RU2582678C2 - Пептидомиметические макроциклы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новым пептидомиметическим макроциклам и способам применения таких макроциклов для модуляции активности p53 и/или HDM2, HDMX. 4 н. и 29 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 13 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет на основании предварительных заявок США № 61/373701, поданной 13 августа 2010 года, № 61/373638, поданной 13 августа 2010 года, и № 61/374163, поданной 16 августа 2010 года, которые включены в данное описание в качестве ссылки во всей полноте.

Уровень техники изобретения

Человеческий белок - фактор транскрипции p53 индуцирует прекращение клеточного цикла и апоптоз в ответ на повреждение ДНК и клеточный стресс и, следовательно, играет важную роль в защите клеток от злокачественной трансформации. E3 убихитин-лигаза HDM2 осуществляет отрицательную регуляцию функции p53 путем непосредственного связывающего взаимодействия, которое нейтрализует трансактивационную активность p53, приводя к экспорту белка p53 из ядра и деградации мишеней p53 по убихитилирующему - протеасомальному пути. Утрата активности p53 в результате делеции, мутации или сверхэкспрессии HDM2 представляет собой наиболее распространенный дефект при раковых заболеваниях человека. Опухоли, экспрессирующие p53 дикого типа, являются чувствительными к фармакологическим средствам, которые стабилизируют активный p53 или повышают его концентрацию. В данном контексте ингибирование активности HDM2 является обоснованным подходом к восстановлению активности p53 и возобновлению способности раковых клеток вступать в апоптоз in vitro и in vivo. Совсем недавно HDMX (HDM4) был идентифицирован как аналогичный отрицательный регулятор p53, причем исследования показали наличие значительной структурной гомологии среди p53-связывающих поверхностей HDM2 и HDMX.

Белок-белковые взаимодействия p53-HDM2 и p53-HDMX опосредуются одним и тем же альфа-спиральным трансактивационным доменом, состоящим из 15 остатков, который вставляется в гидрофобные щели на поверхности HDM2 и HDMX. Три остатка указанного домена p53 (F19, W23 и L26) являются необходимыми для связывания HDM2 и HDMX. Настоящее изобретение предлагает пептидомиметические макроциклы на основе p53, которые модулируют p53 путем ингибирования взаимодействий между p53 и HDM2, p53 и HDMX, или p53 и обоими белками HDM2 и HDMX, и которые можно использовать для лечения заболеваний, включающих в себя, без ограничения, рак и другие гиперпролиферативные болезни.

Сущность изобретения

Ниже описаны пептиды со стабильными поперечными связями, соединенные с фрагментом человеческого p53 ("p53-пептидомиметические макроциклы"). Указанные поперечносшитые пептиды содержат, по меньшей мере, две модифицированные аминокислоты, которые вместе образуют внутримолекулярную поперечную связь, способствующую стабилизации альфа-спиральной вторичной структуры фрагмента p53, что является важным для связывания p53 с HDM2 и для связывания p53 с HDMX. Соответственно, поперечносшитый полипептид, описанный в данном документе, может обладать улучшенной биологической активностью по сравнению с соответствующим полипептидом, не содержащим поперечных связей. Полагают, что p53 пептидомиметические макроциклы препятствуют связыванию p53 с HDM2 и/или p53 с HDMX, высвобождая функциональный p53 и ингибируя его разрушение. Описанные здесь p53 пептидомиметические макроциклы можно использовать в терапии, например, для лечения рака и других нарушений, характеризующихся нежелательно низким уровнем p53, или низкой активностью p53, и/или для лечения рака и других нарушений, характеризующихся нежелательно высоким уровнем HDM2 или HDMX. p53 пептидомиметические макроциклы также можно использовать для лечения любого заболевания, связанного с нарушением регуляции транскрипционного пути p53, приводящим к развитию состояний, связанных с избыточным выживанием клеток и пролиферацией, таких как рак и аутоиммунные заболевания, а также состояний, характеризующихся неадекватным прекращением клеточного цикла и апоптозом, таких как нейродегенерация и иммунодефициты. В некоторых случаях p53 пептидомиметические макроциклы связываются с HDM2 (например, GenBank®, № доступа: 228952; GI:228952) и/или HDMX (который также обозначают HDM4; GenBank®, № доступа: 88702791; GI:88702791).

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает пептидомиметический макроцикл, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 60%, 80%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей в себя аминокислотные последовательности, описанные в таблице 1, 2, 3 или 4. Альтернативно аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла выбрана из группы, включающей в себя аминокислотные последовательности, описанные в таблице 1. Альтернативно аминокислотная последовательность упомянутого пептидомиметического макроцикла выбрана из указанных выше последовательностей и, кроме того, макроцикл не содержит тиоэфир или триазол. В некоторых воплощениях пептидомиметический макроцикл содержит спираль, такую как α-спираль. В других воплощениях пептидомиметический макроцикл содержит α,α-дизамещенную аминокислоту. Пептидомиметический макроцикл настоящего изобретения может содержать поперечный линкер, который соединяет α-положения, по меньшей мере, двух аминокислот. По меньшей мере одна из двух указанных аминокислот может представлять собой α,α-дизамещенную аминокислоту.

В некоторых воплощениях пептидомиметический макроцикл имеет формулу:

Формула I

где:

каждый A, C, D и E независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, а D и E независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;

B представляет собой природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты,

, [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-] или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо обозначают -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;

R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

L обозначает макроцикл-образующий линкер формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;

каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;

каждый K обозначает O, S, SO, SO₂, CO, CO₂ или CONR₃;

каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток D;

R₈ обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток E;

v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;

u обозначает целое число в диапазоне 1-10;

x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и

n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

В разных воплощениях пептидомиметический макроцикл содержит L₁ и L₂, где L₁ и L₂ ни по отдельности, ни в сочетании не содержат тиоэфир или триазол.

В других воплощениях пептидомиметический макроцикл может содержать поперечный линкер, соединяющий скелетную аминогруппу первой аминокислоты со второй аминокислотой, входящей в состав пептидомиметического макроцикла. Например, изобретение предлагает пептидомиметические макроциклы формулы (IV) или (IVa):

Формула (IV)

Формула (IVa)

где:

каждый A, C, D и E независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, а D и E независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;

B обозначает природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты,

, [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-] или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо обозначают -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном, или часть циклической структуры, содержащей остаток E;

R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;

каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;

каждый K обозначает O, S, SO, SO₂, CO, CO₂ или CONR₃;

каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;

u обозначает целое число в диапазоне 1-10;

x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и

n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

Кроме того, изобретение предлагает способ лечения рака у субъекта, включающий в себя введение субъекту пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения. Изобретение также предлагает способ модуляции активности p53, или HDM2, или HDMX, у субъекта, включающий в себя введение субъекту пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения, или способ препятствования взаимодействию p53 с белками HDM2 и/или HDMX у субъекта, включающий в себя введение субъекту такого пептидомиметического макроцикла.

Включение в качестве ссылки

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки в такой степени, как если бы по поводу каждой отдельной публикации, каждого отдельного патента и каждой отдельной патентной заявки было бы конкретно и индивидуально указано, что они включены в качестве ссылки.

Краткое описание чертежей

Новые признаки настоящего изобретения подробно описаны в прилагающейся формуле изобретения. Облегчить понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения помогают приведенные в нижеследующем подробном описании иллюстративные воплощения, основанные на принципах настоящего изобретения, и прилагаемые рисунки:

На фиг.1 описан синтез Fmoc-Me-6-хлортриптофана и Fmoc-6-хлортриптофана.

На фиг.2 показаны результаты анализа Me-6-хлор-(Boc)триптофан-Ni-S-BPB методом ЖХ-МС.

На фиг.3 показан ¹H-ЯМР-спектр Me-6-хлор-(Boc)триптофан-Ni-S-BPB.

На фиг.4 показаны результаты анализа Fmoc-Me-6-хлор-(Boc)триптофана методом ЖХ-МС.

На фиг.5 показан ¹H-ЯМР-спектр Fmoc-Me-6-хлор-(Boc)триптофана.

На фиг.6A-F описаны результаты анализа жизнеспособности клеток, конкурентного анализа ELISA, анализа GRIP, определения значений Kd, анализа активации p21, флуоресцентного поляризационного анализа конкурентного связывания и определения циклической спиральности для типичных пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения.

На фиг.7A-D приведены данные для ряда макроциклов.

На фиг.8A-B приведены данные для ряда макроциклов.

Подробное описание изобретения

В настоящем описании термин "макроцикл" относится к молекуле, химическая структура которой содержит кольцо или цикл, образованный по меньшей мере 9 ковалентно связанными атомами.

В настоящем описании термин "пептидомиметический макроцикл" или "поперечносшитый полипептид" относится к соединению, содержащему совокупность аминокислотных остатков, соединенных рядом пептидных связей, и, по меньшей мере, один макроцикл-образующий линкер, который образует макроцикл путем соединения первого природного или неприродного аминокислотного остатка (или его аналога) со вторым природным или неприродным аминокислотным остатком (или его аналогом), входящим в состав той же молекулы. Пептидомиметический макроцикл включает в себя воплощения, в которых макроцикл-образующий линкер соединяет атом углерода первого аминокислотного остатка (или его аналога) с атомом углерода второго аминокислотного остатка (или его аналога). Пептидомиметические макроциклы необязательно содержат одну или несколько непептидных связей, соединяющих два или более аминокислотных остатков и/или аналогов аминокислотных остатков, и необязательно содержат один или несколько неприродных аминокислотных остатков или аналогов аминокислотных остатков помимо образующих макроцикл. Термин "соответствующий полипептид, не содержащий поперечных связей", упоминающийся в контексте пептидомиметического макроцикла, относится к полипептиду такой же длины, что и макроцикл, который содержит природные аминокислоты, эквивалентные аминокислотам последовательности макроцикла дикого типа.

В настоящем описании термин "стабильность" относится к поддержанию определенной вторичной структуры пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения в растворе, что определяют методом кругового дихроизма, ЯМР или другим биофизическим методом, или к устойчивости к протеолитической деградации in vitro или in vivo. Неограничивающие примеры вторичных структур, охватываемых настоящим изобретением, включают в себя α-спирали, β-изгибы и β-складки.

В настоящем описании термин "стабильность спиральной структуры" относится к поддержанию спиральной структуры пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения, измеряемому методом кругового дихроизма или ЯМР. Например, в некоторых воплощениях по данным кругового дихроизма α-спиральность пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения, по меньшей мере, в 1,25, 1,5, 1,75 или 2 раза превышает α-спиральность соответствующего макроцикла, не содержащего поперечных связей.

Термин "α-аминокислота" или просто "аминокислота" относится к молекуле, которая содержит аминогруппу и карбоксильную группу, присоединенные к атому углерода, обозначаемому "α-атом углерода". Подходящие аминокислоты включают в себя, без ограничения, D- и L-изомеры природных аминокислот, а также неприродных аминокислот, полученных путем органического синтеза или других метаболических процессов. Если контекст конкретно не указывает иначе, термин "аминокислота" в настоящем описании охватывает аналоги аминокислот.

Термин "природная аминокислота" относится к любой из двадцати аминокислот, обычно присутствующих в пептидах, синтезированных в природе, и имеющих однобуквенные обозначения A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y и V.

Термин "аналог аминокислоты" или "неприродная аминокислота" относится к молекуле, структурно подобной аминокислоте, которая может замещать аминокислоту при образовании пептидомиметического макроцикла. Аналоги аминокислот включают в себя, без ограничения, соединения, структурно идентичные аминокислотам, в соответствии с приведенным здесь определением, за исключением вставки одной или нескольких дополнительных метиленовых групп между аминогруппой и карбоксильной группой (например, α-амино-β-карбоновые кислоты), или замены аминогруппы или карбоксильной группы подобной реакционноспособной группой (например, замены первичной аминогруппы вторичной или третичной аминогруппой, или замены карбоксильной группы сложноэфирной группой). Неприродные аминокислоты могут содержать следующие структуры:

.

"Не необходимый" аминокислотный остаток представляет собой остаток последовательности полипептида дикого типа, который можно изменить без утраты или существенного изменения основной биологической или биохимической активности (такой как связывание или активация рецептора) полипептида. "Необходимый" аминокислотный остаток представляет собой остаток последовательности полипептида дикого типа, изменение которого приводит к утрате или существенному изменению основной биологической или биохимической активности полипептида.

"Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, содержащим подобную боковую цепь. В данной области определены семейства аминокислотных остатков, содержащих подобные боковые цепи. Указанные семейства включают в себя аминокислоты, содержащие основные боковые цепи (например, K, R, H), кислые боковые цепи (например, D, E), незаряженные полярные боковые цепи (например, G, N, Q, S, T, Y, C), неполярные боковые цепи (например, A, V, L, I, P, F, M, W), бета-разветвленные боковые цепи (например, T, V, I) и ароматические боковые цепи (например, Y, F, W, H). Таким образом, определенный теоретически не необходимый аминокислотный остаток, входящий в состав полипептида, например, предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком, относящимся к тому же семейству боковых цепей. Другие примеры приемлемых замен включают в себя замены на основе изостерических факторов (например, замена норлейцина на метионин) или других свойств (например, замена 2-тиенилаланин на фенилаланин).

Термин "кэпирующая группа" относится к химическому фрагменту, находящемуся на карбокси- или аминоконце полипептидной цепи указанного пептидомиметического макроцикла. Кэпирующая группа карбоксиконца включает в себя немодифицированную карбоксильную группу (т.е. -COOH) или карбоксильную группу, содержащую заместитель. Например, карбоксиконец может быть замещен аминогруппой с получением карбоксамида на C-конце. Разные заместители включают в себя, без ограничения, первичные и вторичные аминогруппы, в том числе пэгилированные вторичные аминогруппы. Типичные вторичные аминогруппы для кэпирования С-конца включают в себя:

.

Кэпирующая группа аминоконца включает в себя немодифицированную аминогруппу (т.е. -NH₂) или аминогруппу, содержащую заместитель. Например, аминоконец может быть замещен ацильной группой с получением карбоксамида на N-конце. Разные заместители включают в себя, без ограничения, замещенные ацильные группы, такие как C₁-C₆ карбонилы, C₇-C₃₀ карбонилы и пэгилированные карбаматы. Типичные кэпирующие группы для N-конца включают в себя:

.

В настоящем описании в объем термина "член", используемого в применении к макроциклам или макроцикл-образующим линкерам, входят атомы, которые образуют или могут образовать макроцикл, но не атомы заместителей или боковых цепей. Так, например, циклодекан, 1,2-дифтордекан и 1,3-диметилциклодекан считаются десятичленными макроциклами, поскольку заместители водород или фтор, или метильные боковые цепи не участвуют в образовании макроцикла.

Символ "

", используемый для обозначения части молекулярной структуры, означает, что связь может представлять собой одинарную связь или транс- или цис- двойную связь.

Термин "боковая цепь аминокислоты" относится к фрагменту, присоединенному к α-атому углерода аминокислоты. Например, аминокислотная боковая цепь аланина представляет собой метил, аминокислотная боковая цепь фенилаланина представляет собой фенилметил, аминокислотная боковая цепь цистеина представляет собой тиометил, аминокислотная боковая цепь аспартата представляет собой карбоксиметил, аминокислотная боковая цепь тирозина представляет собой 4-гидроксифенилметил, и т.д. В объем термина также входят другие, неприродные аминокислотные боковые цепи, например, встречающиеся в природе (такие как метаболит аминокислоты) или полученные синтетическими способами (такие как α,α-дизамещенная аминокислота).

Термин "α,α-дизамещенная аминокислота" относится к молекуле или фрагменту, в которых аминогруппа и карбоксильная группа связаны с атомом углерода (α-атомом углерода), к которому присоединены две природные или неприродные аминокислотные боковые цепи.

Термин "полипептид" обозначает молекулу, содержащую две или более природных или неприродных аминокислот, соединенных ковалентной связью (например, амидной связью). Описанные здесь полипептиды включают в себя полноразмерные белки (например, полностью процессированные белки), а также более короткие аминокислотные последовательности (например, фрагменты природных белков или синтетических полипептидов).

В настоящем описании термин "реагент макроциклизации" или "макроцикл-образующий реагент" относится к любому реагенту, который может способствовать получению пептидомиметического макроцикла путем опосредования реакции между двумя реакционноспособными группами. Если реакционнопособные группы представляют собой, например, азид и алкин, реагент макроциклизации включает в себя, без ограничения, Cu-содержащие реагенты, например, реагенты, предоставляющие реакционноспособные соединения Cu(I), такие как CuBr, CuI или CuOTf, а также соли Cu(II), такие как Cu(CO₂CH₃)₂, CuSO₄ и CuCl₂, которые можно превратить in situ в активный реагент Cu(I) путем добавления восстанавливающего средства, такого как аскорбиновая кислота или аскорбат натрия. Реагенты макроциклизации также могут включать в себя, например, известные в данной области реагенты Ru, такие как Cp*RuCl(PPh₃)₂, [Cp*RuCl]₄ или другие реагенты Ru, которые могут предоставлять реакционноспособные соединения Ru(II). В других случаях реакционноспособные группы представляют собой концевые олефины. В таких воплощениях реагенты макроциклизации или макроцикл-образующие реагенты представляют собой катализаторы метатезиса, включающие в себя, без ограничения, стабилизированные карбеновые комплексы поздних переходных металлов, такие как карбеновые комплексы переходных металлов VIII группы. Например, такие катализаторы содержат в центре пентакоординированные металлы Ru и Os в степени окисления +2 и с числом электронов 16. Другие катализаторы описаны в Grubbs et al., "Ring Closing Metathesis и Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452, и патенте США № 5811515. В других случаях реакционноспособные группы представляют собой тиольные группы. В таких воплощениях реагент макроциклизации представляет собой, например, линкер, функционализированный двумя тиольными реакционноспособными группами, такими как галоген-содержащие группы.

Термин "галоген" включает в себя атомы фтора, хлора, брома или йода, или их радикалы.

Термин "алкил" относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей указанное число атомов углерода. Например, C₁-C₁₀ обозначает группу, содержащую от 1 до 10 (включительно) атомов углерода. При отсутствии какого-либо численного обозначения "алкил" представляет собой цепь (линейную или разветвленную), содержащую от 1 до 20 (включительно) атомов углерода.

Термин "алкилен" обозначает двухвалентный алкил (т.е. -R-).

Термин "алкенил" относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или несколько углерод-углеродных двойных связей. Алкенильный фрагмент содержит указанное число атомов углерода. Например, C₂-C₁₀ обозначает группу, содержащую от 2 до 10 (включительно) атомов углерода. Термин "низший алкенил" относится к C₂-C₆ алкенильной цепи. При отсутствии какого-либо численного обозначения "алкенил" представляет собой цепь (линейную или разветвленную), содержащую от 2 до 20 (включительно) атомов углерода.

Термин "алкинил" относится к линейной или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или несколько углерод-углеродных тройных связей. Алкинильный фрагмент содержит указанное число атомов углерода. Например, C₂-C₁₀ обозначает группу, содержащую от 2 до 10 (включительно) атомов углерода. Термин "низший алкинил" относится к C₂-C₆ алкинильной цепи. При отсутствии какого-либо численного обозначения "алкинил" представляет собой цепь (линейную или разветвленную), содержащую от 2 до 20 (включительно) атомов углерода.

Термин "арил" относится к 6-углеродной моноциклической или 10-углеродной бициклической ароматической системе, где 0, 1, 2, 3 или 4 атома в каждом цикле замещены заместителем. Примеры арильных групп включают в себя фенил, нафтил и т.п. Термин "арилалкил" или термин "аралкил" относится к алкилу, замещенному арилом. Термин "арилалкокси" относится к алкоксильной группе, замещенной арилом.

"Арилалкил" представляет собой арильную группу, определенную выше, в которой один из атомов водорода замещен C₁-C₅ алкильной группой, определенной выше. Иллюстративные примеры арилалкильной группы включают в себя, без ограничения, 2-метилфенил, 3-метилфенил, 4-метилфенил, 2-этилфенил, 3-этилфенил, 4-этилфенил, 2-пропилфенил, 3-пропилфенил, 4-пропилфенил, 2-бутилфенил, 3-бутилфенил, 4-бутилфенил, 2-пентилфенил, 3-пентилфенил, 4-пентилфенил, 2-изопропилфенил, 3-изопропилфенил, 4-изопропилфенил, 2-изобутилфенил, 3-изобутилфенил, 4-изобутилфенил, 2-втор-бутилфенил, 3-втор-бутилфенил, 4-втор-бутилфенил, 2-трет-бутилфенил, 3-трет-бутилфенил и 4-трет-бутилфенил.

Термин "ариламидо" относится к арильной группе, определенной выше, в которой один из атомов водорода замещен одной или несколькими группами -C(O)NH₂. Иллюстративные примеры группы ариламидо включают в себя 2-C(O)NH₂-фенил, 3-C(O)NH₂-фенил, 4-C(O)NH₂-фенил, 2-C(O)NH₂-пиридил, 3-C(O)NH₂-пиридил и 4-C(O)NH₂-пиридил.

Термин "алкилгетероцикл" относится к C₁-C₅ алкильной группе, определенной выше, в которой один из атомов углерода замещен гетероциклом. Иллюстративные примеры алкилгетероциклической группы включают в себя, без ограничения, -CH₂CH₂-морфолин, -CH₂CH₂-пиперидин, -CH₂CH₂CH₂-морфолин и -CH₂CH₂CH₂-имидазол.

"Алкиламидо" относится к C₁-C₅ алкильной группе, определенной выше, в которой один из атомов углерода замещен группой -C(O)NH₂. Иллюстративные примеры алкиламидной группы включают в себя, без ограничения, -CH₂-C(O)NH₂, -CH₂CH₂-C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH(C(O)NH₂)CH₃, -CH₂CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃, -CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃, -C(CH₃)₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃-CH₃ и -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH=CH₂.

Термин "алканол" относится к C₁-C₅ алкильной группе, определенной выше, в которой один из атомов углерода замещен гидроксильной группой. Иллюстративные примеры алканола включают в себя, без ограничения, -CH₂OH, -CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂OH,-CH₂CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH(OH)CH₃, -CH₂CH(OH)CH₂CH₃, -CH(OH)CH₃ и -C(CH₃)₂CH₂OH.

Термин "алкилкарбокси" относится к C₁-C₅ алкильной группе, определенной выше, в которой один из атомов углерода замещен группой -COOH. Иллюстративные примеры алкилкарбоксильной группы включают в себя, без ограничения, -CH₂COOH, -CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH(COOH)CH₃, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH(COOH)CH₂CH₃, -CH(COOH)CH₂CH₃ и -C(CH₃)₂CH₂COOH.

Термин "циклоалкил" в соответствии с настоящим описанием охватывает насыщенные и частично ненасыщенные циклические углеводородные группы, содержащие от 3 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода, и более предпочтительно от 3 до 6 атомов углерода, где циклоалкильная группа также может быть необязательно замещена. Некоторые циклоалкильные группы включают в себя, без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил и циклооктил.

Термин "гетероарил" относится к ароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической, или 11-14-членной трициклической системе, содержащей 1-3 гетероатомов в случае моноциклической системы, 1-6 гетероатомов в случае бициклической системы, или 1-9 гетероатомов в случае трициклической системы, где указанные гетероатомы выбраны из O, N или S (например, гетероарил содержит атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов, выбранных из O, N или S, в случае моноциклической, бициклической или трициклической системы, соответственно), где 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого цикла замещены заместителем. Примеры гетероарильных групп включают в себя пиридил, фурил или фуранил, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, тиофенил или тиенил, хинолинил, индолил, тиазолил и т.п.

Термин "гетероарилалкил" или термин "гетероаралкил" относится к алкилу, замещенному гетероарилом. Термин "гетероарилалкокси" относится к алкокси, замещенному гетероарилом.

Термин "гетероарилалкил" или термин "гетероаралкил" относится к алкилу, замещенному гетероарилом. Термин "гетероарилалкокси" относится к алкокси, замещенному гетероарилом.

Термин "гетероциклил" относится к неароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической системе, содержащей 1-3 гетероатомов в случае моноциклической системы, 1-6 гетероатомов в случае бициклической системы, или 1-9 гетероатомов в случае трициклической системы, где указанные гетероатомы выбраны из O, N или S (например, гетероциклил содержит атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов, выбранных из O, N или S, в случае моноциклической, бициклической или трициклической системы, соответственно), где 0, 1, 2 или 3 атома в каждом цикле замещены заместителем. Примеры гетероциклильных групп включают в себя пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрагидрофуранил и т.п.

Термин "заместитель" относится к группе, замещающей второй атом или вторую группу, например, атом водорода, в молекуле, соединении или фрагменте. Подходящие заместители включают в себя, без ограничения, такие группы как галоген, гидрокси, меркапто, оксо, нитро, галогеналкил, алкил, алкарил, арил, аралкил, алкокси, тиоалкокси, арилокси, амино, алкоксикарбонил, амидо, карбокси, алкансульфонил, алкилкарбонил и циано.

В некоторых воплощениях соединения настоящего изобретения содержат один или несколько асимметричных центров и, следовательно, могут находиться в виде рацематов и рацемических смесей, отдельных энантиомеров, отдельных диастереомеров и смесей диастереомеров. Если однозначно не указано иначе, все изомерные формы указанных соединений входят в объем настоящего изобретения. В некоторых воплощениях соединения настоящего изобретения также могут присутствовать в виде нескольких таутомерных форм, и в таких случаях изобретение охватывает все таутомерные формы описанных здесь соединений (например, если алкилирование циклической системы приводит к присоединению алкила в нескольких положениях, изобретение охватывает все такие продукты реакции). Если однозначно не указано иначе, все изомерные формы указанных соединений входят в объем настоящего изобретения. Все кристаллические формы описанных здесь соединений также входят в объем настоящего изобретения, если контекст однозначно не указывает иначе.

В настоящем описании термины "увеличивает" и "уменьшает" означают, соответственно, что соединение вызывает статистически значимое (т.е. p<0,1) увеличение или уменьшение, составляющее, по меньшей мере, 5%.

В настоящем описании указание диапазона численных значений переменной означает, что изобретение можно осуществлять при любом значении переменной, попадающим в указанный диапазон. Таким образом, если переменная является по существу дискретной, она может иметь значение, равное любому целому числу, входящему в указанный численный диапазон, включая граничные значения диапазона. Подобным образом, если переменная является по существу непрерывной величиной, она может иметь значение, равное любому действительному числу, входящему в указанный численный диапазон, включая граничные значения диапазона. Например, и без ограничения, если указано, что переменная может иметь значения в диапазоне от 0 до 2, ее значение может быть равно 0, 1 или 2, если переменная является по существу дискретной, или ее значение может быть равно 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 или любому другому действительному числу >0 и <2, если переменная является по существу непрерывной.

Если не указано иначе, в настоящем описании слово "или" используется во включающем смысле "и/или", а не в исключающем смысле "либо/либо".

Термин "в среднем" обозначает среднее значение, полученное при выполнении, по меньшей мере, трех независимых повторов для каждой экспериментальной точки.

Термин "биологическая активность" охватывает структурные и функциональные свойства макроцикла настоящего изобретения. К биологической активности относится, например, структурная стабильность, альфа-спиральность, сродство к мишени, устойчивость к протеолитической деградации, способность проникать в клетки, внутриклеточная стабильность, стабильность in vivo или любое сочетание вышеуказанных свойств.

Детали одного или нескольких конкретных воплощений настоящего изобретения описаны в прилагающихся чертежах и в приведенном ниже описании. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из нижеследующих описания, чертежей и формулы изобретения.

В некоторых воплощениях пептидные последовательности получены из белка p53.

Ниже приведен неограничивающий иллюстративный список пептидов p53, подходящих для применения в настоящем изобретении.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

В таблице 3, а также в других местах, "Aib" обозначает остаток 2-аминоизомасляной кислоты, а "Ac3c" обозначает остаток аминоциклопропанкарбоновой кислоты.

Пептидомиметические макроциклы

В некоторых воплощениях пептидомиметический макроцикл настоящего изобретения имеет формулу (I):

Формула I

где:

каждый A, C, D и E независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, а D и E независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;

B представляет собой природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты,

, [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-] или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо обозначают -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;

R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

L обозначает макроцикл-образующий линкер формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;

каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;

каждый K обозначает O, S, SO, SO₂, CO, CO₂ или CONR₃;

каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток D;

R₈ обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток E;

v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;

u обозначает целое число в диапазоне 1-10;

x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и

n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

В одном воплощении L₁ и L₂, по отдельности или вместе, не образуют триазол или тиоэфир.

В одном примере, по меньшей мере, один из R₁ и R₂ обозначает алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В другом примере и R₁, и R₂ независимо обозначают алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один из R₁ и R₂ обозначает метил. В других воплощениях R₁ и R₂ обозначают метил.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения сумма x+y+z равна, по меньшей мере, 3. В других воплощениях настоящего изобретения сумма x+y+z равна 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Каждый элемент A, B, C, D или E в макроцикле или в предшественнике макроцикла настоящего изобретения выбирают независимо. Например, последовательность, представленная формулой [A]_x, где x равен 3, охватывает воплощения, в которых аминокислоты не являются идентичными, например, Gln-Asp-Ala, и воплощения, в которых аминокислоты являются идентичными, например, Gln-Gln-Gln. Это применимо к любому значению x, y или z в указанных диапазонах. Подобным образом, если u больше 1, каждое соединение настоящего изобретения может включать в себя одинаковые или разные пептидомиметические макроциклы. Например, соединение настоящего изобретения может включать в себя пептидомиметические макроциклы, содержащие линкеры разной длины, или имеющие разные химические составы.

В некоторых воплощениях вторичная структура пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения представляет собой α-спираль, а R₈ обозначает -H, что создает возможность для образования внутриспиральных водородных связей. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один из A, B, C, D или E обозначает α,α-дизамещенную аминокислоту. В одном примере B обозначает α,α-дизамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере, один из A, B, C, D или E обозначает 2-аминоизомасляную кислоту. В других воплощениях, по меньшей мере, один из A, B, C, D или E обозначает

.

В других воплощениях длину макроцикл-образующего линкера L, измеряемую от первого Cα до второго Cα, выбирают так, чтобы стабилизировать желательную вторичную структуру пептида, такую как α-спираль, образованную остатками пептидомиметического макроцикла, включающими в себя, без обязательного ограничения, остатки, находящиеся между первым Cα и вторым Cα.

В одном воплощении пептидомиметический макроцикл формулы (I) представляет собой:

где каждый R₁ и R₂ независимо обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном.

В родственных воплощениях пептидомиметический макроцикл формулы (I) представляет собой:

В других воплощениях пептидомиметический макроцикл формулы (I) представляет собой соединение любой из приведенных ниже формул:

где "AA" обозначает боковую цепь любой природной или неприродной аминокислоты, "

" обозначает [D]_v, [E]_w, как определено выше, а n обозначает целое число от 0 до 20, 50, 100, 200, 300, 400 или 500. В некоторых воплощениях n равен 0. В других воплощениях n меньше 50.

Иллюстративные воплощения макроцикл-образующего линкера L показаны ниже.

где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o, p=0-10	где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o, p=0-10
где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o, p=0-10 R=H, алкил, другой заместитель	где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o=0-10

В других воплощениях D и/или E в соединении формулы I дополнительно модифицируют, чтобы облегчить их поглощение клетками. В некоторых воплощениях липидирование или ПЭГилирование пептидомиметического макроцикла облегчает поглощение клетками, повышает биодоступность, увеличивает время присутствия в кровотоке, изменяет фармакокинетические параметры, снижает иммуногенность и/или уменьшает требуемую частоту введения.

В других воплощениях, по меньшей мере, один из [D] и [E] в соединении формулы I представляет собой фрагмент, содержащий дополнительный макроцикл-образующий линкер, в результате чего пептидомиметический макроцикл содержит, по меньшей мере, два макроцикл-образующих линкера. В конкретном воплощении пептидомиметический макроцикл содержит два макроцикл-образующих линкера. В одном воплощении u равен 2.

Любой из описанных здесь макроцикл-образующих линкеров, входящий в состав пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения, можно использовать в сочетании с любой из последовательностей, приведенных в таблицах 1-4, а также с любым из указанных здесь заместителей R.

В некоторых воплощениях пептидомиметический макроцикл содержит, по меньшей мере, один α-спиральный мотив. Например, A, B и/или C в соединении формулы I содержат один или несколько α-спиральных участков. Обычно виток α-спирали состоит из 3-4 аминокислотных остатков. В некоторых воплощениях α-спираль пептидомиметического макроцикла содержит от 1 до 5 витков и, следовательно, от 3 до 20 аминокислотных остатков. В конкретных воплощениях α-спираль содержит 1 виток, 2 витка, 3 витка, 4 витка или 5 витков. В некоторых воплощениях макроцикл-образующий линкер стабилизирует α-спиральный мотив, входящий в состав пептидомиметического макроцикла. Таким образом, в некоторых воплощениях длину макроцикл-образующего линкера L от первого Cα до второго Cα выбирают так, чтобы увеличить стабильность α-спирали. В некоторых воплощениях макроцикл-образующий линкер стягивает от 1 до 5 витков α-спирали. В некоторых воплощениях макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 1 виток, 2 витка, 3 витка, 4 витка или 5 витков α-спирали. В некоторых воплощениях длина макроцикл-образующего линкера составляет примерно от 5 A до 9 A на виток α-спирали, или примерно от 6 A до 8 A на виток α-спирали. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 1 виток α-спирали, его длина составляет примерно от 5 углерод-углеродных связей до 13 углерод-углеродных связей, примерно от 7 углерод-углеродных связей до 11 углерод-углеродных связей, или примерно 9 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 2 витка α-спирали, его длина составляет примерно от 8 углерод-углеродных связей до 16 углерод-углеродных связей, примерно от 10 углерод-углеродных связей до 14 углерод-углеродных связей, или примерно 12 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 3 витка α-спирали, его длина составляет примерно от 14 углерод-углеродных связей до 22 углерод-углеродных связей, примерно от 16 углерод-углеродных связей до 20 углерод-углеродных связей, или примерно 18 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 4 витка α-спирали, его длина составляет примерно от 20 углерод-углеродных связей до 28 углерод-углеродных связей, примерно от 22 углерод-углеродных связей до 26 углерод-углеродных связей, или примерно 24 углерод-углеродные связи. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 5 витков α-спирали, его длина составляет примерно от 26 углерод-углеродных связей до 34 углерод-углеродных связей, примерно от 28 углерод-углеродных связей до 32 углерод-углеродных связей, или примерно 30 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 1 виток α-спирали, мостик содержит примерно от 4 атомов до 12 атомов, примерно от 6 атомов до 10 атомов, или примерно 8 атомов. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 2 витка α-спирали, мостик содержит примерно от 7 атомов до 15 атомов, примерно от 9 атомов до 13 атомов, или примерно 11 атомов. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 3 витка α-спирали, мостик содержит примерно от 13 атомов до 21 атомов, примерно от 15 атомов до 19 атомов, или примерно 17 атомов. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 4 витка α-спирали, мостик содержит примерно от 19 атомов до 27 атомов, примерно от 21 атома до 25 атомов, или примерно 23 атома. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 5 витков α-спирали, мостик содержит примерно от 25 атомов до 33 атомов, примерно от 27 атомов до 31 атома, или примерно 29 атомов. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 1 виток α-спирали, полученный макроцикл содержит примерно от 17 членов до 25 членов, примерно от 19 членов до 23 членов, или примерно 21 член. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 2 витка α-спирали, полученный макроцикл содержит примерно от 29 членов до 37 членов, примерно от 31 члена до 35 членов, или примерно 33 члена. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 3 витка α-спирали, полученный макроцикл содержит примерно от 44 членов до 52 членов, примерно от 46 членов до 50 членов, или примерно 48 членов. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 4 витка α-спирали, полученный макроцикл содержит примерно от 59 членов до 67 членов, примерно от 61 члена до 65 членов, или примерно 63 члена. Если макроцикл-образующий линкер стягивает примерно 5 витков α-спирали, полученный макроцикл содержит примерно от 74 членов до 82 членов, примерно от 76 членов до 80 членов, или примерно 78 членов. В других воплощениях изобретение предлагает пептидомиметические макроциклы формулы (IV) или (IVa):

Формула (IV)

Формула (IVa)

где:

каждый A, C, D и E независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, а концевые D и E независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;

B обозначает природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты,

, [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-] или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо обозначают -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном, или часть циклической структуры, содержащей остаток E;

R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

L обозначает макроцикл-образующий линкер формулы -L₁-L₂-;

L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;

каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;

каждый K обозначает O, S, SO, SO₂, CO, CO₂ или CONR₃;

каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ обозначает -H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;

v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;

u обозначает целое число в диапазоне 1-10;

x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и

n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

В одном примере L₁ и L₂, по отдельности или вместе, не образуют триазол или тиоэфир.

В одном примере, по меньшей мере, один из R₁ и R₂ обозначает алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В другом примере и R₁ и R₂ независимо обозначают алкил, незамещенный или замещенный галогеном. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один из R₁ и R₂ обозначает метил. В других воплощениях R₁ и R₂ обозначают метил.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения, сумма x+y+z равна, по меньшей мере, 1. В других воплощениях настоящего изобретения сумма x+y+z равна, по меньшей мере, 2. В других воплощениях настоящего изобретения сумма x+y+z равна 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Каждый элемент A, B, C, D или E в макроцикле или в предшественнике макроцикла настоящего изобретения выбирают независимо. Например, последовательность, представленная формулой [A]_x, где x равен 3, охватывает воплощения, в которых аминокислоты не являются идентичными, например, Gln-Asp-Ala, и воплощения, в которых аминокислоты являются идентичными, например, Gln-Gln-Gln. Это применимо к любому значению x, y или z в указанных диапазонах.

В некоторых воплощениях вторичная структура пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения представляет собой α-спираль, а R₈ обозначает -H, что создает возможность для образования внутриспиральных водородных связей. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один из A, B, C, D или E обозначает α,α-дизамещенную аминокислоту. В одном примере B обозначает α,α-дизамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере, один из A, B, C, D или E обозначает 2-аминоизомасляную кислоту. В других воплощениях, по меньшей мере, один из A, B, C, D или E обозначает

.

В других воплощениях длину макроцикл-образующего линкера L, измеряемую от первого Cα до второго Cα, выбирают так, чтобы стабилизировать желательную вторичную структуру пептида, такую как α-спираль, образованную остатками пептидомиметического макроцикла, включающими в себя, без обязательного ограничения, остатки, находящиеся между первым Cα и вторым Cα.

Иллюстративные воплощения макроцикл-образующего линкера L показаны ниже.

где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o, p=0-10	где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o, p=0-10
где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o, p=0-10 R=H, алкил, другой заместитель	где X, Y=-CH2-, O, S или NH m, n, o=0-10

Получение пептидомиметических макроциклов

Пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения можно получить с помощью любого известного в данной области способа. Например, любой остаток, обозначенный "X" в таблицах 1, 2, 3 или 4, может быть замещен остатком, способным образовывать поперечный линкер со вторым остатком в той же молекуле или с предшественником такого остатка.

В данной области известны разные способы получения пептидомиметических макроциклов. Например, получение пептидомиметических макроциклов формулы I описано в Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122: 5891 (2005); Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004); в патенте США № 7192713 и в заявке PCT WO 2008/121767. α,α-Дизамещенные аминокислоты и аминокислотные предшественники, раскрытые в указанных ссылках, можно использовать для синтеза полипептидных предшественников пептидомиметических макроциклов. Например, "S5-олефинаминокислота" представляет собой (S)-α-(2'-пентенил)аланин, а "R8 олефинаминокислота" представляет собой (R)-α-(2'-октенил)аланин. После включения таких аминокислот в полипептиды-предшественники концевые олефины подвергают взаимодействию с катализатором метатезиса, получая пептидомиметический макроцикл. В разных воплощениях для синтеза пептидомиметического макроцикла можно использовать следующие аминокислоты:

.

В других воплощениях пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения имеют формулы IV или IVa. Способы получения таких макроциклов описаны, например, в патенте США № 7202332.

Другие способы получения пептидомиметических макроциклов, подходящие для осуществления настоящего изобретения, включают в себя способы, описанные в Mustapa, M. Firouz Mohd et al., J. Org. Chem (2003), 68, pp. 8193-8198; Yang, Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pp. 1403-1406; патенте США № 5364851; патенте США № 5446128; патенте США № 5824483; патенте США № 6713280; и патенте США № 7202332. В таких воплощениях используют аминокислотные предшественники, содержащие дополнительный заместитель R- в альфа-положении. Такие аминокислоты включают в предшественник макроцикла в желательных положениях, которые могут представлять собой положения, где поперечный линкер является замещенным, или, альтернативно, в других местах последовательности предшественника макроцикла. Затем проводят циклизацию предшественника в соответствии с указанным способом.

Анализы

Свойства пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения анализируют, например, с помощью описанных ниже способов. В некоторых воплощениях пептидомиметический макроцикл настоящего изобретения обладает улучшенными биологическими свойствами по сравнению с соответствующим полипептидом, не содержащим описанные здесь заместители.

Определение α-спиральности

При растворении полипептидов, содержащих α-спиральные домены, их вторичная структура характеризуется динамическим равновесием между структурами, представляющими собой статистические клубки, и α-спиральными структурами, соотношение которых часто выражают в виде "процента спиральности". Так, например, в растворе альфа-спиральные домены преимущественно находятся в виде статистических клубков и содержание α-спиральных участков обычно составляет менее 25%. С другой стороны, альфа-спиральность пептидомиметических макроциклов с оптимизированными линкерами, например, по меньшей мере, в два раза превышает альфа-спиральность соответствующего полипептида, не содержащего поперечных связей. В некоторых воплощениях альфа-спиральность макроциклов настоящего изобретения составляет более 50%. Чтобы определить спиральность пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения, соединения растворяют в водном растворе (например, в 50 мМ растворе фосфата калия при pH 7, или в дистиллированной H₂O, до концентрации 25-50 мкМ). Спектры кругового дихроизма (CD) получают на спектрополяриметре (например, Jasco J-710), используя стандартные параметры измерения (например, температура 20ºC; длина волны 190-260 нм; шаговое разрешение 0,5 нм; скорость 20 нм/сек; накопление 10; ответ 1 сек; ширина полосы 1 нм; длина пути 0,1 см). Содержание альфа-спиральных участков в каждом пептиде рассчитывают путем деления средней остаточной эллиптичности (например, [Ф]222obs) на опубликованное значение, полученное для модельного спирального декапептида (Yang et al. (1986), Methods Enzymol. 130:208)).

Определение температуры плавления (т.пл.).

Пептидомиметический макроцикл настоящего изобретения, вторичная структура которого представляет собой α-спираль, имеет, например, более высокую температуру плавления, чем соответствующий полипептид, не содержащий поперечных связей. Как правило, т.пл. пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения составляет >60ºC, свидетельствуя о высокой стабильности структуры в водных растворах. Чтобы определить, как влияет образование макроцикла на температуру плавления, пептидомиметические макроциклы или немодифицированные пептиды растворяют в дистиллированной H₂O (например, в конечной концентрации 50 мкМ) и определяют т.пл. путем измерения на спектрополяриметре (например, Jasco J-710) изменения эллиптичности в диапазоне температур (например, от 4 до 95ºC), используя стандартные параметры (например, длина волны 222 нм; шаговое разрешение 0,5 нм; скорость 20 нм/сек; накопление 10; ответ 1 сек; ширина полосы, 1 нм; скорость повышения температуры: 1ºC/мин; длина пути 0,1 см).

Анализ устойчивости к протеазам

Амидная связь пептидного скелета чувствительна к гидролизу под действием протеаз, что придает пептидным соединениям склонность к быстрой деградации in vivo. Однако образование пептидной спирали обычно приводит к заглублению амидного скелета и, следовательно, может защитить его от протеолитического расщепления. Чтобы определить изменение скорости деградации по сравнению с полипептидом, не содержащим поперечные связи, пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения можно подвергнуть протеолизу под действием трипсина in vitro. Например, пептидомиметический макроцикл и соответствующий полипептид, не содержащий поперечных связей, инкубируют с трипсин-содержащей агарозой, реакции гасят в разные моменты времени центрифугированием и затем проводят анализ методом ВЭЖХ, чтобы количественно определить остаточный субстрат по ультрафиолетовому поглощению при 280 нм. Коротко говоря, пептидомиметический макроцикл и пептидомиметический предшественник (5 мкг) инкубируют с трипсин-содержащей агарозой (Pierce) (S/E приблизительно 125) в течение 0, 10, 20, 90 и 180 минут. Реакции гасят центрифугированием с высокой скоростью в настольной центрифуге; количественное определение оставшегося субстрата в выделенном супернатанте проводят методом ВЭЖХ с детекцией пика при 280 нм. Протеолитическая реакция характеризуется кинетическими параметрами первого порядка и константой скорости, k, которую определяют из графика зависимости ln[S] от времени (k=-1×угол наклона).

Анализ стабильности ex vivo

Период полужизни ex vivo пептидомиметических макроциклов с оптимизированными линкерами, например, по меньшей мере, в два раза превышает период полужизни соответствующего полипептида, не содержащего поперечных связей, и составляет 12 часов или более. Стабильность в сыворотке ex vivo можно анализировать с помощью ряда способов. Например, пептидомиметический макроцикл и соответствующий полипептид, не содержащий поперечных связей, (2 мкг) инкубируют со свежей мышиной, крысиной и/или человеческой сывороткой (2 мл) при 37ºC в течение 0, 1, 2, 4, 8 и 24 часов. Уровень интактного соединения можно определить с помощью следующего способа: Образцы экстрагируют путем переноса 100 мкл сыворотки в центрифужные пробирки объемом 2 мл с последующим добавлением 10 мкл 50% муравьиной кислоты и 500 мкл ацетонитрила, после чего центрифугируют при 14000 об/мин в течение 10 мин при 4±2ºC. Затем супернатанты переносят в новые пробирки объемом 2 мл и упаривают на Turbovap при давлении N₂ <10 фунт/дюйм² и 37ºC. Образцы перерастворяют в 100 мкл смеси 50:50 ацетонитрил:вода и анализируют методом ЖХ-МС/МС.

Анализ связывания in vitro

Для оценки связывания пептидомиметических макроциклов и пептидомиметических предшественников с акцепторными белками, а также сродства такого связывания, можно использовать, например, анализ поляризации флуоресценции (FPA). Метод FPA позволяет измерять ориентацию и мобильность молекул с использованием поляризованного света и флуоресцентной метки. При возбуждении поляризованным светом флуоресцентные метки (например, FITC), присоединенные к молекулам с высокой кажущейся молекулярной массой (например, FITC-меченные пептиды, связанные с большим белком), испускают поляризованную флуоресценцию на повышенном уровне, поскольку они характеризуются более медленной скоростью вращения, чем флуоресцентные метки, присоединенные к молекулам меньшего размера (например, FITC-меченные пептиды, присутствующие в растворе в свободном состоянии).

Например, меченные флуоресцином пептидомиметические макроциклы (25 нМ) инкубируют с акцепторным белком (25-1000 нм) в буфере для связывания (140 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Связывающую активность измеряют, например, методом поляризации флуоресценции на люминесцентном спектрофотометре (например, Perkin-Elmer LS50B). Значения Kd можно определить методом нелинейной регрессии, используя, например, программное обеспечение Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). В некоторых случаях Kd пептидомиметического макроцикла настоящего изобретения равна или ниже Kd соответствующего полипептида, не содержащего поперечных связей.

Анализ замещения in vitro с целью характеристики антагонистов пептид-белковых взаимодействий

Связывание и сродство соединений, препятствующих взаимодействию пептида с акцепторным белком, определяют, например, методом поляризации флуоресценции (FPA), используя меченный флуоресцеином пептидомиметический макроцикл, полученный из последовательности пептидомиметического предшественника. Метод FPA позволяет измерять ориентацию и мобильность молекул с использованием поляризованного света и флуоресцентной метки. При возбуждении поляризованным светом флуоресцентные метки (например, FITC), присоединенные к молекулам с высокой кажущейся молекулярной массой (например, FITC-меченные пептиды, связанные с большим белком), испускают поляризованную флуоресценцию на повышенном уровне, поскольку они характеризуются более медленной скоростью вращения, чем флуоресцентные метки, присоединенные к молекулам меньшего размера (например, FITC-меченные пептиды, присутствующие в растворе в свободном состоянии). Соединение, препятствующее взаимодействию меченного флуоресцеином пептидомиметического макроцикла и акцепторного белка, детектируют с помощью анализа конкурентного связывания методом FPA.

Например, предполагаемые соединения-антагонисты (в концентрации от 1 нМ до 1 мМ) и меченный флуоресцеином пептидомиметический макроцикл (25 нМ) инкубируют с акцепторным белком (50 нМ) в буфере для связывания (140 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Связывающую активность антагониста измеряют, например, методом поляризации флуоресценции на люминесцентном спектрофотометре (например, Perkin-Elmer LS50B). Значения Kd можно определить методом нелинейной регрессии, используя, например, программное обеспечение Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

В данном анализе в качестве предполагаемых антагонистов можно использовать молекулы любого класса, такие как маленькие органические молекулы, пептиды, олигонуклеотиды или белки.

Анализ связывания белок-лиганд методом аффинной селекции-масс-спектрометрии

Для анализа связывания тестируемых соединений с белками и сродства такого связывания используют, например, метод аффинной селекции-масс-спектрометрии. Анализ связывания белок-лиганд проводят в соответствии с нижеследующей типичной процедурой, описанной для общесистемного контрольного эксперимента, используя 1 мкМ пептидомиметического макроцикла и 5 мкМ hMDM2. Аликвоту объемом 1 мкл 40 мкМ исходного раствора пептидомиметического макроцикла в ДМСО растворяют в 19 мкл PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор: 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,5, содержащий 150 мМ NaCl). Полученный раствор перемешивают путем многократного пипетирования и затем осветляют путем центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин. К аликвоте полученного супернатанта объемом 4 мкл добавляют 4 мкл 10 мкМ раствора hMDM2 в PBS. В результате каждые 8,0 мкл экспериментального образца содержат 40 пмоль (1,5 мкг) белка при концентрации 5,0 мкМ в PBS, 1 мкМ пептидомиметического макроцикла и 2,5% ДМСО. Полученные таким образом образцы с повторами для каждой концентрационной точки инкубируют 60 мин при комнатной температуре, затем охлаждают до 4ºC и подвергают анализу методом гель-хроматографии-ЖХ-МС, используя для ввода 5,0 мкл. Образцы, содержащие целевой белок, комплексы белок-лиганд и несвязанные соединения, вводят на колонку для SEC (Size Exclusion Chromatography - гель-хроматографии), где комплексы отделяют от несвязанных компонентов путем быстрого проведения SEC. Элюат, полученный с колонки для SEC, анализируют с помощью УФ-детекторов, подтверждая, что рано элюирующаяся белковая фракция, которая выходит в свободном объеме колонки для SEC, не содержит несвязанных компонентов, которые удерживаются на колонке. После того, как пик, содержащий белок и комплексы белок-лиганд, элюируется с первичного УФ-детектора, он поступает в петлю для образца, где отделяется от потока стадии SEC и посредством распределительного механизма переносится в ЖХ-МС. ESI-МС показывает наличие иона пептидомиметического макроцикла (M+3H)³⁺ с ожидаемым значением m/z, подтверждая присутствие комплекса белок-лиганд.

Титриметрический анализ для определения Kd комплекса белок-лиганд

Чтобы определить связывание тестируемых соединений с белками и сродство такого связывания, проводят, например, титриметрический анализ для определения Kd комплекса белок-лиганд. Титриметрический анализ для определения Kd комплекса белок-лиганд проводят следующим образом: Получают аликвоты серийных разведений исходного раствора титранта - пептидомиметического макроцикла в ДМСО объемом 2 мкл (5, 2,5, …, 0,098 мМ) и затем добавляют 38 мкл PBS. Полученные растворы перемешивают путем многократного пипетирования и затем осветляют путем центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин. К аликвотам полученных супернатантов объемом 4,0 мкл добавляют 4,0 мкл 10 мкМ раствора hMDM2 в PBS. В результате каждые 8,0 мкл экспериментального образца содержат 40 пмоль (1,5 мкг) белка при концентрации 5,0 мкМ в PBS, разные концентрации (125, 62,5, …, 0,24 мкМ) титрационного пептида и 2,5% ДМСО. Полученные таким образом образцы с повторами для каждой концентрационной точки инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем охлаждают до 4ºC и подвергают анализу методом SEC-ЖХ-МС, используя для ввода 2,0 мкл. ESI-МС показывает наличие ионов (M+H)¹⁺, (M+2H)²⁺, (M+3H)³⁺ и/или (M+Na)¹⁺; экстрагированные ионные хроматограммы подвергают количественному анализу, затем подгоняют к уравнениям, чтобы определить сродство связывания Kd, как описано в "General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C.C; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; и в "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery и Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, и N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Edited by Wanner K, Homer G:Wiley-VCH; 2007: 121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Анализ конкурентного связывания методом аффинной селекции-масс-спектрометрии

Чтобы определить способность тестируемых соединений конкурентно связываться с белками, используют, например, метод аффинной селекции-масс-спектрометрии. Смесь лигандов, содержащую 40 мкМ каждого компонента, получают путем объединения 2 мкл аликвот 400 мкМ исходных растворов каждого из трех соединений с 14 мкл ДМСО. Затем аликвоты объемом 1 мкл полученной смеси, содержащей 40 мкМ каждого компонента объединяют с 1 мкл аликвот серийных разведений исходного раствора титранта пептидомиметического макроцикла в ДМСО (10, 5, 2,5, …, 0,078 мМ). Полученные образцы объемом 2 мкл растворяют в 38 мкл PBS. Полученные растворы перемешивают путем многократного пипетирования и затем осветляют путем центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин. К аликвотам полученных супернатантов объемом 4,0 мкл добавляют 4,0 мкл 10 мкМ раствора hMDM2 в PBS. В результате каждые 8,0 мкл экспериментального образца содержат 40 пмоль (1,5 мкг) белка при концентрации 5,0 мкМ в PBS, 0,5 мкМ лиганда, 2,5% ДМСО и разные концентрации (125, 62,5, …, 0,24 мкМ) титранта пептидомиметического макроцикла. Полученные таким образом образцы с повторами для каждой концентрационной точки инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем охлаждают до 4ºC и подвергают анализу методом SEC-ЖХ-МС, используя для ввода 2,0 мкл. Другие подробности описанных и других методов можно найти в "A General Technique to Rank Protein- Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competitionin Compound Mixtures Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C; Scott, M.P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; а также в "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Edited by Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007: 121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods и Principles in Medicinal Chemistry.

Анализ связывания на интактных клетках

Связывание пептидов или пептидомиметических макроциклов с их природными акцепторами в интактных клетках можно измерить, используя метод иммунопреципитации. Например, интактные клетки инкубируют с соединениями, меченными флуоресцеином (FITC-меченными), в течение 4 ч в отсутствие сыворотки, затем сыворотку заменяют и дополнительно инкубируют в интерале времени от 4 до 18 ч. Затем клетки осаждают центрифугированием и инкубируют в буфере для лизиса (50 мМ трис [pH 7,6], 150 мМ NaCl, 1% CHAPS и смесь ингибиторов протеаз) в течение 10 минут при 4ºC. Экстракты центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 минут, после чего супернатанты собирают и инкубируют, переворачивая, с 10 мкл козьих антител против FITC в течение 2 ч при 4ºC, затем инкубируют еще 2 ч при 4ºC с сефарозой, содержащей белок A/G (50 мкл 50% взвеси гранул). После быстрого центрифугирования осадки промывают буфером для лизиса, содержащим повышенные концентрации соли (например, 150, 300, 500 мМ). Затем гранулы переуравновешивают в 150 мМ NaCl, добавляют SDS-содержащий буфер для образца и кипятят. После центрифугирования супернатанты необязательно подвергают электрофорезу в 4-12% градиенте Bis-Tris гелей и затем переносят на мембраны Immobilon-P. После блокирования блоты необязательно инкубируют с антителом, позволяющим детектировать FITC и, кроме того, с одним или несколькими антителами, позволяющими детектировать белки, способные связываться с пептидомиметическим макроциклом.

Анализ способности проникать в клетки

Пептидомиметический макроцикл, например, лучше проникает в клетки, чем соответствующий макроцикл, не содержащий поперечных связей. Способность проникать в клетки у пептидомиметических макроциклов, содержащих оптимизированные линкеры, например, по меньшей мере, в два раза выше, чем у соответствующего макроцикла, не содержащего поперечных связей, и обычно через 4 часа в клетки проникает 20% или более от количества введенного пептидомиметического макроцикла. Чтобы измерить способность проникать в клетки пептидомиметического макроцикла и соответствующего макроцикла, не содержащего поперечных связей, интактные клетки инкубируют с меченным флуоресцеином пептидомиметическим макроциклом или соответствующим макроциклом, не содержащим поперечных связей, (10 мкМ) в течение 4 ч в бессывороточной среде при 37ºC, дважды промывают средой и инкубируют с трипсином (0,25%) в течение 10 мин при 37ºC. Клетки снова промывают и ресуспендируют в PBS. Флуоресценцию в клетках анализируют, например, с помощью проточного цитометра FACSCalibur или HCS-ридера Cellomics' KineticScan®.

Анализы клеточной эффективности

Эффективность некоторых пептидомиметических макроциклов определяют, например, с помощью анализов выживания клеток, в которых используют ряд образующих опухоль и не образующих опухоль клеточных линий, а также первичные клетки, полученные из человеческих или мышиных клеточных популяций. Жизнеспособность клеток отслеживают, например, на протяжении 24-96 ч инкубации с пептидомиметическими макроциклами (от 0,5 до 50 мкМ), чтобы идентифицировать макроциклы, способные убивать клетки при EC₅₀<10 мкМ. Некоторые стандартные анализы, позволяющие измерять жизнеспособность клеток, являются коммерчески доступными и могут использоваться для определения эффективности пептидомиметических макроциклов. Кроме того, анализы, позволяющие измерять активацию аннексина V и каспазы, можно использовать для определения способности пептидомиметических макроциклов убивать клетки в результате активации апоптотического механизма. Например, можно использовать анализ Cell Titer-glo, который позволяет определять жизнеспособность клеток как функцию внутриклеточной концентрации АТФ.

Анализ стабильности in vivo

Чтобы исследовать стабильность пептидомиметических макроциклов in vivo, например, соединения вводят мышам и/или крысам путем в.в., в.б., п.о. введения, или путем ингаляции, в концентрациях, варьирующих от 0,1 до 50 мг/кг, и через 0 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 4 ч, 8 ч и 24 ч после введения берут образцы крови. Затем измеряют уровни интактных соединений в 25 мкл свежей сыворотки с помощью описанного выше метода ЖХ-МС/МС.

Эффективность у животных моделей in vivo

Чтобы определить антионкогенную активность пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения in vivo, соединения, например, вводят отдельно (в.б., в.в., п.о., путем ингаляции или назального введения) или в сочетании с субоптимальными дозами соответствующей химиотерапии (например, циклофосфамида, доксорубицина, этопозида). В одном примере 5×10⁶ клеток RS4;11 (полученных из костного мозга пациента с острым лимфобластным лейкозом), стабильно экспрессирующих люциферазу, вводят мышам NOD-SCID в хвостовую вену через 3 ч после тотального облучения организма. Необработанные модели данного лейкоза погибают через три недели. Лейкоз легко отслеживать, например, путем введения мышам D-люциферина (60 мг/кг) с последующей томографией анестезированных животных (например, с помощью системы визуализации in vivo Xenogen, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Общую биолюминесценцию организма количественно определяют путем интеграции потока фотонов (фотоны/сек) с помощью программного обеспечения Living Image (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Пептидомиметические макроциклы, например, вводят лейкемическим мышам отдельно или в сочетании с субоптимальными дозами подходящих химиотерапевтических средств (через 10 дней после инъекции/на 1 день эксперимента, в диапазоне биолюминесценции 14-16) через хвостовую вену или внутрибрюшинно в дозах, варьирующих от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг в течение 7-21 дней. На всем протяжении эксперимента через день мышей необязательно подвергают томографии и ежедневно отслеживают выживание. В конце эксперимента умерших мышей необязательно подвергают некропсии. Другую животную модель получают путем имплантации мышам NOD-SCID DoHH2, клеточной линии человеческой фолликулярной лимфомы, стабильно экспрессирующей люциферазу. С помощью описанных анализов in vivo можно получить предварительные фармакокинетические, фармакодинамические и токсикологические данные.

Клинические испытания

Клинические испытания проводят, чтобы определить, можно ли использовать пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения для лечения людей. Например, выбирают пациентов, которые имеют диагностированный рак и нуждаются в лечении, и подразделяют их на экспериментальную группу и одну или несколько контрольных групп, экспериментальной группе вводят пептидомиметический макроцикл настоящего изобретения, а контрольным группам вводят плацебо или известное противораковое средство. Безопасность лечения и эффективность пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения можно оценить путем сравнения таких факторов как выживание и качество жизни в разных группах пациентов. В данном примере в группе пациентов, получающих пептидомиметический макроцикл, наблюдается улучшенное длительное выживание по сравнению с контрольной группой пациентов, получающих плацебо.

Фармацевтические композиции и способы введения

Пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения также включают в себя фармацевтически приемлемые производные или пролекарственные формы. Термин "фармацевтически приемлемое производное" включает в себя все фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры, соли сложных эфиров, пролекарства или другие производные соединений настоящего изобретения, которые при введении реципиенту способны предоставлять (непосредственно или косвенно) соединение настоящего изобретения. Особенно предпочтительными фармацевтически приемлемыми производными являются такие производные, которые повышают биодоступность соединений настоящего изобретения при введении млекопитающему (например, в результате повышенного поступления в кровь после перорального введения соединения), или которые увеличивают доставку активного соединения в биологический компартмент (такой как мозг или лимфатическая система), соответствующий типу пациента. Некоторые фармацевтически приемлемые производные содержат химическую группу, которая повышает растворимость в воде или активный транспорт через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

В некоторых воплощениях пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения модифицируют путем ковалентного или нековалентного присоединения соответствующих функциональных групп с целью улучшения отдельных биологических свойств. Такие модификации включают в себя модификации, которые повышают биологическое проникновение в заданный биологический компартмент (такой как кровь, лимфатическая система, центральная нервная система), увеличивают биодоступность при пероральном применении, повышают растворимость, позволяя вводить соединения путем инъекции, изменяют метаболизм и скорость выведения.

Фармацевтически приемлемые соли соединений данного изобретения включают в себя соли фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры солей подходящих кислот включают в себя ацетат, адипат, бензоат, бензолсульфонат, бутират, цитрат, диглюконат, додецилсульфат, формат, фумарат, гликолят, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроидид, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, пальмоат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тозилат и ундеканоат. Соли подходящих оснований включают в себя соли щелочных металлов (например, натрия), щелочноземельных металлов (например, магния), аммония и N-(алкил)₄ ⁺.

Фармацевтически приемлемые носители, подходящие для получения фармацевтических композиций соединений настоящего изобретения, включают в себя как твердые, так и жидкие носители. Твердые препараты включают в себя порошки, таблетки, пилюли, капсулы, крахмальные облатки, суппозитории и диспергируемые гранулы. Твердый носитель может представлять собой одно или несколько веществ, которые также могут действовать как разбавители, ароматизаторы, связующие средства, консерванты, дезинтегрирующие средства для таблеток или капсулирующие средства. Детали способов получения и введения композиций широко описаны в научной и патентной литературе, например, в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA.

Носитель, используемый для получения порошков, представляет собой мелкоизмельченное твердое вещество, которое смешивают с мелкоизмельченным активным соединением. При получении таблеток активный компонент смешивают с носителем, обладающим необходимыми связывающими свойствами, в подходящем соотношении и прессуют, придавая желательные форму и размер.

Подходящие твердые наполнители, представляющие собой углеводные или белковые наполнители, включают в себя, без ограничения, сахара, такие как лактоза, сахароза, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза натрия; и камеди, такие как гуммиарабик и трагакант; а также белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости добавляют дезинтегрирующие или солюбилизирующие средства, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Жидкие препараты включают в себя растворы, суспензии и эмульсии, например, водные или водно/пропиленгликолевые растворы. Для парентеральной инъекции можно использовать жидкие препараты, полученные в виде водно-полиэтиленгликолевого раствора.

Фармацевтическая композиция предпочтительно находится в виде стандартной лекарственной формы. Для получения такой формы препарат подразделяют на отдельные дозы, содержащие соответствующие количества активного компонента. Стандартная лекарственная форма может представлять собой упакованный препарат, упаковка которого содержит отдельные количества препарата, такие как пакетированные таблетки, капсулы и порошки во флаконах или в ампулах. Кроме того, стандартная лекарственная форма может представлять собой капсулу, таблетку, облатку или пастилку как таковую, или она может представлять собой подходящее число любой из указанных форм в одной упаковке.

Если композиции настоящего изобретения содержат сочетание пептидомиметического макроцикла и одно или несколько других терапевтических или профилактических средств, и соединение, и другое средство должны присутствовать на дозировочных уровнях, составляющих примерно от 1 до 100%, более предпочтительно примерно от 5 до 95% от дозы, обычно вводимой в режиме монотерапии. В некоторых воплощениях другие средства вводят отдельно от соединений настоящего изобретения, как часть режима многократного приема. Альтернативно указанные средства являются частью одной лекарственной формы и в смеси с соединениями настоящего изобретения входят в состав одной композиции.

Способы применения

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает новые пептидомиметические макроциклы, которые можно использовать в анализах конкурентого связывания для идентификации средств, которые связываются с природным лигандом (природными лигандами) белков или пептидов, на основе которых моделируют пептидомиметические макроциклы. Например, в системе p53/HDMX меченные пептидомиметические макроциклы на основе p53 можно использовать в анализе связывания HDMX наряду с маленькими молекулами, которые конкурентно связываются с HDMX. Анализы конкурентного связывания позволяют быстро оценить и детектировать in vitro лекарственные средства-кандидаты, специфичные к системе p53/HDMX. Такие анализы связывания можно проводить с использованием любого из раскрытых здесь пептидомиметических макроциклов и их партнеров по связыванию.

Изобретение дополнительно предлагает антитела против пептидомиметических макроциклов. В некоторых воплощениях указанные антитела специфически связываются как с пептидомиметическим макроциклом, так и с пептидами-предшественниками, такими как p53, родственными пептидомиметическим макроциклам. Такие антитела могут разрушать природные белок-белковые взаимодействия, например, связь между p53 и HDMX.

В других аспектах настоящее изобретение предлагает способы профилактики и лечения субъекта с риском нарушения (или восприимчивого к нарушению), или страдающего от нарушения, характеризующегося аберрантной (например, недостаточной или избыточной) экспрессией или активностью молекул, включающих в себя p53, HDM2 или HDMX.

В другом воплощении нарушение обусловлено, по меньшей мере, отчасти, аномальным уровнем p53, или HDM2, или HDMX, (например, повышенной или пониженной экспрессией), или присутствием p53, или HDM2, или HDMX, обладающих аномальной активностью. Как таковое, уменьшение уровня и/или активности p53, или HDM2, или HDMX, или увеличение уровня и/или активности p53, или HDM2, или HDMX, под действием пептидомиметических макроциклов, полученных из p53, используют, например, для облегчения или уменьшения неблагоприятных симптомов нарушения.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики заболевания, включающего в себя гиперпролиферативное заболевание и воспалительное нарушение, путем препятствования взаимодействию или связыванию партнеров по связыванию, например, p53 и HDM2, или p53 и HDMX. Указанные способы включают в себя введение эффективного количества соединения настоящего изобретения теплокровному животному, в том числе человеку. В некоторых воплощениях введение соединений настоящего изобретения индуцирует прекращение роста клеток или апоптоз.

В настоящем описании термин "лечение" определяют как применение или введение терапевтического средства пациенту, или применение или введение терапевтического средства в выделенную ткань или клеточную линию, полученную от пациента, имеющего заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, излечения, облегчения, уменьшения, изменения, вылечивания, повышения, улучшения или воздействия на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

В некоторых воплощениях пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения используют для лечения, профилактики и/или диагностики раковых заболеваний и неопластических состояний. В настоящем описании термины "рак", "гиперпролиферативный" и "неопластический" относятся к клеткам, обладающим способностью к автономному росту, т.е. к аномальному статусу или состоянию, характеризующемуся быстрой пролиферацией клеток. Гиперпролиферативные и неопластические болезненные состояния можно классифицировать как патологические, т.е. характеризующие или составляющие болезненное состояние, или их можно классифицировать как непатологические, т.е. как отклонение от нормального состояния, не связанное с болезненным состоянием. Подразумевается, что термин включает в себя все типы ракового роста или онкогенных процессов, метастатические ткани или клетки, ткани или органы, подвергшиеся злокачественной трансформации, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Метастатические опухоли могут вырастать из первичных опухолей разных типов, включающих в себя, без ограничения, опухоли молочной железы, легкого, печени, толстой кишки и яичника. "Патологические гиперпролиферативные" клетки встречаются при болезненных состояниях, характеризующихся злокачественным ростом опухоли. Примеры непатологических гиперпролиферативных клеток включают в себя пролиферацию клеток, связанную с заживлением раны. Примеры клеточно-пролиферативных и/или дифференцировочных расстройств включают в себя рак, такой как карцинома, саркома или метастаческие нарушения. В некоторых воплощениях пептидомиметические макроциклы представляют собой новые терапевтические средства лечения рака молочной железы, рака яичника, рака толстой кишки, рака легкого, метастаз указанных раковых заболеваний и т.п.

Примеры раковых заболеваний или неопластичских состояний включают в себя, без ограничения, такие заболевания, как фибросаркома, миосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, саркома Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, рак желудка, рак пищевода, рак прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак простаты, рак матки, рак головы и шеи, рак кожи, рак мозга, плоскоклеточная карцинома, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярный рак, бронхогенный рак, почечноклеточный рак, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, семинома, эмбриональный рак, опухоль Вилма, рак шейки матки, рак яичка, мелкоклеточная карцинома легкого, немелкоклеточный рак легкого, карцинома мочевого пузыря, карцинома эпителия, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, акустическая невринома, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома, ретинобластома, лейкоз, лимфома или саркома Капоши.

Примеры пролиферативных нарушений включают в себя неопластические нарушения кроветворных органов. В настоящем описании термин "неопластические нарушения кроветворных органов" включает в себя заболевания, в которых участвуют гиперпластические/неопластические клетки гематопоэтического происхождения, например, образующиеся из миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий, или из их предшественников. Предпочтительно эти заболевания развиваются из плохо дифференцированных острых лейкозов, таких как эритробластический лейкоз и острый мегакариобластический лейкоз. Другие примеры миелоидных нарушений включают в себя, без ограничения, острый промиелоидный лейкоз (APML), острый миелогенный лейкоз (AML) и хронический миелогенный лейкоз (CML) (обзор можно найти в Vaickus (1991), Crit Rev.Oncol./Hemotol. 11:267-97); лимфоидные злокачественные заболевания включают в себя, без ограничения, острый лимфобластный лейкоз (ALL), в котором участвуют B-линия ALL и T-линия ALL, хронический лимфолейкоз (CLL), пролимфоцитарный лейкоз (PLL), волосатоклеточный лейкоз (HLL) и макроглобулинемия Вальденстрема (WM). Другие формы злокачественных лимфом включают в себя, без ограничения, неходжкинскую лимфому и ее варианты, лимфомы периферических T-клеток, T-клеточный лейкоз/лимфома взрослых (ATL), Т-клеточная лимфома кожи (CTCL), большой гранулярный лимфоцитарный лейкоз (LGF), болезнь Ходжкина и болезнь Рида-Стернберга.

Примеры клеточных пролиферативных и/или дифференцировочных расстройств молочной железы включают в себя, без ограничения, пролиферативную болезнь молочной железы, такую как, например, эпителиальная гиперплазия, склерозирующий аденоз и папилломы маленьких молочных протоков; опухоли, например, стромальные опухоли, такие как фиброаденома, филлоидная цистосаркома и саркомы, а также эпителиальные опухоли, такие как папилломы больших молочных протоков; карцинома молочной железы, такая как карцинома in situ (неинвазивная), которая включает в себя карциному эпителия протоков in situ (в том числе болезнь Педжета) и дольковую карциному in situ, и инвазивная (инфильтрующая) карцинома, включающая в себя, без ограничения, инвазивную карциному эпителия протоков, инвазивную дольковую карциному, медуллярную карциному, коллоидную (слизеобразующую) карциному, тубулярную карциному и инвазивную папиллярную карциному, а также смешанные злокачественные опухоли. Заболевания мужской молочной железы включают в себя, без ограничения, гинекомастию и карциному.

Примеры клеточных пролиферативных и/или дифференцирующих нарушений легких включают в себя, без ограничения, бронхогенный рак, включающий в себя паранеопластические синдромы, бронхоальвеолярную карциному, нейроэндокринные опухоли, такие как бронхиальный карциноид, смешанные опухоли и метастатические опухоли; патологии плевры, включающие в себя воспалительные плевральные экссудаты, невоспалительные плевральные экссудаты, пневмоторакс и плевральные опухоли, включающие в себя отдельные фиброзные опухоли (фибромы плевры) и злокачественную мезотелиому.

Примеры клеточных пролиферативных и/или дифференцирующих нарушений толстой кишки включают в себя, без ограничения, не неопластические полипы, аденомы, семейные синдромы, колоректальный канцерогенез, колоректальную карциному и карциноидные опухоли.

Примеры клеточных пролиферативных и/или дифференцирующих нарушений печени включают в себя, без ограничения, узловые гиперплазии, аденомы и злокачественные опухоли, такие как первичная карцинома печени и метастатические опухоли.

Примеры клеточных пролиферативных и/или дифференцирующих нарушений яичников включают в себя, без ограничения, опухоли яичников, такие как опухоли целомического эпителия, серозные опухоли, слизеобразующие опухоли, эндометриоидные опухоли, светлоклеточная аденокарцинома, цистаденофиброма, опухоль Бреннера, поверхностные эпителиальные опухоли; герминомы, такие как зрелые (доброкачественные) тератомы, монодермальные тератомы, незрелые злокачественные тератомы, дисгерминома, эндодермальная опухоль, хориокарцинома; опухоли зародышевых тяжей-стомы, такие как гранулезотекаклеточные опухоли, текомафибромы, андробластомы, hill cell tumors и гонадобластома; а также метастатические опухоли, такие как опухоли Крукенберга.

В других или следующих воплощениях описанные здесь пептидомиметические макроциклы используют для лечения, профилактики или диагностики состояний, характеризующихся гибелью сверхактивных клеток или клеточной гибелью вследствие физиологического повреждения и др. Некоторые примеры состояний, характеризующихся преждевременной или нежелательной гибелью клеток, или, альтернативно, нежелательной или избыточной пролиферацией клеток, включают в себя, без ограничения гипоцеллюлярные/гипопластические, ацеллюлярные/апластические или гиперцеллюлярные/гиперпластические остояния. Некоторые примеры включают в себя гематологические расстройства, такие как, без ограничения, анемия Фанкони, апластическая анемия, талассемия, наследственный агранулоцитоз и миелодисплазия.

В других или следующих воплощениях пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения, действие которых заключается в уменьшении апоптоза, используют для лечения расстройств, связанных с нежелательным уровнем клеточной гибели. Так, в некоторых воплощениях антиапоптотические пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения используют для лечения расстройств, сопровождающихся гибелью клеток, обусловленной вирусной инфекцией, такой как инфекция, ассоциированная с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Широкий ряд нейрологических заболеваний характеризуется постепенной утратой специфических групп нейронов. Одним из примеров является болезнь Альцгеймера (AD). Болезнь Альцгеймера характеризуется утратой нейронов и синапсов в коре головного мозга и в некоторых подкорковых участках. Данная утрата приводит к явной атрофии пораженных участков. В мозгах пациентов, пораженных AD, видны и амилоидные бляшки, и нейрофибриллярные клубки. Болезнь Альцгеймера была идентифицирована как заболевание, связанное с нарушением свертывания белков вследствие накопления в мозге A-бета и tau-белков с аномальной укладкой. Бляшки образуются из β-амилоида. β-амилоид представляет собой фрагмент более крупного белка, называемого белок-предшественник амилоида (APP). APP играет важную роль в росте нейронов, выживании и восстановлении после повреждения. При AD неизвестный процесс вызывает расщепление APP на более мелкие фрагменты в результате ферментативного протеолиза. Один из таких фрагментов представляет собой скопление волоконец β-амилоида, которые образуют комки, откладывающиеся снаружи нейронов в виде плотных образований, называемых старческие бляшки. Бляшки продолжают расти с образованием нерастворимых скрученных волокон в нервных клетках, часто называемых клубками. Следовательно, нарушение взаимодействия β-амилоида с его природным рецептором является важным фактором при лечении AD. В некоторых воплощениях антиапоптотические пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения используют для лечения AD и других неврологических расстройств, связанных с клеточным апоптозом. Такие неврологические расстройства включают в себя болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (ALS), пигментную дегенерацию сетчатки, атрофию остистой мышцы и разные формы дегенерации мозжечка. При данных заболеваниях утрата клеток не приводит к воспалительному ответу, а механизмом гибели клеток является апоптоз.

Кроме того, ряд гематологических заболеваний связан с уменьшением продукции кровяных клеток. Указанные заболевания включают в себя анемию, ассоциированную с хронической болезнью, апластическую анемию, хроническую нейтропению и миелодиспластические синдромы. Нарушения продукции кровяных клеток, такие как миелодиспластический синдром и некоторые формы апластической анемии, связаны с увеличением апоптотической гибели клеток в костном мозге. Причиной указанных нарушений может служить активация генов, инициирующих апоптоз, приобретенный дефицит стромальных клеток или факторов выживания гематопоэтических клеток, или непосредственное влияние токсинов и медиаторов иммунных ответов. Двумя распространенными нарушениями, связанными с клеточной гибелью, являются инфаркт миокарда и инсульт. При обоих нарушениях клетки в центральном участке ишемического повреждения, образующегося при резком уменьшении кровотока, быстро погибают в результате некроза. Однако вне центральной ишемической зоны клетки погибают в течение более продолжительного периода времени и по данным морфологического анализа - в результате апоптоза. В других или следующих воплощениях антиапоптотические пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения используют для лечения всех указанных нарушений, связанных с нежелательной гибелью клеток.

Некоторые примеры неврологических нарушений, которые можно лечить с помощью описанных здесь пептидомиметических макроциклов, включают в себя, без ограничения, болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом голландского типа, реактивный амилоидоз, семейная амилоидная нефропатия с крапивницей и глухотой, синдром Макла-Веллса, идиопатическую миелому; макроглобулинемия-ассоциированную миелому, семейную амилоидную полиневропатию, семейную амилоидную кардиомиопатию, выделенный сердечный амилоид, системный сенильный амилоидоз, диабет зрелого возраста, инсулинома, выделенный атриальный амилоид, медуллярная карцинома щитовидной железы, семейный амилоидоз, наследственная церебральная геморрагия с амилоидозом, семейная амилоидотическая полиневропатия, почесуха, болезнь Крейтцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, болезнь, опосредуемая прионами, и болезнь Хантингтона.

В другом воплощении описанные здесь пептидомиметические макроциклы используют для лечения, профилактики или диагностики воспалительных расстройств. Существует много типов воспалительных расстройств. Некоторые воспалительные заболевания связаны с иммунной системой, например, аутоиммунные заболевания. Аутоиммунные заболевания возникают в результате повышенного иммунного ответа организма, направленного против веществ и тканей, обычно присутствующих в организме, т.е. против собственных антигенов. Другими словами, при аутоиммунных заболеваниях иммунная система атакует свои собственные клетки. Аутоиммунные заболевания являются основной причиной болезней, опосредуемых иммунной системой. Примером аутоиммунного заболевания является ревматоидный артрит, при котором иммунная система атакует суставы, вызывая воспаление (т.е. артрит) и разрушение. Она также может разрушать некоторые органы, такие как легкие и кожа. Ревматоидный артрит может приводить к значительному снижению функционирования и подвижности. Ревматоидный артрит диагностируют с помощью анализов крови, особенно анализа на ревматоидный фактор. Некоторые примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить с помощью описанных здесь пептидомиметических макроциклов, включают в себя, без ограничения, такие заболевания, как острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром (APS), аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунная болезнь внутреннего уха, синдром Бехчета, буллезный пемфигоид, глютеновая энтеропатия, болезнь Шагаса, синдром Черджа-Строса, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), болезнь Крона, дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, эндометриоз, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре (GBS), тиреоидит Хашимото, гнойный гидраденит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, воспалительная болезнь кишечника (IBD), интерстициальный цистит, красная волчанка, кольцевидная склеродермия, рассеянный склероз, миастения gravis, нарколепсия, нейромиотония, обыкновенная пузырчатка, злокачественная анемия, полимиозит, ревматическая полимиалгия, первичный биллиарный цирроз, псориаз, ревматоидный артрит, шизофрения, склеродермия, синдром Шегрена, темпоральный артериит (также известный как "гигантоклеточный артериит"), синдром Такаясу, васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.

Некоторые примеры других типов воспалительных расстройств, которые можно лечить с помощью описанных здесь пептидомиметических макроциклов, включают в себя, без ограничения, такие заболевания, как аллергия, в том числе аллергический ринит/синусит, кожные аллергии (крапивница/сыпь, ангионевротический аллергический отек, атопический дерматит), пищевые аллергии, медикаментозные аллергии, аллергии на укусы насекомых и редкие аллергические расстройства, такие как мастоцитоз, астма, артрит, в том числе остеоартрит, ревматоидный артрит и спондилоартропатии, первичный ангиит ЦНС, саркоидоз, отторжение органного трансплантата, фибромиалгия, фиброз, панкреатит и воспаление тазовых органов.

Примеры сердечно-сосудистых нарушений (таких как воспалительные нарушения), которые можно лечить или предотвращать с помощью пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, стеноз клапана аорты, атеросклероз, инфаркт миокарда, инсульт, тромбоз, аневризма, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, стенокардия, внезапная сердечная смерть, гипертоническая болезнь сердца; некоронарная болезнь, такая как артериолосклероз, болезнь малых сосудов, нефропатия, гипертриглицеридемия, гиперхолестеринемия, гиперлипидемия, ксантоматоз, астма, гипертония, эмфизема и хроническая болезнь легких; или сердечно-сосудистое состояние, связанное с процедурами вмешательства ("процедурная травма сосудов"), такое как рестеноз после ангиопластики, установка шунта, стента, синтетических или природных эксцизионных трансплантатов в постоянно пребывающем катетере, клапана или других имплантируемых устройств. Предпочтительные сердечно-сосудистые нарушения включают в себя атеросклероз, инфаркт миокарда, аневризму и инсульт.

Хотя здесь показаны и описаны предпочтительные воплощения настоящего изобретения, для специалистов в данной области очевидно, что такие воплощения приведены только для примера. Специалисты в данной области могут осуществить многочисленные вариации, изменения и замены, не отступая от объема и сущности изобретения. Следует понимать, что для осуществления настоящего изобретения можно использовать разные альтернативы воплощениям настоящего изобретения. Подразумевается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, охватывая способы, структуры и их эквиваленты.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Синтез 6-хлортриптофан-Fmoc-аминокислот

Трет-бутил 6-хлор-3-формил-1H-индол-1-карбоксилат, 1. К перемешиваемому раствору в сухом ДМФА (12 мл) добавляют по каплям POCl₃ (3,92 мл, 43 ммоль, 1,3 экв.) при 0ºC в атмосфере аргона. Раствор перемешивают при той же температуре 20 мин и затем добавляют по каплям раствор 6-хлориндола (5,0 г, 33 ммоль, 1 экв.) в сухом ДМФА (30 мл). Полученную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают еще 2,5 ч. Добавляют воду (50 мл) и раствор нейтрализуют 4M водным раствором NaOH (pH приблизительно 8). Полученное твердое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме. Это вещество непосредственно используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К перемешиваемому раствору неочищенного формилиндола (33 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (150 мл) добавляют избыток Boc₂O (7,91 г, 36,3 ммоль, 1,1 экв.) и DMAP (0,4 г, 3,3 ммоль, 0,1 экв.) при комнатной температуре в атмосфере N₂. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре 1,5 ч и растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток помещают в EtOAc, промывают 1 н. HCl, сушат и концентрируют, получая формилиндол 1 (9 г, 98% с 2 стадий) в виде белого твердого вещества.

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 1,70 (с, Boc, 9H), 7,35 (дд, 1H), 8,21 (м, 3H), 10,07 (с, 1H).

Трет-бутил 6-хлор-3-(гидроксиметил)-1H-индол-1-карбоксилат, 2. К раствору соединения 1 (8,86 г, 32 ммоль, 1 экв.) в этаноле (150 мл) добавляют NaBH₄ (2,4 г, 63 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрируют и остаток выливают в смесь диэтилового эфира и воды. Органический слой отделяют, сушат над сульфатом магния и концентрируют, получая белое твердое вещество (8,7 г, 98%). Это вещество непосредственно используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 1,65 (с, Boc, 9H), 4,80 (с, 2H, CH₂), 7,21 (дд, 1H), 7,53 (м, 2H), 8,16 (шир.с, 1H).

Трет-бутил 3-(бромметил)-6-хлор-1H-индол-1-карбоксилат, 3. К раствору соединения 2 (4,1 г, 14,6 ммоль, 1 экв.) в дихлорметане (50 мл) в атмосфере аргона добавляют раствор трифенилфосфина (4,59 г, 17,5 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (50 мл) при -40ºC. Реакционный раствор перемешивают еще 30 мин при 40ºC. Затем добавляют NBS (3,38 г, 19 ммоль, 1,3 экв.). Полученную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Дихлорметан упаривают, добавляют четыреххлористый углерод (100 мл), после чего смесь перемешивают в течение 1 ч и фильтруют. Фильтрат концентрируют, загружают на слой оксида кремния и быстро элюируют 25% раствором EtOAc в гексанах. Полученный раствор концентрируют, получая белую пену (3,84 г, 77%).

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 1,66 (с, Boc, 9H), 4,63 (с, 2H, CH₂), 7,28 (дд, 1H), 7,57 (д, 1H), 7,64 (шир.с, 1H), 8,18 (шир.с, 1H).

αMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4. К S-Ala-Ni-S-BPB (2,66 г, 5,2 ммоль, 1 экв.) и KO-tBu (0,87 г, 7,8 ммоль, 1,5 экв.) добавляют 50 мл ДМФА в атмосфере аргона. Через шприц добавляют бромид-содержащее производное 3 (2,68 г, 7,8 ммоль, 1,5 экв.) в растворе ДМФА (5,0 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Затем раствор гасят 5% водным раствором уксусной кислоты и разбавляют водой. Целевой продукт экстрагируют в дихлорметан, сушат и концентрируют. Маслянистый продукт 4 очищают флэш-хроматографией (твердая загрузка) на нормальной фазе, используя в качестве элюентов EtOAc и гексаны, и получают красное твердое вещество (1,78 г, выход 45%). αMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4: M+H рассчитано 775,21, M+H получено 775,26.

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 1,23 (с, 3H, αMe), 1,56 (м, 11H, Boc+CH₂), 1,82-2,20 (м, 4H, 2CH₂), 3,03 (м, 1H, CH_α), 3,24 (м, 2H, CH₂), 3,57 и 4,29 (AB система, 2H, CH₂ (бензил), J=12,8 Гц), 6,62 (д, 2H), 6,98 (д, 1H), 7,14 (м, 2H), 7,23 (м, 1H), 7,32-7,36 (м, 5H), 7,50 (м, 2H), 7,67 (шир.с, 1H), 7,98 (д, 2H), 8,27 (м, 2H).

Fmoc-αMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6. К раствору 3 н. HCl/MeOH (1/3, 15 мл) при 50ºC по каплям добавляют раствор соединения 4 (1,75 г, 2,3 ммоль, 1 экв.) в MeOH (5 мл). Перемешиваемое вещество исчезает в течение 3-4 ч. Затем кислый раствор охлаждают до 0ºC на ледяной бане и гасят водным раствором Na₂CO₃ (1,21 г, 11,5 ммоль, 5 экв.). Метанол удаляют и к суспензии добавляют еще 8 эквивалентов Na₂CO₃ (1,95 г, 18,4 ммоль). Затем для удаления никеля добавляют дигидрат динатриевой соли ЭДТА (1,68 г, 4,5 ммоль, 2 экв.) и суспензию перемешивают в течение 2 ч. Добавляют раствор Fmoc-OSu (0,84 г, 2,5 ммоль, 1,1 экв.) в ацетоне (50 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляют диэтиловым эфиром и 1 н. HCl. Органический слой сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Целевой продукт 6 очищают на нормальной фазе, используя в качестве элюентов ацетон и дихлорметан, и получают белую пену (0,9 г, выход 70%). Fmoc-αMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6: M+H рассчитано 575,19, M+H получено 575,37.

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 1,59 (с, 9H, Boc), 1,68 (с, 3H, Me), 3,48 (шир.с, 2H, CH₂), 4,22 (м, 1H, CH), 4,39 (шир.с, 2H, CH₂), 5,47 (с, 1H, NH), 7,10 (м, 1H), 7,18 (м, 2H), 7,27 (м, 2H), 7,39 (м, 2H), 7,50 (м, 2H), 7,75 (д, 2H), 8,12 (шир.с, 1H).

6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5. К Gly-Ni-S-BPB (4,6 г, 9,2 ммоль, 1 экв.) и KO-tBu (1,14 г, 10,1 ммоль, 1,1 экв.) добавляют 95 мл ДМФА в атмосфере аргона. Через шприц добавляют бромид-содержащее производное 3 (3,5 г, 4,6 ммоль, 1,1 экв.) в растворе ДМФА (10 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Затем раствор гасят 5% водным раствором уксусной кислоты и разбавляют водой. Целевой продукт экстрагируют в дихлорметан, сушат и концентрируют. Маслянистый продукт 5 очищают флэш-хроматографией (твердая загрузка) на нормальной фазе, используя в качестве элюентов EtOAc и гексаны, и получают красное твердое вещество (5 г, выход 71%). 6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5: M+H рассчитано 761,20, M+H получено 761,34.

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 1,58 (м, 11H, Boc+CH₂), 1,84 (м, 1H), 1,96 (м, 1H), 2,24 (м, 2H, CH₂), 3,00 (м, 1H, CH_α), 3,22 (м, 2H, CH₂), 3,45 и 4,25 (AB система, 2H, CH₂ (бензил), J=12,8 Гц), 4,27 (м, 1H, CH_α), 6,65 (д, 2H), 6,88 (д, 1H), 7,07 (м, 2H), 7,14 (м, 2H), 7,28 (м, 3H), 7,35-7,39 (м, 2H), 7,52 (м, 2H), 7,96 (д, 2H), 8,28 (м, 2H).

Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7. К раствору 3 н. HCl/MeOH (1/3, 44 мл) при 50ºC по каплям добавляют раствор соединения 5 (5 г, 6,6 ммоль, 1 экв.) в MeOH (10 мл). Исходное вещество исчезает в течение 3-4 ч. Затем кислый раствор охлаждают до 0ºC на ледяной бане и гасят водным раствором Na₂CO₃ (3,48 г, 33 ммоль, 5 экв.). Метанол удаляют и к суспензии добавляют еще 8 эквивалентов Na₂CO₃ (5,57 г, 52 ммоль). Затем для удаления никеля добавляют дигидрат динатриевой соли ЭДТА (4,89 г, 13,1 ммоль, 2 экв.) и суспензию перемешивают в течение 2 ч. Добавляют раствор Fmoc-OSu (2,21 г, 6,55 ммоль, 1,1 экв.) в ацетоне (100 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляют диэтиловым эфиром и 1 н. HCl. Органический слой сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Целевой продукт 7 очищают на нормальной фазе, используя в качестве элюентов ацетон и дихлорметан, и получают белую пену (2,6 г, выход 69%). Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7: M+H рассчитано 561,17, M+H получено 561,37.

¹H-ЯМР (CDCl₃) 1,63 (с, 9H, Boc), 3,26 (м, 2H, CH₂), 4,19 (м, 1H, CH), 4,39 (м, 2H, CH₂), 4,76 (м, 1H), 5,35 (д, 1H, NH), 7,18 (м, 2H), 7,28 (м, 2H), 7,39 (м, 3H), 7,50 (м, 2H), 7,75 (д, 2H), 8,14 (шир.с, 1H).

Пример 2: Пептидомиметические макроциклы настоящего изобретения

Пептидомиметические макроциклы синтезируют, очищают и анализируют с помощью описанных выше и ниже способов (Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122: 5891 (2005); Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004); и патент США № 7192713). Пептидомиметические макроциклы конструируют путем замены двух или более природных аминокислот соответствующими синтетическими аминокислотами. Замены осуществляют в положениях i и i+4, i и i+7. Пептидный синтез проводят либо вручную, либо на автоматизированном пептидном синтезаторе (Applied Biosystems, модель 433 A), используя твердую фазу, амидную AM смолу Ринка (Novabiochem) и Fmoc-химию для защиты основной цепи. Для присоединения природных Fmoc-защищенных аминокислот (Novabiochem) используют 10 эквивалентов аминокислот и конденсирующие реагенты HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA в молярном соотношении 1:1:2. Неприродные аминокислоты (4 экв.) присоединяют, используя HATU (Applied Biosystems)/HOBt/DIEA в молярном соотношении 1:1:2. N-концы синтетических пептидов ацетилируют, а C-концы амидируют.

Очистку поперечносшитых соединений проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Varian ProStar) на колонке с обращенной фазой C18 (Varian), получая чистые соединения. Химический состав чистых соединений подтверждают методом масс-спектрометрии ЖХ/МС (Micromass LCT, соединенный с системой ВЭЖХ Agilent 1100) и аминокислотного анализа (Applied Biosystems, модель 420A).

В таблице 4 приведен список полученных пептидомиметических макроциклов настоящего изобретения.

Таблица 4
	Последовательность	Точная масса	М+2	Наблюдаемая масса (м/е)
SP-1	Ac-LSQETF$r8DLWKLL$EN-NH2	2068,13	1035,07	1035,36
SP-2	Ac-LSQETF$r8NLWKLL$QN-NH2	2066,16	1034,08	1034,31
SP-3	Ac-LSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2093,18	1047,59	1047,73
SP-4	Ac-QSQQTF$r8NLWKLL$QN-NH2	2080,15	1041,08	1041,31
SP-5	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2108,15	1055,08	1055,32
SP-6	Ac-QSQQTA$r8NLWRLL$QN-NH2	2032,12	1017,06	1017,24
SP-7	Ac-QAibQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2106,17	1054,09	1054,34
SP-8	Ac-QSQQTFSNLWRLLPQN-NH2	2000,02	1001,01	1001,26
SP-9	Ac-QSQQTF$/r8NLWRLL$/QN-NH2	2136,18	1069,09	1069,37
SP-10	Ac-QSQAibTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2065,15	1033,58	1033,71
SP-11	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$AN-NH2	2051,13	1026,57	1026,70
SP-12	Ac-ASQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2051,13	1026,57	1026,90
SP-13	Ac-QSQQTF$r8ALWRLL$QN-NH2	2065,15	1033,58	1033,41
SP-14	Ac-QSQETF$r8NLWRLL$QN-NH2	2109,14	1055,57	1055,70
SP-15	Ac-RSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2136,20	1069,10	1069,17
SP-16	Ac-RSQQTF$r8NLWRLL$EN-NH2	2137,18	1069,59	1069,75
SP-17	Ac-LSQETFSDLWKLLPEN-NH2	1959,99	981,00	981,24
SP-18	Ac-QSQ$TFS$LWRLLPQN-NH2	2008,09	1005,05	1004,97
SP-19	Ac-QSQQ$FSN$WRLLPQN-NH2	2036,06	1019,03	1018,86
SP-20	Ac-QSQQT$SNL$RLLPQN-NH2	1917,04	959,52	959,32
SP-21	Ac-QSQQTF$NLW$LLPQN-NH2	2007,06	1004,53	1004,97
SP-22	Ac-RTQATF$r8NQWAibANle$TNAibTR-NH2	2310,26	1156,13	1156,52
SP-23	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$RN-NH2	2136,20	1069,10	1068,94
SP-24	Ac-QSQRTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2136,20	1069,10	1068,94
SP-25	Ac-QSQQTF$r8NNleWRLL$QN-NH2	2108,15	1055,08	1055,44
SP-26	Ac-QSQQTF$r8NLWRNleL$QN-NH2	2108,15	1055,08	1055,84
SP-27	Ac-QSQQTF$r8NLWRLNle$QN-NH2	2108,15	1055,08	1055,12
SP-28	Ac-QSQQTY$r8NLWRLL$QN-NH2	2124,15	1063,08	1062,92
SP-29	Ac-RAibQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2134,22	1068,11	1068,65
SP-30	Ac-MPRFMDYWEGLN-NH2	1598,70	800,35	800,45
SP-31	Ac-RSQQRF$r8NLWRLL$QN-NH2	2191,25	1096,63	1096,83
SP-32	Ac-QSQQRF$r8NLWRLL$QN-NH2	2163,21	1082,61	1082,87
SP-33	Ac-RAibQQRF$r8NLWRLL$QN-NH2	2189,27	1095,64	1096,37
SP-34	Ac-RSQQRF$r8NFWRLL$QN-NH2	2225,23	1113,62	1114,37
SP-35	Ac-RSQQRF$r8NYWRLL$QN-NH2	2241,23	1121,62	1122,37
SP-36	Ac-RSQQTF$r8NLWQLL$QN-NH2	2108,15	1055,08	1055,29
SP-37	Ac-QSQQTF$r8NLWQAmlL$QN-NH2	2094,13	1048,07	1048,32
SP-38	Ac-QSQQTF$r8NAmlWRLL$QN-NH2	2122,17	1062,09	1062,35
SP-39	Ac-NlePRF$r8DYWEGL$QN-NH2	1869,98	935,99	936,20
SP-40	Ac-NlePRF$r8NYWRLL$QN-NH2	1952,12	977,06	977,35
SP-41	Ac-RF$r8NLWRLL$Q-NH2	1577,96	789,98	790,18
SP-42	Ac-QSQQTF$r8N2ffWRLL$QN-NH2	2160,13	1081,07	1081,40
SP-43	Ac-QSQQTF$r8N3ffWRLL$QN-NH2	2160,13	1081,07	1081,34
SP-44	Ac-QSQQTF#r8NLWRLL#QN-NH2	2080,12	1041,06	1041,34
SP-45	Ac-RSQQTA$r8NLWRLL$QN-NH2	2060,16	1031,08	1031,38
SP-46	Ac-QSQQTF%r8NLWRLL%QN-NH2	2110,17	1056,09	1056,55
SP-47	HepQSQ$TFSNLWRLLPQN-NH2	2051,10	1026,55	1026,82
SP-48	HepQSQ$TF$r8NLWRLL$QN-NH2	2159,23	1080,62	1080,89
SP-49	Ac-QSQQTF$r8NL6clWRLL$QN-NH2	2142,11	1072,06	1072,35
SP-50	Ac-QSQQTF$r8NLMe6clwRLL$QN-NH2	2156,13	1079,07	1079,27
SP-51	Ac-LTFEHYWAQLTS-NH2	1535,74	768,87	768,91
SP-52	Ac-LTF$HYW$QLTS-NH2	1585,83	793,92	794,17
SP-53	Ac-LTFE$YWA$LTS-NH2	1520,79	761,40	761,67
SP-54	Ac-LTF$zr8HYWAQL$zS-NH2	1597,87	799,94	800,06
SP-55	Ac-LTF$r8HYWRQL$S-NH2	1682,93	842,47	842,72
SP-56	Ac-QS$QTFStNLWRLL$s8QN-NH2	2145,21	1073,61	1073,90
SP-57	Ac-QSQQTASNLWRLLPQN-NH2	1923,99	963,00	963,26
SP-58	Ac-QSQQTA$/r8NLWRLL$/QN-NH2	2060,15	1031,08	1031,24
SP-59	Ac-ASQQTF$/r8NLWRLL$/QN-NH2	2079,16	1040,58	1040,89
SP-60	Ac-$SQQ$FSNLWRLLAibQN-NH2	2009,09	1005,55	1005,86
SP-61	Ac-QS$QTF$NLWRLLAibQN-NH2	2023,10	1012,55	1012,79
SP-62	Ac-QSQQ$FSN$WRLLAibQN-NH2	2024,06	1013,03	1013,31
SP-63	Ac-QSQQTF$NLW$LLAibQN-NH2	1995,06	998,53	998,87
SP-64	Ac-QSQQTFS$LWR$LAibQN-NH2	2011,06	1006,53	1006,83
SP-65	Ac-QSQQTFSNLW$LLA$N-NH2	1940,02	971,01	971,29
SP-66	Ac-$/SQQ$/FSNLWRLLAibQN-NH2	2037,12	1019,56	1019,78
SP-67	Ac-QS$/QTF$/NLWRLLAibQN-NH2	2051,13	1026,57	1026,90
SP-68	Ac-QSQQ$/FSN$/WRLLAibQN-NH2	2052,09	1027,05	1027,36
SP-69	Ac-QSQQTF$/NLW$/LLAibQN-NH2	2023,09	1012,55	1013,82
SP-70	Ac-QSQ$TFS$LWRLLAibQN-NH2	1996,09	999,05	999,39
SP-71	Ac-QSQ$/TFS$/LWRLLAibQN-NH2	2024,12	1013,06	1013,37
SP-72	Ac-QS$/QTFSt//NLWRLL$/s8QN-NH2	2201,27	1101,64	1102,00
SP-73	Ac-$r8SQQTFS$LWRLLAibQN-NH2	2038,14	1020,07	1020,23
SP-74	Ac-QSQ$r8TFSNLW$LLAibQN-NH2	1996,08	999,04	999,32
SP-75	Ac-QSQQTFS$r8LWRLLA$N-NH2	2024,12	1013,06	1013,37
SP-76	Ac-QS$r5QTFStNLW$LLAibQN-NH2	2032,12	1017,06	1017,39
SP-77	Ac-$/r8SQQTFS$/LWRLLAibQN-NH2	2066,17	1034,09	1034,80
SP-78	Ac-QSQ$/r8TFSNLW$/LLAibQN-NH2	2024,11	1013,06	1014,34
SP-79	Ac-QSQQTFS$/r8LWRLLA$/N-NH2	2052,15	1027,08	1027,16
SP-80	Ac-QS$/r5QTFSt//NLW$/LLAibQN-NH2	2088,18	1045,09	1047,10
SP-81	Ac-QSQQTFSNLWRLLAibQN-NH2	1988,02	995,01	995,31
SP-82	Hep/QSQ$/TF$/r8NLWRLL$/QN-NH2	2215,29	1108,65	1108,93
SP-83	Ac-ASQQTF$r8NLRWLL$QN-NH2	2051,13	1026,57	1026,90
SP-84	Ac-QSQQTF$/r8NLWRLL$/Q-NH2	2022,14	1012,07	1012,66
SP-85	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$Q-NH2	1994,11	998,06	998,42
SP-86	Ac-AAARAA$r8AAARAA$AA-NH2	1515,90	758,95	759,21
SP-87	Ac-LTFEHYWAQLTSA-NH2	1606,78	804,39	804,59
SP-88	Ac-LTF$r8HYWAQL$SA-NH2	1668,90	835,45	835,67
SP-89	Ac-ASQQTFSNLWRLLPQN-NH2	1943,00	972,50	973,27
SP-90	Ac-QS$QTFStNLW$r5LLAibQN-NH2	2032,12	1017,06	1017,30
SP-91	Ac-QSQQTFAibNLWRLLAibQN-NH2	1986,04	994,02	994,19
SP-92	Ac-QSQQTFNleNLWRLLNleQN-NH2	2042,11	1022,06	1022,23
SP-93	Ac-QSQQTF$/r8NLWRLLAibQN-NH2	2082,14	1042,07	1042,23
SP-94	Ac-QSQQTF$/r8NLWRLLNleQN-NH2	2110,17	1056,09	1056,29
SP-95	Ac-QSQQTFAibNLWRLL$/QN-NH2	2040,09	1021,05	1021,25
SP-96	Ac-QSQQTFNleNLWRLL$/QN-NH2	2068,12	1035,06	1035,31
SP-97	Ac-QSQQTF%r8NL6clWRNleL%QN-NH2	2144,13	1073,07	1073,32
SP-98	Ac-QSQQTF%r8NLMe6clWRLL%QN-NH2	2158,15	1080,08	1080,31
SP-101	Ac-FNle$YWE$L-NH2	1160,63	-	1161,70
SP-102	Ac-F$r8AYWELL$A-NH2	1344,75	-	1345,90
SP-103	Ac-F$r8AYWQLL$A-NH2	1343,76	-	1344,83
SP-104	Ac-NlePRF$r8NYWELL$QN-NH2	1925,06	963,53	963,69
SP-105	Ac-NlePRF$r8DYWRLL$QN-NH2	1953,10	977,55	977,68
SP-106	Ac-NlePRF$r8NYWRLL$Q-NH2	1838,07	920,04	920,18
SP-107	Ac-NlePRF$r8NYWRLL$-NH2	1710,01	856,01	856,13
SP-108	Ac-QSQQTF$r8DLWRLL$QN-NH2	2109,14	1055,57	1055,64
SP-109	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$EN-NH2	2109,14	1055,57	1055,70
SP-110	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$QD-NH2	2109,14	1055,57	1055,64
SP-111	Ac-QSQQTF$r8NLWRLL$S-NH2	1953,08	977,54	977,60
SP-112	Ac-ESQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2109,14	1055,57	1055,70
SP-113	Ac-LTF$r8NLWRNleL$Q-NH2	1635,99	819,00	819,10
SP-114	Ac-LRF$r8NLWRNleL$Q-NH2	1691,04	846,52	846,68
SP-115	Ac-QSQQTF$r8NWWRNleL$QN-NH2	2181,15	1091,58	1091,64
SP-116	Ac-QSQQTF$r8NLWRNleL$Q-NH2	1994,11	998,06	998,07
SP-117	Ac-QTF$r8NLWRNleL$QN-NH2	1765,00	883,50	883,59
SP-118	Ac-NlePRF$r8NWWRLL$QN-NH2	1975,13	988,57	988,75
SP-119	Ac-NlePRF$r8NWWRLL$A-NH2	1804,07	903,04	903,08
SP-120	Ac-TSFAEYWNLLSP-NH2	1467,70	734,85	734,90
SP-121	Ac-QTF$r8HWWSQL$S-NH2	1651,85	826,93	827,12
SP-122	Ac-FM$YWE$L-NH2	1178,58	-	1179,64
SP-123	Ac-QTFEHWWSQLLS-NH2	1601,76	801,88	801,94
SP-124	Ac-QSQQTF$r8NLAmwRLNle$QN-NH2	2122,17	1062,09	1062,24
SP-125	Ac-FMAibY6clWEAc3cL-NH2	1130,47	-	1131,53
SP-126	Ac-FNle$Y6clWE$L-NH2	1194,59	-	1195,64
SP-127	Ac-F$zr8AY6clWEAc3cL$z-NH2	1277,63	639,82	1278,71
SP-128	Ac-F$r8AY6clWEAc3cL$A-NH2	1348,66	-	1350,72
SP-129	Ac-NlePRF$r8NY6clWRLL$QN-NH2	1986,08	994,04	994,64
SP-130	Ac-AF$r8AAWALA$A-NH2	1223,71	-	1224,71
SP-131	Ac-TF$r8AAWRLA$Q-NH2	1395,80	698,90	399,04
SP-132	Pr-TF$r8AAWRLA$Q-NH2	1409,82	705,91	706,04
SP-133	Ac-QSQQTF%r8NLWRNleL%QN-NH2	2110,17	1056,09	1056,22
SP-134	Ac-LTF%r8HYWAQL%SA-NH2	1670,92	836,46	836,58
SP-135	Ac-NlePRF%r8NYWRLL%QN-NH2	1954,13	978,07	978,19
SP-136	Ac-NlePRF%r8NY6clWRLL%QN-NH2	1988,09	995,05	995,68
SP-137	Ac-LTF%r8HY6clWAQL%S-NH2	1633,84	817,92	817,93
SP-138	Ac-QS%QTF%StNLWRLL%s8QN-NH2	2149,24	1075,62	1075,65
SP-139	Ac-LTF%r8HY6clWRQL%S-NH2	1718,91	860,46	860,54
SP-140	Ac-QSQQTF%r8NL6clWRLL%QN-NH2	2144,13	1073,07	1073,64
SP-141	Ac-%r8SQQTFS%LWRLLAibQN-NH2	2040,15	1021,08	1021,13
SP-142	Ac-LTF%r8HYWAQL%S-NH2	1599,88	800,94	801,09
SP-143	Ac-TSF%r8QYWNLL%P-NH2	1602,88	802,44	802,58
SP-147	Ac-LTFEHYWAQLTS-NH2	1535,74	768,87	769,5
SP-152	Ac-F$er8AY6clWEAc3cL$e-NH2	1277,63	639,82	1278,71
SP-153	Ac-AF$r8AAWALA$A-NH2	1277,63	639,82	1277,84
SP-154	Ac-TF$r8AAWRLA$Q-NH2	1395,80	698,90	699,04
SP-155	Pr-TF$r8AAWRLA$Q-NH2	1409,82	705,91	706,04
SP-156	Ac-LTF$er8HYWAQL$eS-NH2	1597,87	799,94	800,44
SP-159	Ac-CCPGCCBaQSQQTF$r8NLWRLL$QN-NH2	2745,30	1373,65	1372,99
SP-160	Ac-CCPGCCBaQSQQTA$r8NLWRLL$QN-NH2	2669,27	1335,64	1336,09
SP-161	Ac-CCPGCCBaNlePRF$r8NYWRLL$QN-NH2	2589,26	1295,63	1296,2
SP-162	Ac-LTF$/r8HYWAQL$/S-NH2	1625,90	813,95	814,18
SP-163	Ac-F%r8HY6clWRAc3cL%-NH2	1372,72	687,36	687,59
SP-164	Ac-QTF%r8HWWSQL%S-NH2	1653,87	827,94	827,94
SP-165	Ac-LTA$r8HYWRQL$S-NH2	1606,90	804,45	804,66
SP-166	Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2	2080,12	1041,06	1041,61
SP-167	Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2	2066,11	1034,06	1034,58
SP-168	Ac-F$r8AYWEAc3cL$A-NH2	1314,70	658,35	1315,88
SP-169	Ac-F$r8AYWEAc3cL$S-NH2	1330,70	666,35	1331,87
SP-170	Ac-F$r8AYWEAc3cL$Q-NH2	1371,72	686,86	1372,72
SP-171	Ac-F$r8AYWEAibL$S-NH2	1332,71	667,36	1334,83
SP-172	Ac-F$r8AYWEAL$S-NH2	1318,70	660,35	1319,73
SP-173	Ac-F$r8AYWEQL$S-NH2	1375,72	688,86	1377,53
SP-174	Ac-F$r8HYWEQL$S-NH2	1441,74	721,87	1443,48
SP-175	Ac-F$r8HYWAQL$S-NH2	1383,73	692,87	1385,38
SP-176	Ac-F$r8HYWAAc3cL$S-NH2	1338,71	670,36	1340,82
SP-177	Ac-F$r8HYWRAc3cL$S-NH2	1423,78	712,89	713,04
SP-178	Ac-F$r8AYWEAc3cL#A-NH2	1300,69	651,35	1302,78
SP-179	Ac-NlePTF%r8NYWRLL%QN-NH2	1899,08	950,54	950,56
SP-180	Ac-TF$r8AAWRAL$Q-NH2	1395,80	698,90	699,13
SP-181	Ac-TSF%r8HYWAQL%S-NH2	1573,83	787,92	787,98
SP-184	Ac-F%r8AY6clWEAc3cL%A-NH2	1350,68	676,34	676,91
SP-185	Ac-LTF$r8HYWAQI$S-NH2	1597,87	799,94	800,07
SP-186	Ac-LTF$r8HYWAQNle$S-NH2	1597,87	799,94	800,07
SP-187	Ac-LTF$r8HYWAQL$A-NH2	1581,87	791,94	792,45
SP-188	Ac-LTF$r8HYWAQL$Abu-NH2	1595,89	798,95	799,03
SP-189	Ac-LTF$r8HYWAbuQL$S-NH2	1611,88	806,94	807,47
SP-190	Ac-LTF$er8AYWAQL$eS-NH2	1531,84	766,92	766,96
SP-191	Ac-LAF$r8HYWAQL$S-NH2	1567,86	784,93	785,49
SP-192	Ac-LAF$r8AYWAQL$S-NH2	1501,83	751,92	752,01
SP-193	Ac-LTF$er8AYWAQL$eA-NH2	1515,85	758,93	758,97
SP-194	Ac-LAF$r8AYWAQL$A-NH2	1485,84	743,92	744,05
SP-195	Ac-LTF$r8NLWANleL$Q-NH2	1550,92	776,46	776,61
SP-196	Ac-LTF$r8NLWANleL$A-NH2	1493,90	747,95	1495,6
SP-197	Ac-LTF$r8ALWANleL$Q-NH2	1507,92	754,96	755
SP-198	Ac-LAF$r8NLWANleL$Q-NH2	1520,91	761,46	761,96
SP-199	Ac-LAF$r8ALWANleL$A-NH2	1420,89	711,45	1421,74
SP-200	Ac-A$r8AYWEAc3cL$A-NH2	1238,67	620,34	1239,65
SP-201	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AA-NH2	1385,74	693,87	1386,64
SP-202	Ac-F$r8AYWEAc3cL$Abu-NH2	1328,72	665,36	1330,17
SP-203	Ac-F$r8AYWEAc3cL$Nle-NH2	1356,75	679,38	1358,22
SP-204	Ac-F$r5AYWEAc3cL$s8A-NH2	1314,70	658,35	1315,51
SP-205	Ac-F$AYWEAc3cL$r8A-NH2	1314,70	658,35	1315,66
SP-206	Ac-F$r8AYWEAc3cI$A-NH2	1314,70	658,35	1316,18
SP-207	Ac-F$r8AYWEAc3cNle$A-NH2	1314,70	658,35	1315,66
SP-208	Ac-F$r8AYWEAmlL$A-NH2	1358,76	680,38	1360,21
SP-209	Ac-F$r8AYWENleL$A-NH2	1344,75	673,38	1345,71
SP-210	Ac-F$r8AYWQAc3cL$A-NH2	1313,72	657,86	1314,7
SP-211	Ac-F$r8AYWAAc3cL$A-NH2	1256,70	629,35	1257,56
SP-212	Ac-F$r8AYWAbuAc3cL$A-NH2	1270,71	636,36	1272,14
SP-213	Ac-F$r8AYWNleAc3cL$A-NH2	1298,74	650,37	1299,67
SP-214	Ac-F$r8AbuYWEAc3cL$A-NH2	1328,72	665,36	1329,65
SP-215	Ac-F$r8NleYWEAc3cL$A-NH2	1356,75	679,38	1358,66
SP-216	5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2	1922,82	962,41	962,87
SP-217	5-FAM-BaLTF%r8HYWAQL%S-NH2	1986,96	994,48	994,97
SP-218	Ac-LTF$r8HYWAQhL$S-NH2	1611,88	806,94	807
SP-219	Ac-LTF$r8HYWAQTle$S-NH2	1597,87	799,94	799,97
SP-220	Ac-LTF$r8HYWAQAdm$S-NH2	1675,91	838,96	839,09
SP-221	Ac-LTF$r8HYWAQhCha$S-NH2	1651,91	826,96	826,98
SP-222	Ac-LTF$r8HYWAQCha$S-NH2	1637,90	819,95	820,02
SP-223	Ac-LTF$r8HYWAc6cQL$S-NH2	1651,91	826,96	826,98
SP-224	Ac-LTF$r8HYWAc5cQL$S-NH2	1637,90	819,95	820,02
SP-225	Ac-LThF$r8HYWAQL$S-NH2	1611,88	806,94	807
SP-226	Ac-LTIgl$r8HYWAQL$S-NH2	1625,90	813,95	812,99
SP-227	Ac-LTF$r8HYWAQChg$S-NH2	1623,88	812,94	812,99
SP-228	Ac-LTF$r8HYWAQF$S-NH2	1631,85	816,93	816,99
SP-229	Ac-LTF$r8HYWAQIgl$S-NH2	1659,88	830,94	829,94
SP-230	Ac-LTF$r8HYWAQCba$S-NH2	1609,87	805,94	805,96
SP-231	Ac-LTF$r8HYWAQCpg$S-NH2	1609,87	805,94	805,96
SP-232	Ac-LTF$r8HhYWAQL$S-NH2	1611,88	806,94	807
SP-233	Ac-F$r8AYWEAc3chL$A-NH2	1328,72	665,36	665,43
SP-234	Ac-F$r8AYWEAc3cTle$A-NH2	1314,70	658,35	1315,62
SP-235	Ac-F$r8AYWEAc3cAdm$A-NH2	1392,75	697,38	697,47
SP-236	Ac-F$r8AYWEAc3chCha$A-NH2	1368,75	685,38	685,34
SP-237	Ac-F$r8AYWEAc3cCha$A-NH2	1354,73	678,37	678,38
SP-238	Ac-F$r8AYWEAc6cL$A-NH2	1356,75	679,38	679,42
SP-239	Ac-F$r8AYWEAc5cL$A-NH2	1342,73	672,37	672,46
SP-240	Ac-hF$r8AYWEAc3cL$A-NH2	1328,72	665,36	665,43
SP-241	Ac-Igl$r8AYWEAc3cL$A-NH2	1342,73	672,37	671,5
SP-243	Ac-F$r8AYWEAc3cF$A-NH2	1348,69	675,35	675,35
SP-244	Ac-F$r8AYWEAc3cIgl$A-NH2	1376,72	689,36	688,37
SP-245	Ac-F$r8AYWEAc3cCba$A-NH2	1326,70	664,35	664,47
SP-246	Ac-F$r8AYWEAc3cCpg$A-NH2	1326,70	664,35	664,39
SP-247	Ac-F$r8AhYWEAc3cL$A-NH2	1328,72	665,36	665,43
SP-248	Ac-F$r8AYWEAc3cL$Q-NH2	1371,72	686,86	1372,87
SP-249	Ac-F$r8AYWEAibL$A-NH2	1316,72	659,36	1318,18
SP-250	Ac-F$r8AYWEAL$A-NH2	1302,70	652,35	1303,75
SP-251	Ac-LAF$r8AYWAAL$A-NH2	1428,82	715,41	715,49
SP-252	Ac-LTF$r8HYWAAc3cL$S-NH2	1552,84	777,42	777,5
SP-253	Ac-NleTF$r8HYWAQL$S-NH2	1597,87	799,94	800,04
SP-254	Ac-VTF$r8HYWAQL$S-NH2	1583,85	792,93	793,04
SP-255	Ac-FTF$r8HYWAQL$S-NH2	1631,85	816,93	817,02
SP-256	Ac-WTF$r8HYWAQL$S-NH2	1670,86	836,43	836,85
SP-257	Ac-RTF$r8HYWAQL$S-NH2	1640,88	821,44	821,9
SP-258	Ac-KTF$r8HYWAQL$S-NH2	1612,88	807,44	807,91
SP-259	Ac-LNleF$r8HYWAQL$S-NH2	1609,90	805,95	806,43
SP-260	Ac-LVF$r8HYWAQL$S-NH2	1595,89	798,95	798,93
SP-261	Ac-LFF$r8HYWAQL$S-NH2	1643,89	822,95	823,38
SP-262	Ac-LWF$r8HYWAQL$S-NH2	1682,90	842,45	842,55
SP-263	Ac-LRF$r8HYWAQL$S-NH2	1652,92	827,46	827,52
SP-264	Ac-LKF$r8HYWAQL$S-NH2	1624,91	813,46	813,51
SP-265	Ac-LTF$r8NleYWAQL$S-NH2	1573,89	787,95	788,05
SP-266	Ac-LTF$r8VYWAQL$S-NH2	1559,88	780,94	780,98
SP-267	Ac-LTF$r8FYWAQL$S-NH2	1607,88	804,94	805,32
SP-268	Ac-LTF$r8WYWAQL$S-NH2	1646,89	824,45	824,86
SP-269	Ac-LTF$r8RYWAQL$S-NH2	1616,91	809,46	809,51
SP-270	Ac-LTF$r8KYWAQL$S-NH2	1588,90	795,45	795,48
SP-271	Ac-LTF$r8HNleWAQL$S-NH2	1547,89	774,95	774,98
SP-272	Ac-LTF$r8HVWAQL$S-NH2	1533,87	767,94	767,95
SP-273	Ac-LTF$r8HFWAQL$S-NH2	1581,87	791,94	792,3
SP-274	Ac-LTF$r8HWWAQL$S-NH2	1620,88	811,44	811,54
SP-275	Ac-LTF$r8HRWAQL$S-NH2	1590,90	796,45	796,52
SP-276	Ac-LTF$r8HKWAQL$S-NH2	1562,90	782,45	782,53
SP-277	Ac-LTF$r8HYWNleQL$S-NH2	1639,91	820,96	820,98
SP-278	Ac-LTF$r8HYWVQL$S-NH2	1625,90	813,95	814,03
SP-279	Ac-LTF$r8HYWFQL$S-NH2	1673,90	837,95	838,03
SP-280	Ac-LTF$r8HYWWQL$S-NH2	1712,91	857,46	857,5
SP-281	Ac-LTF$r8HYWKQL$S-NH2	1654,92	828,46	828,49
SP-282	Ac-LTF$r8HYWANleL$S-NH2	1582,89	792,45	792,52
SP-283	Ac-LTF$r8HYWAVL$S-NH2	1568,88	785,44	785,49
SP-284	Ac-LTF$r8HYWAFL$S-NH2	1616,88	809,44	809,47
SP-285	Ac-LTF$r8HYWAWL$S-NH2	1655,89	828,95	829
SP-286	Ac-LTF$r8HYWARL$S-NH2	1625,91	813,96	813,98
SP-287	Ac-LTF$r8HYWAQL$Nle-NH2	1623,92	812,96	813,39
SP-288	Ac-LTF$r8HYWAQL$V-NH2	1609,90	805,95	805,99
SP-289	Ac-LTF$r8HYWAQL$F-NH2	1657,90	829,95	830,26
SP-290	Ac-LTF$r8HYWAQL$W-NH2	1696,91	849,46	849,5
SP-291	Ac-LTF$r8HYWAQL$R-NH2	1666,94	834,47	834,56
SP-292	Ac-LTF$r8HYWAQL$K-NH2	1638,93	820,47	820,49
SP-293	Ac-Q$r8QQTFSN$WRLLAibQN-NH2	2080,12	1041,06	1041,54
SP-294	Ac-QSQQ$r8FSNLWR$LAibQN-NH2	2066,11	1034,06	1034,58
SP-295	Ac-LT2Pal$r8HYWAQL$S-NH2	1598,86	800,43	800,49
SP-296	Ac-LT3Pal$r8HYWAQL$S-NH2	1598,86	800,43	800,49
SP-297	Ac-LT4Pal$r8HYWAQL$S-NH2	1598,86	800,43	800,49
SP-298	Ac-LTF2CF3$r8HYWAQL$S-NH2	1665,85	833,93	834,01
SP-299	Ac-LTF2CN$r8HYWAQL$S-NH2	1622,86	812,43	812,47
SP-300	Ac-LTF2Me$r8HYWAQL$S-NH2	1611,88	806,94	807
SP-301	Ac-LTF3Cl$r8HYWAQL$S-NH2	1631,83	816,92	816,99
SP-302	Ac-LTF4CF3$r8HYWAQL$S-NH2	1665,85	833,93	833,94
SP-303	Ac-LTF4tBu$r8HYWAQL$S-NH2	1653,93	827,97	828,02
SP-304	Ac-LTF5F$r8HYWAQL$S-NH2	1687,82	844,91	844,96
SP-305	Ac-LTF$r8HY3BthAAQL$S-NH2	1614,83	808,42	808,48
SP-306	Ac-LTF2Br$r8HYWAQL$S-NH2	1675,78	838,89	838,97
SP-307	Ac-LTF4Br$r8HYWAQL$S-NH2	1675,78	838,89	839,86
SP-308	Ac-LTF2Cl$r8HYWAQL$S-NH2	1631,83	816,92	816,99
SP-309	Ac-LTF4Cl$r8HYWAQL$S-NH2	1631,83	816,92	817,36
SP-310	Ac-LTF3CN$r8HYWAQL$S-NH2	1622,86	812,43	812,47
SP-311	Ac-LTF4CN$r8HYWAQL$S-NH2	1622,86	812,43	812,47
SP-312	Ac-LTF34Cl2$r8HYWAQL$S-NH2	1665,79	833,90	833,94
SP-313	Ac-LTF34F2$r8HYWAQL$S-NH2	1633,85	817,93	817,95
SP-314	Ac-LTF35F2$r8HYWAQL$S-NH2	1633,85	817,93	817,95
SP-315	Ac-LTDip$r8HYWAQL$S-NH2	1673,90	837,95	838,01
SP-316	Ac-LTF2F$r8HYWAQL$S-NH2	1615,86	808,93	809
SP-317	Ac-LTF3F$r8HYWAQL$S-NH2	1615,86	808,93	809
SP-318	Ac-LTF4F$r8HYWAQL$S-NH2	1615,86	808,93	809
SP-319	Ac-LTF4I$r8HYWAQL$S-NH2	1723,76	862,88	862,94
SP-320	Ac-LTF3Me$r8HYWAQL$S-NH2	1611,88	806,94	807,07
SP-321	Ac-LTF4Me$r8HYWAQL$S-NH2	1611,88	806,94	807
SP-322	Ac-LT1Nal$r8HYWAQL$S-NH2	1647,88	824,94	824,98
SP-323	Ac-LT2Nal$r8HYWAQL$S-NH2	1647,88	824,94	825,06
SP-324	Ac-LTF3CF3$r8HYWAQL$S-NH2	1665,85	833,93	834,01
SP-325	Ac-LTF4NO2$r8HYWAQL$S-NH2	1642,85	822,43	822,46
SP-326	Ac-LTF3NO2$r8HYWAQL$S-NH2	1642,85	822,43	822,46
SP-327	Ac-LTF$r82ThiYWAQL$S-NH2	1613,83	807,92	807,96
SP-328	Ac-LTF$r8HBipWAQL$S-NH2	1657,90	829,95	830,01
SP-329	Ac-LTF$r8HF4tBuWAQL$S-NH2	1637,93	819,97	820,02
SP-330	Ac-LTF$r8HF4CF3WAQL$S-NH2	1649,86	825,93	826,02
SP-331	Ac-LTF$r8HF4ClWAQL$S-NH2	1615,83	808,92	809,37
SP-332	Ac-LTF$r8HF4MeWAQL$S-NH2	1595,89	798,95	799,01
SP-333	Ac-LTF$r8HF4BrWAQL$S-NH2	1659,78	830,89	830,98
SP-334	Ac-LTF$r8HF4CNWAQL$S-NH2	1606,87	804,44	804,56
SP-335	Ac-LTF$r8HF4NO2WAQL$S-NH2	1626,86	814,43	814,55
SP-336	Ac-LTF$r8H1NalWAQL$S-NH2	1631,89	816,95	817,06
SP-337	Ac-LTF$r8H2NalWAQL$S-NH2	1631,89	816,95	816,99
SP-338	Ac-LTF$r8HWAQL$S-NH2	1434,80	718,40	718,49
SP-339	Ac-LTF$r8HY1NalAQL$S-NH2	1608,87	805,44	805,52
SP-340	Ac-LTF$r8HY2NalAQL$S-NH2	1608,87	805,44	805,52
SP-341	Ac-LTF$r8HYWAQI$S-NH2	1597,87	799,94	800,07
SP-342	Ac-LTF$r8HYWAQNle$S-NH2	1597,87	799,94	800,44
SP-343	Ac-LTF$er8HYWAQL$eA-NH2	1581,87	791,94	791,98
SP-344	Ac-LTF$r8HYWAQL$Abu-NH2	1595,89	798,95	799,03
SP-345	Ac-LTF$r8HYWAbuQL$S-NH2	1611,88	806,94	804,47
SP-346	Ac-LAF$r8HYWAQL$S-NH2	1567,86	784,93	785,49
SP-347	Ac-LTF$r8NLWANleL$Q-NH2	1550,92	776,46	777,5
SP-348	Ac-LTF$r8ALWANleL$Q-NH2	1507,92	754,96	755,52
SP-349	Ac-LAF$r8NLWANleL$Q-NH2	1520,91	761,46	762,48
SP-350	Ac-F$r8AYWAAc3cL$A-NH2	1256,70	629,35	1257,56
SP-351	Ac-LTF$r8AYWAAL$S-NH2	1474,82	738,41	738,55
SP-352	Ac-LVF$r8AYWAQL$S-NH2	1529,87	765,94	766
SP-353	Ac-LTF$r8AYWAbuQL$S-NH2	1545,86	773,93	773,92
SP-354	Ac-LTF$r8AYWNleQL$S-NH2	1573,89	787,95	788,17
SP-355	Ac-LTF$r8AbuYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	773,99
SP-356	Ac-LTF$r8AYWHQL$S-NH2	1597,87	799,94	799,97
SP-357	Ac-LTF$r8AYWKQL$S-NH2	1588,90	795,45	795,53
SP-358	Ac-LTF$r8AYWOQL$S-NH2	1574,89	788,45	788,5
SP-359	Ac-LTF$r8AYWRQL$S-NH2	1616,91	809,46	809,51
SP-360	Ac-LTF$r8AYWSQL$S-NH2	1547,84	774,92	774,96
SP-361	Ac-LTF$r8AYWRAL$S-NH2	1559,89	780,95	780,95
SP-362	Ac-LTF$r8AYWRQL$A-NH2	1600,91	801,46	801,52
SP-363	Ac-LTF$r8AYWRAL$A-NH2	1543,89	772,95	773,03
SP-364	Ac-LTF$r5HYWAQL$s8S-NH2	1597,87	799,94	799,97
SP-365	Ac-LTF$HYWAQL$r8S-NH2	1597,87	799,94	799,97
SP-366	Ac-LTF$r8HYWAAL$S-NH2	1540,84	771,42	771,48
SP-367	Ac-LTF$r8HYWAAbuL$S-NH2	1554,86	778,43	778,51
SP-368	Ac-LTF$r8HYWALL$S-NH2	1582,89	792,45	792,49
SP-369	Ac-F$r8AYWHAL$A-NH2	1310,72	656,36	656,4
SP-370	Ac-F$r8AYWAAL$A-NH2	1244,70	623,35	1245,61
SP-371	Ac-F$r8AYWSAL$A-NH2	1260,69	631,35	1261,6
SP-372	Ac-F$r8AYWRAL$A-NH2	1329,76	665,88	1330,72
SP-373	Ac-F$r8AYWKAL$A-NH2	1301,75	651,88	1302,67
SP-374	Ac-F$r8AYWOAL$A-NH2	1287,74	644,87	1289,13
SP-375	Ac-F$r8VYWEAc3cL$A-NH2	1342,73	672,37	1343,67
SP-376	Ac-F$r8FYWEAc3cL$A-NH2	1390,73	696,37	1392,14
SP-377	Ac-F$r8WYWEAc3cL$A-NH2	1429,74	715,87	1431,44
SP-378	Ac-F$r8RYWEAc3cL$A-NH2	1399,77	700,89	700,95
SP-379	Ac-F$r8KYWEAc3cL$A-NH2	1371,76	686,88	686,97
SP-380	Ac-F$r8ANleWEAc3cL$A-NH2	1264,72	633,36	1265,59
SP-381	Ac-F$r8AVWEAc3cL$A-NH2	1250,71	626,36	1252,2
SP-382	Ac-F$r8AFWEAc3cL$A-NH2	1298,71	650,36	1299,64
SP-383	Ac-F$r8AWWEAc3cL$A-NH2	1337,72	669,86	1338,64
SP-384	Ac-F$r8ARWEAc3cL$A-NH2	1307,74	654,87	655
SP-385	Ac-F$r8AKWEAc3cL$A-NH2	1279,73	640,87	641,01
SP-386	Ac-F$r8AYWVAc3cL$A-NH2	1284,73	643,37	643,38
SP-387	Ac-F$r8AYWFAc3cL$A-NH2	1332,73	667,37	667,43
SP-388	Ac-F$r8AYWWAc3cL$A-NH2	1371,74	686,87	686,97
SP-389	Ac-F$r8AYWRAc3cL$A-NH2	1341,76	671,88	671,94
SP-390	Ac-F$r8AYWKAc3cL$A-NH2	1313,75	657,88	657,88
SP-391	Ac-F$r8AYWEVL$A-NH2	1330,73	666,37	666,47
SP-392	Ac-F$r8AYWEFL$A-NH2	1378,73	690,37	690,44
SP-393	Ac-F$r8AYWEWL$A-NH2	1417,74	709,87	709,91
SP-394	Ac-F$r8AYWERL$A-NH2	1387,77	694,89	1388,66
SP-395	Ac-F$r8AYWEKL$A-NH2	1359,76	680,88	1361,21
SP-396	Ac-F$r8AYWEAc3cL$V-NH2	1342,73	672,37	1343,59
SP-397	Ac-F$r8AYWEAc3cL$F-NH2	1390,73	696,37	1392,58
SP-398	Ac-F$r8AYWEAc3cL$W-NH2	1429,74	715,87	1431,29
SP-399	Ac-F$r8AYWEAc3cL$R-NH2	1399,77	700,89	700,95
SP-400	Ac-F$r8AYWEAc3cL$K-NH2	1371,76	686,88	686,97
SP-401	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AV-NH2	1413,77	707,89	707,91
SP-402	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AF-NH2	1461,77	731,89	731,96
SP-403	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AW-NH2	1500,78	751,39	751,5
SP-404	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AR-NH2	1470,80	736,40	736,47
SP-405	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AK-NH2	1442,80	722,40	722,41
SP-406	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AH-NH2	1451,76	726,88	726,93
SP-407	Ac-LTF2NO2$r8HYWAQL$S-NH2	1642,85	822,43	822,54
SP-408	Ac-LTA$r8HYAAQL$S-NH2	1406,79	704,40	704,5
SP-409	Ac-LTF$r8HYAAQL$S-NH2	1482,82	742,41	742,47
SP-410	Ac-QSQQTF$r8NLWALL$AN-NH2	1966,07	984,04	984,38
SP-411	Ac-QAibQQTF$r8NLWALL$AN-NH2	1964,09	983,05	983,42
SP-412	Ac-QAibQQTF$r8ALWALL$AN-NH2	1921,08	961,54	961,59
SP-413	Ac-AAAATF$r8AAWAAL$AA-NH2	1608,90	805,45	805,52
SP-414	Ac-F$r8AAWRAL$Q-NH2	1294,76	648,38	648,48
SP-415	Ac-TF$r8AAWAAL$Q-NH2	1310,74	656,37	1311,62
SP-416	Ac-TF$r8AAWRAL$A-NH2	1338,78	670,39	670,46
SP-417	Ac-VF$r8AAWRAL$Q-NH2	1393,82	697,91	697,99
SP-418	Ac-AF$r8AAWAAL$A-NH2	1223,71	612,86	1224,67
SP-420	Ac-TF$r8AAWKAL$Q-NH2	1367,80	684,90	684,97
SP-421	Ac-TF$r8AAWOAL$Q-NH2	1353,78	677,89	678,01
SP-422	Ac-TF$r8AAWSAL$Q-NH2	1326,73	664,37	664,47
SP-423	Ac-LTF$r8AAWRAL$Q-NH2	1508,89	755,45	755,49
SP-424	Ac-F$r8AYWAQL$A-NH2	1301,72	651,86	651,96
SP-425	Ac-F$r8AWWAAL$A-NH2	1267,71	634,86	634,87
SP-426	Ac-F$r8AWWAQL$A-NH2	1324,73	663,37	663,43
SP-427	Ac-F$r8AYWEAL$-NH2	1231,66	616,83	1232,93
SP-428	Ac-F$r8AYWAAL$-NH2	1173,66	587,83	1175,09
SP-429	Ac-F$r8AYWKAL$-NH2	1230,72	616,36	616,44
SP-430	Ac-F$r8AYWOAL$-NH2	1216,70	609,35	609,48
SP-431	Ac-F$r8AYWQAL$-NH2	1230,68	616,34	616,44
SP-432	Ac-F$r8AYWAQL$-NH2	1230,68	616,34	616,37
SP-433	Ac-F$r8HYWDQL$S-NH2	1427,72	714,86	714,86
SP-434	Ac-F$r8HFWEQL$S-NH2	1425,74	713,87	713,98
SP-435	Ac-F$r8AYWHQL$S-NH2	1383,73	692,87	692,96
SP-436	Ac-F$r8AYWKQL$S-NH2	1374,77	688,39	688,45
SP-437	Ac-F$r8AYWOQL$S-NH2	1360,75	681,38	681,49
SP-438	Ac-F$r8HYWSQL$S-NH2	1399,73	700,87	700,95
SP-439	Ac-F$r8HWWEQL$S-NH2	1464,76	733,38	733,44
SP-440	Ac-F$r8HWWAQL$S-NH2	1406,75	704,38	704,43
SP-441	Ac-F$r8AWWHQL$S-NH2	1406,75	704,38	704,43
SP-442	Ac-F$r8AWWKQL$S-NH2	1397,79	699,90	699,92
SP-443	Ac-F$r8AWWOQL$S-NH2	1383,77	692,89	692,96
SP-444	Ac-F$r8HWWSQL$S-NH2	1422,75	712,38	712,42
SP-445	Ac-LTF$r8NYWANleL$Q-NH2	1600,90	801,45	801,52
SP-446	Ac-LTF$r8NLWAQL$Q-NH2	1565,90	783,95	784,06
SP-447	Ac-LTF$r8NYWANleL$A-NH2	1543,88	772,94	773,03
SP-448	Ac-LTF$r8NLWAQL$A-NH2	1508,88	755,44	755,49
SP-449	Ac-LTF$r8AYWANleL$Q-NH2	1557,90	779,95	780,06
SP-450	Ac-LTF$r8ALWAQL$Q-NH2	1522,89	762,45	762,45
SP-451	Ac-LAF$r8NYWANleL$Q-NH2	1570,89	786,45	786,5
SP-452	Ac-LAF$r8NLWAQL$Q-NH2	1535,89	768,95	769,03
SP-453	Ac-LAF$r8AYWANleL$A-NH2	1470,86	736,43	736,47
SP-454	Ac-LAF$r8ALWAQL$A-NH2	1435,86	718,93	719,01
SP-455	Ac-LAF$r8AYWAAL$A-NH2	1428,82	715,41	715,41
SP-456	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AAib-NH2	1399,75	700,88	700,95
SP-457	Ac-F$r8AYWAQL$AA-NH2	1372,75	687,38	687,78
SP-458	Ac-F$r8AYWAAc3cL$AA-NH2	1327,73	664,87	664,84
SP-459	Ac-F$r8AYWSAc3cL$AA-NH2	1343,73	672,87	672,9
SP-460	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AS-NH2	1401,73	701,87	701,84
SP-461	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AT-NH2	1415,75	708,88	708,87
SP-462	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AL-NH2	1427,79	714,90	714,94
SP-463	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AQ-NH2	1442,76	722,38	722,41
SP-464	Ac-F$r8AFWEAc3cL$AA-NH2	1369,74	685,87	685,93
SP-465	Ac-F$r8AWWEAc3cL$AA-NH2	1408,75	705,38	705,39
SP-466	Ac-F$r8AYWEAc3cL$SA-NH2	1401,73	701,87	701,99
SP-467	Ac-F$r8AYWEAL$AA-NH2	1373,74	687,87	687,93
SP-468	Ac-F$r8AYWENleL$AA-NH2	1415,79	708,90	708,94
SP-469	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AbuA-NH2	1399,75	700,88	700,95
SP-470	Ac-F$r8AYWEAc3cL$NleA-NH2	1427,79	714,90	714,86
SP-471	Ac-F$r8AYWEAibL$NleA-NH2	1429,80	715,90	715,97
SP-472	Ac-F$r8AYWEAL$NleA-NH2	1415,79	708,90	708,94
SP-473	Ac-F$r8AYWENleL$NleA-NH2	1457,83	729,92	729,96
SP-474	Ac-F$r8AYWEAibL$Abu-NH2	1330,73	666,37	666,39
SP-475	Ac-F$r8AYWENleL$Abu-NH2	1358,76	680,38	680,39
SP-476	Ac-F$r8AYWEAL$Abu-NH2	1316,72	659,36	659,36
SP-477	Ac-LTF$r8AFWAQL$S-NH2	1515,85	758,93	759,12
SP-478	Ac-LTF$r8AWWAQL$S-NH2	1554,86	778,43	778,51
SP-479	Ac-LTF$r8AYWAQI$S-NH2	1531,84	766,92	766,96
SP-480	Ac-LTF$r8AYWAQNle$S-NH2	1531,84	766,92	766,96
SP-481	Ac-LTF$r8AYWAQL$SA-NH2	1602,88	802,44	802,48
SP-482	Ac-LTF$r8AWWAQL$A-NH2	1538,87	770,44	770,89
SP-483	Ac-LTF$r8AYWAQI$A-NH2	1515,85	758,93	759,42
SP-484	Ac-LTF$r8AYWAQNle$A-NH2	1515,85	758,93	759,42
SP-485	Ac-LTF$r8AYWAQL$AA-NH2	1586,89	794,45	794,94
SP-486	Ac-LTF$r8HWWAQL$S-NH2	1620,88	811,44	811,47
SP-487	Ac-LTF$r8HRWAQL$S-NH2	1590,90	796,45	796,52
SP-488	Ac-LTF$r8HKWAQL$S-NH2	1562,90	782,45	782,53
SP-489	Ac-LTF$r8HYWAQL$W-NH2	1696,91	849,46	849,5
SP-491	Ac-F$r8AYWAbuAL$A-NH2	1258,71	630,36	630,5
SP-492	Ac-F$r8AbuYWEAL$A-NH2	1316,72	659,36	659,51
SP-493	Ac-NlePRF%r8NYWRLL%QN-NH2	1954,13	978,07	978,54
SP-494	Ac-TSF%r8HYWAQL%S-NH2	1573,83	787,92	787,98
SP-495	Ac-LTF%r8AYWAQL%S-NH2	1533,86	767,93	768
SP-496	Ac-HTF$r8HYWAQL$S-NH2	1621,84	811,92	811,96
SP-497	Ac-LHF$r8HYWAQL$S-NH2	1633,88	817,94	818,02
SP-498	Ac-LTF$r8HHWAQL$S-NH2	1571,86	786,93	786,94
SP-499	Ac-LTF$r8HYWHQL$S-NH2	1663,89	832,95	832,38
SP-500	Ac-LTF$r8HYWAHL$S-NH2	1606,87	804,44	804,48
SP-501	Ac-LTF$r8HYWAQL$H-NH2	1647,89	824,95	824,98
SP-502	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHPr	1639,91	820,96	820,98
SP-503	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHsBu	1653,93	827,97	828,02
SP-504	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHiBu	1653,93	827,97	828,02
SP-505	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHBn	1687,91	844,96	844,44
SP-506	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHPe	1700,92	851,46	851,99
SP-507	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHChx	1679,94	840,97	841,04
SP-508	Ac-ETF$r8AYWAQL$S-NH2	1547,80	774,90	774,96
SP-509	Ac-STF$r8AYWAQL$S-NH2	1505,79	753,90	753,94
SP-510	Ac-LEF$r8AYWAQL$S-NH2	1559,84	780,92	781,25
SP-511	Ac-LSF$r8AYWAQL$S-NH2	1517,83	759,92	759,93
SP-512	Ac-LTF$r8EYWAQL$S-NH2	1589,85	795,93	795,97
SP-513	Ac-LTF$r8SYWAQL$S-NH2	1547,84	774,92	774,96
SP-514	Ac-LTF$r8AYWEQL$S-NH2	1589,85	795,93	795,9
SP-515	Ac-LTF$r8AYWAEL$S-NH2	1532,83	767,42	766,96
SP-516	Ac-LTF$r8AYWASL$S-NH2	1490,82	746,41	746,46
SP-517	Ac-LTF$r8AYWAQL$E-NH2	1573,85	787,93	787,98
SP-518	Ac-LTF2CN$r8HYWAQL$S-NH2	1622,86	812,43	812,47
SP-519	Ac-LTF3Cl$r8HYWAQL$S-NH2	1631,83	816,92	816,99
SP-520	Ac-LTDip$r8HYWAQL$S-NH2	1673,90	837,95	838,01
SP-521	Ac-LTF$r8HYWAQTle$S-NH2	1597,87	799,94	800,04
SP-522	Ac-F$r8AY6clWEAL$A-NH2	1336,66	669,33	1338,56
SP-523	Ac-F$r8AYdl6brWEAL$A-NH2	1380,61	691,31	692,2
SP-524	Ac-F$r8AYdl6fWEAL$A-NH2	1320,69	661,35	1321,61
SP-525	Ac-F$r8AYdl4mWEAL$A-NH2	1316,72	659,36	659,36
SP-526	Ac-F$r8AYdl5clWEAL$A-NH2	1336,66	669,33	669,35
SP-527	Ac-F$r8AYdl7mWEAL$A-NH2	1316,72	659,36	659,36
SP-528	Ac-LTF%r8HYWAQL%A-NH2	1583,89	792,95	793,01
SP-529	Ac-LTF$r8HCouWAQL$S-NH2	1679,87	840,94	841,38
SP-530	Ac-LTFEHCouWAQLTS-NH2	1617,75	809,88	809,96
SP-531	Ac-LTA$r8HCouWAQL$S-NH2	1603,84	802,92	803,36
SP-532	Ac-F$r8AYWEAL$AbuA-NH2	1387,75	694,88	694,88
SP-533	Ac-F$r8AYWEAI$AA-NH2	1373,74	687,87	687,93
SP-534	Ac-F$r8AYWEANle$AA-NH2	1373,74	687,87	687,93
SP-535	Ac-F$r8AYWEAmlL$AA-NH2	1429,80	715,90	715,97
SP-536	Ac-F$r8AYWQAL$AA-NH2	1372,75	687,38	687,48
SP-537	Ac-F$r8AYWAAL$AA-NH2	1315,73	658,87	658,92
SP-538	Ac-F$r8AYWAbuAL$AA-NH2	1329,75	665,88	665,95
SP-539	Ac-F$r8AYWNleAL$AA-NH2	1357,78	679,89	679,94
SP-540	Ac-F$r8AbuYWEAL$AA-NH2	1387,75	694,88	694,96
SP-541	Ac-F$r8NleYWEAL$AA-NH2	1415,79	708,90	708,94
SP-542	Ac-F$r8FYWEAL$AA-NH2	1449,77	725,89	725,97
SP-543	Ac-LTF$r8HYWAQhL$S-NH2	1611,88	806,94	807
SP-544	Ac-LTF$r8HYWAQAdm$S-NH2	1675,91	838,96	839,04
SP-545	Ac-LTF$r8HYWAQIgl$S-NH2	1659,88	830,94	829,94
SP-546	Ac-F$r8AYWAQL$AA-NH2	1372,75	687,38	687,48
SP-547	Ac-LTF$r8ALWAQL$Q-NH2	1522,89	762,45	762,52
SP-548	Ac-F$r8AYWEAL$AA-NH2	1373,74	687,87	687,93
SP-549	Ac-F$r8AYWENleL$AA-NH2	1415,79	708,90	708,94
SP-550	Ac-F$r8AYWEAibL$Abu-NH2	1330,73	666,37	666,39
SP-551	Ac-F$r8AYWENleL$Abu-NH2	1358,76	680,38	680,38
SP-552	Ac-F$r8AYWEAL$Abu-NH2	1316,72	659,36	659,36
SP-553	Ac-F$r8AYWEAc3cL$AbuA-NH2	1399,75	700,88	700,95
SP-554	Ac-F$r8AYWEAc3cL$NleA-NH2	1427,79	714,90	715,01
SP-555	H-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1489,83	745,92	745,95
SP-556	mdPEG3-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1679,92	840,96	840,97
SP-557	mdPEG7-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1856,02	929,01	929,03
SP-558	Ac-F$r8ApmpEt6clWEAL$A-NH2	1470,71	736,36	788,17
SP-559	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQL$S-NH2	1565,81	783,91	809,18
SP-560	Ac-LTF3Cl$r8HYWAQL$A-NH2	1615,83	808,92	875,24
SP-561	Ac-LTF3Cl$r8HYWWQL$S-NH2	1746,87	874,44	841,65
SP-562	Ac-LTF3Cl$r8AYWWQL$S-NH2	1680,85	841,43	824,63
SP-563	Ac-LTF$r8AYWWQL$S-NH2	1646,89	824,45	849,98
SP-564	Ac-LTF$r8HYWWQL$A-NH2	1696,91	849,46	816,67
SP-565	Ac-LTF$r8AYWWQL$A-NH2	1630,89	816,45	776,15
SP-566	Ac-LTF4F$r8AYWAQL$S-NH2	1549,83	775,92	776,15
SP-567	Ac-LTF2F$r8AYWAQL$S-NH2	1549,83	775,92	776,15
SP-568	Ac-LTF3F$r8AYWAQL$S-NH2	1549,83	775,92	785,12
SP-569	Ac-LTF34F2$r8AYWAQL$S-NH2	1567,83	784,92	785,12
SP-570	Ac-LTF35F2$r8AYWAQL$S-NH2	1567,83	784,92	1338,74
SP-571	Ac-F3Cl$r8AYWEAL$A-NH2	1336,66	669,33	705,28
SP-572	Ac-F3Cl$r8AYWEAL$AA-NH2	1407,70	704,85	680,11
SP-573	Ac-F$r8AY6clWEAL$AA-NH2	1407,70	704,85	736,83
SP-574	Ac-F$r8AY6clWEAL$-NH2	1265,63	633,82	784,1
SP-575	Ac-LTF$r8HYWAQLSt/S-NH2	16,03	9,02	826,98
SP-576	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHsBu	1653,93	827,97	828,02
SP-577	Ac-STF$r8AYWAQL$S-NH2	1505,79	753,90	753,94
SP-578	Ac-LTF$r8AYWAEL$S-NH2	1532,83	767,42	767,41
SP-579	Ac-LTF$r8AYWAQL$E-NH2	1573,85	787,93	787,98
SP-580	mdPEG3-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1679,92	840,96	840,97
SP-581	Ac-LTF$r8AYWAQhL$S-NH2	1545,86	773,93	774,31
SP-583	Ac-LTF$r8AYWAQCha$S-NH2	1571,88	786,94	787,3
SP-584	Ac-LTF$r8AYWAQChg$S-NH2	1557,86	779,93	780,4
SP-585	Ac-LTF$r8AYWAQCba$S-NH2	1543,84	772,92	780,13
SP-586	Ac-LTF$r8AYWAQF$S-NH2	1565,83	783,92	784,2
SP-587	Ac-LTF4F$r8HYWAQhL$S-NH2	1629,87	815,94	815,36
SP-588	Ac-LTF4F$r8HYWAQCha$S-NH2	1655,89	828,95	828,39
SP-589	Ac-LTF4F$r8HYWAQChg$S-NH2	1641,87	821,94	821,35
SP-590	Ac-LTF4F$r8HYWAQCba$S-NH2	1627,86	814,93	814,32
SP-591	Ac-LTF4F$r8AYWAQhL$S-NH2	1563,85	782,93	782,36
SP-592	Ac-LTF4F$r8AYWAQCha$S-NH2	1589,87	795,94	795,38
SP-593	Ac-LTF4F$r8AYWAQChg$S-NH2	1575,85	788,93	788,35
SP-594	Ac-LTF4F$r8AYWAQCba$S-NH2	1561,83	781,92	781,39
SP-595	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQhL$S-NH2	1579,82	790,91	790,35
SP-596	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCha$S-NH2	1605,84	803,92	803,67
SP-597	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQChg$S-NH2	1591,82	796,91	796,34
SP-598	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCba$S-NH2	1577,81	789,91	789,39
SP-599	Ac-LTF$r8AYWAQhF$S-NH2	1579,84	790,92	791,14
SP-600	Ac-LTF$r8AYWAQF3CF3$S-NH2	1633,82	817,91	818,15
SP-601	Ac-LTF$r8AYWAQF3Me$S-NH2	1581,86	791,93	791,32
SP-602	Ac-LTF$r8AYWAQ1Nal$S-NH2	1615,84	808,92	809,18
SP-603	Ac-LTF$r8AYWAQBip$S-NH2	1641,86	821,93	822,13
SP-604	Ac-LTF$r8FYWAQL$A-NH2	1591,88	796,94	797,33
SP-605	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHAm	1667,94	834,97	835,92
SP-606	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHiAm	1667,94	834,97	835,55
SP-607	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr3Ph	1715,94	858,97	859,79
SP-608	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnBu3,3Me	1681,96	841,98	842,49
SP-610	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr	1639,91	820,96	821,58
SP-611	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnEt2Ch	1707,98	854,99	855,35
SP-612	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHHex	1681,96	841,98	842,4
SP-613	Ac-LTF$r8AYWAQL$S-NHmdPeg2	1633,91	817,96	818,35
SP-614	Ac-LTF$r8AYWAQL$A-NHmdPeg2	1617,92	809,96	810,3
SP-615	Ac-LTF$r8AYWAQL$A-NHmdPeg4	1705,97	853,99	854,33
SP-616	Ac-F$r8AYdl4mWEAL$A-NH2	1316,72	659,36	659,44
SP-617	Ac-F$r8AYdl5clWEAL$A-NH2	1336,66	669,33	669,43
SP-618	Ac-LThF$r8AYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	774,11
SP-619	Ac-LT2Nal$r8AYWAQL$S-NH2	1581,86	791,93	792,43
SP-620	Ac-LTA$r8AYWAQL$S-NH2	1455,81	728,91	729,15
SP-621	Ac-LTF$r8AYWVQL$S-NH2	1559,88	780,94	781,24
SP-622	Ac-LTF$r8HYWAAL$A-NH2	1524,85	763,43	763,86
SP-623	Ac-LTF$r8VYWAQL$A-NH2	1543,88	772,94	773,37
SP-624	Ac-LTF$r8IYWAQL$S-NH2	1573,89	787,95	788,17
SP-625	Ac-FTF$r8VYWSQL$S-NH2	1609,85	805,93	806,22
SP-626	Ac-ITF$r8FYWAQL$S-NH2	1607,88	804,94	805,2
SP-627	Ac-2NalTF$r8VYWSQL$S-NH2	1659,87	830,94	831,2
SP-628	Ac-ITF$r8LYWSQL$S-NH2	1589,89	795,95	796,13
SP-629	Ac-FTF$r8FYWAQL$S-NH2	1641,86	821,93	822,13
SP-630	Ac-WTF$r8VYWAQL$S-NH2	1632,87	817,44	817,69
SP-631	Ac-WTF$r8WYWAQL$S-NH2	1719,88	860,94	861,36
SP-632	Ac-VTF$r8AYWSQL$S-NH2	1533,82	767,91	768,19
SP-633	Ac-WTF$r8FYWSQL$S-NH2	1696,87	849,44	849,7
SP-634	Ac-FTF$r8IYWAQL$S-NH2	1607,88	804,94	805,2
SP-635	Ac-WTF$r8VYWSQL$S-NH2	1648,87	825,44	824,8
SP-636	Ac-FTF$r8LYWSQL$S-NH2	1623,87	812,94	812,8
SP-637	Ac-YTF$r8FYWSQL$S-NH2	1673,85	837,93	837,8
SP-638	Ac-LTF$r8AY6clWEAL$A-NH2	1550,79	776,40	776,14
SP-639	Ac-LTF$r8AY6clWSQL$S-NH2	1581,80	791,90	791,68
SP-640	Ac-F$r8AY6clWSAL$A-NH2	1294,65	648,33	647,67
SP-641	Ac-F$r8AY6clWQAL$AA-NH2	1406,72	704,36	703,84
SP-642	Ac-LHF$r8AYWAQL$S-NH2	1567,86	784,93	785,21
SP-643	Ac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1531,84	766,92	767,17
SP-644	Ac-LTF$r8AHWAQL$S-NH2	1505,84	753,92	754,13
SP-645	Ac-LTF$r8AYWAHL$S-NH2	1540,84	771,42	771,61
SP-646	Ac-LTF$r8AYWAQL$H-NH2	1581,87	791,94	792,15
SP-647	H-LTF$r8AYWAQL$A-NH2	1473,84	737,92	737,29
SP-648	Ac-HHF$r8AYWAQL$S-NH2	1591,83	796,92	797,35
SP-649	Ac-aAibWTF$r8VYWSQL$S-NH2	1804,96	903,48	903,64
SP-650	Ac-AibWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1755,91	878,96	879,4
SP-651	Ac-AibAWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1826,95	914,48	914,7
SP-652	Ac-fWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1817,93	909,97	910,1
SP-653	Ac-AibWWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1941,99	972,00	972,2
SP-654	Ac-WTF$r8LYWSQL$S-NH2	1662,88	832,44	832,8
SP-655	Ac-WTF$r8NleYWSQL$S-NH2	1662,88	832,44	832,6
SP-656	Ac-LTF$r8AYWSQL$a-NH2	1531,84	766,92	767,2
SP-657	Ac-LTF$r8EYWARL$A-NH2	1601,90	801,95	802,1
SP-658	Ac-LTF$r8EYWAHL$A-NH2	1582,86	792,43	792,6
SP-659	Ac-aTF$r8AYWAQL$S-NH2	1489,80	745,90	746,08
SP-660	Ac-AibTF$r8AYWAQL$S-NH2	1503,81	752,91	753,11
SP-661	Ac-AmfTF$r8AYWAQL$S-NH2	1579,84	790,92	791,14
SP-662	Ac-AmwTF$r8AYWAQL$S-NH2	1618,86	810,43	810,66
SP-663	Ac-NmLTF$r8AYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	774,11
SP-664	Ac-LNmTF$r8AYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	774,11
SP-665	Ac-LSarF$r8AYWAQL$S-NH2	1501,83	751,92	752,18
SP-667	Ac-LGF$r8AYWAQL$S-NH2	1487,82	744,91	745,15
SP-668	Ac-LTNmF$r8AYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	774,2
SP-669	Ac-TF$r8AYWAQL$S-NH2	1418,76	710,38	710,64
SP-670	Ac-ETF$r8AYWAQL$A-NH2	1531,81	766,91	767,2
SP-671	Ac-LTF$r8EYWAQL$A-NH2	1573,85	787,93	788,1
SP-672	Ac-LT2Nal$r8AYWSQL$S-NH2	1597,85	799,93	800,4
SP-673	Ac-LTF$r8AYWAAL$S-NH2	1474,82	738,41	738,68
SP-674	Ac-LTF$r8AYWAQhCha$S-NH2	1585,89	793,95	794,19
SP-675	Ac-LTF$r8AYWAQChg$S-NH2	1557,86	779,93	780,97
SP-676	Ac-LTF$r8AYWAQCba$S-NH2	1543,84	772,92	773,19
SP-677	Ac-LTF$r8AYWAQF3CF3$S-NH2	1633,82	817,91	818,15
SP-678	Ac-LTF$r8AYWAQ1Nal$S-NH2	1615,84	808,92	809,18
SP-679	Ac-LTF$r8AYWAQBip$S-NH2	1641,86	821,93	822,32
SP-680	Ac-LT2Nal$r8AYWAQL$S-NH2	1581,86	791,93	792,15
SP-681	Ac-LTF$r8AYWVQL$S-NH2	1559,88	780,94	781,62
SP-682	Ac-LTF$r8AWWAQL$S-NH2	1554,86	778,43	778,65
SP-683	Ac-FTF$r8VYWSQL$S-NH2	1609,85	805,93	806,12
SP-684	Ac-ITF$r8FYWAQL$S-NH2	1607,88	804,94	805,2
SP-685	Ac-ITF$r8LYWSQL$S-NH2	1589,89	795,95	796,22
SP-686	Ac-FTF$r8FYWAQL$S-NH2	1641,86	821,93	822,41
SP-687	Ac-VTF$r8AYWSQL$S-NH2	1533,82	767,91	768,19
SP-688	Ac-LTF$r8AHWAQL$S-NH2	1505,84	753,92	754,31
SP-689	Ac-LTF$r8AYWAQL$H-NH2	1581,87	791,94	791,94
SP-690	Ac-LTF$r8AYWAHL$S-NH2	1540,84	771,42	771,61
SP-691	Ac-aAibWTF$r8VYWSQL$S-NH2	1804,96	903,48	903,9
SP-692	Ac-AibWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1755,91	878,96	879,5
SP-693	Ac-AibAWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1826,95	914,48	914,7
SP-694	Ac-fWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1817,93	909,97	910,2
SP-695	Ac-AibWWTF$r8HYWAQL$S-NH2	1941,99	972,00	972,7
SP-696	Ac-WTF$r8LYWSQL$S-NH2	1662,88	832,44	832,7
SP-697	Ac-WTF$r8NleYWSQL$S-NH2	1662,88	832,44	832,7
SP-698	Ac-LTF$r8AYWSQL$a-NH2	1531,84	766,92	767,2
SP-699	Ac-LTF$r8EYWARL$A-NH2	1601,90	801,95	802,2
SP-700	Ac-LTF$r8EYWAHL$A-NH2	1582,86	792,43	792,6
SP-701	Ac-aTF$r8AYWAQL$S-NH2	1489,80	745,90	746,1
SP-702	Ac-AibTF$r8AYWAQL$S-NH2	1503,81	752,91	753,2
SP-703	Ac-AmfTF$r8AYWAQL$S-NH2	1579,84	790,92	791,2
SP-704	Ac-AmwTF$r8AYWAQL$S-NH2	1618,86	810,43	810,7
SP-705	Ac-NmLTF$r8AYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	774,1
SP-706	Ac-LNmTF$r8AYWAQL$S-NH2	1545,86	773,93	774,4
SP-707	Ac-LSarF$r8AYWAQL$S-NH2	1501,83	751,92	752,1
SP-708	Ac-TF$r8AYWAQL$S-NH2	1418,76	710,38	710,8
SP-709	Ac-ETF$r8AYWAQL$A-NH2	1531,81	766,91	767,4
SP-710	Ac-LTF$r8EYWAQL$A-NH2	1573,85	787,93	788,2
SP-711	Ac-WTF$r8VYWSQL$S-NH2	1648,87	825,44	825,2
SP-713	Ac-YTF$r8FYWSQL$S-NH2	1673,85	837,93	837,3
SP-714	Ac-F$r8AY6clWSAL$A-NH2	1294,65	648,33	647,74
SP-715	Ac-ETF$r8EYWVQL$S-NH2	1633,84	817,92	817,36
SP-716	Ac-ETF$r8EHWAQL$A-NH2	1563,81	782,91	782,36
SP-717	Ac-ITF$r8EYWAQL$S-NH2	1589,85	795,93	795,38
SP-718	Ac-ITF$r8EHWVQL$A-NH2	1575,88	788,94	788,42
SP-719	Ac-ITF$r8EHWAQL$S-NH2	1563,85	782,93	782,43
SP-720	Ac-LTF4F$r8AYWAQCba$S-NH2	1561,83	781,92	781,32
SP-721	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQhL$S-NH2	1579,82	790,91	790,64
SP-722	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCha$S-NH2	1605,84	803,92	803,37
SP-723	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQChg$S-NH2	1591,82	796,91	796,27
SP-724	Ac-LTF3Cl$r8AYWAQCba$S-NH2	1577,81	789,91	789,83
SP-725	Ac-LTF$r8AY6clWSQL$S-NH2	1581,80	791,90	791,75
SP-726	Ac-LTF4F$r8HYWAQhL$S-NH2	1629,87	815,94	815,36
SP-727	Ac-LTF4F$r8HYWAQCba$S-NH2	1627,86	814,93	814,32
SP-728	Ac-LTF4F$r8AYWAQhL$S-NH2	1563,85	782,93	782,36
SP-729	Ac-LTF4F$r8AYWAQChg$S-NH2	1575,85	788,93	788,35
SP-730	Ac-ETF$r8EYWVAL$S-NH2	1576,82	789,41	788,79
SP-731	Ac-ETF$r8EHWAAL$A-NH2	1506,79	754,40	754,8
SP-732	Ac-ITF$r8EYWAAL$S-NH2	1532,83	767,42	767,75
SP-733	Ac-ITF$r8EHWVAL$A-NH2	1518,86	760,43	760,81
SP-734	Ac-ITF$r8EHWAAL$S-NH2	1506,82	754,41	754,8
SP-735	Pam-LTF$r8EYWAQL$S-NH2	1786,07	894,04	894,48
SP-736	Pam-ETF$r8EYWAQL$S-NH2	1802,03	902,02	902,34
SP-737	Ac-LTF$r8AYWLQL$S-NH2	1573,89	787,95	787,39
SP-738	Ac-LTF$r8EYWLQL$S-NH2	1631,90	816,95	817,33
SP-739	Ac-LTF$r8EHWLQL$S-NH2	1605,89	803,95	804,29
SP-740	Ac-LTF$r8VYWAQL$S-NH2	1559,88	780,94	781,34
SP-741	Ac-LTF$r8AYWSQL$S-NH2	1547,84	774,92	775,33
SP-742	Ac-ETF$r8AYWAQL$S-NH2	1547,80	774,90	775,7
SP-743	Ac-LTF$r8EYWAQL$S-NH2	1589,85	795,93	796,33
SP-744	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHAm	1667,94	834,97	835,37
SP-745	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHiAm	1667,94	834,97	835,27
SP-746	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr3Ph	1715,94	858,97	859,42
SP-747	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnBu3,3Me	1681,96	841,98	842,67
SP-748	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnBu	1653,93	827,97	828,24
SP-749	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnPr	1639,91	820,96	821,31
SP-750	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHnEt2Ch	1707,98	854,99	855,35
SP-751	Ac-LTF$r8HYWAQL$S-NHHex	1681,96	841,98	842,4
SP-752	Ac-LTF$r8AYWAQL$S-NHmdPeg2	1633,91	817,96	855,35
SP-753	Ac-LTF$r8AYWAQL$A-NHmdPeg2	1617,92	809,96	810,58
SP-754	Ac-LTF$r5AYWAAL$s8S-NH2	1474,82	738,41	738,79
SP-755	Ac-LTF$r8AYWCouQL$S-NH2	1705,88	853,94	854,61
SP-756	Ac-LTF$r8CouYWAQL$S-NH2	1705,88	853,94	854,7
SP-757	Ac-CouTF$r8AYWAQL$S-NH2	1663,83	832,92	833,33
SP-758	H-LTF$r8AYWAQL$A-NH2	1473,84	737,92	737,29
SP-759	Ac-HHF$r8AYWAQL$S-NH2	1591,83	796,92	797,72
SP-760	Ac-LT2Nal$r8AYWSQL$S-NH2	1597,85	799,93	800,68
SP-761	Ac-LTF$r8HCouWAQL$S-NH2	1679,87	840,94	841,38
SP-762	Ac-LTF$r8AYWCou2QL$S-NH2	1789,94	895,97	896,51
SP-763	Ac-LTF$r8Cou2YWAQL$S-NH2	1789,94	895,97	896,5
SP-764	Ac-Cou2TF$r8AYWAQL$S-NH2	1747,90	874,95	875,42
SP-765	Ac-LTF$r8ACou2WAQL$S-NH2	1697,92	849,96	850,82
SP-766	Dmaac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1574,89	788,45	788,82
SP-767	Hexac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1587,91	794,96	795,11
SP-768	Napac-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1657,89	829,95	830,36
SP-769	Pam-LTF$r8AYWAQL$S-NH2	1728,06	865,03	865,45
SP-770	Ac-LT2Nal$r8HYAAQL$S-NH2	1532,84	767,42	767,61
SP-771	Ac-LT2Nal$/r8HYWAQL$/S-NH2	1675,91	838,96	839,1
SP-772	Ac-LT2Nal$r8HYFAQL$S-NH2	1608,87	805,44	805,9
SP-773	Ac-LT2Nal$r8HWAAQL$S-NH2	1555,86	778,93	779,08
SP-774	Ac-LT2Nal$r8HYAWQL$S-NH2	1647,88	824,94	825,04
SP-775	Ac-LT2Nal$r8HYAAQW$S-NH2	1605,83	803,92	804,05
SP-776	Ac-LTW$r8HYWAQL$S-NH2	1636,88	819,44	819,95
SP-777	Ac-LT1Nal$r8HYWAQL$S-NH2	1647,88	824,94	825,41

В последовательностях, приведенных выше и в других местах, используют нижеследующие сокращения: "Nle" обозначает норлейцин, "Aib" обозначает 2-аминоизомасляную кислоту, "Ac" обозначает ацетил и "Pr" обозначает пропионил. Аминокислоты, обозначаемые "$", представляют собой альфа-Me S5-пентенил-аланин-олефин-аминокислоты, соединенные углеродным i - i+4 поперечным линкером, содержащим одну двойную связь. Аминокислоты, обозначаемые "$r5", представляют собой альфа-Me R5-пентенил-аланин-олефин-аминокислоты, соединенные углеродным i - i+4 поперечным линкером, содержащим одну двойную связь. Аминокислоты, обозначаемые "$s8", представляют собой альфа-Me S8-октенил-аланин-олефин-аминокислоты, соединенные углеродным i - i+7 поперечным линкером, содержащим одну двойную связь. Аминокислоты, обозначаемые "$r8", представляют собой альфа-Me R8-октенил-аланин-олефин-аминокислоты, соединенные углеродным i - i+7 поперечным линкером, содержащим одну двойную связь. "Ahx" обозначает аминоциклогексильный линкер. Поперечные линкеры представляют собой углеродные поперечные линкеры, содержащие восемь или одиннадцать атомов углерода между альфа-атомами углерода аминокислот. Аминокислоты, обозначаемые "$/", представляют собой альфа-Me S5-пентенил-аланин-олефин-аминокислоты, которые не соединяются поперечными линкерами. Аминокислоты, обозначаемые "$/r5", представляют собой альфа-Me R5-пентенил-аланин-олефин-аминокислоты, которые не соединяются поперечным линкером. Аминокислоты, обозначаемые "$/s8", представляют собой альфа-MeS8-октенил-аланин-олефин-аминокислоты, которые не соединяются поперечным линкером. Аминокислоты, обозначаемые "$/r8", представляют собой альфа-Me R8-октенил-аланин-олефин-аминокислоты, которые не соединяются поперечным линкером. Аминокислоты, обозначаемые "Amw", представляют собой альфа-Me-триптофанаминокислоты. Аминокислоты, обозначаемые "Aml", представляют собой альфа-Me-лейцинаминокислоты. Аминокислоты, обозначаемые "2ff", представляют собой 2-фтор-фенилаланинаминокислоты. Аминокислоты, обозначаемые "3ff", представляют собой 3-фтор-фенилаланинаминокислоты. Аминокислоты, обозначаемые "St", представляют собой аминокислоты, содержащие две боковые цепи пентенил-аланин-олефин, каждая из которых соединена поперечной связью с другой аминокислотой, как указано. Аминокислоты, обозначаемые "St//", представляют собой аминокислоты, содержащие две пентенил-аланинолефиновые боковые цепи, которые не участвуют в образовании поперечных связей. Аминокислоты, обозначаемые "%St", представляют собой аминокислоты, содержащие две пентенил-аланинолефиновые боковые цепи, каждая из которых соединена поперечной связью с другой аминокислотой, как указано, посредством полность насыщенных углеводородных мостиков.

Например, соединения, обозначенные SP-72, Sp-56 и SP-138, имеют следующие структуры:

Например, другие соединения имеют следующие структуры:

Пример 3: Анализ конкурентного связывания методом ELISA (HDM2 и HDMX)

Лунки 96-луночных планшетов Immulon покрывают белком p53-His6 (30 нМ/лунку) в течение ночи при комнатной температуре. В день эксперимента планшеты промывают 1×PBS-твин 20 (0,05%), используя автоматизированную машину для мойки планшетов ELISA, блокируют блокирующим реагентом ELISA Micro well Blocking в течение 30 минут при комнатной температуре; избыток блокирующего реагента удаляют путем промывания планшетов 1×PBS-твин 20 (0,05%). Рабочие растворы пептидов с концентрацией 500 мкМ получают путем разведения исходных 10 мМ растворов в ДМСО стерильной водой, для дальнейших разведений используют 0,5% ДМСО, поддерживая одинаковую концентрацию ДМСО во всех образцах. Пептиды добавляют в лунки в концентрации, в два раза превышающей желательную, в объеме 50 мкл, и затем добавляют разбавленный раствор белка GST-HDM2 или GST-HMDX (конечная концентрация: 10 нМ). Образцы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего планшеты промывают PBS-твин 20 (0,05%) и добавляют 100 мкл HRP-конъюгированного антитела против GST [Hypromatrix, INC], разбавленного до концентрации 0,5 мкг/мл HRP-стабилизирующим буфером. После инкубации с детекционным антителом в течение 30 мин планшеты промывают и инкубируют со 100 мкл/лунку раствора субстрата TMB-E в течение не более 30 минут; реакции останавливают с помощью 1M HCl и измеряют поглощение при 450 нМ на ридере для микропланшетов. Результаты анализируют с помощью программного обеспечения Graph Pad PRISM.

Пример 4: Анализ жизнеспособности клеток SJSA-1

Клетки SJSA1 высевают в 96-луночные планшеты с плотностью 5000 клеток/100 мкл/лунку за день до анализа. В день исследования клетки промывают один раз средой Opti-MEM и добавляют 90 мкл среды Opti-MEM. Рабочие растворы пептидов с концентрацией 500 мкМ получают путем разведения исходных 10 мМ растворов в ДМСО стерильной водой, для дальнейших разведений используют 0,5% ДМСО, поддерживая одинаковую концентрацию ДМСО во всех образцах. Диапазон конечной концентрации пептидов составляет 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1, 1,56, 0,8 и 0 мкМ в конечном объеме 100 мкл на лунку. Наивысшую конечную концентрацию ДМСО, которая составляет 0,5%, используют в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют (-)-нутлин-3 (10 мМ) Cayman Chemicals Cell-Based Assay. Нутлин разводят по той же схеме, что и пептиды: чтобы достичь желательных конечных концентраций, в соответствующие лунки добавляют 10 мкл растворов с концентрацией, в 10 раз превосходящей желательную. Затем клетки инкубируют с пептидами в течение 20-24 ч при 37ºC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. После инкубации измеряют жизнеспособность клеток, используя реагенты Promega Cell Titer-Glo, в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 5: Анализ повышающей регуляции SJSA-1 под действием p21

Клетки SJSA1 высевают в 6-луночные планшеты с плотностью 0,8 миллионов клеток/2 мл/лунку за день до анализа. В день исследования клетки промывают один раз средой Opti-MEM и добавляют 1350 мкл среды Opti-MEM. Рабочие растворы пептидов с концентрацией 500 мкМ получают путем разведения исходных 10 мМ растворов в ДМСО стерильной водой, для дальнейших разведений используют 0,5% ДМСО, поддерживая одинаковую концентрацию ДМСО во всех образцах. Наивысшую конечную концентрацию ДМСО, которая составляет 0,5%, используют в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют (-)-нутлин-3 (10 мМ) Cayman Chemicals Cell-Based Assay. Нутлин разводят по той же схеме, что и пептиды: чтобы достичь желательных конечных концентраций, в соответствующие лунки добавляют 150 мкл растворов с концентрацией, в 10 раз превосходящей желательную. Затем клетки инкубируют с пептидами в течение 18-20 ч при 37ºC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. После инкубации клетки собирают, промывают 1×PBS (не содержащим Ca⁺⁺/Mg⁺⁺) и лизируют в 1× буфере для лизиса клеток (10× буфер Cell Signaling technologies, разбавленный до 1× и дополненный ингибиторами протеаз и ингибиторами фосфатаз) на льду в течение 30 мин. Лизаты центрифугируют со скоростью 13000 об/мин в микроцентрифуге при 40ºC в течение 8 мин; прозрачные супернатанты собирают и хранят при -80ºC до последующего применения. Общее содержание белка в лизатах измеряют с помощью набора для определения белка BCA, используя стандартные растворы БСА от Thermofisher. 25 мкг общего белка используют для детекции p21 методом ELISA. Каждый образец в планшете ELISA анализируют с тройными повторами. Анализ ELISA проводят в соответствии с инструкциями производителя. Каждая лунка содержит 25 мкг общего белка и имеет три повтора. Результаты анализируют с помощью программного обеспечения Graph Pad PRISM.

Пример 6: Анализ p53 методом GRIP

Анализ перераспределения Thermo Scientific* BioImage p53-Hdm2 позволяет регистрировать взаимодействие белка с Hdm2 и внутриклеточное перемещение GFP-меченного p53 в ответ на лекарственные соединения или другие стимулы. Рекомбинантные клетки CHO-hIR стабильно экспрессируют p53(1-312), соединенный с C-концом усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), и PDE4A4-Hdm2(1-124), гибридный белок, содержащий PDE4A4 и Hdm2(1-124). Они представляют собой готовую к применению аналитическую систему, которую можно использовать для измерения влияния экспериментальных состояний на взаимодействие p53 и Hdm2. Визуализацию и анализ проводят на платформе HCS.

Клетки CHO-hIR регулярно поддерживают в среде Ham's F12, содержащей 1% пенициллина-стрептомицина, 0,5 мг/мл генетицина, 1 мг/мл зеоцина и 10% FBS. Клетки высевают в 96-луночные планшеты с плотностью 7000 клеток/100 мкл/лунку за 18-24 часа до начала анализа с использованием культуральной среды. На следующий день среду заменяют на свежую и к клеткам добавляют PD177 с конечной концентрацией 3 мкМ, чтобы активировать образование очагов. Контрольные лунки не содержат раствор PD-177. Через 24 ч после стимуляции PD177 клетки промывают один раз средой Opti-MEM и добавляют 50 мкл среды Opti-MEM, содержащей PD-177 (6 мкМ). Рабочие растворы пептидов с концентрацией 500 мкМ получают путем разведения исходных 10 мМ растворов в ДМСО стерильной водой, для дальнейших разведений используют 0,5% ДМСО, поддерживая одинаковую концентрацию ДМСО во всех образцах. Наивысшую конечную концентрацию ДМСО, которая составляет 0,5%, используют в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют (-)-нутлин-3 (10 мМ) Cayman Chemicals Cell-Based Assay. Нутлин разводят по той же схеме, что и пептиды. Чтобы достичь желательных конечных концентраций, в соответствующие лунки добавляют 50 мкл растворов с концентрацией, в 2 раза превосходящей желательную. Затем клетки инкубируют с пептидами в течение 6 ч при 37ºC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. После инкубации среду осторожно отсасывают и клетки фиксируют путем добавления 150 мкл фиксирующего раствора на лунку в течение 20 минут при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывают 4 раза, каждый раз используя 200 мкл PBS на лунку. В конце последнего промывания добавляют 100 мкл 1 мкМ окрашивающего раствора Hoechst. Герметично закрытые планшеты инкубируют в течение, по меньшей мере, 30 мин в темноте, промывают PBS, чтобы удалить избыток окрашивающего реагента, и в каждую лунку добавляют PBS. Планшеты можно хранить при 4ºC в темноте до 3 дней. Перемещение p53/HDM2 визуализируют с помощью модуля молекулярного перемещения прибора Cellomics Arrayscan, используя 10× объектив, набор фильтров XF-100 для Hoechst и GFP. Выходным параметром является Mean-CircRTNGAveIntenRatio (отношение средних значений интенсивности флуоресценции в ядре и цитоплазме (с полным усреднением)). Минимально число клеток на лунку, которое можно использовать для анализа визуализации, составляет 500.

Пример 7: Анализ прямого связывания hDM2 методом поляризации флуоресценции (FP)

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

1. hDM2 (собственного получения, 41 кДа) разбавляют буфером для FP (буфер с высоким содержанием солей: 200 мМ Nacl, 5мМ CHAPS, pH 7,5) с получением исходного рабочего раствора с концентрацией 10 мкМ.

2. Добавляют 30 мкл 10 мкМ исходного раствора белка в лунки A1 и B1 96-луночного черного микропланшета HE (Molecular Devices).

3. В 30 мкл буфера для FP наносят на колонку A2-A12, B2-B12, C1-C12 и D1-D12.

4. Осуществляют 2- или 3-кратные серийные разведения исходных растворов белка A1, B1 с получением растворов A2, B2; A2, B2 разводят с получением A3, B3; … с достижением после последнего разведения концентрации, равной однозначному числу в нМ-диапазоне.

5. 1 мМ раствор (в 100% ДМСО) FAM-меченного линейного пептида разводят ДМСО до 100 мкМ (разведение 1:10). 100 мкМ растворы разводят до 10 мкМ водой (разведение 1:10) и затем 10 мкМ растворы разводят буфером для FP до 40 нМ (разведение 1:250). Так получают рабочий раствор, концентрация которого в лунке составляет 10 нМ (разведение 1:4). Разведенный раствор FAM-меченного пептида держат в темноте до использования.

6. В каждую лунку добавляют 10 мкл 10 нМ раствора FAM-меченного пептида, инкубируют и прочитывают в разные моменты времени. Kd комплекса с 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH₂ составляет приблизительно 13,38 нМ.

Пример 8: Конкурентный анализ hDM2 методом поляризации флуоресценции

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

1. hDM2 (собственного получения, 41 кДа) разбавляют буфером для FP (буфер с высоким содержанием солей: 200 мМ Nacl, 5 мМ CHAPS, pH 7,5) с получением исходного рабочего раствора с концентрацией 84 нМ (2×).

2. Добавляют 20 мкл 84 нМ (2×) исходного раствора белка в каждую лунку 96-луночного черного микропланшета HE (Molecular Devices).

3. 1 мМ раствор (в 100% ДМСО) FAM-меченного линейного пептида разводят ДМСО до 100 мкМ (разведение 1:10). 100 мкМ растворы разводят до 10 мкМ водой (разведение 1:10) и затем 10 мкМ растворы разводят буфером для FP до 40 нМ (разведение 1:250). Так получают рабочий раствор, концентрация которого в лунке составляет 10 нМ (разведение 1:4). Разведенный раствор FAM-меченного пептида держат в темноте до использования.

4. Планшет, содержащий немеченый пептид в разных концентрациях, получают, используя буфер для FP и начиная с концентрации пептида 1 мкМ (конечная) с последующими 5-кратными серийными разведениями для 6 точек с помощью нижеследующей схемы разведения. 10 мМ раствор (в 100% ДМСО) разводят ДМСО до 5 мМ (разведение 1:2). 5 мМ раствор разводят H₂O до 500 мкМ (разведение 1:10) и затем 500 мкМ раствор разводят буфером для FP до 20 мкМ (разведение 1:25). Получают 5-кратные серийные разведения от 4 мкМ (4×) для 6 точек.

5. 10 мкл серийных разведений немеченых пептидов переносят в каждую лунку и добавляют 20 мкл 84 нМ раствора белка.

6. В каждую лунку добавляют 10 мкл 10 нМ раствора FAM-меченного пептида, инкубируют в течение 3 часов и прочитывают. Результаты примеров 7 и 8 приведены на фиг.7A-D в виде данных по HDM2.

Пример 9: Анализ прямого связывания hDMX методом поляризации флуоресценции (FP)

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

1. hDMX (собственного получения, 40 кДа) разбавляют буфером для FP (буфер с высоким содержанием солей: 200 мМ NaCl, 5 мМ CHAPS, pH 7,5) с получением исходного рабочего раствора с концентрацией 10 мкМ.

2. Добавляют 30 мкл 10 мкМ исходного раствора белка в лунки A1 и B1 96-луночного черного микропланшета HE (Molecular Devices).

3. В 30 мкл буфера для FP наносят на колонку A2-A12, B2-B12, C1-C12 и D1-D12.

4. Осуществляют 2- или 3-кратные серийные разведения исходных растворов белка A1, B1 с получением растворов A2, B2; A2, B2 разводят с получением A3, B3; … с достижением после последнего разведения концентрации, равной однозначному числу в нМ-диапазоне.

5. 1 мМ раствор (в 100% ДМСО) FAM-меченного линейного пептида разводят ДМСО до 100 мкМ (разведение 1:10). 100 мкМ растворы разводят до 10 мкМ водой (разведение 1:10) и затем 10 мкМ растворы разводят буфером для FP до 40 нМ (разведение 1:250). Так получают рабочий раствор, концентрация которого в лунке составляет 10 нМ (разведение 1:4). Разведенный раствор FAM-меченного пептида держат в темноте до использования.

6. В каждую лунку добавляют 10 мкл 10 нМ раствора FAM-меченного пептида, инкубируют и прочитывают в разные моменты времени.

Kd комплекса с 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH₂ составляет приблизительно 51 нМ.

Пример 10: Конкурентный анализ hDMX методом поляризации флуоресценции

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

1. hDM2 (собственного получения, 40 кДа) разбавляют буфером для FP (буфер с высоким содержанием солей: 200 мМ NaCl, 5 мМ CHAPS, pH 7,5) с получением исходного рабочего раствора с концентрацией 300 нМ (2×).

2. Добавляют 20 мкл 300 нМ (2×) исходного раствора белка в каждую лунку 96-луночного черного микропланшета HE (Molecular Devices).

3. 1 мМ раствор (в 100% ДМСО) FAM-меченного линейного пептида разводят ДМСО до 100 мкМ (разведение 1:10). 100 мкМ растворы разводят до 10 мкМ водой (разведение 1:10) и затем 10 мкМ растворы разводят буфером для FP до 40 нМ (разведение 1:250). Так получают рабочий раствор, концентрация которого в лунке составляет 10 нМ (разведение 1:4). Разведенный раствор FAM-меченного пептида держат в темноте до использования.

4. Планшет, содержащий немеченый пептид в разных концентрациях, получают, используя буфер для FP и начиная с концентрации пептида 5 мкМ (конечная) с последующими 5-кратными серийными разведениями для 6 точек с помощью нижеследующей схемы разведения.

5. 10 мМ раствор (в 100% ДМСО) разводят ДМСО до 5 мМ (разведение 1:2). 5 мМ раствор разводят H₂O до 500 мкМ (разведение 1:10) и затем 500 мкМ раствор разводят буфером для FP до 20 мкМ (разведение 1:25). Получают 5-кратные серийные разведения от 20 мкМ (4×) для 6 точек.

6. 10 мкл серийных разведений немеченых пептидов переносят в каждую лунку и добавляют 20 мкл 300 нМ раствора белка.

7. В каждую лунку добавляют 10 мкл 10 нМ (4×) раствора FAM-меченного пептида, инкубируют в течение 3 часов и прочитывают. Результаты примеров 9 и 10 приведены на фиг.7A-D в виде данных по HDMX.

Пример 11: Анализ жизнеспособности клеток

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

Высевание клеток: Клетки трипсинизируют, считают и высевают с заранее определенной плотностью в 96-луночные планшеты за день до анализа. Для каждой анализируемой клеточной линии используют следующие значения плотности:

SJSA-1: 7500 клеток/лунку

RKO: 5000 клеток/лунку

RKO-E6: 5000 клеток/лунку

HCT-116: 5000 клеток/лунку

SW-480: 2000 клеток/лунку

MCF-7: 5000 клеток/лунку

В день анализа среду при комнатной температуре заменяют на свежую, содержащую 11% FBS (среда для анализа). В каждую лунку добавляют 180 мкл среды для анализа. В контрольные лунки, не содержащие клетки, добавляют 200 мкл среды.

Разведение раствора пептида: все разведения и добавление полученных растворов к клеткам проводят при комнатной температуре.

Получают 10 мМ исходные растворы пептидов в ДМСО. Используя ДМСО в качестве разбавителя проводят серийные разведения исходного раствора по схеме 1:3 с получением 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 мМ растворов. Серийно разведенные растворы пептидов в ДМСО разводят в 33,3 раза стерильной водой. В результате получают ряд 10× рабочих растворов. Также готовят смесь ДМСО/стерильная вода (3% ДМСО) для контрольных лунок.

В результате получают рабочие растворы с концентрациями в мкМ диапазоне, которые составляют 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 и 0 мкМ. Содержимое лунок на каждой стадии разведения тщательно перемешивают, используя многоканальную систему.

Ряд H содержит контроли. В H1-H3 добавляют 20 мкл среды для анализа. В H4-H9 добавляют 20 мкл 3% раствора ДМСО в воде. H10-H12 содержат только среду и не содержат клетки.

Положительный контроль: В качестве положительного контроля используют низкомолекулярный ингибитор HDM2, нутлин-3a (10 мМ). Растворы нутлина разводят по той же схеме, что и пептиды.

Добавление рабочих растворов к клеткам:

В соответствующие лунки добавляют 20 мкл растворов с концентрацией, в 10 раз превосходящей желательную, чтобы достичь нужной конечной концентрации в общем объеме 200 мкл/лунку. (20 мкл 300 мкМ раствора пептида +180 мкл суспензии клеток в среде = конечная концентрация 30 мкМ в 200 мкл/лунку). Осторожно перемешивают несколько раз с помощью пипетки. Таким образом, диапазон используемых конечных концентраций включает в себя 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 и 0 мкМ (для активных пептидов используют дополнительные разведения).

Контрольные лунки включают в себя лунки, которые не содержат пептиды, но содержат такие же концентрации ДМСО, как и лунки, содержащие пептиды, или лунки, не содержащие клетки.

Инкубируют в течение 72 часов при 37ºC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Жизнеспособность клеток определяют с помощью реагента MTT от Promega. Жизнеспособность клеток SJSA-1, RKO, RKO-E6, HCT-116 определяют на 3 день, клеток MCF-7 на 5 день, а клеток SW-480 на 6 день. После инкубации в течение указанного времени планшеты оставляют остывать до комнатной температуры. Из каждой лунки удаляют 80 мкл среды для анализа. В каждую лунку добавляют 15 мкл оттаявшего реагента MTT.

Планшет инкубируют в течение 2 ч при 37ºC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, и добавляют 100 мкл солюбилизирующего реагента в соответствии с инструкциями производителя. Инкубируют при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего с помощью многопланшетного ридера Synergy Biotek определяют поглощение при 570 нМ.

Жизнеспособность клеток анализируют против контролей ДМСО, используя аналитические инструменты GraphPad PRISM.

Реагенты:

Среда для культивирования клеток Invitrogen.

i. 96-луночные обработанные прозрачные планшеты для культивирования клеток Falcon (Nunc 353072)

ДМСО (Sigma D 2650)

RPMI 1640 (Invitrogen 72400)

MTT (Promega G4000)

Инструменты: Многопланшетный ридер для измерения поглощения (Synergy 2)

Результаты примера 11 приведены на фиг.7A-D как EC₅₀ SJSA-1.

Пример 12. Анализ P21 методом ELISA

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

Высевание клеток:

Клетки SJSA-1 трипсинизируют, считают и высевают с плотностью 7500 клеток/100 мкл/лунку в 96-луночные планшеты за день до анализа.

В день анализа среду при комнатной температуре заменяют на свежую RPMI, содержащую 11% FBS (среда для анализа). В каждую лунку добавляют 90 мкл среды для анализа. В контрольные лунки, не содержащие клетки, добавляют 200 мкл среды.

Разведение раствора пептида:

Получают 10 мМ исходные растворы пептидов в ДМСО. Используя ДМСО в качестве разбавителя проводят серийные разведения исходного раствора по схеме 1:3 с получением 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 мМ растворов. Серийно разведенные растворы пептидов в ДМСО разводят в 33,3 раза стерильной водой. В результате получают ряд 10× рабочих растворов. Также готовят смесь ДМСО/стерильная вода (3% ДМСО) для контрольных лунок.

В результате получают рабочие растворы с концентрациями в мкМ диапазоне, которые составляют 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 и 0 мкМ. Содержимое лунок на каждой стадии разведения тщательно перемешивают, используя многоканальную систему.

Ряд H содержит контроли. В H1-H3 добавляют 10 мкл среды для анализа. В H4-H9 добавляют 10 мкл 3% раствора ДМСО в воде. H10-H12 содержат только среду и не содержат клетки.

Положительный контроль: В качестве положительного контроля используют низкомолекулярный ингибитор HDM2, нутлин-3a (10 мМ). Растворы нутлина разводят по той же схеме, что и пептиды.

Добавление рабочих растворов к клеткам:

В соответствующие лунки добавляют 10 мкл растворов с концентрацией, в 10 раз превосходящей желательную, чтобы достичь нужной конечной концентрации в общем объеме 100 мкл/лунку. (10 мкл 300 мкМ раствора пептида +90 мкл суспензии клеток в среде = конечная концентрация 30 мкМ в 100 мкл/лунку). Таким образом, диапазон используемых конечных концентраций включает в себя 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 и 0 мкМ.

Контрольные лунки включают в себя лунки, которые не содержат пептиды, но содержат такие же концентрации ДМСО, как и лунки, содержащие пептиды, или лунки, не содержащие клетки.

Через 20 ч после инкубации среду отсасывают; клетки промывают 1×PBS (не содержащим Ca⁺⁺/Mg⁺⁺) и лизируют в 60 мкл 1× буфера для лизиса клеток (10ъ буфер Cell Signaling technologies разбавляют до 1× и добавляют ингибиторы протеазы и ингибиторы фомфатазы) на льду в течение 30 мин.

Планшеты центрифугируют со скоростью 5000 об/мин при 4ºC в течение 8 мин; прозрачные супернатанты собирают, замораживают при -80ºC и хранят до последующего применения.

Определение белка:

Общее содержание белка в лизатах измеряют с помощью набора для определения белка BCA, используя стандартные растворы БСА Thermofisher. Предположительно в каждой лунке содержится примерно 6-7 мкг белка.

Для проведения анализа p21 методом ELISA используют 50 мкл лизата на лунку.

Анализ человеческого общего p21 методом ELISA:

Анализ ELISA проводят в соответствии с инструкциями производителя. Используют 50 мкл лизата на лунку, причем каждую лунку готовят с тройными повторами.

Реагенты:

(-)-Нутлин-3 для клеточных анализов (10 мМ): Cayman Chemicals, № по каталогу 600034

OptiMEM, Invitrogen, № по каталогу 51985

Буфер для лизиса Cell Signaling (10×), Cell signaling technology, № по каталогу 9803

Таблетки смеси ингибиторов протеаз (мини), Roche Chemicals, № по каталогу 04693124001

Таблетки смеси ингибиторов фосфатаз, Roche Chemicals, № по каталогу 04906837001

Набор для определения человеческого общего p21 методом ELISA, R&D Systems, DYC 1047-5

Стоп-раствор (1M HCl), Cell Signaling Technologies, № по каталогу 7002

Инструменты: микроцентрифуга-Эппендорф 5415D и многопланшетный ридер для измерения поглощения (Synergy 2).

Результаты примера 12 приведены на фиг.7A-D как данные для p21.

Пример 13: Детекция каспазы 3

Анализ проводят в соответствии с нижеследующей общей схемой:

Высевание клеток:

Клетки SJSA-1 трипсинизируют, считают и высевают с плотностью 7500 клеток/100 мкл/лунку в 96-луночные планшеты за день до анализа. В день анализа среду при комнатной температуре заменяют на свежую RPMI, содержащую 11% FBS (среда для анализа). В каждую лунку добавляют 180 мкл среды для анализа. В контрольные лунки, не содержащие клетки, добавляют 200 мкл среды.

Разведение раствора пептида:

Получают 10 мМ исходные растворы пептидов в ДМСО. Используя ДМСО в качестве разбавителя проводят серийные разведения исходного раствора по схеме 1:3 с получением 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 мМ растворов. Серийно разведенные растворы пептидов в ДМСО разводят в 33,3 раза стерильной водой. В результате получают ряд 10× рабочих растворов. Также готовят смесь ДМСО/стерильная вода (3% ДМСО) для контрольных лунок.

В результате получают рабочие растворы с концентрациями в мкМ диапазоне, которые составляют 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 и 0 мкМ. Содержимое лунок на каждой стадии разведения тщательно перемешивают, используя многоканальную систему. В соответствующие лунки добавляют 20 мкл 10× рабочие растворы.

Ряд H содержит контроли. В H1-H3 добавляют 20 мкл среды для анализа. В H4-H9 добавляют 20 мкл 3% раствора ДМСО в воде. H10-H12 содержат только среду и не содержат клетки.

Положительный контроль: В качестве положительного контроля используют низкомолекулярный ингибитор HDM2, нутлин-3a (10 мМ). Растворы нутлина разводят по той же схеме, что и пептиды.

Добавление рабочих растворов к клеткам:

В соответствующие лунки добавляют 10 мкл растворов с концентрацией, в 10 раз превосходящей желательную, чтобы достичь нужной конечной концентрации в общем объеме 100 мкл/лунку. (10 мкл 300 мкМ раствора пептида +90 мкл суспензии клеток в среде = конечная концентрация 30 мкМ в 100 мкл/лунку). Таким образом, диапазон используемых конечных концентраций включает в себя 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 и 0 мкМ.

Контрольные лунки включают в себя лунки, которые не содержат пептиды, но содержат такие же концентрации ДМСО, как и лунки, содержащие пептиды, или лунки, не содержащие клетки.

Через 48 ч после инкубации отсасывают 80 мкл среды из каждой лунки; добавляют 100 мкл реагента для анализа Caspase3/7Glo (аналитическая система Caspase 3/7glo, Promega, G8092) на лунку, инкубируют при осторожном встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре.

Люминесценцию определяют с помощью многопланшетного ридера Synergy Biotek.

Результаты анализируют в виде активации каспазы 3 над ДМСО-обработанными клетками.

Результаты примера 13 приведены на фиг.7A-D в виде данных по p21.

Claims (33)

1. Пептидомиметический макроцикл, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

2. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

3. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

4. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит спираль.

5. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит α-спираль.

6. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит α, α-дизамещенную аминокислоту.

7. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит поперечный линкер, соединяющий α-положения по меньшей мере двух аминокислот в пептидомиметическом макроцикле.

8. Пептидомиметический макроцикл по п. 7, где по меньшей мере одна из двух указанных аминокислот представляет собой α, α-дизамещенную аминокислоту.

9. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, где пептидомиметический макроцикл имеет формулу:

где:
каждый А, С, D и Е независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, a D и Е независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;
В представляет собой природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты или

;
R₁ и R₂ независимо обозначают -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;
R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;
L обозначает макроцикл-образующий линкер формулы -L₁-L₂-;
L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;
каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;
каждый К обозначает О, S, SO, SO₂, СО, CO₂ или CONR₃;
каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;
каждый R₆ независимо обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;
R₇ обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток D;
R₈ обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток Е;
v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;
u обозначает целое число в диапазоне 1-10;
x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и
n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

10. Пептидомиметический макроцикл по п. 9, где L не содержит тиоэфир или триазол.

11. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит поперечный линкер, соединяющий скелетную аминогруппу первой аминокислоты со второй аминокислотой, входящей в состав пептидомиметического макроцикла.

12. Пептидомиметический макроцикл по п. 11, где пептидомиметический макроцикл имеет формулу (IV) или (IVa):

где:
каждый А, С, D и Е независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, a D и Е независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;
В обозначает природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты или

;
R₁ и R₂ независимо обозначают -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном, или часть циклической структуры, содержащей остаток Е;
R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;
L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;
каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;
каждый К обозначает О, S, SO, SO₂, СО, CO₂ или CONR₃;
каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;
каждый R₆ независимо обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;
R₇ обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;
v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;
u обозначает целое число в диапазоне 1-10;
x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и
n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

13. Пептидомиметический макроцикл формулы IV или IVa по п. 12, где L₁ и L₂ по отдельности или в сочетании не содержат тиоэфир или триазол.

14. Пептидомиметический макроцикл формулы IV или IVa по п. 12, где L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен или алкинилен.

15. Пептидомиметический макроцикл формулы IV или IVa по п. 12, где L₁ и L₂ независимо обозначают С₃-С₁₀ алкилен или алкенилен.

16. Пептидомиметический макроцикл по п. 15, где L₁ и L₂ независимо обозначают С₃-С₆ алкилен или алкенилен.

17. Пептидомиметический макроцикл формулы IV или IVa по п. 12, где R₁ и R₂ обозначают Н.

18. Пептидомиметический макроцикл формулы IV или IVa по п. 12, где R₁ и R₂ независимо обозначают алкил.

19. Пептидомиметический макроцикл по п. 12, где R₁ и R₂ обозначают метил.

20. Применение пептидомиметического макроцикла для лечения злокачественного новообразования у субъекта, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

21. Применение пептидомиметического макроцикла для модуляции активности р53 и/или HDM2, HDMX или комбинации перечисленного у субъекта, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

22. Применение пептидомиметического макроцикла для препятствования взаимодействию белков р53 и HDM2 или белков р53 и HDMX у субъекта, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

23. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-3, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 507.

24. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

25. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и SEQ ID NO: 714.

26. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит спираль.

27. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит α-спираль.

28. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит α, α-дизамещенную аминокислоту.

29. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит поперечный линкер, который соединяет α-положения по меньшей мере двух аминокислот с пептидомиметическим макроциклом.

30. Применение по п. 29, где по меньшей мере одна из двух аминокислот представляет собой α, α-дизамещенную аминокислоту.

31. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл имеет формулу:

где:
каждый А, С, D и Е независимо обозначает природную или неприродную аминокислоту, a D и Е независимо и необязательно содержат кэпирующую группу;
В представляет собой природную или неприродную аминокислоту, аналог аминокислоты или

;
R₁ и R₂ независимо обозначают -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;
R₃ обозначает водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅;
L обозначает макроцикл - образующий линкер формулы -L₁-L₂-;
L₁ и L₂ независимо обозначают алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен R₅;
каждый R₄ обозначает алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен;
каждый К обозначает О, S, SO, SO₂, СО, CO₂ или CONR₃;
каждый R₅ независимо обозначает галоген, алкил, -OR₆, N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;
каждый R₆ независимо обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентный фрагмент, радиоизотоп или терапевтическое средство;
R₇ обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток D;
R₈ обозначает -Н, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил или гетероциклоарил, необязательно замещенный R₅, или часть циклической структуры, содержащую остаток Е;
v и w независимо обозначают целые числа в диапазоне 1-1000;
u обозначает целое число в диапазоне 1-10;
x, y и z независимо обозначают целые числа в диапазоне 0-10; и
n обозначает целое число в диапазоне 1-5.

32. Применение по п. 31, где L не содержит тиоэфир или триазол

33. Применение по любому из пп. 20-22, где пептидомиметический макроцикл содержит поперечный линкер, соединяющий скелетную аминогруппу первой аминокислоты со второй аминокислотой, входящей в состав пептидомиметического макроцикла.

Images