검사될 수 있으며, HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 평가될 수 있다. 예를 들어, 검사된 진단용 샘플 내의 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 피험체 또는 환자의 초기 예후를 결정하기 위하여, 피험체 또는 환자가 종양 형성을 위한 치료를 받기 전에 평가될 수 있다. 추가로, 검사된 진단용 샘플 내의 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준은 피험체 또는 환자의 예후가 치료 경로를 통해 다소 바람직하게 되었는지 여부를 결정하기 위해, 피험체 또는 환자가 종양 형성을 위한 치료를 받는 동안 평가될 수 있다.
예를 들어, 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플에서 검출된 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 상당히 높거나, 또는 계속해서 남아있는 경우, 의사는 피험체 또는 환자의 예후가 바람직하지 않을 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)이 계속적인 평가를 통해 저하된 경우, 피험체 또는 환자의 예후가 개선되었음을 나타낼 수 있다. 피험체 또는 환자의 검사된 진단용 샘플에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용)의 수준이 계속적인 평가를 통해 상당히 저하되지 않는 경우, 피험체 또는 환자의 예후가 개선되지 않았음을 나타낼 수 있다. 마지막으로, 피험체 또는 환자의 진단용 샘플에서 HAUSP 발현(또는 p53-HAUSP 상호작용) 이 낮거나, 또는 정상인 경우, 의사는 피험체 또는 환자의 예후가 바람직하다는 결론을 내릴 수 있다.
유사하게, 본 발명은 피험체의 예후가 진단용 샘플에서 Mdm2 발현의 감소 및 HAUSP 발현의 감소의 검출로 개선되며, 피험체의 예후가 진단용 샘플에서 Mdm2 발현의 증가 및 HAUSP 발현의 증가의 검출로 더 악화되는, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대한 피험체의 진단용 샘플의 검사에 의한 종양 형성을 갖는 피험체의 예후 평가 방법이 제공된다. 한 구현예에서, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현이 진단용 샘플에서 Mdm2-HAUSP 상호작용의 검출에 의해 진단용 샘플 내에서 검출된다.
HAUSP가 종양 형성을 나타내는 세포에서 검출될 수 있다는 발견은 종양 형성을 갖는 환자를 확인하는 수단을 제공하며, 종양 형성의 진단을 위한 시험 형태에서의 상업적인 적용의 잠재성을 나타낸다. 이러한 시험의 개발은 일반적인 스크리닝 절차를 제공할 수 있다. 이러한 절차는 암의 초기 검출 및 진단에 원조할 수 있으며, 정상치보다 높은 HAUSP 발현(p53-HAUSP 상호작용 포함) 및 Mdm2 발현(Mdm2-HAUSP 상호작용 포함)이 검출된 환자의 추적 조사를 위한 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 HAUSP의 발현(및 p53-HAUSP 상호작용)을 검출하기 위한 적당한 시약 및 HAUSP 와 반응성인 제제를 포함하는 종양 형성의 검사로서 사용하기 위한 키트를 더 제공한다. 본 발명은 또한, 하기를 포함하는 종양 검출에 사용하기 위한 키트를 제공한다: (a) Mdm2와 반응성인 하나 이상의 제제; (b) HAUSP와 반응성인 하나 이상의 제제; 및 (c) Mdm2의 발현 및 HAUSP의 발현을 검출하기에 적당한 시약. 제제는 상술한 것일 수 있으며, HAUSP 발현, Mdm2 발현, p53-HAUSP 상호작용, 및 Mdm2-HAUSP 상호작용을 검출 또는 정량화하기 위한 상술한 검사 또는 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 하나 이상의 제제는 검출 가능한 마커 또는 표지로 표지된다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 전체 암 경우의 60% 이상이 p53 돌연변이와 관련된다. 따라서, p53은 많은 암을 치료하기 위해 중요하며, p53 경로는 특히 관심의 촛점이다. p53은 일반적으로 안정한 단백질이 아니다; 그것은 약 20분의 반감기를 가지며 유비퀴틴화(유비퀴틴의 결합)에 이어 단백질 분해 경로에서 프로테아좀에 의해 매우 빠르게 분해된다. p53의 안정화는 종양 억제자로서 환자의 효능을 위해 중요하다고 믿어진다.
본 발명은 HAUSP(또는 USP7)이 p53으로부터 유비퀴틴을 제거함으로써 p53 종양 억제자를 안정화할 수 있으며, 따라서 단백질 분해로부터 p53을 구한다. 따라서, HAUSP는 탈유비퀴나제이다. HAUSP는 p53의 반감기를 20분 에서 90분으로 증가시켜 상당히 향상시킨다. 흥미롭게, 하기 기술되는 바와 같이, HAUSP는 또한 유전자가 발현되었을 때 종양 억제자로서 행위하는 것으로 나타난다. HAUSP의 종양 억제자 기능은 p53에 의존한다고 믿어진다. 탈유비퀴나제가 효모로 확인되었고 포유동물 세포에 존재하는 것으로 알려져 있지만, 특정 탈유비퀴나제가 기질 특이성을 갖는다는 것을 논증한 것은 본 발명자들의 지식으로 처음 여기에서 나타낸 발견이다.
p53 경로에서 결함과 관련된 몇몇 암은 p53에서의 결함에 기인하는 것이 아니라, 돌연변이된 HAUSP(예컨대, 코딩 영역에서 유전 변경으로부터 초래되는 돌연 변이) 및/또는 발현 수준에서 HAUSP 조절의 결함(예컨대, HAUSP 유전자의 프로모터 부위에서 유전 변경으로부터 초래되는 결함) 및/또는 발현된 수준에서 Mdm2 조절의 결함 및/또는 돌연변이된 Mdm2에 기인하는 것으로 예상된다. 앞서 말한 관점에서, 세포내의 HAUSP, Mdm2, 및/또는 HAUSP-Mdm2의 수준의 조절은 p53의 종양 억제자 기능 향상, 및 HAUSP 자신의 종양 억제자 활성을 갖는 기능의 보충을 위한 수단을 제공한다는 것은 명백하다. 따라서, 본 발명은 피험체의 HAUSP의 증가 활성을 포함하는, 종양 치료가 필요한 피험체에서 종양의 치료를 위한 방법을 더 제공한다. 종양은 상술한 것일 수 있지만, 바람직하게는 p53-관련 종양이다.
본 발명의 방법에 따라, 피험체에서의 HAUSP의 활성은 HAUSP를 직접적으로 표적화함으로써 증가시킬 수 있다. 따라서, 피험체 내의 HAUSP의 활성은 피험체에서 HAUSP의 기능 또는 수준을 조정 또는 조절할 수 있는 효소 또는 기타 내인성 분자를 표적화함으로써, 간접적으로 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 피험체에서의 HAUSP 활성은 본 발명의 방법에서 10% 이상 향상된다. 더 바람직하게는, HAUSP 활성은 20% 이상으로 향상될 수 있다.
예를 들어, 피험체에서 HAUSP의 활성은 (예컨대, HAUSP와 상호작용하는 단백질의 조절 또는 조절에 의해) 피험체에서 HAUSP의 하나 이상의 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 활성화, 촉진화, 또는 자극함으로써 증가될 수 있다. 여기에서 사용된 바의 용어 "활성화"는 피험체에서 HAUSP의 기능을 자극 또는 유도하는 것, 특히 p53의 탈유비퀴틴화, 및 그 결과의 안정성을 의미한다. 본 발명의 방법에서, 피험체에서의 HAUSP는 예를 들어 상기 정의된 바와 같이 HAUSP를 자극하거나 또는 HAUSP와 반응성인 작은 분자 또는 단백질 의태물을 피험체에게 투여되어 활성화될 수 있다.
피험체에서의 HAUSP의 활성은 또한 피험체 내에서 HAUSP 발현의 상향 조절을 직접적으로 또는 간접적으로 야기, 유발, 또는 자극함으로써 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 피험체의 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 HAUSP 발현의 조절제를 피험체에 투여함으로써 피험체에서의 HAUSP의 활성이 증가된다. 여기에서 사용된 바의, "발현의 조절제(modulator of expression)"은 특이 단백질의 발현에 대하여 길항(저해) 또는 작동(촉진)을 갖는 제제의 조합 또는 임의의 제제일 수 있다. 따라서, 발현의 조절제는 작동제 또는 길항제일 수 있다. 본 발명의 조절제는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 분자, 화합물, 항생물질, 및 약물 및 단백질의 발현을 유도하거나 상향 조절하는 관심 있는 단백질(예컨대, HAUSP)과 반응성인 제제를 포함한다.
HAUSP의 조절제는 단순한 스크리닝 검사를 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, HAUSP의 후보 조절제를 스크린 하기 위해, 인체 폐 암종 세포(H1299)를 마이크로타이터 평판에서 평판 배양하고, 그 후 약물의 라이브러리와 접촉한다. HAUSP 발현의 증가 또는 상향 조절하는 결과는 그 후 ELISA를 포함하는 당업계의 공지 기술인 핵산 하이브리드화 및/또는 면역학적 기술을 사용하여 검출될 수 있다. HAUSP 발현의 추가 조절제는 당업계에 잘 알려지거나 또는 여기에서 개시된 스크리닝 절차를 사용하여 확인될 수 있다. HAUSP의 조절제는 HAUSP의 발현을 유도 또는 상향 조절할 수 있는 약물일 것이다. 이 방식에서, 후보 조절제는 또한 신생물 내에서 세포의 성장 또는 세포 분할이 속도의 감소, 또는 정지된 지시자로서의 HAUSP 발현을 사용하여 신생물의 증식을 저해하는 이들의 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다.
HAUSP 발현의 조절제는 종양의 치료 효과 증가, 표적화의 효능 증가, 및/또는 p53 탈유비퀴틴화의 효능의 증가를 위해 항종양성 약물 또는 리보자임과 같은 다른 제제와 조합하여 투여되거나 다른 제제에 결합될 수 있다는 것은 본 발명의 내에 속한다. HAUSP 발현의 조절제가 결합될 수 있는 항종양성 약물의 예로는, 제한함이 없이, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 데옥소루비신, 에토포사이드, 및 빈크리스틴을 포함한다.
피험체에서의 HAUSP의 활성은 또한 피험체의 체내 HAUSP의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시켜 피험체 내에서 증가될 수 있다. 예를 들어, 피험체에서 HAUSP의 수준은 피험체에서 종양 치료를 위해 효과적인 양으로 HAUSP 단백질을 피험체에게 투여하여 증가시킬 수 있다. 유사하게, 피험체에서 HAUSP의 수준은 피험체에서 HAUSP의 발현을 허용하는 방식으로, 및 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 HAUSP를 코딩하는 핵산 서열을 피험체에게 투여함으로써 증가될 수 있다.
본 발명은 시험관내에서(예컨대 화학적인 수단에 의해 또는 mRNA의 시험관내 번역에 의해) 폴리펩티드의 합성에 의해 산출된 단백질 및 단백질 유사체의 용도를 심사숙고하였다. 예를 들어, HAUSP 및 Mdm2는 당업자에게 일반적으로 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다(Modern Techniques of Peptide and Amino Acid Analysis (New York: John Wiley & Sons, 1981; Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis (New York: Springer-Verlag New York, Inc., 1984). 아미노산 서열, 및 이들 서열의 유사체의 합성에 사용될 수 있는 방법의 예는 제한되는 것은 아니지만, 고체상 펩티드 합성, 용액 방법 펩티드 합성, 및 상업상 이용할 수 있는 펩티드 합성기를 사용한 합성을 포함한다. 본 발명의 아미노산 서열은 단백질 서열의 합성에 사용되며, 당업자에게 잘 알려진 결합제 및 보호기를 함유할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, HAUSP 단백질은 단독으로 또는 종양의 치료에 사용되는 하나 이상의 항종양성의 약물과 조합하여 종양을 보유하는 피험체에게 투여될 수 있다. HAUSP 단백질이 결합될 수 있는 항종양성 약제의 예는 제한함이 없이 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 독소루비신, 에토포사이드, 및 빈크리틴을 포함한다.
본 발명의 방법에서, HAUSP 발현의 조절제, HAUSP 단백질, 또는 HAUSP를 코딩하는 핵산 서열은 피험체에서 종양을 치료하기에 효과적인 양으로 종양을 보유하는 피험체에게 투여된다. 여기에서 사용된 바의, 구 "종양을 치료하기에 효과적인"은 종양으로부터 초래하는 임상적인 손상 또는 증상을 개선하거나 최소화하기 위해 효과적인 것을 의미한다. 예를 들어, 종양의 임상학적인 손상 또는 증상은 만약 그렇지 않으면 이러한 치료의 부재시 예측되는 것을 넘어서 피험체의 생존을 연장함으로써; 종양의 성장 또는 만연을 억제하거나 또는 방지함으로써; 또는 신생물 내에서 세포의 성숙 및 증식을 한정, 중지, 종결, 또는 그렇지않으면 제어함으로써 피험체에 의해 겪는 통증 또는 불쾌감을 감소함으로써 개선 또는 최소화될 수 있다. 피험체에서 종양을 치료하기에 효과적인 HAUSP 발현의 조절제, HAUSP 단백질, 또는 HAUSP를 코팅하는 핵산의 양은 종양의 형태, 종양의 단계, 피험체의 체중, 피험체의 상태의 심각성, 및 투여 방법을 포함하는 각 경우의 특정 인자에 의존하여 변할 것이다. 이들 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, HAUSP 발현의 조절제, HAUSP 단백질, 또는 HAUSP를 코팅하는 핵산 서열은, 제한함이 없이, 경구 투여, 비경구 투여(예컨대, 근막상, 소관내(intracapsular), 피부내(intracutaneous), 피내(intradermal), 근육내, 안와내(intraorbital), 복강내, 척수내(intraspinal), 흉골내(intrasternal), 혈관내, 정맥내, 실질(parenchymatous), 또는 피하 투여), 경피 투여(transdermal administration) 및 삼투 펌프에 의한 투여를 포함하는 공지 절차에 의해 인간 또는 동물 피험체에게 투여될 수 있다. 투여의 한 바람직한 방법은 정맥 내 또는 피하 투여에 의한 비경구 투여이다.
경구 투여를 위해, HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산의 배합물은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 또는 현탁액으로 존재할 수 있다. 배합물은 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분, 또는 감자 전분과 같은 통상의 첨가제를 가질 수 있다. 배합물은 또한 결정성 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴과 같은 결합제와 존재할 수 있다. 추가로, 배합물은 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 붕괴제(disintegrator)와 존재할 수 있다. 배합물은 또한 2염기성 인산 칼슘 또는 나트륨 전분 글리콜레이트와 존재할 수 있다. 마지막으로, 배합물은 탈크 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제와 존재할 수 있다.
비경구 투여를 위해, HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산은, 바람직하게는 피험체의 혈액과 등장성인, 멸균 수용액과 조합될 수 있다. 이러한 배합물은 수용액을 생성하기 위해, 생리학적 조건에 적합한 완충 pH를 가지며, 염화나트륨, 글리신, 등과 같은 생리적으로 적합한 물질을 포함하는 물 중에 고체 활성 성분을 용해하고, 그 후 상기 멸균 용액을 제공하여 제조될 수 있다. 배합물은 밀봉된 앰풀 또는 바이알과 같은 1회 복용량 또는 다회 복용량 용기에 존재할 수 있다. 배합물은 또한 상술한 것을 포함하는 주사 방식에 의해 전달될 수 있다.
경피 투여에 대하여, HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이소프로판올, 에탄올, 올레산, N-메틸피롤리돈, 등과 같은 피부 침투 향상제와 조합될 수 있으며, 이것은 조절제, 단백질, 또는 핵산으로의 피부의 침투성을 증가시키고, 피부를 통해 혈류로 조절제, 단백질 또는 핵산을 침투하도록 허용한다. 향상제 및 조절제, 단백질, 또는 핵산의 조성물은 또한 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 에틸렌/비닐아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 등과 같은 중합 물질과 더 조합되어 겔 형태의 조성물을 제공할 수 있으며, 이것은 염화메틸렌과 같은 용매 내에서 용해, 원하는 점도로 증발, 및 그 후 이면재(backing material)에 적용되어 패치를 제공할 수 있다. 조절제, 단백질, 또는 핵산은 신생물이 국소화된 피험체의 부위 상에 또는 근처에 경피적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 조절제, 단백질, 또는 핵산은 전신 투여를 성취하기 위해, 영향을 받은 영역 이외의 부위에 경피적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산은 또한 삼투 미니-펌프 또는 기타 시간 배출 장치로부터 방출되거나 전달될 수 있다. 간단한 삼투 미니-펌프(elementary osmotic mini-pump)로부터의 방출 속도는 방출 오리피스 내에 배치된 미공성의, 빠른 응답 겔로 조절될 수 있다. 삼투 미니-펌프는 조절제, 단백질, 또는 핵산의 방출 제어, 또는 표적화 전달에 유용하다.
본 발명의 방법에 따라, HAUSP 발현의 조절제는 단백질이거나, 또는 HAUSP 단백질은 선택의 요법인 경우, 단백질은 단백질 자체로 피험체에 도입되거나 또는 단백질 발현을 허용하는 방식으로 단백질을 코딩하는 핵산을 피험체에 도입함으로써 피험체에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 피험체에서의 HAUSP의 활성은 많은 양의 단백질(예컨대, HAUSP 발현의 조절제, 또는 HAUSP 단백질 자체)을 피험체에게 투여하여 증가될 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 피험체에서의 HAUSP활성은 단백질(예컨대, HAUSP 발현의 조절제, HAUSP 단백질 그자체)를 코딩하는 핵산 서열을 피험체에서 HAUSP의 발현을 허용하는 방식으로 피험체에게 투여하여 증가될 수 있다.
본 발명의 단백질은 예를 들어, 주사 및 수혈(transfusion)을 포함하는 단백질 및 기타 약제의 도입을 위해 사용되는 공지 기술에 의해 피험체에게 투여되거나 또는 도입될 수 있다. 신생물이 피험체의 몸의 특정 영역에 국소화된 경우, 주사 또는 기타 다른 수단에 의해(예컨대, 혈액 또는 다른 체액으로 단백질을 도입함으로써), 치료 단백질을 그 영역에 직접 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 사용된 단백질의 양은 상술한 바와 같이 피험체에서 종양을 치료하기 위해 효과적인 양이며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, HAUSP 발현의 조절제가 단백질인 경우, 또는 HAUSP 단백질이 선택 요법인 경우, 단백질은 또한 피험체에서 단백질의 발현을 허용하는 방식으로 단백질을 코딩하는 피험체 핵산의 충분한 수의 세포로 도입함으로써 피험체에게 투여 또는 도입될 수 있다. 치료 단백질을 코딩하는 핵산의 양은 피험체에서 상기 정의된 바와 같은 종양의 치료에 효과적인 양으로 단백질을 생성하게 될 양이다. 이러한 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
HAUSP 발현의 뉴클레오타이드 조절제 뿐만 아니라 HAUSP 발현의 조절제, 또는 HAUSP 단백질을 코딩하는 핵산, 모두는 제한함이 없이 전기 영동, DEAE 덱스트란 트랜스펙션, 인산칼슘 트랜스펙션, 리포펙션, 일가양이온 리포솜 융합, 다가양이온 리포솜 융합, 원형질체 융합, 생체내 전기 장의 창출, DNA-피복된 미세입자 충격(microprojectile bombardment), 재조합 복제-결함 바이러스를 사용한 주사, 상동성 재조합, 생체내 유전자 요법, 생체 외 유전자 요법, 바이러스 벡터, 및 네이키드(naked) DNA 전달, 또는 그의 조합을 포함하는, 당업계의 통상의 절차를 사용하여 피험체에 도입될 수 있다. 유전자 요법을 위해 적당한 재조합 바이러스 벡터는, 제한되는 것은 아니지만, 레트로바이러스, HSV, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 세밀리키 포리스트(Semiliki Forest) 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 백시니아 바이러스와 같은 이러한 바이러스의 게놈으로부터 유도된 벡터를 포함한다.
HAUSP 발현의 조절제를 코딩하는 핵산, 또는 HAUSP 단백질 자체를 코딩하는 핵산이 통상의 절차를 사용하여 시험관내에서 적당한 세포로 도입되어 세포내에서 치료 단백질의 발현을 성취하는 것은 본 발명에 속한다. HAUSP 발현의 조절제를 발현하는 세포, 또는 HAUSP 단백질은 그 후 생체내에서 종양을 치료하는 환자에게 도입될 수 있다. 이러한 생체 외 유전자 요법의 접근에서, 세포는 바람직하게는 치료 단백질을 코딩하는 핵산을 혼입하는 DNA 기술을 수행하여, 피험체로부터 제거되며, 그 후 피험체으로 재도입된다.
HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산을 함유하는 배합물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 더 회합될 수 있으며, 이와 같이 하여 약제학적 조성물을 포함하는 것 역시 본 발명에 속한다. 따라서, 본 발명은 HAUSP 발현의 조절제, 또는 HAUSP 단백질 또는 HAUSP를 코딩하는 핵산 서열, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 더 제공한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물의 다른 성분과의 상화성의 면에서 "허용 가능한" 것이어야 하며, 그의 수령자에 유해하지 않아야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 그중에서도 카르복시메틸 셀룰로오스, 결정성 셀룰로오스, 글리세린, 아라비아검, 락토오스, 스테아르산 마그네슘, 메틸 셀룰로오스, 분말, 염수, 아르긴산 나트륨, 슈크로오스, 전분, 탈크 및 물을 포함한다. 약제학적 조성물의 배합물은 단위 투약으로 편리하게 존재할 수 있다.
본 발명의 배합물은 약제학적 기술에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산은 현탁액 또는 용액으로서 담체 또는 희석제와 회합될 수 있다. 임의로, 하나 이상의 부성분(예컨대, 완충액, 향미제, 표면활성제, 등)이 또한 첨가될 수 있다. 담체의 선택은 투여 경로에 의존될 것이다. 약제학적 조성물은 본 발명의 HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산을 종양을 치료할 피험체에게 투여하기 위해 유용할 것이다. HAUSP 조절제, 단백질, 또는 핵산은 약제학적 조성물이 투여되는 피험체의 종양을 치료하기 위해 효과적인 양으로 제공된다. 양은 상술한 바와 같이 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다.
본 발명은 p53의 활성이 피험체의 Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절함으로써 p53의 활성이 피험체에서 증가 또는 향상되는, 피험체에서 p53 활성의 증가 또는 향상에 의해 피험체의 종양을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 피험체에서의 p53활성은 본 발명의 방법에서 10% 이상으로 증가 또는 향상된다. 더 바람직하게는 p53 활성은 20% 이상에 의해 증가 또는 향상된다. 종양은 상술한 것일 수 있지만, 바람직하게는 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 종양이다.
Mdm2-HAUSP 상호작용은 피험체에게 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제를 투여함으로써 피험체에서 조절될 수 있다. 여기에서 사용된 바의, "Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제"는 Mdm2-HAUSP 상호작용에 대하여 길항(저해) 또는 작동(촉진) 효과을 갖는 제제의 조합 또는 임의의 제제일 수 있다. 따라서, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제는 작동제 또는 길항제일 수 있다. Mdm2-HAUSP의 조절제는 Mdm2 단백질, Mdm2를 코딩하는 핵산 서열, Mdm2 발현의 조절제, HAUSP 단백질, HAUSP를 코딩하는 핵산 서열, HAUSP 발현의 조절제, Mdm2-HAUSP 복합체와 반응성인 제제, 및 Mdm2-HAUSP 상호작용을 직접 조절하는 제제일 수 있다. Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제는 현재 알려진 것 또는 나중에 발견되는 것을 포함하며, 또한 천연 또는 합성일 수 있다.
예로서, Mdm2-HAUSP 상호작용은 피험체의 체내 Mdm2 및 HAUSP의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시킴으로써 피험체에서 조절될 수 있다. 피험체에서 Mdm2 또는 HAUSP의 수준은 피험체에게 각기 Mdm2 단백질 또는 HAUSP 단백질을 투여함으로써 증가될 수 있다. 유사하게, 피험체에서 Mdm2 (또는 HAUSP)의 수준은 피험체의 Mdm2(또는 HAUSP)의 발현을 허용하는 방식으로 Mdm2(또는 HAUSP)를 코딩하는 핵산 서열을 피험체에게 투여함으로써 증가될 수 있다.
Mdm2-HAUSP 상호작용은 피험체의 Mdm2 또는 HAUSP의 하나 이상의 기능을 (예컨대 Mdm2 또는 HAUSP와 상호작용하는 단백질의 조절 또는 조절에 의해) 직접적으로 또는 간접적으로 활성화, 촉진화, 또는 자극함으로써 피험체에서 또한 조절될 수 있다. 피험체에서의 Mdm2(또는 HAUSP)는 예를 들어 Mdm2(또는 HAUSP)를 자극하거나 또는 Mdm2(또는 HAUSP)와 반응성인 작은 분자 또는 단백질 의태물을 피험체에게 투여함으로써 활성화될 수 있다. 더욱이, Mdm2-HAUSP 상호작용은 피험체 내에서 Mdm2(또는 HAUSP) 발현의 상향 조절을 직접적으로 또는 간접적으로 야기, 유발, 또는 자극함으로써 피험체에서 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, Mdm2-HAUSP 상호작용은 Mdm2(또는 HAUSP) 발현의 조절제를 피험체에게 투여함으로써 피험체에서 Mdm2-HAUSP 상호작용이 조절된다.
더욱이, Mdm2-HAUSP 상호작용은 Mdm2-HAUSP 복합체와 반응성이거나 그렇지 않으면 Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절하는 단백질을 직접적으로 또는 간접적으로 활성화, 촉진, 조절, 조절, 또는 자극함으로써 피험체에서 조절될 수 있다. 따라서, 다른 구현예에서, Mdm2-HAUSP 상호작용은 Mdm2-HAUSP 복합체와 반응성인 제제 및 Mdm2-HAUSP 상호작용을 직접적으로 조절하는 제제를 피험체에게 투여함으로써 피험체에서 조절된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 조절제는 제한함이 없이, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 분자, 화합물, 항생 물질, 약제, HAUSP 발현을 유도하거나 상향 조절된 HAUSP와 반응성인 제제, Mdm2 발현을 유도하거나 상향 조절된 Mm2와 반응성인 제제, 및 Mdm2-HAUSP 복합체와 반응성인 제제를 포함한다. Mdm2의 조절제는 단순한 스크리닝 검사를 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, Mdm2의 후보 조절제를 스크린 하기 위해, 세포 (예컨대, Mdm2-무기능(null) 세포 또는 Mdm2를 포함하는 세포)를 마이크로타이터 평판에서 평판 배양하고, 그 후 약물의 라이브러리와 접촉시킨다. 그 후, Mdm2 발현의 증가 또는 상향 조절의 결과는 ELISA를 포함하는 당업계의 공지 기술인 핵산 하이브리드화 및/또는 면역학적 기술을 사용하여 검출될 수 있다. Mdm2의 조절제는 Mdm2의 발현을 유도 또는 상향 조절하는 약물일 것이다. Mdm2-HAUSP 복합체와 반응성인 제제 및 Mdm2-HAUSP 상호작용을 직접적으로 조절하는 제제뿐만 아니라 Mdm2 발현의 추가 조절제는 당업계에 공지되거나 여기에서 개시된 스크리닝 절차를 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 방법에서, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제는 종양을 보유하는 피험체에게 여기에서 기술된 것을 포함하는 공지 절차에 의해 투여(단독으로 또는 하나 이상의 항종양성 약물과 조합하여)된다. 선택의 조절제는 피험체의 p53의 활성을 증가 시키기 위한 효과적인 양으로 제공되어 피험체에서의 종양을 치료한다. 이 양은 종양의 형태, 종양의 단계, 피험체의 체중, 피험체의 상태의 심각성, 및 투여 방법을 포함하는 각 경우의 특정 인자에 의존하여 변할 것이지만, 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 발명자들은 p53과 상호작용하는 HAUSP를 결정하기 위해 친화성-정제된 p53-관련 인자의 질량 분광 분석을 사용하였다. HAUSP는 과량의 Mdm2의 존재에서조차, p53을 강하게 안정화하며, p53-의존 세포-성장 억제 및 아톱포시스를 유도한다. 중요하게, HAUSP는 시험관내 및 생체내 양자에서, 특이적으로 p53을 탈유비퀴틴화하는 고유 효소 활성을 갖는다. 반대로, 세포내에서의 촉매-불활성 HAUSP 점 돌연변이의 발현은 p53 유비퀴틴화의 수준을 증가시키며 p53을 불안정화시킨다. 이러한 발견은 p53이 직접적인 탈유비퀴틴화에 의해 안정화될 수 있다는 중요한 기전을 나타낸다. 상술한 점에서, 본 발명은 p53을 함유하는 세포내에서 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화하기 위한 방법을 더 제공한다. 그 방법은 p53을 탈유비퀴틴 및/또는 안정화하기에 효과적인 양으로 HAUSP와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 여기에서 사용된 바의, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 구술하지 않는다면 복수 참고를 포함한다. 예를 들어, "세포"를 참고로 하면 이것은 세포들과 같은 복수를 포함하며, 그의 등가물은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 방법은 피험체의 체내, 또는 시험관내에서, p53으로부터 유비퀴틴을 제거하거나 또는 p53을 탈유비퀴틴화 하기 위해 사용될 수 있다. p53의 탈유비퀴틴화는 공지 절차에 의해 검출될 수 있으며, 임의의 방법, 분자 절차, 및 여기에서 개시된 검사를 포함한다. p53의 탈유비퀴틴화를 조절하는 HAUSP의 능력은 상술한 바와 같이 종양, 특히 p53-관련 종양을 치료하기 위해 특히 유용한 HAUSP가 되게 한다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 피험체는 종양을 보유하는 인간이며, HAUSP는 종양을 치료한다.
HAUSP는 HAUSP의 발현을 허용하는 방식으로 세포에 HAUSP 단백질을 도입함으로써, 또는 세포에 HAUSP를 코딩하는 핵산 서열을 도입함으로써, 피험체의 시험관내 또는 생체내 p53을 함유하는 세포와 접촉될 수 있다. 세포는 공지된 기술로부터 용이하게 결정되는 표준 검출 방법에 의해 피험체의 조직에 함유될 수 있으며, 그리고 피험체의 조직에서 검출될 수 있고, 그 예로는 제한함이 없이 면역 기술(예컨대, 면역조직 화학 염색), 형광 영상 기술, 및 현미경 기술을 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 피험체에게 HAUSP를 투여함으로써 접촉이 피험체의 체내에 수행된다. 피험체에게 단백질 및 핵산 서열을 도입 또는 투여하기 위한 방법 및 제제는 이미 기술되어왔다.
추가로, 본 발명은 Mdm2 함유 세포내에서 Mdm2의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화를 위한 방법을 제공한다. 방법은 Mdm2를 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화하기 위한 효과적인 양으로 세포와 HAUSP를 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 피험체의 체내, 또는 시험관내에서 Mdm2를 탈유비퀴틴화, 또는 Mdm2로부터 유비퀴틴을 제거하기 위해 사용될 수 있다. Mdm2의 탈유비퀴틴화는 여기에서 개시된 모든 방법, 분자 절차, 및 검사를 포함하는 공지 절차에 의해 검출될 수 있다. Mdm2의 탈유비퀴틴화를 조절하는 HAUSP의 능력은 종양, 특히 Mdm2-, HAUSP-, 및 p53-관련 종양의 치료를 위해 유용한 HAUSP가 되게 한다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 피험체는 종양이 있는 인간이며, HAUSP는 종양을 치료한다. HAUSP와 피험체의 하나 이상의 세포를 접촉시키기 위하여, HAUSP는 여기에서 개시된 것을 포함하는 임의의 형식의 투여에 의해 피험체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 Mdm2 및 HAUSP 간의 상호작용에 의해 세포내의 p53의 안정성 및 탈유비퀴틴화가 영향을 받을 수 있다는 것을 개시하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 간접적인 p53 활성화를 초래하는, 극단적으로 불안정하게 되는 자가-유비퀴틴화된 Mdm2를 통해 HAUSP-제거된 세포에서; 정상 세포에서 Mdm2 안정성을 위해 HASUP 가 필요하다는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 Mdm2- 매개 p53 분해가 HAUSP 발현에 의해 강하게 구원되며, 이와 같이 하여 Mdm2가 안정화된다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명은 p53을 함유하는 세포내에서 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하기 위한 방법을 더 제공한다. 그 방법은 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하기 위한 효과적인 양으로 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 피험체의 체내, 또는 시험관내에서 p53의 탈유비퀴틴화를 조절(즉, p53으로부터 유비퀴틴을 제거하거나, 또는 p53에 유비퀴틴을 첨가함으로써)하기 위해 사용될 수 있다. 여기에서 기술된 바와 같이, p53의 탈유비퀴틴화가 증가되는 경우, p53의 안정성은 또한 증가될 것이며; p53의 탈유비퀴틴화는 그 후 p21의 유도를 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, p53의 탈유비퀴틴화는 세포내에서 증가되며, p53의 안정성은 세포내에서 증가되고, p21은 세포내에서 유도된다. p53의 유비퀴틴화 및 탈유비퀴틴화는 여기에서 개시된 모든 방법, 분자 절차, 및 검사를 포함하는 공지 절차에 의해 검출될 수 있다.
p53의 탈유비퀴틴화를 조절하기 위한 Mdm2-HAUSP 상호작용의 능력은 종양, 특히 Mdm2-, HAUSP-, 및 p53-관련 종양을 치료하기 위해 유용한 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제가 된다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 피험체는 종양을 보유하는 인간이며, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제는 종양을 치료한다.
Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제는 조절제의 발현을 허용하는 방식으로, 세포에 단백질 조절제를 도입함에 의해, 또는 세포에 조절제를 코딩하는 핵산 서열을 도입함에 의해, 피험체의 체내 또는 시험관내에서 p53을 함유하는 세포와 접촉될 수 있다. 세포는 상술한 바와 같이 공지 기술로부터 용이하게 결정된 표준 검출 방법에 의해 피험체의 조직 내에 함유될 수 있으며, 피험체의 조직 내에서 검출될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 접촉은 피험체에게 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제를 투여함으로써 피험체의 체내에서 수행된다. 피험체에게 단백질 및 핵산 서열을 도입 또는 투여하기 위한 방법 및 배합물은 여기에서 개시된다.
본 발명은 또한 HAUSP-p53 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가함으로써 p53과 반응성인 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 다른 지시가 없으면, "p53"은 그의 보존적 치환을 포함하는 p53 단백질(진뱅크(GenBank) 수탁 번호 CAA38095), 및 p53 유사체 양자를 포함한다. "p53 유사체"는 p53 단백질과 60% 이상(바람직하게는 70%이상) 아미노산 서열 상동성을 갖는 p53 생물 활성을 갖는 p53 단백질의 기능적인 변형체이다. 여기에서 더 사용된 바의 용어 "p53 생물활성"은 친화성이 p53과 다를 수 있지만, 여기에서 기술된 검사의 조건하에 HAUSP와 검출할 수 있는 결합(즉, 음성 대조의 배경 결합 위의 약 2배, 또는 더 바람직하게는 약 5배 결합)을 나타내는 단백질 또는 펩티드의 활성을 의미한다.
본 발명의 방법은 (a) HAUSP의 존재하에 p53과 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (b) HAUSP-p53 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같은 "제제"는 상기에서 제공된 정의를 가지며, 상술한 제제의 예를 포함한다. p53에 결합하는 제제는 천연 또는 합성일 수 있다. 여기에서 개시된 바와 같이, p53과 반응성인 제제는 HAUSP의 위치에서 p53에 결합함으로써 HAUSP-p53 상호작용을 저해하는 능력을 가지므로, HAUSP 및 p53의 상호작용을 저해한다. p53에 결합하는 능력을 갖는 후보 제제는 이러한 결합의 결과로서 입체 장애를 통해 p53 활성을 방지하거나, 또는 p53의 탈유비퀴틴화에서 HAUSP를 모방함으로써 HAUSP의 안정화력을 보강한다.
본 발명의 방법에 따라, p53과 반응성인 제제는 시험관내 검사(예컨대, 직접 결합 검사, 경쟁적 결합 분석, 등)를 사용하여 확인될 수 있다. 예컨대, 직접 결합 검사에서, p53 또는 그의 펩티드 단편으로의 후보 제제의 결합은 직접적으로 측정될 수 있다. 후보 제제는 예를 들어, 펩티드 라이브러리에 의해 공급될 수 있다.
대안적으로 경쟁적 결합 분석에서, 표준 방법론은 p53에 결합하여, HAUSP 및 p53의 상호작용을 저해하는 HAUSP를 치환 또는 대체하는 후보 제제의 능력을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, 후보 제제는 p53에 결합하기 위해 HAUSP와 경쟁하며, 일단 p53에 결합하면, p53으로의 HAUSP의 결합을 각기 입체적으로 방해할 수 있어 HAUSP에 의한 p53의 탈유비퀴틴화를 방지하거나, 또는 탈유비퀴틴화하는 또는 그렇지 않으면 안정화하는 p53에서 HAUSP로서 기능한다. 경쟁적 결합 분석은 HAUSP-p53 상호작용의 저해를 평가하는 편리한 방법을 나타내는데 그 이유는 그것이 p53 및 HAUSP를 포함하는 미정제 추출물의 용도를 허용하기 때문이다.
경쟁적 결합 분석은 p53, 또는 p53 생물활성(상기 정의된 바와 같음)을 함유하는 추출물을 양자가 기지 농도의 혼합물로 존재하는 후보 제제 및 표지된 HAUSP를 함유하는 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 인큐베이션 후, p53/제제 복합체는 결합되지 않은 표지된 HAUSP 및 표지되지 않은 후보 제제로부터 분리, 및 산출될 수 있다. 그 후 p53(IS)으로의 표지된 HAUSP의 결합의 50%를 저해하기 위해 필요시되는 후보 제제의 농도가 산출될 수 있다.
여기에서 기술된 결합 분석 형식은 표지된 검사 성분을 사용한다. HAUSP 또는 p53의 표지화는 상기 기술된 것을 포함하는 당업계에 공지된 여러 가지 상이한 화학발광 및 방사선 표지 중의 하나를 사용하여 성취될 수 있다. 정성적인 결과가 길항적인 자기방사-평판 결합 검사에 의해 수득 될 수 있으며; 대안적으로, 스캐차드 플롯(Scatchard plots)이 정량적인 결과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 표지는 당업계의 공지 방법에 따라 그 검사의 원하는 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 표지의 선택은 요구되는 감도, 표지될 화합물과의 공액의 용이성, 안정성 요건, 및 이용할 수 있는 기구를 포함하는 다수의 관련 인자에 의존한다.
직접 및 경쟁적 결합 분석 양자는 여러 가지 상이한 구성에 사용될 수 있다. 한 경쟁적 결합 분석에서, 예를 들어, 후보 제제는 컬럼 크로마토그래피 매트릭스 또는 관과 같은 고체 기질에 결합하는 p53(포획 제제) 상의 특이적 결합 위치에 대하여 표지된 HAUSP (표지된 피분석물)에 대하여 경쟁할 수 있다. 대안적으로, 후보 제제는 고체 기질에 결합된 야생형 HAUSP 또는 그의 단편(포획 제제)에 대하여 표지된 p53(표지된 피분석물) 상의 특이적 결합 위치에 대하여 경쟁할 수 있다. 포획 제제는 결합하지 않은 표지된 피분석물로부터 결합한 표지된 피분석물의 분리를 수행하기 위해 고체 기질에 결합된다. 경쟁적 결합 분석의 어느 형태이든, 고형 기질에 결합된 포획 제제에 결합하는 표지된 피분석물의 농도는 결합 검사에서 경쟁하는 후보 제제의 능력에 반비례한다. 후보 제제에 의한 표지된 피분석물의 저해 양은 결합 검사 조건 및 사용된 후보 제제, 표지된 피분석물, 및 포획 제제의 농도에 의존한다.
또 다른 경쟁적 결합 분석은 액체 상에서 수행될 수 있다. 검사의 형태에서, 당업계에 공지된 여러 가지 기술이 결합되지 않은 표지된 피분석물로부터 결합한 표지된 피분석물(HAUSP 또는 p53일 수 있음)을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분리 후에, 결합한 표지된 피분석물의 양이 결정될 수 있다. 분리된 샘플 내에 존재하는 결합하지 않은 표지된 피분석물의 양은 결합한 표지된 피분석 물의 양에 반비례한다.
추가의 대안에서, 분리 단계가 필요하지않는 균일 결합 검사가 수행될 수 있다. 이러한 형태의 결합 검사에서, 표지된 피분석물(이것은 HAUSP 또는 p53 일 수 있다)상의 표지는 포획 제제로의 피분석물의 결합에 의해 변경된다. 표지된 피분석물에서 이러한 대안은 표지에 의해 방사된 신호의 감소 또는 증가를 초래하므로, 결합 검사의 말기에 표지의 측정은 피분석물의 검출 또는 정량화를 허용한다.
특이화된 검사 조건하에, 포획 제제로의 표지된 피분석물의 결합 양이 50%(바람직하게는 90%) 이상 감소한다면, 후보 제제는 경쟁적 결합 분석에서 p53으로의 HAUSP의 결합을 저해할 수 있는 것으로 간주된다. 직접 결합 검사 구성이 사용되는 경우, 측정된 신호가 배경 수준의 2 배 이상일 때 후보 제제가 p53에 결합한 것으로 간주 된다. 더욱이, HAUSP 경쟁적 결합 분석을 사용하여 확인된 후보 제제의 특이성의 증거로서, 결합 경쟁 또한 세척된 리보솜의 존재하에 정제된 p53을 사용하여 수행될 수 있다.
p53 종양 억제자는 아톱포시스, 세포 주기 정지, 또는 노화를 유도하는 다수의 스트레스 요인에 의해 활성화된다. p53-매개 생물 활성은 종종 연구의 촛점이 되는데, 그 이유는 여기에서 기술된 바와 같이, p53은 강한 종양 억제자 기능을 갖기 때문이다. 그럼 에도 불구하고, p53은 또한 다른 생물학적 현상에 연루된다. 예를 들어, p53 유전자의 첫번째 6 엑손에서 결실 돌연변이- 불활성화되기 보다는 차라리 활성화된 p53-과 일치하는 표현형을 수여하는 돌연변이-를 갖는 마우스에서, 자발적 종양에 대한 향상된 내성은 감소된 수명, 골다공증, 일반화된 기관 위축증 및 감소된 스트레스 내성을 포함하는 노화와 연관된 표현형의 조발형에 의해 수반된다. 이들 자료는 p53이 유기체 내에서 노화를 조절하는 역할을 하는 것을 암시한다(Tyner 등, p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes. Nature, 415:45-53, 2002).
추가로, p53은 화학 요법제의 사용에 관한 부작용을 생성하는 역할을 하는 것으로 시하되었다. 항암제는 모낭(HF)에서 아톱포시스를 자극하며, 화학요법의 가장 일반적인 부작용인 모발 손실을 초래한다. 모발 손실을 초래하는 화학 요법에 대한 한 마우스 모델에서, p53은 이러한 목적을 위해 필수적인 것을 나타낸다. 구체적으로, 야생 마우스와는 반대로, p53-결핍 마우스는 시클로포스파미드 치료 후 활성 증식이 유지된 HF 케라티노사이트에서 모발 손실 또는 아톱포시스를 나타내지 않는다. 이들 관측은 p53의 국소 약리학적 저해가 모발 손실과 관련된 화학요법을 방지하기 위해 유용할 수 있다는 것을 나타낸다(Botchkarev et al., p53 is essential for chemotherapy-induced hair loss. Cancer Res., 60:5002-02, 2000).
전술한 관점에서, HAUSP의 구조를 중심으로, 또는 유사하게 고안된 치료제가 종양, 노화, 및 화학요법 유발 또는 약물 유발 부작용을 포함하는 p53과 관련된 다수의 상태의 치료에 유용할 수 있다는 것은 명백하다. 따라서, 본 발명의 후보 제제가 스크린되고, p53에 대한 적당한 결합 친화성(즉, 그것은 p53과 반응성임)을 갖는 것으로 결정되었다면, 종양, 노화, 및 제약 및 기타 화학요법제의 사용과 관련된 부작용을 포함하는 p53이 연루된 생물학적 현상 또는 과정에 대한 효과를 갖는지 여부에 대한 확인이 평가될 수 있다. 특히, 후보 제제는 적당한 종양 억제제로서 세포 분할 또는 그렇지않으면 기능의 저해제로서 작용하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 본 발명의 후보 제제가 여기에서 개시된 바의 종양 치료를 위해 유용할 것으로 기대된다. 후보 제제는 또한 노화와 관련된 부정적 효과 또는 피험체에게 화학 요법제의 투여와 관련된 능력에 부정적 효과를 저하하는 능력에 대하여 평가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 (c) p53을 함유하는 하나 이상의 세포와 후보 제제가 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 하나 이상의 세포내에서 하나 이상의 p53-관련 생물학적 현상에 효과적인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함한다. 여기에서 사용된 바의, "p-53-관련 생물학적 현상"은 p53 활성이 연루된 생화학 또는 생리적 과정을 포함한다. 여기에서 개시된 바의, p-53 관련 생물학적 현상의 예로는 p53-관련 종양, 노화 과정과 관련된 부정적 효과(예컨대, 감소된 스트레스 내성, 일반화된 기관 위축증, 골다공증, 및 감소된 수명), 및 제약 및 기타 화학 요법제의 투여 또는 사용과 관련된 부정적인 부작용(예컨대, 탈모증, 또는 모발 손실, 및 메스꺼움)을 포함한다.
본 발명의 한 구현예에서, 예를 들어 방법은 (c) 후보 제제가 하나 이상의 종양 세포(신생물 세포)와 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 종양 세포의 증식에 효과를 갖는 지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 바의 "증식"은 제한 함이 없이, 종양 세포의 분할, 성장, 및 번식을 포함한다. 후보 제제가 접촉될 수 있는 종양 세포의 예는 인체 폐 암종 세포(H1299) 및 p53을 함유하는 임의의 다른 종양 세포를 포함한다. 여기에서 더 사용된 바의, "p53을 함유하는" 세포는 p53 또는 그의 유도체 또는 상동체가 자연적으로 발현 또는 자연적으로 일어나는 세포이다. 본 발명의 방법에 따라, 후보 제제는 시험관내에서 종양 세포와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포의 배양액은 후보 제제를 함유하는 조제(preparation)와 인큐베이션될 수 있다. 종양 세포의 증식에 대한 후보 제제의 효과는 그 후 조직학적 분석을 포함하는 당업계의 공지된 생물학적 검사 또는 방법에 의해 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 Mdm2와 반응성인 제제를 동정하는 방법을 더 제공한다. 본 발명의 방법은 (a) HAUSP의 존재하에 Mdm2와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (b) Mdm2-HAUSP 상호작용을 저해하는(예컨대, Mdm2의 탈유비퀴틴화를 저해하는) 후보 제제의 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 다른 지시가 없다면, "Mdm2"는 Mdm2(murine double minute 2) 단백질 및 Mdm2 유사체 양자를 포함한다. 여기에서 더 사용된 것으로서, "Mdm2 유사체"는 Mdm2 단백질과 60% 이상(바람직하게는 70%이상) 아미노산 서열 상동성을 갖는 Mdm2 생물 활성을 갖는 Mdm2 단백질의 기능적인 변형체이다. Mdm2 "유사체"는 상동성 3 차원 입체 형태를 갖는 Mdm2 단백질의 변형체이다. 여기에서 사용된 바의 용어 "Mdm2 생물활성"은 여기에서 기술된 바와 같이 p53을 유비퀴틴화하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩티드의 활성을 의미한다. Mdm2 및 Mdm2 유사체는 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있거나, 또는 원래의 세포로부터 단리될 수 있다. Mdm2는 바람직하게는 통상의 기술 및 Mdm2를 코딩하는 cDNA 를사용하여 재조합적으로 생성될 수 있다.
Mdm2에 결합하거나 반응하는 제제는 천연 또는 합성일 수 있다. Mdm2와 반응성인 제제는 입체 장해를 통해 Mdm2 활성 및/또는 Mdm2-HAUSP 상호작용을 방지함으로써 Mdm2-HAUSP 상호작용을 저해할 수 있고, HAUSP와 유사한 구조를 가질 수 있다. Mdm2와 반응성인 제제는 또한 Mdm2의 탈유비퀴틴화에서 HAUSP를 모방하여 Mdm2의 안정성을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, Mdm2와 반응성인 제제는 당업계의 공지 기술 및/또는 여기에서 개시된 기술에 따라, 시험관내 검사(예컨대, 직접 결합 검사, 경쟁적 결합 분석, 동종성 결합 검사, 등)을 사용하여 확인될 수 있다.
HAUSP의 구조를 중심으로, 또는 유사하게 고안된 치료제가 종양을 포함하는 Mdm2와 관련된 상태의 치료에 유용할 수 있다. 게다가, 상술한 바와 같이 HAUSP의 구조를 중심으로, 또는 유사하게 고안된 치료제는 또한 종양, 노화, 및 화학요법 유발 또는 약물 유발 부작용을 포함하는 p53과 관련된 다수의 상태의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 후보 제제가 스크린되고, Mdm2에 대한 적당한 결합 친화성(즉, 그것은 Mdm2와 반응성임)을 갖는 것으로 결정되었다면, 종양, 노화, 및 제약 및 기타 화학요법제의 사용과 관련된 부작용을 포함하는 Mdm2, HAUSP, 및 p53이 연루된 생물학적 현상 또는 과정에 대한 효과를 갖는지 여부의 확인이 평가될 수 있다. 특히, 후보 제제는 적당한 종양 억제제로서 세포 분할 또는 그렇지않으면 기능의 저해제로서 작용하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 본 발명의 후보 제제가 여기에서 개시된 것을 포함하는, 종양 치료를 위해 유용할 것으로 기대된다. 후보 제제는 또한 노화와 관련된 부정적 효과, 또는 피험체에게 화학 요법제의 투여와 관련된 부정적 효과의 감소에 대한 그의 능력에 대하여 평가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 (c) Mdm2, HAUSP, 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 후보 제제가 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 하나 이상의 세포내에서 하나 이상의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 생물학적 현상에 효과적인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함한다. 여기에서 사용된 바의, "Mdm2-관련 생물학적 현상"은 Mdm2 활성이 연루된 생화학 또는 생리적 과정(예컨대, 종양)을 포함하며, "HAUSP-관련 생물학적 현상"은 HAUSP 활성이 연루된 생화학 또는 생리적 과정(예컨대, 종양)을 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 예를 들어, 그 방법은 (c) 하나 이상의 신생물(종양 세포)와 후보 제제가 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 종양 세포의 증식에 효과적인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에서 더 사용된 바의, "Mdm2 또는 HAUSP를 포함하는" 세포는 Mdm2 또는 HAUSP, 또는 그의 유도체 또는 상동체가 자연적으로 발현되거나 또는 자연적으로 발생하는 세포이다.
유사하게, 본 발명은 HAUSP와 반응성인 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 (a) Mdm2의 존재하에 HAUSP와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (b) HAUSP-Mdm2 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가하는 단계를 포함한다. HAUSP에 결합하거나 반응하는 제제는 천연 또는 합성일 수 있다. HAUSP와 반응성인 제제는 입체 장해를 통해 HAUSP 활성 및/또는 HAUSP-Mdm2 상호작용을 방지함으로써 HAUSP-Mdm2 상호작용을 저해할 수 있고, Mdm2와 유사한 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, HAUSP와 반응성인 제제는 당업계의 공지 기술 및/또는 여기에서 개시된 기술에 따라, 시험관내 검사(예컨대, 직접 결합 검사, 경쟁적 결합 분석, 동종성 결합 검사, 등)을 사용하여 확인될 수 있다.
Mdm2-HAUSP 상호작용을 저해하도록 고안된 치료제는 종양을 포함하는 Mdm2와 관련된 상태의 치료에 유용할 수 있다. 게다가, Mdm2의 구조를 중심으로, 또는 유사하게 고안된 치료제는 또한 종양, 노화, 및 화학요법 유발 또는 약물 유발 부작용을 포함하는 p53과 관련된 다수의 상태의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 후보 제제가 스크린되고, HAUSP에 대한 적당한 결합 친화성(즉, 그것은 HAUSP와 반응성임)을 갖는 것으로 결정되었다면, 종양, 노화, 및 제약 및 기타 화학요법제의 사용과 관련된 부작용을 포함하는 Mdm2, HAUSP, 및 p53이 연루된 생물학적 현상 또는 과정에 대한 효과를 갖는지 여부의 확인이 평가될 수 있다. 특히, 후보 제제는 적당한 종양 억제제로서 세포 분할 또는 그렇지않으면 기능의 저해제로서 작용하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 본 발명의 후보 제제가 여기에서 개시된 것을 포함하는, 종양 치료를 위해 유용할 것으로 기대된다. 후보 제제는 또한 노화와 관련된 부정적 효과, 또는 피험체에게 화학 요법제의 투여와 관련된 부정적 효과의 감소에 대한 그의 능력에 대하여 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (c) Mdm2, HAUSP, 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 후보 제제가 접촉시키는 단계; 및 (d) 제제가 하나 이상의 세포내에서 하나 이상의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 생물학적 현상에 효과적인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 또한 Mdm2-HAUSP 상호작용에 영향을 주는(즉, 증가 또는 감소) 후보 조절제의 능력을 평가함으로써, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 시험관내 시스템을 수득하거나 생성하는 단계; (b) 후보 조절제와 시험관내 시스템을 접촉시키는 단계; 및 (c) 시험관내 시스템에서 후보 조절제가 Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절하는지를 결정하는 단계. 예를 들어, 본 발명의 시험관내 시스템은 세포의 수집(예를 들어, 세포의 배양)일 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 시험관내 시스템이 정제된 단백질(예컨대, Mdm2 및 HAUSP)의 혼합물, 세포 용해물(lysate)(예컨대, 항-Mdm2 또는 항-HAUSP 항체를 더 포함), 재구성된 세포 용해물, 또는 세포 용해물의 혼합물과 같은 세포가 아닌 시스템이다.
당업자는 미처리된 대조와의 비교를 포함하는 여러 개의 공지된 방법 및 여기에서 개시된 검사에 의해 임의의 특정 후보자가 Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제인지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 단계 (c)에서 결정이 후보 조절제의 부재 하에 Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 제2 시험관내 시스템 내에서 Mdm2-HAUSP 상호작용으로 단계(b)의 시험관내 시스템에서 Mdm2-HAUSP 상호작용을 비교하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 시험관내 시스템이 세포의 콜렉션인 경우, HAUSP 또는 Mdm2에 대하여 특이적인 길항제는 단계(b)의 시험관내 시스템에 첨가될 수 있으며, 단계(c)에서의 결정은 선택된 길항제의 부재하에 단계(b)의 시험관내 시스템에서 Mdm2-HAUSP 상호작용과 Mdm2, HAUSP, 및 후보 조절제를 포함하는 제2 시험관내 시스템에서 Mdm2-HAUSP 상호작용을 비교하여 수행될 수 있다. 추가의 대안에서, 시험관내 시스템이 세포가 아닌 시스템인 경우, 항-HAUSP 항체 또는 항-Mdm2 항체가 단계(b)의 시험관내 시스템에 첨가될 수 있으며, 단계(c)에서의 결정은 선택된 항체의 부재하에, Mdm2, HAUSP, 및 후보 조절제를 포함하는 제2 시험관내 시스템에서 Mdm2-HAUSP 상호작용과 단계(b)의 시험관내 시스템에서 Mdm2-HAUSP 상호작용을 비교하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체가 항-HAUSP 단일클론 항체인 경우, Mdm2의 활성의 수준은 제1 및 제2 시험관내 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 조절제가 제1 시스템이 아니라, 제2 시스템에서 Mdm2 수준 및/또는 활성에 대한 효과를 가진다면, 후보 조절제는 HAUSP를 통한 그의 조절 효과를 가질 수 있으며, 따라서, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제인 것으로 결론을 내릴 수 있다.
Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절하도록 고안된 치료는 종양을 포함하는 Mdm2-HAUSP와 관련된 상태의 치료에 유용할 수 있다. 더욱이, 이러한 치료는 또한 종양, 노화, 및 화학 요법 유발 또는 약물 유발 부작용을 포함하는 p53과 관련된 다수의 상태의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 후보 조절제가 스크린되고, Mdm2-HAUSP 상호작용에 대한 적당한 조절 효과를 갖는 것으로 결정되었다면, 종양, 노화, 및 제약 및 기타 화학요법제의 사용과 관련된 부작용을 포함하는 Mdm2, HAUSP, 및 p53이 연루된 생물학적 현상 또는 과정에 대한 효과를 갖는지 여부의 확인이 평가될 수 있다. 특히, 후보 조절제는 적당한 종양 억제제로서 세포 분할 또는 그렇지않으면 기능의 저해제로서 작용하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 본 발명의 후보 조절제가 여기에서 개시된 것을 포함하는, 종양 치료를 위해 유용할 것으로 기대된다. 후보 조절제는 또한 노화와 관련된 부정적 효과, 또는 피험체에게 화학 요법제의 투여와 관련된 부정적 효과의 감소에 대한 그의 능력에 대하여 평가될 수 있다.
본 발명은 추가로 상술한 동정 방법에 의하여 동정된 제제 및 조절제에 관한 것이다. 이러한 제제 및 조절제는 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태를 치료하기 위해 유용할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, "Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태"는 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53- 활성이 연루되며, 치료가 필요시 되는 피험체에서의 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 종양, 치료가 필요한 피험체의 노화와 관련된 부정적 효과, 및 피험체의 제약 또는 화학 요법제의 사용과 관련된 부정적인 부작용을 포함하는 상태, 질환, 또는 장애이다. Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태는 피험체에서 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태를 치료하기 위해 효과적인 본 발명의 제제 또는 조절제의 양을 피험체에게 투여함으로써 피험체가 치료될 수 있다. 이러한 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험체의 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태를 치료하는 효과적인 양으로 본 발명의 제제 또는 조절제(예컨대, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제)를 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서의 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태의 치료 방법을 더 제공한다. 또한, 종양의 치료 방법에서 본 발명의 제제 또는 조절제(예컨대, Mdm2-HAUSP 상호작용의 조절제)의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 상술한 확인 방법 중의 하나에 의해 동정된 제제 또는 조절제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 적당한 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예, 및 약제학적 배합물의 제조 방법 및 조성물의 예가 상기에서 기술된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 Mdm2-, HAUSP-, 및/또는 p53-관련 병태를 치료하기 위해, 본 발명의 제제 또는 조절제를 피험체에게 투여하는 것으로 유용할 것이다. 이러한 경우, 약제학적 조성물이 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 피험체에게 투여된다.
본 발명은 또한 HAUSP 및 p53을 포함하는 복합체를 제공한다. 이러한 HAUSP- p53 복합체에서, HAUSP의 p53-결합 위치의 아미노산 잔기는 p53의 아미노산 잔기와 직접적인 반 데르 발츠 및/또는 수소 결합 및/또는 염-가교이다. 본 발명의 복합체는 p53의 완전한 아미노산 서열과 복합체화 되는 HAUSP의 완전한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 복합체는 적어도 HAUSP의 N-말단 영역을 포함하며, 이것은 HAUSP의 p53-결합 위치를 함유한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "HAUSP의 N-말단 영역"은 HAUSP의 잔기 1-248,및 그의 유사체를 의미한다. 더욱이, 여기에서 사용된 바의 "결합 위치"는 다양한 공유 및/또는 비공유 결합력을 통해- 제한함이 없이 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 분자, 화합물, 항생 물질 또는 약물을 포함하는- 그의 형상 및 전하 전위의 결과로서 다른 제제와 순조롭게 상호작용 또는 관련하는 분자 또는 분자 복합체의 부위를 의미한다. 따라서, 본 발명에 의해 고려되는 바와 같이, "HAUSP의 p53-결합 위치"는 다른 제제와 순조롭게 상호작용 또는 관련하는 그의 형상, 반응성, 전하, 전위, 및/또는 다른 특징의 결과로서 제한함이 없이 단백질(예컨대, p53), 폴리펩티드, 펩티드, 핵산(DNA 또는 RNA 포함), 분자, 화합물, 항생 물질 또는 약물을 포함하는 HAUSP 상의 결합 위치이다.
다양한 HAUSP의 동형체(isoform)에서, 또는 본 발명에 의해 커버되는 HAUSP 유사체에서 아미노산 잔기의 번호 매김은 여기에서 진술한 것과 상이할 수 있거나, 여기에서 기술된 것과 동일한 p53-결합 활성을 생성하는 특정의 보존적 아미노산 치환기를 함유할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 동형체 또는 유사체에서 상응하는 아미노산 및 보존적 치환은 가시적으로 관련 아미노산 서열을 검정함으로써, 또는 상업적으로 이용할 수 있는 상동성 소프트웨어 프로그램을 사용함으로써 용이하게 확인된다.
HAUSP의 p53-결합 위치는 p53결합의 HAUSP 상의 실제 위치를 포함할 수 있다. p53-결합 위치는 HAUSP 상의 보조적인 결합 위치, p53의 실제 위치에 근접하거나 인접한 결합을 포함할 수 있으며, 그럼에도 불구하고 특정 제제와의 상호작용 또는 연합시의 HAUSP 또는 p53-HAUSP 활성에 영향을 줄 수 있으며- p53 결합의 실제 위치와의 직접적인 간섭에 의해 또는 HAUSP 분자의 입체 형태 또는 전하 전위에 간접적인 영향에 의해, 이와 같이 하여 p53 결합의 실제 위치에서 HAUSP에 결합하는 p53을 방지하거나 또는 감소시킨다.
분자 또는 분자 복합체의 결합 부위의 확인은 분자 또는 분자 복합체의 생물 활성이 종종 제제/리간드 및 하나 이상의 분자 또는 분자 복합체의 결합 위치 간의 상호작용을 초래하기 때문에 중요하다. 따라서, HAUSP의 p53-결합 위치의 국소화는 HAUSP 또는 HAUSP-p53의 활성에 영향을 주는 저해제를 확인하기 위한 가장 적당한 도구를 제공한다. HAUSP의 p53-결합 위치의 국소화는 또한 HAUSP 또는 HAUSP 유사체의 p-53 결합 위치와 순조롭게 관련 또는 상호작용할 수 있는 화학 제제를 고안 및 합성하는 목적을 위한 다양한 분자 고안 및 분석 기술의 사용을 허용하며, 여기에서 화학 제제는 HAUSP 또는 HAUSP-p53 활성의 저해제로서 잠재적으로 작용한다. 전술한 관점에서, 본 발명의 HAUSP-p53 상호작용 및 HAUSP-p53 복합체는 제해제 제제 또는 조절제로서 작용할 수 있는 작은 분자 저해제를 위한 표적으로써, 및 펩티도의태물(peptidomimetics)를 위한 기준으로서 약물 스크린의 합리적인 고안 및 개발의 도구로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 복합체를 제공한다. 이러한 Mdm2-HAUSP 복합체에서, Mdm2의 아미노산 잔기는 HAUSP의 아미노산 잔기와 물리적 접촉된다(예컨대, 직접 반데르 발스 접촉, 수소 결합을 통한 접촉, 염 가교를 통한 접촉). 본 발명의 복합체는 HAUSP의 완전한 아미노산 서열과 복합체화된 Mdm2의 완전한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 복합체는 적어도 일부의 HAUSP의 부분을 포함할 수 있으며, 이것은 Mdm2와 상호작용 또는 물리적 관련의 부위를 하나 이상 함유한다.
본 발명은 코어 영역에서 높은 보존 Cys 잔기가 Ser로 대체된 점-돌연변이 HAUSP 단백질(HAUSP-cs)을 더 제공한다. 더 구체적으로, 점-돌연변이 단백질은 아미노산 잔기 223에서 Cys 에 대하여 Ser이 치환된 도 6(서열 번호 6)에서 설명된 아미노산 서열을 포함한다. 이 돌연변이 단백질은 시험관내 p53과 강한 결합을 보유한다. 추가로, 여기에서 개시된 바와 같이 세포내에서의 HAUSP-cs의 발현은 p53 유비퀴틴화의 수준을 증가지키겨, 이것은 HAUSP-cs가 p53의 내인성 HAUSP-매개 탈유비퀴틴화 간섭에 의한 우성-음성(dominant-negative) 돌연변이로서 작용할 수 있다. 여기에서 제공되는 것은 또한 본 발명의 HAUSP 점 돌연변이 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 핵산 서열로 트랜스펙션된 세포이다.
본 발명은 감소된, 돌연변이, 또는 HAUSP가 없는 유전자 생성물을 발현하거나 또는 오로지 인체 HAUSP 유전자 생성물을 발현하는 인간이 아닌 트랜스제닉 동물(transgenic animal)을 더 제공한다. 특히, 본 발명은 HAUSP가 선택적으로 불활성인 인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 게놈이 HAUSP 유전자에서 분열되는 것을 포함하는 인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 제공하며, 여기에서 트랜스제닉 동물은 야생형에 비하여 기능적인 HAUSP 단백질의 감소된 수준을 나타낸다. 인간이 아닌 동물은 임의의 적당한 동물(예컨대, 고양이, 소, 개, 말, 염소, 설치류, 및 양)일 수 있지만, 바람직하게는 설치류이다. 더 바람직하게는 인간이 아닌 동물은 쥐 또는 마우스이다.
다른 지시가 없으면, 용어 "HAUSP 유전자"는 여기에서 HAUSP 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 그의 임의의 대립 형질 변형체(allelic variants)를 의미한다. 유전 암호의 퇴화로 인하여, 본 발명의 HAUSP 유전자는 HAUSP 단백질을 또한 코딩하게될 다수의 핵산 치환기를 포함한다. "내인성" HAUSP 유전자는 유기물 내에서 자연적으로 유래하거나 또는 발생하는 것이다. 용어 "HAUSP 단백질", "HAUSP 유사체", 및 "HAUSP-단백질 생물 활성"은 상기 정의된 것이다.
여기에서 사용된 바와 같은 용어 "인간이 아닌 트랜스제닉 동물(tansgenic non-human animal)"은 유전자 변형된 인간이 아닌 동물을 의미하며, 실험 조작에 의해 생성되며, 그의 게놈은 외래 유전자(transgene)의 도입에 의해 변경된다. 여기에서 더 사용된, 용어 "외래 유전자"은 실험 조작에 의해 동물의 게놈에 도입되는 핵산(예컨대, DNA 또는 유전자)를 의미하며, 여기에서, 도입된 유전자는 동물에 내인성이 아니거나, 또는 동물에 내인성인 유전자의 변형 또는 돌연 변이된 형태이다. 내인성 유전자의 변형 또는 돌연 변이된 형태는 인체 개재(예컨대, 점 돌연 변이의 도입, 프레임시프트 돌연변이의 도입, 내인성 유전자의 부분 또는 단편의 결실, 선택적 마커 유전자의 삽입, 종결 코돈의 삽입, 등에 의해)를 통해 생성될 수 있다. 인간이 아닌 트랜스제닉 동물은, 제한함이 없이, 인간이 아닌 동물의 배아 줄기 세포, 새로운 수정란 또는 초기 배아로의 외래 유전자의 도입; 인간이 아닌 동물의 체세포 및/또는 생식 세포의 염색체로의 외래 유전자의 통합; 및 여기에서 기술된 임의의 방법을 비롯한 인체 개재를 포함하는 여러 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 HAUSP 유전자가 내인성 HAUSP 유전자에서의 분열을 초래하는 선택적으로 불활성화된 게놈을 가진다. 여기에서 사용된 바의, "분열"은 기능적 HAUSP 단백질의 정상 발현을 방지하는 HAUSP 유전자 내의 돌연변이(즉, 유전자 물질의 영구적, 전염성(transmissable) 변화)를 의미한다(예컨대, 그것은 돌연변이 HAUSP 단백질의 발현을 초래하며; 그것은 HAUSP 단백질의 정상 량의 발현을 방지하고; 또는 그것은 HAUSP 단백질의 발현을 방지한다). 분열의 예로는 제한 함이 없이, 점 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이의 도입, 내인성 유전자의 부분 또는 단편의 결실, 선택성 마커 유전자의 삽입, 및 종결 코돈의 삽입을 포함한다. 여기에서 사용된 바의, 용어 "돌연 변이"는 야생형 유전자(또는 그의 유전자 생성물)과 비교하여 그의 서열(또는 그의 기능적 성질)의 하나 이상의 변형을 나타내는 유전자(또는 그의 유전자 생성물)을 의미한다. 반대로, 용어 "야생형"은 그의 자연 원(예컨대 자연 개체군)에서 가장 빈번히 발견하는 바와 같은 특정 유전자형(또는 표현형)을 의미한다. 예를 들어, 야생형 동물은 기능적 HAUSP 단백질을 발현한다.
본 발명의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물의 선택적 불활성화는 다양한 방법에 의해 성취될 수 있으며, 이형 접합 분열(하나의 HAUSP 유전자 대립 형질은 수득한 트랜스제닉 동물이 돌연 변이를 위해 이질 접합이 되도록 분열된다) 또는 동형 접합 분열(HAUSP 유전자 대립형질 양자는 수득한 트랜스제닉 동물이 돌연 변이를 위해 동형 접합이 되도록 분열된다)을 초래할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물의 내인성 HAUSP 유전자는 HAUSP 유전자 생성물에 공통인 영역을 코딩하는 핵산 서열과의 상동성 재조합을 통해 분열된다. 예를 들어, 상동성 재조합을 통한 분열은 HAUSP 유전자, 특히 하나 이상의 결실이 HAUSP 유전자의 하나 이상의 엑손(예컨대, 엑손 1)으로 도입된 넉아웃 돌연변이에서 넉아웃 돌연변이를 생성할 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법에 따라, HAUSP 유전자의 분열은 내인성 HAUSP 유전자로의 이종 선택성 마커 유전자의 삽입을 초래할 수 있다. 여기에서 사용된 바의, 용어 "선택성 마커 유전자"는 마커의 발현 또는 활성이 (예컨대, neo 유전자와 같은 양성 마커)를 위해 또는 (예컨대, dt 유전자와 같은 음성 마커)에 대하여 선택될 수 있도록 약물 또는 항생 물질에 대한 내성이 발현되는 세포 또는 유기체상에서 부여하는 효소를 코딩하는 유전자를 나타낸다. 여기에서 더 사용된 바와 같이, 용어 "이종 선택성 마커 유전자(heterologous selectable marker gene)"는 실험 조작을 통해 정상적으로 발견할 수 없는 동물의 게놈으로 삽입된 선택성 마커 유전자를 의미한다. 이러한 이종 선택성 마커 유전자는 HAUSP 유전자의 임의의 코딩 엑손으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물은 상응하는 동일 종의 야생형 인간이 아닌 동물에 비하여 기능성 HAUSP 단백질의 발현이 감소 된다는 것을 나타낸다. 여기에서 사용된 바와 같이, 구 "기능성 HAUSP 단백질의 감소된 발현을 나타내는"은 기능성 HAUSP의 검출된 양이 야생형 HAUSP 유전자를 함유하는 게놈을 갖는 상응하는 동일 종의 동물에서 검출된 것보다 더 작은 트랜스제닉 동물을 의미한다. 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 상응하는 야생형 동물보다 적어도 50% 미만의 기능성 HAUSP를 함유한다. 더 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 상응하는 야생형 동물보다 적어도 75% 미만의 기능성 HAUSP를 함유한다. 더욱더 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 상응하는 야생형 동물보다 적어도 90% 미만의 기능성 HAUSP를 함유한다. 동물에서 HAUSP의 수준 및 HAUSP 활성은 공지 기술에서와 같은 표준 검사를 사용하여 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 야생형에 비하여 기능성 HAUSP 단백질의 감소된 발현을 나타내며, 트랜스제닉 동물 내의 기능성 HAUSP 단백질의 수준은 만약 그렇지 않으면 자연에서 찾을 수 있는 것보다 낮다. 본 발명의 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 돌연 변이 HAUSP(양에 상관 없이)를 발현한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 HAUSP(야생형 또는 돌연 변이)를 발현하지 않는다. 여전히 본 발명의 다른 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 야생형 HAUSP 단백질을 발현하지만, 상응하는 동일 종의 야생형 동물에 비하여 발현의 수준이 감소된다.
본 발명의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물, 또는 야생형에 비하여 기능성 HAUSP 단백질의 감소된 발현을 나타내는 인간이 아닌 임의의 트랜스제닉 동물은 유전 공학적인 트랜스제닉 동물 대한 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상응하는 동일 종의 야생형 동물에 비하여 기능성 HAUSP 단백질의 감소된 발현을 나타내는 인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 창조하기 위해, 당업계의 잘 알려진 기술을 사용하여 HAUSP 표적 벡터가 처음으로 생성될 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같은, 용어 "HAUSP 표적화 벡터"는 HAUSP 유전자의 일부 또는 전부를 포함하며, 수용체 세포(recipient cell) 내에서 내인성 HAUSP 유전자의 하나 이상의 대립 형질로의 표적화 벡터의 상동성 재조합을 허용하기에 충분한 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 한 구현예에서, 표적화 벡터는 양성(positive) 또는 음성(negative)의 이종 선택성 마커 유전자(예컨대, 양성 선택성 유전자, neo)를 더 포함한다. 추가로, 표적화 벡터는 교체 벡터(즉, 내인성 표적 유전자를 대체하는 선택성 마커 유전자)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 대체 벡터는 기능성 HAUSP 단백질이 발현되지 않도록 HAUSP 유전자의 분열을 초래하는 HAUSP 유전자로 이종 선택성 마커 유전자를 삽입할 수 있다. 이러한 분열은 여기에서 "무기능(null)" 또는 "넉아웃(knockout)" 돌연변이로 언급된다. 또한 표적화 벡터가 삽입 벡터일 수 있는 것 역시 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 본 발명의 HAUSP 표적화 벡터는 하나 이상의 엑손(예컨대, HAUSP의 엑손 1) 내에 하나 이상의 결손이 있는 인간이 아닌 HAUSP 유전자의 적어도 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 발생된 HAUSP 표적화 벡터는 인간이 아닌 동물의 수용체 세포(야생형 HAUSP 유전자 포함)로 도입되어 처리된 수용체 세포를 생성한다. 이러한 도입은 수용체 세포의 게놈 내에서 하나 이상의 야생형 HAUSP 유전자로 벡터의 상동성 재조합에 적당한 조건하에 수행될 수 있다. 수용체 세포는 예를 들어, 배아 줄기 세포, 또는 접합체 또는 난모 세포일 수 있다.
본 발명의 HAUSP 표적화 벡터는 제한 함이 없이, 전기 연동, DEAE 덱스트란 트랜스펙션, 인산칼슘 트랜스펙션, 리포펙션(lipofection), 일가양이온 리포솜 융합, 다가양이온 리포솜 융합, 원형질체 융합, 생체내 전기장의 창출, DNA-피복된 미세입자 충격, 재조합 복제-결함 바이러스로 주사, 상동성 재조합, 바이러스 벡터, 및 네이키드 DNA 전달, 또는 그의 조합을 포함하는 유전자 전달에 적당한 생체내 또는 생체 외 수단에 의해 수용체 세포로 도입될 수 있다. 유전자 전달에 적당한 재조합 바이러스 벡터는 제한함이 없이, 레트로바이러스, HSV, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 세밀리키 포리스트 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 백시니아 바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터 유도된 벡터를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라, 처리된 수용체 세포는 그 후 동일 종의 인간이 아닌 동물의 배반포 (예컨대, 배낭강(blastocoel cavity)으로 주사 또는 미량 주사에 의해)로 도입되어 처리된 배반포를 생성한다. 그 후, 처리된 배반포는 발현 및 자손(progeny)으로의 후속하는 생식계열 유전(germline transmission)을 위해 동일 종의 가임신한(pseudopregnant) 인간이 아닌 동물로 (예컨대, 이식에 의해)도입될 수 있다. 예를 들어, 처리된 배반포는 기간을 확장하기 위해 허용되어, 가임신 동물이 상동적으로 재조합된 벡터를 포함하는 자손에게 전달하도록 허용되며, 여기에서 자손은 상응하는 동일 종의 야생 동물에 대하여 HAUSP의 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 그 후, 게놈이 그의 내인성 HAUSP 유전자 내에서 분열하는 것을 포함하는 인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 확인하는 것이 가능하다. 확인된 트랜스제닉 동물은 그 후 상응하는 동일 종의 야생형 동물에 대하여 기능성 HAUSP 단백질의 감소된 발현을 나타내는 이종 접합 또는 동형 접합의 인간이 아닌 동물을 생성하기 위해 다른 창설자 트랜스제닉 동물과 이종 교배 되어질 수 있다. 본 발명은 상술한 방법에 의해 창출된 인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 더 제공한다.
상술한 바와 같이, 오늘날까지의 연구는 p53 경로가 암의 경우 비록 모두는 아닐 지라도 대부분 기능장애이며, p53 자체는 모든 암의 대략 60% 로 돌연변이된다는 것을 시사한다. 야생형 p53이 검출되는 암의 경우, 그 후, p53은 활성화 또는 안정화되지 않는 것으로 믿어지는데, 그 이유는 p53 경로에서 또 다른 효소 또는 생화학(예컨대, HAUSP)이 결함되기 때문이다. 야생형에 비하여 기능성 HAUSP 단백질의 감소된 발현을 나타내며 야생형 HAUSP 유전자가 결여된 본 발명의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물에 대한 연구는 종양 발생, 특히 p53-관련 종양에서 HAUSP의 생리적 역할의 이해가 용이 해질 수 있다. 예를 들어, 인간이 아닌 트랜스제닉 동물은 HAUSP의 손실이 종양의 전개에 영향을 미치는 지 여부를 시험하기 위해 사용될 수 있다. 인체 HAUSP를 발현하는 유전자 변형된 인간이 아닌 트랜스제닉 동물은 생체내에서 HAUSP 화합물을 유도하는 시험에 대한 가치있는 반응자가 될 것이다. 더욱이, 본 발명자들의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물은 p53과의 상호작용으로 HAUSP를 대체할 수 있는 p53 활성의 조절제에 대한 스크리닝을 위한 가치있으며, 독특하고, 유용한 반응자를 제공한다.
본 발명은 하기 실시예로 기술되며, 이것은 본 발명의 이해를 돕기 위해 설명된 것이며 이후에 나오는 특허청구범위에서 한정된 바와 같이 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하려는 것으로 해석하지 않아야 한다.
실시예 1- 플라스미드 및 항체
실시예 2-3에서 사용된 플라스미드 및 항체는 하기와 같이 제조되었다. HAUSP 및 USP11 발현 벡터를 구성하기 위해, 완전한 길이 단백질에 상응하는 DNA 서열(Everett et al., A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997; Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem . Biophys . Res . Commun., 266:633-40, 1999)은 Marathon-Ready Hela cDNA (Clontech)로부터 PCR로 증폭하고, pcDNA3-Topo 벡터(Invitrogen)로, 또는 Flag-태그를 사용하여 박테리아 내에서의 발현을 위한 pET-11 벡터 또는 포유 동물 세포내에서의 발현을 위한 pCIN4 벡터 및 pBabe 벡터로 서브클로닝하였다(Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000; Luo et al., Negative control of p53 by Sir2
Figure 112006078263129-PCT00001
promotes cell survival under stress. Cell, 107:137-48, 2001). 상이한 결실-돌연변이 구성에 대하여, 상이한 부위에 상응하는 DNA 서열은 상기 구성으로부터 PCR에 의해 증폭하였으며 각각의 발현 벡터로 서브클로닝하였다. HAUSP 항체를 제조하기 위해, 발명자들은 재조합 HAUSP 완전한 길이 단백질에 대한 다클론 항체를 만들었다. 완전한 길이의 단백질에 상응하는 DNA서열은 pET-15-His 벡터(Novagene)로 서브클로닝하였다. α-HAUSP 항혈청은 정제된 His-HAUSP 단백질(Covance)에 대하여 토끼에서 생성하였으며, 단백질-A 컬럼 상에서 추가로 친화성 정제하였다.
실시예 2- p53 -결합 단백질로서의 HAUSP 의 동정
비특이적 단백질 결합의 제거는 친화성 크로마토그래피 검사에서 p53에 대한 진실한(bona fide) 결합 파트너의 성공적인 확인을 위해 중요하다(Gu et al., Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature, 387:819-23, 1997; Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000). 이러한 문제에 대하여, 결합 및 용리 조건 간의 염 농도 범위는 선행 방법(Gu et al., Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature, 387:819-23, 1997; Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000)(e.g., 200 mM NaCl for binding, 500 mM NaCl for elution)과 비교하여 용리로부터 단백질의 수를 제한하기 위해 변형되었다. 더욱이, 핵 추출물은 GST-p53 친화성 컬럼 상에서 주입하기 전에 GST 컬럼을 사용하여 충분히 예비 세정하였다. 의사(mock) 정제는 임의의 가능한 비특이적 결합을 확인하기 위해 동일 핵 추출물을 주입한 GST 컬럼, 및 블랭크 완충액을 주입한 추가의 GST-p53 컬럼 양자에서 동시에 수행하였다.
간단히, 40 ㎕의 지시된 GST-융합-단백질 결합된 비드를 함유하는 컬럼은 BC500(25 mM 트리스, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% 글리세롤, 0.2% NP40, 1% 트리톤 X-100, 0.1% DOC, pH 7.8)으로 충분히 세척하고, 그 후 주입을 위한 BC200(25 mM 트리스, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% 글리세롤, 0.2% NP40, pH 7.8)으로 평형을 유지하였다. 인체 폐 암종 세포(H1299)는 DMEM 배지 내 에서 퍼지고, 핵 추출물은 실질적으로 앞서 기술된 바와 같이 제조하였다(Gu et al., Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature, 387:819-23, 1997; Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000). 핵 추출물은 200 mM NaCl 및 0.2% NP40으로 조절되었고, 3회 이상 동안 GST 컬럼을 통해 흐르게 함으로써 예비 세정하였다. 800 ㎕의 예비 세정된 핵 추출물은 GST 또는 GST-p53 미니 컬럼에 주입하였다. 1 ml의 BC200 완충액으로 5회 세척한 후, 회합된 단백질은 40 ㎕의 BC500으로 컬럼으로부터 용리시켰다. 약 10 x 109 세포로부터 유도된 핵 추출물은 큰 조제를 위해 사용되었다.
실시예 3- p53 의 안정화 및 p53 의 유비퀴틴화 수준의 검출
p53-무기능 H1299 세포를 0.1-2mg의 CMV-Flag-p53, 2mg의 CMV-Mdm2, 1mg의 CMV-GFP, 및 5-16mg의 CMV-HAUSP 또는 지시된 HAUSP 돌연변이 또는 다른 단백질을 위한 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 24 시간 후, 세포는 Flag-세포 용해 완충액(50 mM 트리스, 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.2% 사르코실, 1 mM DTT, 10% 글리세롤, pH 7.8; 및 새로운 프로테이나제 저해제)에서 웨스턴 블롯 분석을 위해 용해하였다. GFP의 수준은 트랜스펙션 효율 대조군으로서 항-GFP 단일클론 항체, JL-8(Clontech)을 사용하여 검출되었다. p53의 유비퀴틴화 수준은 앞에서 기술된 바와 같이 필수적으로 검출되었다(Rodriguez et al., Multiple C-terminal lysine residues target p53 for ubiquitin-proteasome- mediated degradation. Mol . Cell . Biol., 20:8458-67, 2000). 세포는 50 mM의 프로테아좀 저해제, LLNL(Sigma)를 사용하여 수확 전 4시간 동안 처리하였고, 세포는 Flag-세포 용해 완충액 내에서 온화한 초음파로 용해시켰다. 세포 추출물은 Flag 단일클론 항체(M2)로 면역 침전시켰고, 후속하여 8% 또는 4-20% SDS-PAGE 겔(Novex)로 용해시켰으며, α-p53(DO-1)을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
시험관내 탈유비퀴틴화 검사를 위한 기질로서 다량의 유비퀴틴화된 p53을 제조하기 위해, H1299 세포(5X107)을 Flag-p53 및 Mdm2 발현 벡터와 동시-트랜스펙션하였다. 상기와 같이 동일하게 처리 후, 유비퀴틴화된 p53은 Flag-세포용해 완충액을 사용하여 M2-친화성 컬럼상에서 세포 추출물로부터 정제하였다. Flag-세포 용해 완충액으로 광범위하게 세척한 후, 단백질은 Flag-펩티드(Sigma)를 사용하여BC100 완충액 (25 mM 트리스, 100 mM NaCl, pH7.8)에서 용리시켰다. 재조합 Flag-HAUSP 및 돌연변이 형태 (HAUSP-cs)를 BL21 세포로 발현시키고 M2 컬럼상에서 정제하였다. 시험관내 탈유비퀴틴화 검사 반응을 위해, 유비퀴틴화된 p53 단백질은 재조합 HAUSP(100ng) 또는 탈유비퀸화 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH8.0; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 5% 글리세롤) 내의 동일량의 다른 지시된 단백질을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
하기 요약은 상기 실시예 1-3의 실험과 연관된 본 발명자에 의해 수득된 결과이다.
GST-p53 친화성 크로마토그래피로 생화학 정제 방법을 사용하여(Gu et al., Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature, 387:819-23, 1997; Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000), 본 발명자들은 인체 폐 암종 세포(H1299)의 핵 추출물로부터 p53-결합 단백질을 확인하였다. 도 1A에서 나타낸 바와 같이, GST-p53 친화성 컬럼 및 다른 컬럼으로부터 용리된 분획에 존재하는 다수의 단백질이 있다. 현저하게, 단지 하나의 단백질, p135(상대 분자 질량 ~135,000; Mr: 135K)는 GST-p53 컬럼으로부터 수득된 관련 인자 내에 특이적으로 존재하였지만, GST 컬럼 또는 대조군 컬럼으로부터 수득된 인자에는 존재하지 않는다(레인 3 vs. 레인 1, 2). 큰 조제(preparation)에 이어, p135 밴드의 충분한 물질이 질량 분광법을 위해 수득되었으며, 총 5 펩티드 서열이 수득되었다(서열 번호 1-5). 모두 5 개의 펩티드 서열이 HAUSP 또는 인체 USP7로 알려진, 허피스바이러스 단백질 Vmw110-관련 세포 인자로부터 유도되었다(Everett et al., A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997).
HAUSP는 탈유비퀴틴화 효소(DUBs)의 유비퀴틴-(Ub)-특이적 진행 프로테아제(UBP) 패밀리에 속하며, 코어 효소 영역에서 특징적인 Cys 및 His 모티프를 함유한다(Everett et al., A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997). 흥미롭게, UBP 패밀리의 다른 구성원에 대하여 중요한 상동성이 없으며, 기질 특이성을 위해 중요하다고 생각되는 HAUSP의 아 미노-말단 및 카르복실-말단 연장(Everett et al., A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997; D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit . Rev . Biochem . Mol . Biol., 35:337-52, 1998; Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem . Biophys . Res . Commun., 266:633-40, 1999; Wilkinson, K.D., Ubiquintination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasom. Semin. Cell Dev . Biol., 11:141-48, 2000)은 시험관내에서 p53에 직접적으로 결합하였다. 그러나, 도 9에서 나타낸 바와 같이, 35S-표지 시험관내- 번역된 HAUSP는 GST-p53에 강하게 결합되었지만, GST 단독은 아니다(레인 2 vs. 3). 더욱이, p53은 HAUSP의 N-말단 연장[HAUSP(NT)]에 단단히 결합되며(레인2, 도9B), 그의 카르복실-말단 연장[HAUSP(CT)]에 약하게 결합(레인6, 도9B)되지만, 코어 촉매 영역[HAUSP(M)]에는 결합하지 않았다(레인 5, 도 9B).
동시-면역침전화 분석으로 생체내 상호작용을 평가하기 위해, p53-무기능 세포(H1299)는 p53 및 Flag-태그된 HAUSP 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, p53은 Flag-HAUSP 및 p53 양자로 동시 트랜스펙션된 세포로부터 용이하게 면역 침전되었으며(레인 4), p53 만으로 트랜스펙션된 세포로부터는 그렇지 않다(레인 2).
HAUSP-특이성 항체를 사용하여, 본 발명자들은 또한 내인성 p53 및 HAUSP 단백질 간의 상호작용을 시험하였다. 웨스턴-블롯 분석은 p53이 인체 폐 암종 세포(H460)의 세포 추출물로부터 α-HAUSP 면역침전에 존재하지만, 면역전 혈청으로 수득된 대조군 면역침전물에서는 아닌 것으로 나타났다(도 1C). 흥미롭게, 이러한 상호작용은 유전자독소 스트레스(레인 2 vs. 레인 3, 도 1C)에서 수행된 세포내에서 강하게 검출되었으며, 반면, 프로테아좀 저해제, LLNL으로 처리된 세포내에서는 약간의 향상만이 검출되었다(레인 4, 도 1C). 이들 결과는 생체내에서 p53이 HAUSP와 상호작용하고, HAUSP에 의한 p53의 가능한 조절은 DNA 손상 반응 동안 세포내에서 여전해 수행될 수 있음을 나타낸다.
p53-HAUSP 상호작용의 기능적 결과를 결정하기 위해, 본 발명자들은 HAUSP가 p53의 안정화에 영향을 주는지 여부를 시험하였다. 도 2A에서 나타낸 바와 같이, HAUSP 발현은 정지 상태의 p53의 세포의 수준을 상당히 증가시켰다. 반면, HAUSP는 p27의 수준에 대하여 명백한 효과를 갖지 않지만(도 2B), 다른 수명이 짧은 종양 억제자 단백질에서 그의 안정성은 또한 유비퀴틴화 경로에 의해 조절되었다(Slingerland and Pagano, Regulation of the cdk inhibitor p27 and its deregulation in cancer. J. Cell Physi., 183:10-17, 2000). 더욱이, 도2C에 나타낸 바와 같이, HAUSP는 Mdm2-매개 분해로부터 p53을 효과적으로 구한다. 따라서, Mdm2 의 과발현은 p53 분해를 상당히 유도하며(레인 3 vs. 1, 도2C), p53의 분해는 HAUSP의 발현시 복용량 의존 방식으로 저해되었다(레인 4-6, 도2C).
본 발명자들은 내인성 p53의 안정화에 대한 HAUSP 발현의 효과를 더 시험하 였다. 정상 인체 섬유아세포 IMR-90 세포는 pBabe 레트로바이러스 결여 벡터 또는 HAUSP를 함유하는 pBabe 레트로바이러스로 감염되었다. 본 발명자들은 웨스턴-블롯 분석에 의해 내인성 p53의 단백질 수준을 최초로 시험하였다. 상당히 높은 p53 단백질의 수준은 pBabe-HAUSP-감염 세포내에서 검출되었다(레인 2 vs. 1, 도2D). 흥미롭게, 내인성 p21의 발현은 또한 일시적인 트랜스펙션 결과(자료는 나타나 있지 않음)와 일치하는 것으로 유도되었으며(레인 2 vs 1, 도2D), 이와 같이 하여 HAUSP가 p53-의존 전사 활성화를 활성화한다는 것을 나타낸다. 그와는 반대로, 내인성 p27의 수준은 동일한 것으로 남아있으며, 생체내에서 HAUSP가 p53을 안정화 하지만 p27은 그렇지 않다는 의견을 지지한다. 명백히, pBabe-HAUSP 감염 세포내의 p53의 반감기는 HAUSP 발현에 의해 상당히 증가(약 20 분 내지 약 90분)되었지만, 반면, 의사 감염된 세포에서 p53의 반감기는 30분 미만이다(도2E). 이들 결과를 보강하기 위해, 발명자들은 pBabe-HAUSP-감염된 세포내에서 p53의 유비퀴틴화 수준이 의사 감염된 세포의 수준과 비교시 저하되었다는 것을 또한 알아내었다(도2F). 따라서, 이들 자료는 HAUSP가 생체내에서 p53을 특이적으로 안정화함을 나타낸다.
HAUSP의 생물학적 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 군락-형성 검사에서 세포 성장시 HAUSP의 효과를 시험하였다. 한 쌍의 인체 폐암종 세포(H1299 및H460)는 HAUSP를 코딩하는 pBabe-puro 레트로바이러스 또는 결여(empty) pBabe-puro 대조 레트로바이러스로 감염시켰고, 약리학적 선택 하에 2 주간 배양하였다. 현저하게, HAUSP는 야생형 p53을 발현하는, H460 세포의 세포 성장을 상당히 저해하였지만, p53-무기능 H1299 세포에 대하여 중요한 효과를 갖지 않는다(도3A). HAUSP에 의한 유사한 세포 성장 억제는 또한 MEF p53(+/+) 세포내에서 관측되었지만, MEF p53(-/-) 세포에서는 관측되지 않았으며 (도 3A), 이것은 HAUSP에 의한 세포 성장 억제가 p53-의존성임을 시사한다.
본 발명자들은 HAUSP가 p53-의존 아톱포시스에 직접적으로 영향을 주는지 여부를 시험하였다. H1299 세포는 p53만으로 트랜스펙션하거나, 또는 p53 및Mdm2, 또는 p53, Mdm2 및 HAUSP로 동시-트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후, 세포는 고정시키고, p53을 위해 염색시키고, DNA 성분에 따라 아톱포시스 세포(SubG1)에 대하여 분석하였다(Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000). 도 3B에서 나타낸 바와 같이, p53 단독의 과발현이 상당한 아톱포시스(31.0%)를 유도한다는 것을 나타낼지라도, Mdm2는 p53-의존성 아톱포시스의 수준을 강하게 저하시켰다(11.2%). 그러나, HAUSP의 발현은 p53- 매개된 아톱포시스 상의 Mdm2의 저해 효과를 효과적으로 감소시켰다(28.5% vs. 11.2%, 도 3B). 이들 자료는 HAUSP가 p53-의존 아톱포시스의 조절뿐만 아니라 세포 성장 저해의 조절에 중요하게 포함됨을 나타낸다.
HAUSP가 p53을 안정화함에 의한 분자 기전을 설명하기 위해, 본 발명자들은 생체내 p53 유비퀴티화의 수준을 HAUSP가 직접적으로 제어하는지 여부를 시험하였다. 도 4A에서 나타낸 바와 같이, 유비퀴틴화된 p53의 높은 수준은 세포내에서 Mdm2와 동시-트랜스펙션되는 것으로 발견되었지만(레인 2); 그러나, p53 유비퀴틴화는 HAUSP 발현에 의해 상당히 폐기되었다(레인3 vs. 레인 2). 반대로, HAUSP는 유비퀴틴화된 p27의 수준에 대하여 효과가 없었다(자료는 나타내지 않았다). 명백 히, p53- 결합에 결함이 있는(나타내지 않음) 관계가 없는 인체 UBP 패밀리 구성원(인체 USP11)(D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit . Rev . Biochem . Mol . Biol., 33:337-52, 1998; Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem. Biophys . Res . Commun., 266:633-40, 1999; Wilkinson, K.D., Signal transduction: aspirin, ubiquitin and cancer. Nature, 424:738-39, 2003)은 p53 유비퀴틴화(레인 5, 도 4A) 또는 p53 안정화(레인 5, 도 4B)의 수준에 대한 명백한 효과를 갖지 않았다. 중요하게, 코어 영역에서 짧은 결실을 갖는 HAUSP 돌연변이는 p53의 안정화능을 손실하였으며(레인 4, 도 4B) 또는 p53 유비퀴틴화의 세포 수준을 저하시켰으며(레인 4, 도 4A), 이것은 HAUSP에 의한 p53의 안정화가 그의 탈유비퀴틴화하는 효소 활성을 필요로 함을 나타낸다.
p53에 대한 HAUSP의 특이적 탈유비퀴틴화 활성을 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 HAUSP가 정제된 시스템 내에서 p53을 직접적으로 탈유비퀴틴화할 수 있는 지 여부를 시험하였다. HAUP 단백질은 박테리아에서 발현되고 근접한 동종성으로 정제되었다. p53의 유비퀴틴화된 형태는 그 후 Flag-태그된 p53 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포로부터, 매우 엄중한 조건하에 M2 친화성 컬럼 상에서 정제되었다. 시험관내 시스템에서의 고도의 정제는 저해 인자(즉, p14ARE) 또는 p53의 유비퀴틴화를 포함하는 임의의 효소에 의해 가능한 오염을 방지하도록 하기 위해 이 검사에 사용되었다. 도 4C에서 나타낸 바와 같이, p53은 정제된 재조합 HAUSP와 인큐베이션할 때 효율적으로 탈유비퀴틴화되었다(레인 2). 따라서, 전술한 결과는 HAUSP 가 시험관내 및 생체내 양자에서 특이적으로 p53을 탈유비퀴틴할 수 있다는 것을 나타낸다.
흥미롭게, 코어 영역에서 고도로 보전된 Cys 잔기가 Ser로 대체된, HAUSP 점 돌연변이 단백질(HAUSP-cs)은 p53과의 강한 결합을 유지하였다(도9); 그러나, 돌연변이는 시험관내 탈유비퀴틴화한 p53에서 기능적으로 결함이 있다(레인3, 도4C). 중요하게, 야생형 HAUSP에 의해 생성된 효과와는 반대로, 세포내에서 HAUSP-cs의 발현은 p53 유비퀴틴화의 수준을 증가시켰으며(레인 4 vs. 2, 도5A), 이것은 HAUSP-cs가 내인성 HAUSP-매개된 p53의 탈유비퀴틴화를 방해함으로써 우성-음성 돌연변이로서 기능할 수 있다는 것을 나타낸다.
이들 결과를 확증하기 위해, 본 발명자들은 또한 HAUSP-cs 발현이 세포내에서 p53 단백질의 수준에 영향을 주는지 여부를 시험하였다. 도 5B에서 나타낸 바와 같이, p53과의 HAUSP-cs의 동시-발현은 약간, 그렇지만 중요하게 p53 단백질(레인 1, 3 vs. 레인 2, 4)의 수준을 감소시킨다. HAUSP가 내인성 p53을 조절하는 것을 더 설명하기 위해, 본 발명자들은 정상 인체 세포에 점 돌연변이(HAUSP-cs)를 도입하였다. IMR-90 세포는 pBabe 레트로바이러스 결여 벡터 또는 HAUSP-cs를 함유하는 pBabe 레트로바이러스로 감염되었다. 도 5C에서 나타낸 바와 같이, 의사 감염된 세포내에서 p53 단백질의 수준은 DNA 손상에 의해 강하게 유도되었다 (레인 1, 3, 5). 그러나, HAUSP-cs 발현은 정상 및 DNA 손상 조건하에서 p53 안정화의 중요한 저하를 초래한다(레인 2, 4, 6). 함께 취하여, 이들 결과는 HAUSP가 생리적 조건하에서 p53의 안정화뿐만 아니라 탈유비퀴틴화에 중요하게 포함됨을 시사한다.
실시예 4- 동시-면역침전 분석
동시 면역침전 분석에 의해 생체내 상호작용을 더 평가하기 위해, p53-무기능 세포(H1299)를 p53 및 Flag-태그된 HAUSP 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. 도8A에 나타낸 바와 같이, p53은 Flag-HAUSP 및 p53 양자로 동시-트랜스펙션된 세포로부터 용이하게 면역침전되었지만(레인 4), p53 단독으로 트랜스펙션된 세포로부터는 그렇지않다(레인 2). HAUSP-특이적 항체를 사용함으로써, 본 발명자들은 또한 내인성 p53 및 HAUSP 단백질 간의 상호작용을 시험하였다. 웨스턴-블롯 분석은 p53이 야생형 p53을 발현하는 인체 폐 암종 세포(H460)의 세포 추출물로부터 α-HAUSP 면역침전물에 존재하였지만(레인 4, 도 8B), 면역전 혈청으로 수득된 대조군 면역침전물에서는 아니다(레인2, 도 8B). 흥미롭게, 이러한 상호반응은 유전자독소 스트레스(레인 3 vs. 레인 4, 도 8B)에서 수행된 세포내에서 훨씬 강하게 나타났으며, 반면, 프로테아좀 저해제, LLNL로 처리된 세포내에서는 약간의 향상만이 검출되었다(레인 5, 도 8B). 게다가, p53-HAUSP 상호작용의 향상이 DNA 손상(도 7C) 2-4 시간 후 곧 관측되었으며, 이것은 DNA-손상 반응 동안 p53 안정성을 조절하는 HAUSP의 중요한 역할을 시사한다. 따라서, DNA 손상에 의한 Mdm2-p53 상호작용의 폐지와는 반대로(Shieh et al., DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition MDM2. Cell, 91:325-34, 1997) 이들 결과는 내인성 HAUSP가 p53 안정화에 중요한 역할을 한다는 시사와 일관 되게, 생체내에서 p53이 HAUSP와 상호작용하는 것을 나타내며, 이러한 상호작용은 DNA 손상 후 세포내에서 향상됨을 나타낸다.
실시예 5- 추가의 플라스미드 및 항체
실시예 6-7에서 사용된 플라스미드 및 항체는 하기와 같이 제조되었다. p53을 구성하기 위해, Mdm2, HAUSP, 및 유비퀴틴 발현 벡터, 완전한 길이의 단백질에 상응하는 cDNA 서열은 Marathon-Ready HeLA cDNA(Clontech) 또는 다른 주형에 의해 증폭되고, 박테리아 내에서 발현하기 위한 pGEX(GST) 또는 pET-11(His6) 벡터로, 또는 포유 동물 세포에서의 발현을 위한 pcDNA3 벡터로 서브클로닝하였다. FLAG 에피토프 태그는 PCR에 의해 도입되었다. 돌연변이 구조물을 제조하기 위해, 상이한 부위에 상응하는 cDNA 서열은 상기 구조물로부터 PCR에 의해 증폭되었으며, 진 에딧(Gene Edit) 시스템(Promega)를 사용하여 위치 지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 위해 서브클로닝하였다. p53(DO-1)(Santa Cruz), p21(Santa Cruz), GFP(Clontech), 마우스 유비퀴틴(Calbiochem), c-Myc(Santa Cruz), 및 p27(Calbiochem)에 대한 단일클론 항체는 지시된 회사로부터 구입하였다. MdmX 및 Mdm2(4B2) 단일클론 항체는 각기 제이. 첸(J. Chen's) 및 에이. 레바인(A. Levine's)의 랩으로부터 제공받았다. MdmX 항체는 또한 IBL Co., Ltd로부터 수득될 수 있다(후지오까, 일본). Mdm2(4B2) 항체에 대하여 첸(Chen) 등 참조(Mapping of the p53 and mdm-2 interaction domains. Mol . Cell, Biol., 13:4107-14, 1993).
Mdm2 및 HAUSP 다중클론 항체에 대하여, 항혈청은 각기 정제된 GST-Mdm2(1-110) 및 GST-HAUSP(1-98) 단백질 단편에 대하여 토끼에서 생성하였으며, 항원 컬럼 에서 추가로 친화성 정제되었다.
실시예 6- RNAi 및 shRNA 에 의한 내인성 HAUSP 의 제거
U2OS 세포내의 HAUSP 수준의 효율적인 감소를 위해, 2 단계 공정을 사용하였다. 첫번째로, 본 발명자들은 필수적으로 앞서 기술된 바와 같은, HAUSP 쇼트-헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하는 안정한 세포계를 확립하였다(Hemann et al., An epi-allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo . Nat . Genet., 33:396-400, 2003). 간단히, 3' 올리고뉴클레오타이드는 하기에 상응하는 것을 생성하였다: U6 프로모터에 대하여 상동성, HAUSP의 28-nt 부위(nt 133-161), 8-nt 스페이서, HAUSP 서열의 안티센스, 및 pol III 종결 위치. 5' 올리고뉴클레오티드는 U6 프로모터의 5' 말단에서 SP6 위치에 상응한다. U6 프로모터를 함유하는 pGEM 벡터는 PCR 반응을 위한 주형으로 사용되었다. 생성물은 그 후 pGlow-TOPO 벡터(Invitrogen)로 서브클로닝하였고, 후속하여 G418 내성(Gibco)에 의한 안정한 계의 클론 선택성을 위해 U20S 세포로 트랜스펙션하였다. 이 방법은 1/2로 HAUSP 수준을 감소시켰으며, 10 세포계 초과가 유사한 효과로 수득되었다.
추가적인 감소를 위해, U2OS-HAUSP shRNA 안정한 계는 HAUSP mRNA- 구체적으로, HAUSP#1(AAUGUGGCCCUGAGUGAUGGA)(서열 번호 8) 또는 HAUSP#2 (AAGUCUUUGUACAGGCGGAUG)(서열 번호 9) (Dharmacon)에 상응하는 3'dTdT 오버행을 함유하는 21-nt siRNA 이중 가닥으로 트랜스펙션하였다. 2 뉴클레오타이드가 변화된 동일한 서열 (HAUSP#1-돌연 변이)(AAUGUGGGCCUGAGAGAUGGA) (서열 번호 10)을 대 조로서 사용하였다. RNAi 트랜스펙션은 올리고펙타민을 사용하여 수행되었다. 대략, 100만개 세포가 트랜스펙션되기 24 시간 전에 10 cm 접시에서 평판 배양하였다. 제조자의 프로토콜(Invitrogen)은 모든 트랜스펙션에 대하여 수행되었다. 다른 목적을 위하여, RNAi-매개 내인성 HAUSP의 제거는 상술한 바와 같이 HAUSP 21-뉴클레오타이드 siRNA 이중 가닥을 사용하여 또한 수행되었다. 이들 세포는 그 후 기술된 검사에서 사용되었다.
실시예 7- 시험관내 탈유비퀴틴화 분석
기질로서, 유비퀴틴화된 Mdm2의 제조를 위하여, 3 ng의 박테리아로 생성된 GST-Mdm2는 10 ng의 E1, 20-100ng의 E2(UbcH5a), 및 5 ㎍의 His-유비퀴틴을 포함하는 다른 정제된 성분과 200 ㎕의 반응 완충액(40 mM 트리스, 5mM MgCl2, 2mM ATP, 및 2mM DTT; pH 7.6) 내에서 혼합하였다. 각각의 반응은 8 M 요소 세척 완충액(완충액 A)의 첨가에 이어, 실온에서 Ni2 + -NTA-아가로스 비드를 사용하여 4-시간 인큐베이션에 의해 60분 후 37℃에서 정지되었다. 비드는 그 후 각각의 하기 완충액으로 5분간 세척하였다: 완충액 A((8M 요소, 0.1 M Na2PO4/NaH2PO4, 0.01 M 트리스/HCl(pH 8.0), 10 mM ß-머캅토에탄올, 및 0.2% 트리톤 X-100) 및 완충액 B (8M 요소, 0.1 M Na2PO4/NaH2PO4, 0.01 M 트리스/HCl(pH 6.3), 10 mM ß-머캅토에탄올, 및 0.2% 트리톤 X-100). His6-태그된 유비퀴틴화된 단백질은 그 후 용리 완충액(100 mM NaCl, 20% 글리세롤, 20 mM 트리스-HCl(pH 7.9), 200 mM 이미다졸 및 1 mM DTT)으 로 4℃에서 60분 동안 용리시켰다.
유비퀴틴화된 Flag-c-Myc 및 Flag-p53 기질의 제조를 위해, 293 및 HeLa 세포를 각기 10 ㎍의 pCIN4-Flag-Myc 및 5 ㎍의 pCIN4-Flag-p53으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션한 지 24시간 후에, 세포는 각기 6 시간 동안 25 μM의 프로테아좀 저해제, MG132 및 LLNL(Sigma)로 처리하고 이어서 Flag-세포용해 완충액으로 용해하였다. 세포 추출물은 Flag 단일클론 항체(M2)로 면역침전시켰다. 탈유비퀴틴화 검사를 위해, 용리액은 그 후 100ng의 정제된 박테리아 발현된 GST-HASUP, GSTHAUSP-cs, 또는 GST-UBP11으로 60분 동안 인큐베이션 시키고, 후속하여 웨스턴 분석을 위해 4-12% 구배 겔 상에서 용해하였다.
하기 요약은 상기 실시예 5-7의 실험과 관련하여 본 발명자들에 의해 수득된 결과이다.
내인성 HAUSP 의 RNAi -매개 감소에 의한 p53 수준에 대한 차등적 영향
생체내 HAUSP의 역할을 설명하기 위해, 본 발명자들은 내인성 HAUSP의 RNAi-매개 감소의 기능적 결과를 시험하였다. 이러한 목적을 위하여, HAUSP 및 야생형 p53 단백질 양자를 발현하는 정상 인체 섬유아세포(NFH-1 및 IMR90)가 HAUSP- 특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드(RNAi/HAUSP#1) 또는 대조군 GFP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드(RNAi/대조)로 트랜스펙션하였다. 도 10A에서 나타낸 바와 같이, 내인성 HAUSP 폴리펩티드의 수준은 HAUSP가 상대적으로 안정한 단백질인 것처럼, 1 회차의 올리고뉴클레오타이드 트랜스펙션 후 단지 부분적으로 감소 되었다(상부; 레 인 2 및 4 vs. 레인 1 및 3). 이러한 조건하에서, 내인성 p53 단백질의 수준은 또한 온화하게 감소되었으며, 이것은 세포 p53의 안정화에서 HAUSP에 대한 양성 역할을 뒷받침한다.
흥미롭게, HAUSP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션의 연속 3 회차 후, 내인성 HAUSP 단백질의 수준은 거의 완전히 고갈되었다(도 10B, 상부; 레인 2 vs. 레인 1). 놀라웁게도, 그러나, HAUSP 발현의 심각한 제거는 p53의 안정화를 유도하였다(중간; 레인 2 vs. 레인 1). 이 현상을 확인하기 위해, 본 발명자들은 상이한 접근을 사용하여 또 다른 세포 형태로 HAUSP 고갈의 효과를 시험하였다.
인체 골육종 U2OS 세포내에서 HAUSP 수준의 효율적인 감소에 대하여, 2 단계 공정이 사용되었다. 첫번째로, 본 발명자들은 필수적으로 전술한 것과 같은 HAUSP 쇼트-헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하는 안정한 세포계를 확립하였다(Hemann et al., An epi-allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo . Nat . Genet., 33:396-400, 2003). 그 후, HAUSP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드를 사용한 1 회차의 트랜스펙션은 U2OS-HAUSP shRNA 안정한 계에서 HAUSP 수준을 더 감소시키기 위해 사용되었다. 도10C에서 나타낸 바와 같이, 내인성 HAUSP 단백질은 거의 검출되지 않았다; 그러나, 내인성 p53의 수준은 다시 상당히 증가되었다. 함께 취하여, 이들 결과는 RNAi에 의한 내인성 HAUSP 발현 수준의 부분적인 감소는 실제로 내인성 p53을 불안정화시켰으며; 기대치않게, 그러나, HAUSP의 심한 제거는 내인성 p53을 반대로 안정화함을 나타낸다.
HAUSP 발현은 또한 Mdm2 를 안정화한다
HAUSP에 의한 p53 수준의 조절의 차이에 대한 책임이 있는 분자 기전을 이해하기 위해, 본 발명자들은 p53이외에, HAUSP-고갈 세포에서 간접적인 p53 안정화를 초래하는, HAUSP에 의해 다른 세포 인자가 조절될 수 있다는 것을 추론하였다. 따라서, 본 발명자들은 p53 경로에서 다른 중요한 조절자에 대하여 HAUSP의 효과를 시험하였다. 흥미롭게, p53, Mdm2, 및 HAUSP를 코딩하는 발현 벡터로 H1299 세포(p53-무기능, 인체 폐 암종 세포계)를 트랜스펙션한 후, 본 발명자들은 Mdm2의 상승된 수준을 관측하였다. 따라서, 도 10D에서 나타낸 바와 같이, Mdm2- 매개 p53 분해가 HAUSP 발현에 의해 실제로 강하게 구해지며, Mdm2의 수준은 또한 상당히 향상된다. HAUSP가 또한 Mdm2를 안정화 할 수 있음을 나타내는 유사한 결과가 또한 인체 U2OS 세포에서 관측되었다(도 14, 상부 패널). 반대로 본 발명자들은 HAUSP 발현에 의한 MdmX에 대한 중요한 효과를 검출하지 못하였다(도 10E).
HAUSP 는 p53 의 부재하에 Mdm2 와 상호작용한다
Mdm2의 HAUSP 매개 안정화가 직접적인 효과 인지 여부를 결정하게 위해, 본 발명자들은 HAUSP가 p53의 부재하에 Mdm2와 결합할 수 있는지 여부를 처음으로 시험하였다. 도 11A에서 나타낸 바와 같이 35S-표지된 시험관내 번역된 HAUSP 를 고정된 GST-Mdm2 폴리펩티드에 강하게 결합시켰으며 GST 단독은 그렇지 않았다 (레인3 vs. 레인 2). 본 발명자들은 다음 H1299 세포, p53-무기능 세포계 내의 Mdm2 및 HAUSP 간의 p53-독립 상호작용에 대하여 시험하였다. Mdm2의 내인성 수준이 H1299 세포에서 극단적으로 낮기 때문에, 본 발명자들은 Flag-태그된 야생형 인체 Mdm2를 안정하게 발현하는 유도 세포계를 생성하였다. 도 11B에서 나타낸 바와 같이, 내인성 HAUSP는 Flag-특이성 M2 항체를 사용한 Flag-Mdm2의 면역침전화에 의한 이들 세포로부터 용이하게 회수되었다(레인 4). HAUSP-특이성 항체를 사용하여, 본 발명자들은 또한 U20S 세포내에서 내인성 HAUSP 및 Mdm2 단백질 간의 상호작용을 입증하였다. 웨스턴-블롯 분석은 Mdm2가 U2OS 세포의 세포 추출물로부터의 항-HAUSP 면역침전물에 존재하지만 대조군 면역침전물에서는 그렇지 않다는 것을 나타냈다 (도 11C; 레인 3 vs. 레인 2). 이들 결과는 p53에 독립적인 HAUSP 및 Mdm2 간의 물리적 상호작용을 설명한다.
Mdm2 는 HAUSP 매개 탈유비퀴틴화의 기질이다
본 발명자들은 HAUSP가 Mdm2 안정화에서 효소적인 역할을 갖는지 여부를 결정하기 위해 더 탐구하였다. 시험관내에서 유비퀴틴화된 Mdm2가 재조합 HAUSP 또는 효소 결핍 돌연변이 HAUSP-cs로 동시- 인큐베이션된 탈유비퀴틴화 검사가 수행되었다. 도 11D에서 나타낸 바와 같이, HAUSP의 존재 하에 Mdm2는 상당히 탈유비퀴틴화되었지만, HAUSP-cs의 존재하에서는 그렇지 않다. 그 중에서도 특히, HAUSP는 시험관내에서 유비퀴틴화된 c-Myc 단백질을 탈유비퀴틴화하는 데 실패하였으며; 관계없는 인체 탈유비퀴나제, UBP11은 유사한 검사에 의해 비특이성 기질을 탈유비퀴틴화할 수 있지만 Mdm2를 탈유비퀴틴화하는 데 실패하였으며(도 14(중간 및 하부 패널) 및 도 15(상부 패널)), 이것은 HAUSP 매개 Mdm2 탈유비퀴틴화의 특이성을 확증하는 것이다.
본 발명자들은 그 후 Mdm2 및 야생형 또는 돌연변이 HAUSP를 사용하여 동시-트랜스펙션하는 p53-무기능 H1299에 의해 p53의 부재하에 Mdm2를 안정화하는 HAUSP의 능력을 시험하였다. 도 11E에서 나타낸 바와 같이, Mdm2는 세포내에서 짧은 수명의 단백질(상부 패널)이지만, Mdm2는 야생형 HAUSP의 존재하에 강하게 안정화되며(중간 패널), 및 안정화는 촉매 돌연변이 HAUSP-cs에 의해 심하게 제거된다(하부 패널). 이들 자료는 HAUSP가 p53의 부재하에 탈유비퀴틴화하는 Mdm2에 의해 Mdm2 안정성을 직접적으로 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
Mdm2 는 HAUSP-제거 세포내에서 극단적으로 불안정하여, p53 기능의 간접적인 활성화를 초래한다
HAUSP RNAi에 의해 유도된 특이한 효과를 더 입증하기 위해, 본 발명자들은 HAUSP mRNA의 상이한 부위를 인지하는 또 다른 HAUSP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드, RNAi/HAUSP#2를 사용하여 유사한 검사를 수행하였다. 연속 3 회차의 트랜스펙션 후, 내인성 HAUSP 단백질의 수준은 거의 완전히 제거되었으며(도 12A, 상부 패널; 레인 3 vs. 레인 4), p53의 수준은 HAUSP 고갈에 의해 다시 상승되었다(도 12A). 이들 결과는 도 10에서 존재하는 것과 일치한다.
본 발명자들은 또한 HAUSP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드의 점 돌연변이를 사용하여 대조 실험을 수행하였다. 도 12A에서 나타낸 바와 같이, 내인성 HAUSP의 심한 고갈은 HAUSP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드 #1(RNAi/HAUSP#1)에 의해 U2OS 세포내에서 p53 안정화를 초래하지만, HAUSP-특이성 RNA 올리고뉴클레오타이드#1 점 돌연변이(RNAi/HAUSP#1-mut)에 의해 처리된 세포내에서는 상당한 효과는 관측되지 않았다. 더욱이, HAUSP 고갈에 의해 c-Myc 또는 p27과 같은 기타 짧은 수명의 단백질에 대하여 상당한 효과는 관측되지 않았다(도 15, 중간 패널). 그 중에서도 특히, HAUSP고갈은 또한 p21 (도 12B)의 유도, p53의 주요 전사 표적을 초래하였다. 이들 결과는 HAUSP 고갈 세포내에서 p53이 안정화되고 활성화됨을 나타낸다.
본 발명자들은 HAUSP 고갈에 의한 내인성 Mdm2에 대한 효과를 더 시험하였다. Mdm2의 mRNA의 수준은 상승되었는데, 그 이유는 Mdm2가 또한 p53의 전사 표적이기 때문이다(도 15, 하부 패널). 그러나, 현저하게, 내인성 Mdm2의 반감기가 HAUSP의 RNAi-매개 고갈시 극단적으로 짧아졌다(도 12C). 그러므로, HAUSP 과발현이 Mdm2 및 p53 양자를 안정화하는 한편(도 10D), HAUSP 고갈의 순수 성과는 p53의 안정화 및 기능 활성화인데, 그 이유는 Mdm2가 명백히 세포내에서 p53을 분해시키기에는 너무 불안정하기 때문이다. 이것은 또한 HAUSP 고갈 세포내에서, (Mdm2 활성 및 p53의 간접 활성화의 감소를 초래하는)Mdm2의 탈유비퀴틴화 실패가 HAUSP-매개 p53 탈유비퀴틴화의 손실로 인해, p53의 예측되는 불안정화를 번복한다는 것을 시사한다.
p53 의 HAUSP -매개 피드백 조절은 Mdm2 에 대하여 특이적이다
p53-Mdm2 조절에서 HAUSP의 특이적인 역할을 입증하기 위해, 본 발명자들은 HAUSP-고갈에 의한 p53 안정화의 효과가 Mdm2-의존성인지 여부를 시험하였다. 명백하게, 야생형 p53을 발현하는 정상 세포가 Mdm2의 손실에 의해 생존할 수 없기 때문에, 이러한 문제를 직접적으로 제기하는 것은 난해한 것이다. HeLA 세포에서, p53의 유비퀴틴화 및 분해는 세포 E6AP 유비퀴틴 리가제와 조합하여 인체 유두종 바이러스(HPV) 단백질 E6에 의해 주로 제어된다(Hengstermann et al., Complete switch from Mdm2 to human papillomavirus E6-mediated degradation of p53 in cervical cancer cells. Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 98:1218-23, 2001; Munger and Howley, Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res., 89:213-28, 2002). 따라서, 본 발명자들은 HAUSP가 또한 E6 매개 p53 분해를 저해하는지 여부를 처음으로 시험하였다. 도 13A에서 나타낸 바와 같이, HAUSP의 과발현은 p53의 E6-매개 분해를 효과적으로 구한다(레인 4,5 vs. 레인 2,3). 더욱이, HeLa 세포로부터 정제된 유비퀴틴화된 p53 단백질은 재조합 HAUSP에 의해 용이하게 탈유비퀴틴화되지만(도 13B; 레인 2 vs. 레인 1), 탈유비퀴나제-결함 돌연변이 HAUSP-cs(레인 3)에 의하여는 그렇지 않다.
p53 유비퀴틴화의 Mdm2-의존성 경로가 HeLa 세포에서 불활성이기 때문에(Hengstermann et al., Complete switch from Mdm2 to human papillomavirus E6-mediated degradation of p53 in cervical cancer cells. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 98:1218-23, 2001), p53의 E6-매개 분해의 구원시 HAUSP 과발현의 직접적인 효과는 이들 세포내에서 정체를 나타낸다. 이러한 해석을 확인하기 위해, 본 발명자들은 p53에 대하여 상이한 효과를 초래하는 HeLa 세포내에서의 HAUSP 발현의 고갈 여부를 시험하였다. 도 13C에서 나타낸 바와 같이, HeLa 세포내에서 HAUSP 고갈은 내인성 p53의 수준을 저하시키며 p21의 활성화가 실패되는 반면, 반대로 U2OS 세포에서는 수행된다. 따라서, HAUSP-매개 탈유비퀴틴화의 제거는 HeLa 세포내에서 p53의 분해를 더 용이하게 한다. 이들 자료는 p53의 HAUSP-매개 피드백 조절이 Mdm2에 특이적이며, 또한 생체내 p53 안정화에서 HAUSP의 양성 역할을 확인하는 것을 시사한다.
전술한 발명은 명백히 함 및 이해의 목적을 위해 어느 정도 상세히 기술하였지만, 명세서를 읽음으로써 첨부된 청구의 범위 내에서 본 발명의 진실한 범주로부터 벗어남이 없이 형태 및 상세한 설명의 다양한 변화를 할 수 있다는 것은 당업자에 의해 인식될 것이다.
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Claims (60)

  1. Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대하여 피험체의 진단용 샘플을 분석하는 것을 포함하는, 피험체가 종양을 보유하는지 여부를 결정하는 방법으로서, 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현이 검출되는 것은 피험체가 종양을 보유하는 것으로 진단되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 종양이 암종, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식성 질환, 육종, 또는 혼합 종양 형태인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 종양이 Mdm2- 또는 HAUSP-관련 종양인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 종양이 p53-관련 종양인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현은 진단용 샘플 중의 정상치보다 높은 Mdm2-HAUSP 상호작용을 검출함으로써 진단용 샘플에서 검출하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 진단용 샘플은 Mdm2와 반응성인 제제 및 HAUSP와 반응성인 제제를 사용하여 분석하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 1종의 제제는 검출 가능한 마커로 표지하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 적어도 1종의 제제는 항체인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 진단용 샘플은 Mdm2를 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 프로브 및 HAUSP를 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 프로브를 사용하여 분석하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 각 핵산 프로브는 DNA 또는 RNA인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 프로브는 검출 가능한 마커로 표지하는 것인 방법.
  12. Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대해 피험체의 진단용 샘플을 분석하는 것을 포함하는, 종양 치료를 받았거나 치료 중인 피험체의 종양을 치료하기 위한 요법의 효능을 평가하는 방법으로서, 진단용 샘플에서 정상 Mdm2 발현 및 정상 HAUSP 발현이 검출되는 것은 종양 치료를 위한 성공적 요법임을 나타내는 것이며, 진단용 샘플에서 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현이 검출되는 것 은 종양 치료를 위해 요법을 지속할 필요가 있음을 나타내는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 정상치보다 높은 Mdm2 발현 및 정상치보다 높은 HAUSP 발현은 진단용 샘플 중의 정상치보다 높은 Mdm2-HAUSP 상호작용을 검출함으로써 진단용 샘플에서 검출하는 것인 방법.
  14. Mdm2 발현 및 HAUSP 발현에 대하여 피험체의 진단용 샘플의 분석하는 것을 포함하는, 종양을 보유하는 피험체의 예후를 평가하는 방법으로서, 피험체의 예후는 진단용 샘플에서 Mdm2 발현 감소 및 HAUSP 발현 감소가 검출됨에 따라 개선되며, 피험체의 예후는 진단용 샘플에서 Mdm2 발현 증가 및 HAUSP 발현 증가가 검출됨에 따라 악화되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, Mdm2 발현 및 HAUSP 발현은 진단용 샘플 중의 Mdm2-HAUSP 상호작용을 검출함으로써 진단용 샘플에서 검출하는 것인 방법.
  16. (a) Mdm2와 반응성인 제제 1종 이상;
    (b) HAUSP와 반응성인 제제 1종 이상; 및
    (c) Mdm2의 발현 및 HAUSP의 발현을 검출하기에 적당한 시약
    을 포함하는, 종양 검출용 키트.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 1종의 제제는 검출 가능한 마커로 표지된 것인 키트.
  18. 피험체에서 p53의 활성을 증가시키는 것을 포함하는, 피험체의 종양을 치료하는 방법으로서, p53의 활성은 피험체에서 Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절함으로써 증가시키는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 종양이 암종, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식성 질환, 육종, 또는 혼합 종양 형태인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 종양이 Mdm2- 또는 HAUSP-관련 종양인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 종양이 p53-관련 종양인 방법.
  22. 제18항에 있어서, Mdm2-HAUSP 상호작용은 피험체에 Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제(modulator)를 투여함으로써 피험체에서 조절하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 조절제는 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 투여로 피험체에 투여하는 것인 방법.
  24. Mdm2를 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화하는 데 유효한 양으로 HAUSP와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포내에서 Mdm2를 탈유비퀴틴화 및/또는 안정화하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 접촉은 시험관내에서 실시하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 접촉은 피험체의 체내에서 실시하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 접촉은 피험체에 HAUSP를 투여함으로써 피험체의 체내에서 수행하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, HAUSP는 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 투여로 피험체에 투여하는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 인간이 종양을 보유하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 종양이 암종, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식성 질환, 육종, 또는 혼합 종양 형태인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 종양이 Mdm2- 또는 HAUSP-관련 종양인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 종양이 p53-관련 종양인 방법.
  34. 제30항에 있어서, HAUSP가 피험체의 종양을 치료하는 것인 방법.
  35. p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하기에 유효한 양으로 Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포내 p53의 탈유비퀴틴화 및/또는 안정성을 조절하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 세포내에서 p53의 탈유비퀴틴화가 증가되고, p53의 안정성이 증가되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, p21은 p53에 의해 세포내에서 유도되는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 접촉은 시험관내에서 실시하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 접촉은 피험체의 체내에서 실시하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 접촉은 피험체에 조절제를 투여함으로써 피험체의 체내에서 실시하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 피험체가 종양을 보유하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 종양이 암종, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 악성 림프종, 악성 흑색종, 골수증식성 질환, 육종, 또는 혼합 종양 형태인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 종양이 Mdm2- 또는 HAUSP-관련 종양인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 종양이 p53-관련 종양인 방법.
  46. 제42항에 있어서, Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제가 피험체의 종양을 치료하는 것인 방법.
  47. (a) Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 시험관내 시스템을 구하거나 제조하는 단계;
    (b) 상기 시험관내 시스템과 후보 조절제를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 시험관내 시스템에서 상기 후보 조절제가 Mdm2-HAUSP 상호작용을 조절하는지를 결정하는 단계
    를 포함하는, Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제를 동정하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 단계 (c)의 결정은 후보 조절제 부재 하에 Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 제2 시험관내 시스템에서의 Mdm2-HAUSP 상호작용과 단계 (b)의 시험관내 시스템에서의 Mdm2-HAUSP 상호작용을 비교하여 수행하는 것인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 단계 (c)의 결정은 Mdm2, HAUSP, 후보 조절제, 및 항-Mdm2 또는 항-HAUSP 항체 또는 길항제를 포함하는 제2 시험관내 시스템에서의 Mdm2-HAUSP 상호작용과 단계 (b)의 시험관내 시스템에서의 Mdm2-HAUSP 상호작용을 비교하여 수행하는 것인 방법.
  50. 제47항의 방법에 의해 동정된 조절제.
  51. 피험체의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 병태를 치료하는 데 유효한 양의 제50항의 조절제를 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 병태를 치료하는 방법.
  52. 종양의 치료 방법에 있어서의 Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제의 용도.
  53. 유효량의 Mdm2-HAUSP 상호작용 조절제와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  54. (a) HAUSP 존재 하에 Mdm2와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (b) Mdm2-HAUSP 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가하는 단계
    를 포함하는, Mdm2와 반응성인 제제를 동정하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    (c) Mdm2, HAUSP, 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 제제가 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 생물학적 현상에 영향을 미치는지를 결정하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  56. 제54항의 방법에 의해 동정된 제제.
  57. (a) Mdm2 존재 하에 HAUSP와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (b) HAUSP-Mdm2 상호작용을 저해하는 후보 제제의 능력을 평가하는 단계
    를 포함하는, HAUSP와 반응성인 제제를 동정하는 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    (c) Mdm2, HAUSP, 또는 p53을 포함하는 하나 이상의 세포와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 제제가 하나 이상의 세포내에서 하나 이상의 Mdm2-, HAUSP-, 또는 p53-관련 생물학적 현상에 영향을 미치는지를 결정하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  59. 제57항의 방법에 의해 동정된 제제.
  60. Mdm2 및 HAUSP를 포함하는 복합체.
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