JP2014520120A - 安定化した変異型mamlペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
ヒトMAMLから誘導される内部で架橋したペプチドおよびその誘導体が記載および特徴付けされ、それらはICN1−CSL複合体に親和性を示す。これらのペプチドはNOTCHシグナル伝達を干渉し、したがって、ある種の癌を含む様々な疾患の治療に有用である。
Description
本願は、安定化した変異型MAMLペプチドおよびその使用に関する。
異常な転写因子機能は、腫瘍の発生および進行の特徴である。これらの重要な調節分子の脱制御は、キナーゼ(例えばBCR−Abl、b−Rafおよびk−Ras)のような上流の調節タンパク質の変異、転座や増幅、タンパク質ホスファターゼ(例えばPTEN)の欠損または不活性化変異、増殖因子受容体シグナル伝達(例えばVEGF−VEGFR)の変化、あるいは転写因子それ自体(例えばMYC、p53およびNOTCH1)の直接的な変異、欠損、増幅または融合等の数々の遺伝的事象に起因し得る。これらの例のそれぞれにおいて、シグナル伝達カスケードは最終的に1つまたはそれ以上の転写因子の異なる活性化をもたらし、異常な遺伝子発現ネットワークを引き起こす1。多くの「ドライバー」癌遺伝子が特徴解析されているが、悪性の表現型および癌の進行に最終的に寄与するのはこれらのネットワークである。しかしながら、癌のような遺伝病におけるこれらの重要な役割にもかかわらず、転写因子は従来の小分子薬の開発に関して極めて研究しがいのある標的であることが判明している。
Notchシグナル伝達経路は、多タンパク質であるNOTCHトランス活性化複合体を介した過剰なシグナル伝達によって引き起こされる癌遺伝子転写ネットワークの典型例である。正常なNotchシグナル伝達は、神経前駆細胞の特異化、造血幹細胞の維持および系統決定を含む様々な発生過程にとって重要である2,3。これらの過程の厳密な制御の大部分は、活性化したNotch経路から発せられるシグナルの期間および量にわたって細胞から通常課せられる精巧な制御に由来する。Notch経路機能および制御における異常はヒトの様々な疾患と関係している。NOTCHタンパク質機能を失わせる変異は、CADASIL4、先天性大動脈弁疾患5およびアラジール(Allagille)症候群6を含む数々の発生学的疾患において確認されている。一方で、Notch経路の不適切に持続する活性化を引き起こす遺伝的変異には、原因として癌が関係している。実際、ヒトNOTCH1は、T細胞性急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)の患者におけるt(7;9)染色体転座へのその関与に基づいて発見された7。その後、NOTCH1における様々な変異がT−ALLの患者の50%以上で発見された8。これらのT−ALLにおける重要な発見に続いて、Notchシグナル伝達を増強する更なる遺伝子の損傷が、多数の他の癌の形態で同定され、それらの癌の形態には、乳癌9、卵巣癌10、肺癌11,12、膵臓癌および消化管癌13があり、他にも、黒色腫4、多発性骨髄腫15および髄芽腫において同定されている。更に最近では、異常なNotchシグナル伝達は、癌以外にも、炎症性アテローム性動脈硬化症16、糸球体硬化症17、骨粗鬆症18および動脈性高血圧19を含む様々な慢性疾患の発症機序に関与しているとされている。
NOTCHタンパク質と疾患との間に広範な因果関係があることから、Notch経路を遮断する薬剤の開発には高い関心が寄せられている。受容体活性化に続いて、NOTCHタンパク質はADAMファミリーメタロプロテアーゼ20およびγ−セクレターゼ複合体21〜23による2つの連続するタンパク質分解的切断事象を経る。γ−セクレターゼによるNOTCH受容体の膜内切断はNOTCH(ICN)の細胞内ドメインを放出し、これは核内に移行して、転写因子CSLおよびマスターマインド(Mastermind)様ファミリー(ヒトではMAML1〜3)の補助活性化因子とともに活性NOTCH転写複合体(NTC)を形成する(図1a)24〜27,28。NOTCHリガンド29,30、NOTCH受容体の細胞外ドメイン31,32およびγ−セクレターゼ複合体33〜36を阻害するための治療剤は何種類か開発されている。
特許文献1には、MAML1から誘導された特定の架橋ペプチドが記載されており、これらは水溶解度、ICN−CSL複合体への結合強度、および細胞透過性について試験された。そのようなペプチドの1つ、SAHM1は、ICN1−CSL複合体に特異的に結合し、組換えdnMAML1および完全長MAML1の結合を競合的に阻害することが分かった。ヒトT−ALL細胞とともに培養すると、SAHM1は標準的なNotch標的遺伝子(HES1、MYC、DTX1)のパネルの発現の阻害を示した。遺伝子発現特徴解析および遺伝子セットエンリッチメント分析を用いた更に包括的な調査では、SAHM1はヒトおよびマウスT−ALL細胞においてNotch遺伝子を抑制する転写シグナル伝達(実際、このシグナル伝達は小分子γ−セクレターゼ阻害剤(GSI)での治療により生じたものと顕著な一致を示した)を生じることが実証された。NOTCH−CSL転写活性化の直接阻害は、ヒトT−ALL細胞株においても、また、臨床で見られた変異NOTCH1対立遺伝子によって引き起こされたT−ALLの生物発光マウスモデルにおいても、NOTCH特異的抗増殖作用をもたらした。
下記に記載するのは、ヒトMAML1(「ステープルド(stapled)MAML1ペプチド」)の一部分に関連する安定に架橋されたペプチドである。この架橋ペプチドは少なくとも2個の修飾アミノ酸を含み、それらは一緒に、その2個の修飾アミノ酸のα炭素間に内部(分子内)架橋を形成する。この架橋は、このペプチドのαヘリックス二次構造の安定化に寄与する(米国特許第7192173号およびVerdine et al.2012 Methods in Enzymology 503:3を参照されたい)。いくつかの場合では、ペプチドは4(6、8または10)個の修飾アミノ酸を含み、これらが対となって内部架橋を形成する。このようなペプチドは、1個以上の、例えば3個のアミノ酸によって隔てられた2(3、4または5)個の内部架橋を有する。いくつかの場合では、ペプチドは3個の修飾アミノ酸を含み、真ん中の修飾アミノ酸が2つの隣接するアミノ酸のそれぞれと架橋を(α炭素の間に)形成する。2個の内部架橋も有するこのような架橋ペプチドは、「ステッチド(stitched)」ペプチドと称される場合もあり、米国特許出願公開第2010/0184645号明細書に記載されている。
本明細書に記載する架橋ポリペプチドは、架橋していない対応するポリペプチドに対して改善された生物学的活性を有し得る。架橋MAML1ペプチドはICN1−CSL複合体に結合して組換えMAML1または完全長MAMLタンパク質(MAML1〜3)のICN1−CSL複合体への結合を競合阻害することができる。ある種の活性ペプチドは、T−ALL細胞またはNotchシグナル伝達が活性な他の細胞において、Notchにより調節される1つ以上の遺伝子(HES1、MYC、DTX1等)の発現を阻害することが予測され、この予測はNotch−1依存性レポーター遺伝子のいくつかの研究により支持されている。本明細書に記載の内部架橋MAMLペプチドは治療用途で、例えば、患者の種々の癌やNotch依存性疾患、例えば、Notch受容体またはNotchにより活性化される遺伝子の望ましくない活性化によって特徴付けられる癌や他の疾患の治療のために使用することができる。
本明細書に記載の架橋MAML1ペプチドは、ヒトMAML1の一部分の異型(variants)であり、他のMAMLアイソフォーム(MAML2およびMAML3)からのアミノ酸置換または新規なアミノ酸変異を含む場合がある。ヒトMAML1の関連する一部分の配列(MAML1のアミノ酸21位から開始する)を下記に示す。
(配列番号1):
Glu1Arg2Leu3Arg4Arg5Arg6Ile7Glu8Leu9Cys10Arg11Arg12His13His14Ser15Thr16Cys17Glu18Ala19Arg20Tyr21Glu22Ala23Val24Ser25Pro26Glu27Arg28Leu29(配列番号1)
他の関連するMAML配列は下記を含む:
配列番号2(MAML−1;アミノ酸19〜62位):
VMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQR
配列番号3(MAML−2):
IVERLRARIAVCRQHHLSCEGRYERGRAESSDRERESTLQLLSL
配列番号4(MAML−3):
VVERLRQRIEGCRRHHVNCENRYQQAQVEQLELERRDTVSLYQR
配列番号5(MAML−1;転写複合体に結合するための予測ドメインを含む):
HSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
配列番号6(MAML−2;転写複合体に結合するための予測ドメインを含む):
HSAIVERLRARIAVCRQHHLSCEGRYERGRAESSDRERESTLQLLSLVQH GQGARKAGKH
配列番号7(MAML−3;転写複合体に結合するための予測ドメインを含む):
AVPKHSTVVERLRQRIEGCRRHHVNCENRYQQAQVEQLELERRDTVSLYQ RTLEQRAKKS
配列番号8(MAML−1コア)ERLRRRIELCRRHHST
配列番号9(MAML−2コア)ERLRARIAVCRQHHLSC
配列番号10(MAML−3コア)ERLRQRIEGCRRHHVN
配列番号11(MAML−2フラグメント):
ERLRARIAVCRQHHLSCEGRYERGRAESS
配列番号21(MAML−3フラグメント):
ERLRQRIEGCRRHHVNCENRYQQAQVEQL
本開示の架橋ペプチドは、配列番号12〜20の少なくとも10個の連続するアミノ酸を含み、3または7個のアミノ酸によって隔てられた2個以上のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されている。それぞれの場合において、下記に示すアミノ酸は対応するαメチルアミノ酸で置換されてもよい。すなわち、LeuはαメチルLeuでもよい。本発明の架橋ペプチドは、3または6個のアミノ酸によって隔てられた2個以上のアミノ酸が内部架橋で置換されている配列番号1〜10の架橋ペプチドをいずれも含まない。
(配列番号1):
Glu1Arg2Leu3Arg4Arg5Arg6Ile7Glu8Leu9Cys10Arg11Arg12His13His14Ser15Thr16Cys17Glu18Ala19Arg20Tyr21Glu22Ala23Val24Ser25Pro26Glu27Arg28Leu29(配列番号1)
他の関連するMAML配列は下記を含む:
配列番号2(MAML−1;アミノ酸19〜62位):
VMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQR
配列番号3(MAML−2):
IVERLRARIAVCRQHHLSCEGRYERGRAESSDRERESTLQLLSL
配列番号4(MAML−3):
VVERLRQRIEGCRRHHVNCENRYQQAQVEQLELERRDTVSLYQR
配列番号5(MAML−1;転写複合体に結合するための予測ドメインを含む):
HSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
配列番号6(MAML−2;転写複合体に結合するための予測ドメインを含む):
HSAIVERLRARIAVCRQHHLSCEGRYERGRAESSDRERESTLQLLSLVQH GQGARKAGKH
配列番号7(MAML−3;転写複合体に結合するための予測ドメインを含む):
AVPKHSTVVERLRQRIEGCRRHHVNCENRYQQAQVEQLELERRDTVSLYQ RTLEQRAKKS
配列番号8(MAML−1コア)ERLRRRIELCRRHHST
配列番号9(MAML−2コア)ERLRARIAVCRQHHLSC
配列番号10(MAML−3コア)ERLRQRIEGCRRHHVN
配列番号11(MAML−2フラグメント):
ERLRARIAVCRQHHLSCEGRYERGRAESS
配列番号21(MAML−3フラグメント):
ERLRQRIEGCRRHHVNCENRYQQAQVEQL
本開示の架橋ペプチドは、配列番号12〜20の少なくとも10個の連続するアミノ酸を含み、3または7個のアミノ酸によって隔てられた2個以上のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されている。それぞれの場合において、下記に示すアミノ酸は対応するαメチルアミノ酸で置換されてもよい。すなわち、LeuはαメチルLeuでもよい。本発明の架橋ペプチドは、3または6個のアミノ酸によって隔てられた2個以上のアミノ酸が内部架橋で置換されている配列番号1〜10の架橋ペプチドをいずれも含まない。
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Arg5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Ser15Xaa16
(配列番号12;MAML−1関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Ala5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Leu15Xaa16Xaa17Xaa18Gly19Arg20Xaa21Glu22Arg23Gly24Arg25Ala26Glu27Ser28Ser29
(配列番号15;MAML−2関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Gln5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Val15Xaa16Xaa17Xaa18Asn19Arg20Xaa21Gln22Gln23Ala24Gln25Val26Glu27Gln28Leu29
(配列番号18;MAML−3関連)
ここで、
Xaa3はLeu、TrpまたはPheであり、
Xaa4はArg、Lys、Ala、Aib(アミノイソブチル酸)であり、
Xaa7はIle、Leu、またはNorLであり、
Xaa8はGlu、AlaまたはAibであり、
Xaa9はLeu、Trp、Phe、またはTyrであり、
Xaa10はCys、PheまたはValであり、
Xaa12はArg、AlaまたはAib Xaa16はThrまたはAlaまたはAibであり、
Xaa3がLeu、Xaa7がIle、かつXaa9がLeuの場合、Xaa10はCysではなく、Xaa7がIle、かつXaa9がLeu、かつXaa10がCysの場合、Xaa3はLeuではなく、Xaa3がLeu、Xaa9がIle、かつXaa10がCysの場合、Xaa7はIleではなく、Xaa3がLeu、Xaa7がIle、かつXaa10がCysの場合、Xaa9はLeuではない。
(配列番号12;MAML−1関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Ala5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Leu15Xaa16Xaa17Xaa18Gly19Arg20Xaa21Glu22Arg23Gly24Arg25Ala26Glu27Ser28Ser29
(配列番号15;MAML−2関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Gln5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Val15Xaa16Xaa17Xaa18Asn19Arg20Xaa21Gln22Gln23Ala24Gln25Val26Glu27Gln28Leu29
(配列番号18;MAML−3関連)
ここで、
Xaa3はLeu、TrpまたはPheであり、
Xaa4はArg、Lys、Ala、Aib(アミノイソブチル酸)であり、
Xaa7はIle、Leu、またはNorLであり、
Xaa8はGlu、AlaまたはAibであり、
Xaa9はLeu、Trp、Phe、またはTyrであり、
Xaa10はCys、PheまたはValであり、
Xaa12はArg、AlaまたはAib Xaa16はThrまたはAlaまたはAibであり、
Xaa3がLeu、Xaa7がIle、かつXaa9がLeuの場合、Xaa10はCysではなく、Xaa7がIle、かつXaa9がLeu、かつXaa10がCysの場合、Xaa3はLeuではなく、Xaa3がLeu、Xaa9がIle、かつXaa10がCysの場合、Xaa7はIleではなく、Xaa3がLeu、Xaa7がIle、かつXaa10がCysの場合、Xaa9はLeuではない。
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Arg5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Ser15Xaa16Xaa17Xaa18Ala19Arg20Xaa21
(配列番号13;MAML−1関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Ala5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Leu15Xaa16Xaa17Xaa18Gly19Arg20Xaa21
(配列番号16;MAML−2関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Gln5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Val15Xaa16Xaa17Xaa18Asn19Arg20Xaa21
(配列番号19;MAML−3関連)
ここで、
Xaa3はLeu、TrpまたはPheであり、
Xaa4はArg、Lys、Ala、Aib(アミノイソブチル)であり、
Xaa7はIle、Leu、またはNorLであり、
Xaa8はGlu、AlaまたはAibであり、
Xaa9はLeu、Trp、Phe、またはTyrであり、
Xaa10はCys、PheまたはValであり、
Xaa12はArg、AlaまたはAibであり、
Xaa16はThr、AlaまたはAibであり、
Xaa17はCys、Aib、Ala、またはD−ペンタフルオロフェニルアラニンであり、
Xaa18はGlu、AlaまたはAibである。
(配列番号13;MAML−1関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Ala5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Leu15Xaa16Xaa17Xaa18Gly19Arg20Xaa21
(配列番号16;MAML−2関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Gln5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Val15Xaa16Xaa17Xaa18Asn19Arg20Xaa21
(配列番号19;MAML−3関連)
ここで、
Xaa3はLeu、TrpまたはPheであり、
Xaa4はArg、Lys、Ala、Aib(アミノイソブチル)であり、
Xaa7はIle、Leu、またはNorLであり、
Xaa8はGlu、AlaまたはAibであり、
Xaa9はLeu、Trp、Phe、またはTyrであり、
Xaa10はCys、PheまたはValであり、
Xaa12はArg、AlaまたはAibであり、
Xaa16はThr、AlaまたはAibであり、
Xaa17はCys、Aib、Ala、またはD−ペンタフルオロフェニルアラニンであり、
Xaa18はGlu、AlaまたはAibである。
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Arg5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Ser15Xaa16Xaa17Xaa18Ala19Arg20Xaa21Glu22Ala23Val24Ser25Pro26Glu27Arg28Leu29
(配列番号14)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Ala5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Leu15Xaa16Xaa17Xaa18Gly19Arg20Xaa21Glu22Arg23Gly24Arg25Ala26Glu27Ser28Ser29
(配列番号17;MAML−2関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Gln5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Val15Xaa16Xaa17Xaa18Asn19Arg20Xaa21Gln22Gln23Ala24Gln25Val26Gly27Gln28Leu29
(配列番号20;MAML−3関連)
ここで、
Xaa3はLeu、TrpまたはPheであり、
Xaa4はArg、Lys、AlaまたはAib Xaa7はIle、Leu、またはNorLであり、
Xaa8はGluまたはAlaまたはAibであり、
Xaa9はLeu、Trp、Phe、またはTyrであり、
Xaa10はCys、PheまたはValであり、
Xaa12はArg、AlaまたはAibであり、
Xaa16はThrまたはAlaまたはAibであり、
Xaa17はCys、Aib、AlaまたはD−ペンタフルオロフェニルアラニンであり、
Xaa18はGlu、AlaまたはAibであり、
Xaa21はTyr、1−ナフチルアラニン、Trp、または2−ナフチルアラニンである。
(配列番号14)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Ala5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Leu15Xaa16Xaa17Xaa18Gly19Arg20Xaa21Glu22Arg23Gly24Arg25Ala26Glu27Ser28Ser29
(配列番号17;MAML−2関連)
Glu1Arg2Xaa3Xaa4Gln5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Val15Xaa16Xaa17Xaa18Asn19Arg20Xaa21Gln22Gln23Ala24Gln25Val26Gly27Gln28Leu29
(配列番号20;MAML−3関連)
ここで、
Xaa3はLeu、TrpまたはPheであり、
Xaa4はArg、Lys、AlaまたはAib Xaa7はIle、Leu、またはNorLであり、
Xaa8はGluまたはAlaまたはAibであり、
Xaa9はLeu、Trp、Phe、またはTyrであり、
Xaa10はCys、PheまたはValであり、
Xaa12はArg、AlaまたはAibであり、
Xaa16はThrまたはAlaまたはAibであり、
Xaa17はCys、Aib、AlaまたはD−ペンタフルオロフェニルアラニンであり、
Xaa18はGlu、AlaまたはAibであり、
Xaa21はTyr、1−ナフチルアラニン、Trp、または2−ナフチルアラニンである。
いくつかの実施形態において、上述した架橋ペプチドは、Xaa3がLeu、Xaa7がIle、かつXaa9がLeuの場合、Xaa10はCysではなく、かつ/または、Xaa7がIle、かつXaa9がLeu、かつXaa10がCysの場合、Xaa3はLeuではなく、かつ/または、Xaa3がLeu、Xaa9がIle、かつXaa10がCysの場合、Xaa7はIleではなく、かつ/または、Xaa3がLeu、Xaa7がIle、かつXaa10がCysの場合、Xaa9はLeuではない。
本明細書に記載の架橋ペプチドにおいて、N位のアミノ酸のα炭素は、N+4位のアミノ酸のα炭素と、両アミノ酸の側鎖を内部架橋で置換することにより架橋させたものであってもよい。ペプチドが2個の内部架橋を有する場合では、N位のアミノ酸のα炭素は、N+4位のアミノ酸のα炭素と、両アミノ酸の側鎖を内部架橋で置換することにより架橋させたものであってよく、また、N+8位のアミノ酸のα炭素をN+12位のアミノ酸のα炭素と、両アミノ酸の側鎖を内部架橋で置換することにより架橋させたものであってよい。1個のアミノ酸が2個の架橋に関与している、すなわち1個のアミノ酸のα炭素が2個の異なるアミノ酸に架橋した2個の架橋を有する所謂ステッチドペプチドの場合、N位のアミノ酸のα炭素はN+4位のアミノ酸のα炭素に架橋していてもよく、N+4位のアミノ酸のα炭素はN+8位のアミノ酸のα炭素に架橋していてもよい。これは通常、N位のアミノ酸の側鎖をN+4位のアミノ酸のα炭素への架橋と置換すること、N+4位のアミノ酸の側鎖およびHのそれぞれを架橋(1つはN位のアミノ酸への架橋、もう1つはN+8位のアミノ酸への架橋)で置換すること、およびN+8位のアミノ酸の側鎖をN+4位のアミノ酸のα炭素への架橋と置換することによって達成される。
配列番号12(および13〜20)において、好ましい架橋は、Xaa4とXaa8との間、Xaa8とXaa12との間、Xaa12とXaa16との間、Xaa4とXaa8および同時にXaa8とXaa12との間(ステッチドペプチド)、Xaa8とXaa12および同時にXaa12とXaa16との間(ステッチドペプチド)である。
一態様において、本開示は式(I)の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を特徴とし、
R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはC1〜C10アルキル(好ましくはメチル)、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
R3はアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは[R4’−K−R4]n(それぞれ0〜6個のR5で置換される)であり、
R4およびR4’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり(例えば、それぞれ独立してC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9またはC10アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり)、
R5はハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
KはO、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、
R6はH、アルキル、または治療剤であり、
nは2、3、4または6であり、
xは2〜10の整数(好ましくは3〜6)であり、
wおよびyは独立して0〜100の整数であり、
zは1〜10の整数(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)であり、
Xaaはそれぞれ独立してアミノ酸(例えば20個の天然のアミノ酸のうちの1つまたは任意の天然非天然のアミノ酸、例えばD−アミノ酸またはαアルキルアミノ酸(例えばαメチルアミノ酸))であり、
上記ポリペプチドは、配列番号12〜20のいずれかまたはその異型の少なくとも8個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、(a)配列番号12〜20の連続する8アミノ酸のうち、3、4または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも1対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されているもの、および(b)そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR2で置換されているもの、を除くものを含む。したがって、配列[Xaa]wL’[Xaa]yL”[Xaa]z(ここで、L’およびL”は側鎖が結合基R3で置換されたアミノ酸である)は少なくとも配列番号12〜20の連続したアミノ酸を含む。
別の態様において、本発明は式(II)の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を特徴とし、
R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはC1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
R3はC8〜C16アルキレン、C8〜C16アルケニレン(好ましくは4位と5位の炭素間に二重結合を有するC8アルケニレン)またはC8〜C16アルキニレン、あるいは[R4’−K−R4]n(それぞれ0〜6個のR5で置換される)であり、
R4およびR4’は独立してC1〜C10アルキレン、C2〜C10アルケニレンまたはC2〜C10アルキニレンであり(例えば、それぞれ独立してC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9またはC10アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり)、
R5はハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
KはO、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、
R6はH、C1〜C10アルキル、または治療剤であり、
xは2〜10の整数(好ましくは3〜6)であり、
wおよびyは独立して0〜100の整数であり、
zは1〜10の整数(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)であり、
Xaaはそれぞれ独立してアミノ酸(例えば20個の天然のアミノ酸のうちの1つまたは任意の天然非天然のアミノ酸)であり、
R7はPEG、tatタンパク質、アフィニティーラベル、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、例えばチオカルバメート、カルバメート、アミド、アミン、エーテルまたはトリアゾール結合を介して結合した蛍光プローブ(例えばフルオレセインまたはローダミン)であり、
R8はH、OH、NH2、NHR8a、NR8aR8bであり、
上記ポリペプチドは、配列番号12〜20のいずれかまたはその異型の少なくとも14個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、(a)配列番号12〜20の連続する8アミノ酸のうち、3、4または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも1対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されているもの、および(b)そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(II)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(II)に示されるようにR2で置換されているもの、を除くものを含む。したがって、ペプチド[Xaa]wX[Xaa]yX’[Xaa]x(ここで、[Xaa]w、[Xaa]y、および[Xaa]xは式(I)および(II)において上記で定義したとおりであり、XおよびX’は側鎖が結合基R3で置換されたアミノ酸を表す)は少なくとも配列番号12〜20の連続したアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、[R4’−K−R4]nは
更に、式(IV)を有するペプチドまたはその薬学的に許容される塩も含まれる。
R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはC1〜C10アルキル(好ましくはメチル)、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
R3はアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは[R4’−K−R4]n(それぞれ0〜6個のR5で置換される)であり、
R4およびR4’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり(例えば、それぞれ独立してC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9またはC10アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり)、
R5はハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
KはO、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、
R6はH、アルキル、または治療剤であり、
xおよびx’は独立して2〜10の整数(好ましくは3〜6;好ましくは両方とも3、あるいは一方が3で他方が6)であり、
wおよびyは独立して0〜100の整数であり、
Xaaはそれぞれ独立してアミノ酸(例えば20個の天然のアミノ酸のうちの1つまたは任意の天然非天然のアミノ酸、例えばD−アミノ酸またはαアルキルアミノ酸(例えばαメチルアミノ酸))であり、
上記ポリペプチドは、配列番号12〜20のいずれかまたはその異型の少なくとも8個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、(a)配列番号12〜20の連続する8アミノ酸のうち、3、4または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも1対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されているもの、および(b)そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR2で置換されているもの、を除くものを含む。
上述したように、架橋の位置は様々であり得る。特定の例が下記に示される。これらにおいて、「AA」はアミノ酸側鎖を表し、「L」は分子内架橋(式(I)〜(IV)のR3)を表す。
x=2(すなわちN+3結合)の場合、R3はC7アルキレンまたはアルケニレンであり得る。それがアルケニレンである場合、1個以上の二重結合が存在し得る。x=6(すなわちi+7結合)の場合、R3はC12またはC13アルキレンまたはアルケニレンであり得る。それがアルケニレンである場合、1個以上の二重結合が存在し得る。x=3(すなわちi+4結合)の場合、R3はC8アルキレン、アルケニレンであり得る。それがアルケニレンである場合、1個以上の二重結合が存在し得る。
ステープルドペプチドにおいて、Glnが占める任意の位置はGluに替えてもよく、Gluが占める任意の位置はGlnに替えてもよい。同様に、Asnが占める任意の位置はAspに替えてもよく、Aspが占める任意の位置はAsnに替えてもよい。いくつかの場合において、AsnかArgか、およびGlnかGluかの選択は、ステープルドペプチドの所望の電荷に依存するであろう。多くの場合、架橋ペプチドは中性であるか、または生理的pHで正味の正電荷を持つことが好ましい。
いくつかの例において、wはそれぞれ独立して3〜15の整数である。いくつかの例において、yはそれぞれ独立して1〜15の整数である。いくつかの例において、R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはC1〜C6アルキルである。いくつかの例において、R1およびR2はそれぞれ独立してC1〜C3アルキルである。いくつかの例において、R1およびR2の少なくとも一方はメチルである。例えば、R1およびR2は両方ともメチルである。いくつかの例において、R3はアルキル(例えばC8アルキル)であり、xは3である。いくつかの例において、R3はC11アルキルであり、xは6である。いくつかの例において、R3はアルケニル(例えばC8アルケニル)であり、xは3である。いくつかの例において、xは6であり、R3はC11アルケニルである。いくつかの例において、R3は直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。いくつかの例において、R3は−CH2−CH2−CH2−CH=CH−CH2−CH2−CH2−である。いくつかの例において、R3は−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH=CH−CH2−CH2−CH2−である。いくつかの例において、R3は−CH2−CH2−CH2−CH=CH−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−である。
いくつかの例において、2個のα,α−二置換立体中心(α炭素)は両方ともR型またはS型(例えばN、N+4架橋)であるか、または一方の立体中心がR型かつ他方がS型(例えばN、N+7架橋)である。したがって、式(I)が
C’およびC”二置換立体中心は、例えばxが3の時、両方ともR型であってもよく、両方ともS型であってもよい。xが6の時は、C’二置換立体中心はR型であり、C”二置換立体中心はS型である。xが2の時は、C’二置換立体中心はR型であり、C”二置換立体中心はS型である。R3二重結合はE型またはZ型立体化学形態にあってもよい。式(II)において、すぐ上に示した式のC’およびC”に対応する炭素についても同様の形態が可能である。
いくつかの例において、R3は[R4−K−R4’]nであり、R4およびR4’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン(例えば、それぞれ独立してC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9またはC10アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン)である。
いくつかの例において、ポリペプチドは、分子内架橋で置換されたアミノ酸側鎖に加え、配列番号1〜21(例えば配列番号12〜20)のいずれかにおいて1、2、3、4または5個のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む。
架橋はアルキル、アルケニル、またはアルキニル部分(例えば、C5、C8またはC11アルキルまたはC5、C8またはC11アルケニル、あるいはC5、C8またはC11アルキニル)を含むことができる。架橋アミノ酸はα二置換(例えばC1〜C3またはメチル)であってもよい。[Xaa]yおよび[Xaa]wは独立して、異型MAML1、2または3ペプチド(例えば配列番号12〜20のいずれか)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25個またはそれ以上の連続するアミノ酸(好ましくは2または5個の連続するアミノ酸)を含み得るペプチドであり、[Xaa]xは異型MAML1、2または3ペプチドの少なくとも3または6個の連続するアミノ酸を含み得るペプチドである。
ペプチドは、異型MAML1、2または3ペプチドの8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個のアミノ酸を含んでいてもよい。これらのアミノ酸は、3または6個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸の1個以上の対が、例えばR3を介した架橋を形成するアミノ酸置換物により置換されていることを除いて連続している。すなわち、少なくとも2個のアミノ酸は架橋したアミノ酸または架橋したアミノ酸置換物で置換され得る。よって、式(I)が
ペプチドは、本明細書に記載の異型MAML1、2または3ポリペプチドの10個(11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50またはそれ以上)の連続するアミノ酸を含んでもよく、3個のアミノ酸(または6個のアミノ酸)によって隔てられた2個のアミノ酸のα炭素はR3を介して結合しており、その2個のα炭素のうちの一方はR1で置換され、他方はR2で置換され、それぞれペプチド結合を介して追加のアミノ酸に結合している。
いくつかの例において、上記ポリペプチドはNotch複合体形成の阻害剤として働く。いくつかの例において、上記ポリペプチドは、蛍光性部分またはラジオアイソトープまたはラジオアイソトープをキレートすることが可能な部分(例えば、メルカプトアセチルトリグリシン、またはRe、InまたはYの放射活性同位体をキレートした1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−N,N’,N”,N’”−テトラ酢酸(DOTA))を更に含む。いくつかの例において、R1およびR2はメチルであり、R3はC8アルキル、C11アルキル、C8アルケニル、C11アルケニル、C8アルキニル、またはC11アルキニルであり、xは2、3、または6である。いくつかの例において、上記ポリペプチドはPEGリンカー、tatタンパク質、アフィニティーラベル、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、蛍光プローブ(例えばフルオレセインまたはローダミン)または酵素機構をリクルートする別の生物活性分子であって、例えばユビキチンリガーゼ(ヌトリン(nutlin)、SAH−p53−8)に結合してリクルートする小分子、ヒストンデアセチラーゼタンパク質および複合体(SIN3αヘリックス、SAHA)またはコアクチベータータンパク質(MLLαヘリックス、VP16αヘリックス)等の生物活性分子を含む。
また、本明細書には患者を治療する方法であって、本明細書に記載の化合物のいずれかを患者に投与することを含む方法も記載される。いくつかの例において、その方法は追加の治療剤、例えば化学療法剤を投与することも含む。
上記ペプチドは、1個以上の不斉中心を含んでいてもよく、したがって、存在する任意のオレフィンのラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物および幾何異性体(例えばZまたはシスおよびEまたはトランス)として生じる。これらの化合物のそのような異性体はすべて本発明に明示的に包含される。上記化合物は多数の互変異性型で表わされる場合もあり、そのような例において、本発明は、本明細書に記載の化合物のすべての互変異性型を明示的に包含する(例えば、環系のアルキル化は多数の位置のアルキル化をもたらす場合があり、本発明はそのような反応生成物すべてを明示的に包含する)。そのような化合物のそのような立体異性体のすべては、すべての結晶形と同様に包含される。
α炭素と呼ばれる1個の炭素に結合したアミノ基とカルボキシル基とを両方含むアミノ酸。α炭素には更に水素および側鎖が結合している。適切なアミノ酸は、ペプチドに見られる20個の共通天然アミノ酸(例えば、A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V(一文字表記で知られているもの))のD型およびL型異性体の両方、および有機合成や他の代謝経路で作られる天然および非天然アミノ酸を含むがこれらに限定されない。下記の表は20個の共通天然アミノ酸の側鎖の構造を示す。この表中、各構造の右側の「−」はα炭素との結合である。
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、類似した側鎖を持つアミノ酸残基で置換することである。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で既に定義されている。これらのファミリーは塩基性側鎖を持つアミノ酸(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を持つアミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖を持つアミノ酸(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を持つアミノ酸(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖を持つアミノ酸(例えばトレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を持つアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
記号
用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸におけるα炭素に結合した部分を指す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチル、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチル、システインのアミノ酸側鎖はチオメチル、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチル、チロシンのアミノ酸側鎖は4−ヒドロキシフェニルメチル、等である。他の非天然アミノ酸側鎖も含まれ、例えば天然の側鎖(例えばアミノ酸代謝産物)や合成により作られる側鎖(例えばα二置換アミノ酸)である。
用語「ポリペプチド」は、共有結合(例えばアミド結合)で結合された2個以上の天然または合成アミノ酸を指す。本明細書に記載のポリペプチドは、完全長タンパク質(例えば完全に形成されたタンパク質)も、それより短いアミノ酸配列(例えば天然タンパク質の断片または合成ポリペプチド断片)も含む。用語「異型MAML−1ペプチド」は配列番号12〜14を含む。用語「異型MAML−2ペプチド」は配列番号15〜17を含む。用語「異型MAML−3ペプチド」は配列番号18〜20を含む。
用語「ハロ」はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意のラジカルを指す。用語「アルキル」は、指定された数の炭素原子を含む直鎖でも分岐鎖でもよい炭化水素鎖を指す。例えば、C1〜C10は、その基が1〜10個(包括的)の炭素原子を有し得ることを示す。数字による指定がない場合、「アルキル」は1〜20個(包括的)の炭素原子を有する鎖(直鎖または分岐鎖)である。用語「アルキレン」は二価アルキル(すなわち−R−)を指す。
用語「アルケニル」は、Z型またはE型幾何学形態にある1個以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖でも分岐鎖でもよい炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は指定された数の炭素原子を含む。例えば、C2〜C10はその基が2〜10個(包括的)の炭素原子を有し得ることを示す。用語「低級アルケニル」はC2〜C8アルケニル鎖を指す。数字による指定がない場合、「アルケニル」は2〜20個(包括的)の炭素原子を有する鎖(直鎖または分岐鎖)である。
用語「アルキニル」は、1個以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖でも分岐鎖でもよい炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は指定された数の炭素原子を含む。例えば、C2〜C10はその基が2〜10個(包括的)の炭素原子を有し得ることを示す。用語「低級アルキニル」はC2〜C8アルキニル鎖を指す。数字による指定がない場合、「アルキニル」は2〜20個(包括的)の炭素原子を有する鎖(直鎖または分岐鎖)である。
用語「アリール」は6炭素単環式または10炭素二環式芳香環系を指し、ここで、各環の0、1、2、3、または4個の原子は置換基で置換されてもよい。アリール基の例として、フェニル、ナフチル等が挙げられる。用語「アリールアルキル」または用語「アラルキル」はアリールで置換されたアルキルを指す。用語「アリールアルコキシ」はアリールで置換されたアルコキシを指す。
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、3〜12個の炭素、好ましくは3〜8個の炭素、更に好ましくは3〜6個の炭素を有する飽和および一部不飽和の環状炭化水素基であって、その環状アルキル基が任意に置換されていてもよい環状炭化水素基を含む。好ましいシクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを含むがこれらに限定されない。
用語「ヘテロアリール」は、芳香族の5〜8員単環系、8〜12員二環系、または11〜14員三環系であって、単環の場合1〜3個のヘテロ原子を、二環の場合1〜6個のヘテロ原子を、三環の場合1〜9個のヘテロ原子を有するものを指す。上記ヘテロ原子はO、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および、単環、二環、三環の場合それぞれ1〜3、1〜6、または1〜9個のN、O、またはSのヘテロ原子)、各環の0、1、2、3、または4個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例として、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、1,2,3−トリアゾリル、1,2,4−トリアゾリル、ベンゾイミダゾール、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等が挙げられる。用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」はヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」はヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
用語「ヘテロシクリル」は非芳香族の5〜8員単環系、8〜12員二環系、または11〜14員三環系であって、単環の場合1〜3個のヘテロ原子を、二環の場合1〜6個のヘテロ原子を、三環の場合1〜9個のヘテロ原子を有するものを指す。上記ヘテロ原子はO、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および、単環、二環、三環の場合それぞれ1〜3、1〜6、または1〜9個のN、O、またはSのヘテロ原子)、各環の0、1、2または3個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例として、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、アジリジニル、オキシリル、チイリル(thiiryl)、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基の任意の原子の所で「置換された」基を指す。適切な置換基は、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、アジド、およびシアノ基を含むがそれらに限定されない。
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
以下に、Notch転写複合体(NTC)の分子ダイナミクス(MD)コンピュータモデルを説明する。このモデルはNTCの広範囲な安定性およびdnMAML1、ANK1およびCSLのタンパク質−タンパク質接触面に関与するすべての残基の寄与を調査するために使用された。また、NTC複合体形成を測定する生化学的アッセイ、反復的医化学アプローチ、および、SAHMよりも強力なペプチドを含む架橋MAML1ペプチドを設計するための細胞ベースのアッセイと組み合わせたこれらのモデルの使用も以下に説明する。
以下に、ヒトMAML1(およびMAML−2およびMAML−3)に関連する様々な内部架橋αヘリックスドメインポリペプチドを説明する。これらのポリペプチドは、そのポリペプチドのαヘリックス二次構造を優位に促進する2個の非天然アミノ酸(すなわち、側鎖が架橋で置換されている2個のアミノ酸)の間の内部架橋を含む。一般に、架橋(ステープルと称する場合もある)は1または2個のヘリックスターンの長さ(すなわち、約3、4または約7個のアミノ酸)を横切るように延びる。したがって、iとi+3、iとi+4、またはiとi+7の位置にあるアミノ酸は、化学的修飾および架橋の理想的な候補である。よって、例えばペプチドが・・・Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9・・・(「・・・」は任意に追加のアミノ酸が存在することを示す)の配列を有する場合、Xaa1とXaa4との間の架橋、またはXaa1とXaa5との間の架橋、またはXaa1とXaa8との間の架橋は、Xaa2とXaa5との間の架橋、またはXaa2とXaa6との間の架橋、またはXaa2とXaa9との間等の架橋と同様に有用である。ポリペプチドは、そのポリペプチド配列中に、その配列を更に安定化するため、またはより長いポリペプチド伸長の安定化を容易にするために、1個以上の架橋を含み得る。一部において、ポリペプチドが長すぎて容易に合成できない場合、独立に合成した複数の架橋ペプチドをネイティブケミカルライゲーションと呼ばれる技術によって結合してもよい(Bang,et al.,J.Am.Chem.Soc.126:1377)。
本明細書では、ICN1−CSL複合体に対する親和性を示し、かつ対応する非修飾(架橋されていない)MAML1ペプチドとは対照的に、より容易に細胞に入り込む機構を示すMAML1の安定化αヘリックス(stabilized alpha−helix)(SAH−MAML1)ペプチドを説明する。
様々な長さのオレフィン側鎖を含むα,α−二置換非天然アミノ酸は、既知の方法で合成することができる(Williams et al.1991 J.Am.Chem.Soc. 113:9276;Schafmeister et al. 2000 J.Am.Chem.Soc.122:5891)。iがi+7に結合したステープルを用いるペプチド(ヘリックスの2個のターンが安定化されている)については、1個のS5アミノ酸および1個のR8を用いるか、あるいは1個のS8アミノ酸および1個のR5アミノ酸を用いる。R8は、出発キラル補助基がR−アルキル立体異性体を与えることを除き、同じ手段を用いて合成される。また、8−ヨードオクテンを5−ヨードペンテンの代わりに用いる。阻害剤は、MBHA樹脂上の固相ペプチド合成(SPPS)を用いて固体支持体上で合成する。
単一のアミノ酸が2個の架橋に関与する架橋ペプチドの調製方法は米国特許出願公開第2010/184645号明細書に記載されており、参照により本明細書に援用される。
(NTCの分子ダイナミクスシミュレーション)
NTC(dnMAML1−ANK1−CSL)のMDシミュレーションは、約5ns後に、この時点後の複合体RMSDの相対的安定化により証明されたように、収束した(図1b、左)。タンパク質−ペプチド結合相互作用は、dnMAML1の残基の対とANK1−CSLの接触面における浅い溝との間の多数の弱い相互作用により構成される(図1b、右)。相互作用の結合自由エネルギーに最も寄与する残基、すなわちタンパク質−ペプチド接触面における所謂「ホットスポット」は、いくつかのタンパク質−タンパク質相互作用(例えばp53−MDM2接触面)において空間的に集合しており、他は、より大きい結合接触面に沿って、より散らばっている。本発明者らのdnMAML1ステープルドペプチドフラグメントの評価および公開されている突然変異誘発実験では、重要な接触の大多数はN末端ヘリックス中に含まれるものの、結合エネルギーが接触面のどの程度の範囲まで分布しているかについてはほとんど分かっていないことが示されている。dnMAML1の各残基のNTC複合体安定性へのエネルギー寄与を確認するために、本発明者らはコンピュータによる結合自由エネルギー分解(BFED)分析を採用した。類似の方法はコンピュータによるアラニンスキャニング(CAS)であり、これは、所定の残基をアラニンに変異させた時の自由エネルギー中の電荷を算定するものである。アラニンへの変異はかなりの立体構造変化を引き起こし得、したがって結合系を乱すが、これはCASによっては示すことができない。一方、BFED法は主鎖および側鎖の両方のエネルギー寄与を計算し、アラニン変異の摂動を取り入れない。そのため、本発明者らは、収束MD軌跡(5〜35ns)から抽出したスナップショットに基づくこの系にBFED法を適用した。
(NTCの分子ダイナミクスシミュレーション)
NTC(dnMAML1−ANK1−CSL)のMDシミュレーションは、約5ns後に、この時点後の複合体RMSDの相対的安定化により証明されたように、収束した(図1b、左)。タンパク質−ペプチド結合相互作用は、dnMAML1の残基の対とANK1−CSLの接触面における浅い溝との間の多数の弱い相互作用により構成される(図1b、右)。相互作用の結合自由エネルギーに最も寄与する残基、すなわちタンパク質−ペプチド接触面における所謂「ホットスポット」は、いくつかのタンパク質−タンパク質相互作用(例えばp53−MDM2接触面)において空間的に集合しており、他は、より大きい結合接触面に沿って、より散らばっている。本発明者らのdnMAML1ステープルドペプチドフラグメントの評価および公開されている突然変異誘発実験では、重要な接触の大多数はN末端ヘリックス中に含まれるものの、結合エネルギーが接触面のどの程度の範囲まで分布しているかについてはほとんど分かっていないことが示されている。dnMAML1の各残基のNTC複合体安定性へのエネルギー寄与を確認するために、本発明者らはコンピュータによる結合自由エネルギー分解(BFED)分析を採用した。類似の方法はコンピュータによるアラニンスキャニング(CAS)であり、これは、所定の残基をアラニンに変異させた時の自由エネルギー中の電荷を算定するものである。アラニンへの変異はかなりの立体構造変化を引き起こし得、したがって結合系を乱すが、これはCASによっては示すことができない。一方、BFED法は主鎖および側鎖の両方のエネルギー寄与を計算し、アラニン変異の摂動を取り入れない。そのため、本発明者らは、収束MD軌跡(5〜35ns)から抽出したスナップショットに基づくこの系にBFED法を適用した。
N末端からP46まで(1個のキンク(kink)を取り込む以外は連続したヘリックスである)、dnMAML1はANK1およびCSLの両方で構成される表面に結合する。P46からC末端まで、dnMAML1はCSLと相互作用するのみである(図1b、右)。表1は、dnMAML1−ANK1−CSL結合自由エネルギーに最も寄与する上位15残基を一覧にしたものである(図1b、右)。本発明者らは、上位15個のホットスポット残基のうちの10個(太字のもの)がdnMAML1(N末端からP46)とANK1−CSLとの間の接触面に位置していることを発見した。このことは、この領域が結合にとってより重要であることを示している。上位にランキングされたN末端へリックスの外側の残基は、L59を有するCSLの疎水性の溝とdnMAML1のT56との間の相互作用の周囲に集まる。N末端へリックス内の上位の残基は、dnMAML1内に、ANK1のD1973およびE2009、ならびにCSLのE378と安定な塩のブリッジを形成するアルギニンのクラスター(R22、R25およびR31)を含む。この伸長部における他の重要な残基には、2個のヒスチジン(H34およびH33)、および1個のチロシン(Y41)が含まれ、これらのファンデルワールスエネルギー項は、結合の自由エネルギーの中心となる。以前の実験では、ゲルシフトアッセイにより、R25E/R22Eの2つからなるdnMAML1変異またはD1973RからなるANK1変異がNTC複合体の形成を抑制したことが報告された45。更に、本発明者らは以前に、R22E/R26E変異を含むステープルドペプチドSAHM1−D1が多くのアッセイで活性の減少を示すことを報告した37。これらの発見と合致して、本発明者らの計算では、R25およびD1973(図1bにおいて赤で色付けされている)はそれぞれ、dnMAML1およびANK1において最も重要な残基であることが判明した。このモデルでは、M380(図1bにおいて赤で色付けされている)が、dnMAML1のI27、C30、R31およびH34と相互作用する、CSLにおける重要な残基であることも予測された。
図1cは、dnMAML1の各残基のBFED寄与を示し、ここで、負の値は重要な相互作用を表し、小さい値または正の値は重要でないか有害な相互作用をそれぞれ表す。これらの計算は、本発明者らの報告したステープルドペプチド評価の結果を要約したものである。ここで、重要な接触の大多数は、SAHM1の生成に用いたE21〜T36までの伸長部に含まれている。この領域における高密度の結合エネルギー分布は、多くの種からのマスターマインドオルソログのこのペプチド伸長部における高度な保存を説明する(図1d)。重要なことに、これらの計算は、結合には関与するが利用されなくてもよい多くの残基(dnMAML1のこの伸長部においてL23、I27、L29およびC30を含む)もハイライトする。これらの残基の天然または非天然アミノ酸への変異により、より強力かつ特異的なNOTCH複合体のステープルドペプチド阻害剤が生成される可能性がある。
(非修飾およびステープルドMAMLペプチドの分子ダイナミクスシミュレーション)
本発明者らは次に、ステープルドペプチドを正確に描き、かつNTCを標的とするSAHMアナログの設計情報を与えることが可能な分子ダイナミクスモデルの開発に努めた。公開されている多数の報告が、ステープルドペプチドを研究するためにMDシミュレーションを採用している。しかしながら、これらは主に炭化水素ステープルのペプチド安定性およびヘリシティへの影響に関するものである47、48。本発明者らは、ステープルドペプチド結合の定量的な情報を得るため、およびアナログのSARパラメータを開発するためにMDシミュレーションを成功裏に採用した報告を全く知らない。本発明者らの計算において、E21〜T36dnMAML1ペプチド[MAML1(21〜36)]がヘリックスを保つ程度を最初に評価するため、NOTCH複合体から抽出した対応するヘリックス構造についてMDシミュレーションを実施した。また、E28およびR32をi→i+4結合α,α−二置換「S5」アミノ酸に変異させることにより(図6)、対応するステープルドペプチドアナログ(SAHM1)も作製した。NTCシミュレーションと同様のパラメータを用いて、陽溶媒中のMAML1(21〜36)およびSAHM1について20nsMDシミュレーションを実施した。MD軌跡により、MAML1(21〜36)は約6〜9ns後にそのαヘリックス構造を失い(図1e)、一方、SAHM1は20nsMDシミュレーションの全体に亘り、C末端のセリン−トレオニン伸長部に僅かな無秩序があるものの、そのヘリックス内容をほぼ保持することが判明した(図1f)。MAML1(21〜36)のシミュレーション中、E28とR32との間の塩ブリッジは崩壊し、主鎖の水素結合は失われ、これによりペプチドの折り畳みはほどかれた。反対に、SAHM1の中心的な炭化水素ステープルはペプチドの中央でヘリックスターンを保持し、E21はR24またはR25と一時的な塩ブリッジを形成した。これらの定性的な結果は、以前にMAML1(21〜36)およびSAHM1のヘリシティを比較した円偏光二色性測定結果と合致している37。
本発明者らは次に、ステープルドペプチドを正確に描き、かつNTCを標的とするSAHMアナログの設計情報を与えることが可能な分子ダイナミクスモデルの開発に努めた。公開されている多数の報告が、ステープルドペプチドを研究するためにMDシミュレーションを採用している。しかしながら、これらは主に炭化水素ステープルのペプチド安定性およびヘリシティへの影響に関するものである47、48。本発明者らは、ステープルドペプチド結合の定量的な情報を得るため、およびアナログのSARパラメータを開発するためにMDシミュレーションを成功裏に採用した報告を全く知らない。本発明者らの計算において、E21〜T36dnMAML1ペプチド[MAML1(21〜36)]がヘリックスを保つ程度を最初に評価するため、NOTCH複合体から抽出した対応するヘリックス構造についてMDシミュレーションを実施した。また、E28およびR32をi→i+4結合α,α−二置換「S5」アミノ酸に変異させることにより(図6)、対応するステープルドペプチドアナログ(SAHM1)も作製した。NTCシミュレーションと同様のパラメータを用いて、陽溶媒中のMAML1(21〜36)およびSAHM1について20nsMDシミュレーションを実施した。MD軌跡により、MAML1(21〜36)は約6〜9ns後にそのαヘリックス構造を失い(図1e)、一方、SAHM1は20nsMDシミュレーションの全体に亘り、C末端のセリン−トレオニン伸長部に僅かな無秩序があるものの、そのヘリックス内容をほぼ保持することが判明した(図1f)。MAML1(21〜36)のシミュレーション中、E28とR32との間の塩ブリッジは崩壊し、主鎖の水素結合は失われ、これによりペプチドの折り畳みはほどかれた。反対に、SAHM1の中心的な炭化水素ステープルはペプチドの中央でヘリックスターンを保持し、E21はR24またはR25と一時的な塩ブリッジを形成した。これらの定性的な結果は、以前にMAML1(21〜36)およびSAHM1のヘリシティを比較した円偏光二色性測定結果と合致している37。
(SAHM1アナログのANK1−CSLとのシミュレーションおよびBFED計算)
これらのMDモデルに誘導され、本発明者らは続いて、改善されたSAHM1アナログを設計できるか否か決定することを目標とした。非天然アミノ酸リンカーを含むアナログペプチドを、最初のX線構造(PDBid:2f8x)に基づき作成し、dnMAML1をSAHM1アナログで置換することによりMDシミュレーションを実行した。変異させた天然/非天然残基(ステープルを含む)をMaestro(登録商標)8.5で作成した。非天然残基の作成のためのパラメータは実験方法の節に詳述されている。変異したアミノ酸を有する新たなNOTCH複合体それぞれの立体構造の調査は、Macromodelを用いて行い、その後エネルギー最小化を行った。変異させた残基の自由な動きを許容し、4Å以内の周囲の残基を定数200()によって規制し、かつ他の残基を固定したままにすることによって、Macromodelのmixed torsional/lowモードモンテカルロ法を適用した。最低エネルギーの立体構造を、NTCシミュレーションで用いたものと同じパラメータ設定のMDシミュレーションの出発構造として用いた。SAHM1アナログが異なる新たな複合体それぞれについて、16nsMDシミュレーションを実施した。収束MD軌跡に沿ってスナップショットを抽出し、SAHM1アナログのANK1−CSL複合体への相対結合親和性を比較するために、MMGBSAスコアを算出した。
これらのMDモデルに誘導され、本発明者らは続いて、改善されたSAHM1アナログを設計できるか否か決定することを目標とした。非天然アミノ酸リンカーを含むアナログペプチドを、最初のX線構造(PDBid:2f8x)に基づき作成し、dnMAML1をSAHM1アナログで置換することによりMDシミュレーションを実行した。変異させた天然/非天然残基(ステープルを含む)をMaestro(登録商標)8.5で作成した。非天然残基の作成のためのパラメータは実験方法の節に詳述されている。変異したアミノ酸を有する新たなNOTCH複合体それぞれの立体構造の調査は、Macromodelを用いて行い、その後エネルギー最小化を行った。変異させた残基の自由な動きを許容し、4Å以内の周囲の残基を定数200()によって規制し、かつ他の残基を固定したままにすることによって、Macromodelのmixed torsional/lowモードモンテカルロ法を適用した。最低エネルギーの立体構造を、NTCシミュレーションで用いたものと同じパラメータ設定のMDシミュレーションの出発構造として用いた。SAHM1アナログが異なる新たな複合体それぞれについて、16nsMDシミュレーションを実施した。収束MD軌跡に沿ってスナップショットを抽出し、SAHM1アナログのANK1−CSL複合体への相対結合親和性を比較するために、MMGBSAスコアを算出した。
前述したNTC MDシミュレーションの結果から、残基L23、I27、L29およびC30は、dnMAML1結合自由エネルギーに大きくは寄与しないことが示された。これにより、ANK1−CSLとのより強力な相互作用を得るために、これらの残基を変異させてもよいことが示唆される。この前提を試験するため、これらの位置に疎水性点突然変異を含むアナログペプチドの集中的ライブラリーを構築した。各ペプチドのMD軌跡の分析およびMMGBSAスコアを用い、各変異が好ましいものであるか否か、ならびに、各位置についてどれが最良の変異(複数の変異を含む)であるかを決定した。非修飾MAML1(21〜36)ペプチドに対するMMGBSAスコアを算出し、図1gに示す。注目すべき点として、C30およびL23から、より大きい芳香族側鎖(それぞれ、フェニルアラニンおよびトリプトファン)への変異はMMGBSAスコアに最も大きい効果を及ぼすようであった。L29およびI27への変異は正の効果を有する場合があり(L29F/Y/W、I27L)、他では有害であった(L29I、I27F/W)。全体として、これらの計算は、最適化相互作用がこれらの変異を介して与えられ得るという見解を支持する。よって、本発明者らはNTCアセンブリを測定する確固たる生化学的アッセイを開発し、そしてこの一連のアナログを試験することに努めた。これらの変異の効果についての構造上の根拠は、下記で説明し、生化学的研究の結果と比較する。
(ALPHAスクリーニングアッセイの開発とNTCの生化学)
NTCアセンブリの生物物理学を、電気泳動移動度シフト解析24、等温滴定型熱量測定49、および様々な免疫沈降法を含む比較的ロースループットのアッセイを用いて調べた。最近では、デル・ビアンコ(Del Bianco)らが、NTCアセンブリ時のドナーフルオロフォア標識ANKタンパク質のアクセプター標識オリゴヌクレオチドへの近接度を測定するFRETベースのシステムの使用を報告しており、このシステムは、複合体全体についての相対平衡定数の測定を可能にする45。本発明者らも、NTCコンポーネント同士の会合およびNTCコンポーネントとステープルドペプチドとの会合を測定する表面プラズモン共鳴(SPR)および蛍光極性アッセイの使用を報告した37。しかしながら、今日まで、dnMAML1−NOTCH−CSL複合体形成を定量的に測定するハイスループットアッセイは報告されていない。本発明者らは本願において、dnMAML1のNOTCH−CSLヘテロダイマーへの結合を測定するための、ALPHAスクリーニング技術を用いた確固たる均質なアッセイを紹介する。ALPHAスクリーニング技術(ALPHAはamplified luminescence proximity homogenous assayを意味する)は、溶液中で同種の結合パートナーの会合を検出するために、機能性を付与した直径約200nmのビーズを使用する50、51。ドナービーズのレーザ励起(680nm)により、一重項酸素流が放出され、これは個別の半減期に起因して、約200nmで拡散する。結合相互作用を介して近位に局在しているアクセプタービーズは、低波長(520〜620nm)の放射を放出する発光カスケードにおいて一重項酸素を利用する。図2aに示すように、このアッセイは、合成ビオチン化dnMAML1ペプチドの、CSLおよびGST標識RAMANK1の複合体との会合を検出するように構成された(RAMドメインおよびANKドメインは、CSL結合に関してICNの最小サブユニットを構成する)。このアッセイ形式を可能にするために、本発明者らは最初に、完全合成dnMAML1ポリペプチド(sdnMAML1、残基16〜70)を合成および精製する方法を開発した。その方法は、従来の方法による固相ペプチド合成(SPPS、図2b)のサイズ制限を超える。マイクロ波を利用したペプチド合成および僅かに変更したSPPSプロトコールは、ビオチン化sdnMAML1ペプチド(bio−sdnMAML1、他は代替のN末端修飾)を、LCMS分析による純度95%超で容易に提供した(図2b、図7)。
NTCアセンブリの生物物理学を、電気泳動移動度シフト解析24、等温滴定型熱量測定49、および様々な免疫沈降法を含む比較的ロースループットのアッセイを用いて調べた。最近では、デル・ビアンコ(Del Bianco)らが、NTCアセンブリ時のドナーフルオロフォア標識ANKタンパク質のアクセプター標識オリゴヌクレオチドへの近接度を測定するFRETベースのシステムの使用を報告しており、このシステムは、複合体全体についての相対平衡定数の測定を可能にする45。本発明者らも、NTCコンポーネント同士の会合およびNTCコンポーネントとステープルドペプチドとの会合を測定する表面プラズモン共鳴(SPR)および蛍光極性アッセイの使用を報告した37。しかしながら、今日まで、dnMAML1−NOTCH−CSL複合体形成を定量的に測定するハイスループットアッセイは報告されていない。本発明者らは本願において、dnMAML1のNOTCH−CSLヘテロダイマーへの結合を測定するための、ALPHAスクリーニング技術を用いた確固たる均質なアッセイを紹介する。ALPHAスクリーニング技術(ALPHAはamplified luminescence proximity homogenous assayを意味する)は、溶液中で同種の結合パートナーの会合を検出するために、機能性を付与した直径約200nmのビーズを使用する50、51。ドナービーズのレーザ励起(680nm)により、一重項酸素流が放出され、これは個別の半減期に起因して、約200nmで拡散する。結合相互作用を介して近位に局在しているアクセプタービーズは、低波長(520〜620nm)の放射を放出する発光カスケードにおいて一重項酸素を利用する。図2aに示すように、このアッセイは、合成ビオチン化dnMAML1ペプチドの、CSLおよびGST標識RAMANK1の複合体との会合を検出するように構成された(RAMドメインおよびANKドメインは、CSL結合に関してICNの最小サブユニットを構成する)。このアッセイ形式を可能にするために、本発明者らは最初に、完全合成dnMAML1ポリペプチド(sdnMAML1、残基16〜70)を合成および精製する方法を開発した。その方法は、従来の方法による固相ペプチド合成(SPPS、図2b)のサイズ制限を超える。マイクロ波を利用したペプチド合成および僅かに変更したSPPSプロトコールは、ビオチン化sdnMAML1ペプチド(bio−sdnMAML1、他は代替のN末端修飾)を、LCMS分析による純度95%超で容易に提供した(図2b、図7)。
SPRを、固定化bio−sdnMAML1ペプチドと等モルのRAMANK1−CSL複合体との間の結合動態を測定するために用い、高親和性結合(KD=0.04μM、図2c)が確認された。本発明者らの知る限りでは、これらの実験は、NTCの任意のコンポーネントへのdnMAML1の親和性を最初に報告したものである。本発明者らの以前の結果およびMD計算が示唆するように、N末端ヘリックスが単独でRAMANK1−CSLに結合する能力を持つのか否かを確認するために、SPRによってbio−nt−sdnMAML1(残基16〜45)の親和性も測定した(図2d、図6)。N末端dnMAML1ペプチドはRAMANK1−CSLに結合することが確認されたが(KD=0.4μM)、bio−sdnMAML1やbio−SAHM1ほど強くはなかった(KD=0.1μM、図2d、e)。
NTC ALPHAスクリーニングアッセイの最適条件を決定するために、様々なGST−RAMANK1−CSLおよびbio−sdnMAML1濃度の滴定マトリクスを試験した。これらの実験により、10〜100nMの範囲の結合コンポーネントで最大約45000c.p.s.の発光シグナルにおける用量依存的増加が明らかになった(図2f)。重要なことに、より高濃度のタンパク質で特徴的な「フック効果(hook effect)」が観察され、これはGST標識タンパク質がALPHAスクリーニングビーズの結合能を上回って阻害性になるポイントを表す。最適条件下および最適結合パートナー濃度(全パートナーが40nM)では、このアッセイは顕著に優れたシグナル対ノイズ比(約30倍)をもたらすことが示され、全結合パートナーの存在に対して特異的であった(図2g)。非標識Ac−sdnMAML1ペプチドまたはAcW−SAHM1の、予備インキュベートされたbio−sdnMAML1−GSTRAMANK1−CSLの複合体への滴定は、複合体の用量依存的解離およびシグナル減少をもたらした(図2h)。総合すると、これらの結果は、NTC阻害剤のスクリーニングに理想的に適切な、NTCアセンブリを調べるための確固たるハイスループットの生化学的アッセイの創出を支援する。
(SAHMアナログSAR試験)
本発明者らのMD計算の関連性を相関させるために、図1gに示す一連の点突然変異SAHMアナログを合成し、競合的ALPHAスクリーニングによって特徴分析を行った(図3a)。一般的に、観察された阻害活性はMD予測とよく一致した。C30をValまたはPheで置換したペプチドは、SAHM1と比べて優れた複合体阻害を示し、一方、C30L化合物の作用は弱かった(図3b)。本発明者らのC30F変異体(SAHM1−3)での計算およびMDスナップショットの視覚的検査と酷似したこれらの結果により、CSLのF30とM356との間、L388とN349との間の安定な相互作用が明らかになった。更に、F30はANK1中に、CSLに向かって移動しA2007との相互作用を生み出すループも取り込んでいた(図3c)。L29の周囲の溝はかなり大きく、かつ極性であり、MDスナップショットの検査では、L29IやL29F変異については明らかな効果は判明しなかった。しかしながら、L29FはMMGBSAスコアを向上させた。L29のトリプトファンへの変異(SAHM1−6)は、ANK1のA2007およびL2006の側鎖およびN2041の主鎖との疎水性相互作用を促進するようであった。CSLのR382もW29に近づくように移動し、潜在的なカチオン−π相互作用を形成した(図3d)。L29Y(SAHM1−14)変異体も、CSLのR382とのこの相互作用に加え、ANK1のN2041の側鎖アミドならびにN2040およびV2039の主鎖カルボニルとの水素結合を形成するようであった(図3e)。モデリング結果では、L29YおよびL29W変異が結合を向上させることが示されていたが、L29のみの変異は全体的にペプチド性能に強い影響を及ぼさなかった。したがって、これらの変異は後に組合せ変異アナログにおいて調査した。
本発明者らのMD計算の関連性を相関させるために、図1gに示す一連の点突然変異SAHMアナログを合成し、競合的ALPHAスクリーニングによって特徴分析を行った(図3a)。一般的に、観察された阻害活性はMD予測とよく一致した。C30をValまたはPheで置換したペプチドは、SAHM1と比べて優れた複合体阻害を示し、一方、C30L化合物の作用は弱かった(図3b)。本発明者らのC30F変異体(SAHM1−3)での計算およびMDスナップショットの視覚的検査と酷似したこれらの結果により、CSLのF30とM356との間、L388とN349との間の安定な相互作用が明らかになった。更に、F30はANK1中に、CSLに向かって移動しA2007との相互作用を生み出すループも取り込んでいた(図3c)。L29の周囲の溝はかなり大きく、かつ極性であり、MDスナップショットの検査では、L29IやL29F変異については明らかな効果は判明しなかった。しかしながら、L29FはMMGBSAスコアを向上させた。L29のトリプトファンへの変異(SAHM1−6)は、ANK1のA2007およびL2006の側鎖およびN2041の主鎖との疎水性相互作用を促進するようであった。CSLのR382もW29に近づくように移動し、潜在的なカチオン−π相互作用を形成した(図3d)。L29Y(SAHM1−14)変異体も、CSLのR382とのこの相互作用に加え、ANK1のN2041の側鎖アミドならびにN2040およびV2039の主鎖カルボニルとの水素結合を形成するようであった(図3e)。モデリング結果では、L29YおよびL29W変異が結合を向上させることが示されていたが、L29のみの変異は全体的にペプチド性能に強い影響を及ぼさなかった。したがって、これらの変異は後に組合せ変異アナログにおいて調査した。
I27のロイシンへの変異(SAHM1−7)は、SAHM1に比べて高い阻害活性をもたらした。(図3b)。反対に、I27のメチオニン等量式(isostere)ノルロイシン(NL)またはフェニルアラニンへの変異は性能を有意には向上させなかった。一方、より大きいアミノ酸であるトリプトファンへの変異はNTC阻害にとって有害であった。これらのデータは基本的にはコンピュータによる計算と一致しているが、MDスナップショットでは、I27NL変異体がそのロイシン同位体よりも強力であると予測された(図1g)。MDスナップショットにより、ロイシン側鎖およびノルロイシン側鎖の両方が、V354、M356、M380およびV390に取り囲まれたCSL上の疎水性ポケットに、より効果的に嵌合し、MMGBSAスコアを向上させることが判明した(図3f)。MMGBSAスコアおよび競合的ALPHAスクリーニング性能に対する最大の向上は、L23の変異によって生じる。MDシミュレーションにおいて、SAHM1へのL23FまたはL23Wの導入は、CSLの残基N349〜M356を含むフレキシブルループにおける立体構造変化を引き起こすことが分かった。このフレキシブル領域の翻訳は、変異ペプチドを含むMDスナップショットにおいてL23F/WならびにI27およびR24への接触を改善した(図3g)。同様に、この位置における増加した疎水性部分はALPHAスクリーニング競合(SAHM1−11からSAHM1−13)において反復的減少をもたらし、SAHM1−13がSAHM1に対して最も強力な単一変異であった(図3b)。
全体として、これらの結果は変異NTC MDシミュレーションとNTC形成に対する生化学的性能との間の凡その一致を表し、したがって、本発明者らのステープルドペプチド−NTC MDモデルをアナログインヒビターの設計のための方策として使用することの正当性を実証する。
dnMAML1のE21〜T36領域に由来するアナログペプチドの設計に加え、BFED計算(図2b、c)により、SAHM1スカフォールドのC末端延長がより強力かつ特異的なステープルドペプチドを生じ得ることが示された。具体的には、Y41への延長(SAHM1−24)はdnMAML1のC37、E38、R40およびY41由来の相互作用を追加することが予測された(図3h)。L49への延長(SAHM1−75)は、ANK1ドメインをキャップするE42、V44、E47およびL49由来の潜在的な接触を更に追加するであろう(図3i)。これらの延長スカフォールドペプチドは、好ましい点突然変異を同時に多数の位置に組み込むことによって、更に複数回のSAHM1スカフォールドとの最適化に含められた。最初の組合せ変異体は、I27変異およびL29変異を、最も効果的な点突然変異であるL23WおよびC30Fのそれぞれと、および両方と併用した時の効果を決定することに注目した(図4a)。ALPHAスクリーニング競合実験により、L23W/I27L二重変異は、単一変異で観察された活性の利益を保持するが、この二重変異の有意な利益はないことが判明した(SAHM1−31/SAHM1−36と比較したSAHM1−21/SAHM1−23)。その理由は、両方の残基がCSL上の同じ疎水性の溝を標的とし、この溝はより大きい組合せには恐らく耐えられないためだと考えられる。L23W/C30F変異の組合せは、I27L変異およびL29Y変異の異なる組合せの存在下で、ペプチドの性能を向上させると考えられる(SAHM1−21、SAHM1−31およびSAHM1−56;図4d)。
更に、L23W/L29W組合せ変異体は、それぞれ競合性を向上させ好ましいMMGBSAスコアを得ることが確認されており、C30での小さい置換基(ただしC30F変異以外)との組合せで低いIC50値を有するペプチドをもたらした(図4a)。この一般的なSAR傾向は、L23W/C30FおよびL23W/L29W二重変異を含むより強力なペプチドを伴う、より大きいE21〜Y41ステープルドペプチドスカフォールドにおいても観察された(SAHM1−25、SAHM1−27、図4b)。E21〜Y41スカフォールド由来のペプチドは以前に報告されたものよりも大きいため、低下したヘリシティは低い標的親和性をもたらすかも知れない。ペプチド主鎖の下への多数のステープルの組み込みが活性を向上させるか否か決定するために、本発明者らは、αへリックスの2個の配列ターンに及ぶステープルを有する2個の「ステッチド」ペプチドを合成した(SAHM1−29、SAHM1−30、図8)。興味深いことに、どちらもその対応するステープルドペプチドほど活性は強くなかった(SAHM1−24、図4b)。最も大きいペプチドスカフォールド(E21〜L49)由来のアナログはSAHM1およびSAHM1−24よりも強力であった(図4b)。しかしながら、最も強力なE21〜L49ペプチドのコンピュータによるMDシミュレーションでは、ペプチドの大部分については安定な結合であったが、プロリンに誘発されたキンク後のC末端伸長ではかなり無秩序であった(図4e)。
本発明者らのNTC MDモデルにより可能となった予測される構造に基づく設計の利益を得る努力において、本発明者らは、非天然アミノ酸の組み込みがステープルドペプチドの性能も向上させるか否かを決定することに興味を持った。前述した点突然変異コンピュータスクリーニングと同様の手法において、本発明者らは市販の非天然アミノ酸のライブラリーを本発明者らのMDシミュレーションにインポートした。非天然アミノ酸は、MDで決定された最適化(L23、C30、C37およびY41を含む)のためにE21〜Y41スカフォールドの有望な部位内で置換された。結果として生じる変異体を、各結合部位−アミノ酸の対にドッキングし、MMGBSA自由エネルギー値およびMDスナップショットを得た。MMGBSAスコアおよびドッキング構造の比較により、これらの非天然アミノ酸を少数含むペプチドが結合を改善することが示唆され、結果として生じるペプチドが合成された(図4a、c;図8)。この努力から、いくつかの非天然アミノ酸が比較的ペプチド性能を保持すると同時に、タンパク質を構成しない側鎖を取り込むことが分かった(図4c)。注目すべき例は、C37のD−ペンタフルオロフェニルアラニンへの変異およびY41の1−ナフチルアラニンへの変異である(図4c、f)。対照的に、MDスクリーニングにおけるいくつかのヒットは、L23のニコチニルリシンアミノ酸での置換(SAHM1−53、図4a)のような有意に減少した活性を持つペプチドを得た。これらの結果は、MDシミュレーションがステープルドペプチドアナログに適切なタンパク質非構成残基を決定可能であるが、一方でいくつかの予測された立体構成は利用できず、有害な相互作用をもたらす場合があることを示唆する。しかしながら、一般に、これらのSAR試験は本発明者らの最初のMDシミュレーションの結果とよく合致し、主としてL23およびC30を、確立された(E21〜T36)および新規な(E21〜Y41)ステープルドペプチドスカフォールドの両方において、最適化の最も有望な部位であると決定した。I27との接触を形成するCSLの比較的固い疎水性の溝のMDスナップショットは改善の可能性を明らかにしたが、I27と有効なL23W変異とを組み合わせた変異はかなりの追加の利益を示した。反対に、L29によって標的化されるANK1の比較的極性かつ平坦な表面は、多数の組合せ変異アナログにおけるチロシンまたはトリプトファンへの変異を介した改善の部位であった。Y41およびL49に延長されたステープルドペプチドスカフォールドへの好ましい変異の包含は、性能の増大をもたらすことも分かった。
(ステープルドペプチドアナログの細胞ベースの活性)
これらのSAR試験により、3個のMAML1スカフォールドに基づくアナログステープルドペプチドが、野生型配列のみに基づくペプチドよりもNTC形成をより強く阻害可能であることが立証された。観察された活性の獲得にも関わらず、これらの改善は必ずしも向上した機能的有効性の指標とはならない。標的の嵌合に加え、ステープルドペプチドの細胞性活性を左右する主な要因は細胞内アクセス、細胞内分布および化学的安定性である。本明細書に記載のアナログが細胞内でNOTCH1−CSLトランス活性化を拮抗可能か否かを決定するために、構造的に活性化したNOTCH1によって決定される確立されたレポーター−遺伝子アッセイにおいてすべてのアナログを試験した37、46。U2OS細胞をCSL調節ホタルルシフェラーゼ構築物、対照のウミシイタケルシフェラーゼ構築物および短縮ΔEGFΔLNR−NOTCH1対立遺伝子で共トランスフェクションした後、アナログ化合物またはビヒクルで処理した。ALPHAスクリーニングアッセイにおけるステープルドペプチドのIC50値の比較およびNOTCH1駆動性レポーター遺伝子シグナルの標準化阻害の比較により、アナログのライブラリーについて、生化学的活性と細胞ベースの活性との間の強い相関関係が明らかになった(図5a、図9)。この分析により、E21〜T36およびE21〜Y41の両方のスカフォールドからのより強力なアナログは、ほぼ完全にレポーターを抑制可能であることが示された(図5b)。興味深いことに、より短いスカフォールドからの最適化アナログ(SAHM1−31、SAHM1−56)での用量依存的試験は、AcW−SAHM1と比較して僅かに低いEC50値が明らかになったのみである。より長いE21〜Y41スカフォールドに基づくアナログ(SAHM1−25、SAHM1−62)は、それぞれ約10μMおよび5μMの有意に低いEC50値を示した。注目すべきは、最も長いスカフォールドクラス(E21〜L49)からのペプチドがSAHM1−25およびSAHM1−62に類似したALPHAスクリーニングIC50値を示したのに対し、これらはNOTCH1/CSLレポーターシグナルの中程度の抑制しかもたらさなかったことである(図5a)。
これらのSAR試験により、3個のMAML1スカフォールドに基づくアナログステープルドペプチドが、野生型配列のみに基づくペプチドよりもNTC形成をより強く阻害可能であることが立証された。観察された活性の獲得にも関わらず、これらの改善は必ずしも向上した機能的有効性の指標とはならない。標的の嵌合に加え、ステープルドペプチドの細胞性活性を左右する主な要因は細胞内アクセス、細胞内分布および化学的安定性である。本明細書に記載のアナログが細胞内でNOTCH1−CSLトランス活性化を拮抗可能か否かを決定するために、構造的に活性化したNOTCH1によって決定される確立されたレポーター−遺伝子アッセイにおいてすべてのアナログを試験した37、46。U2OS細胞をCSL調節ホタルルシフェラーゼ構築物、対照のウミシイタケルシフェラーゼ構築物および短縮ΔEGFΔLNR−NOTCH1対立遺伝子で共トランスフェクションした後、アナログ化合物またはビヒクルで処理した。ALPHAスクリーニングアッセイにおけるステープルドペプチドのIC50値の比較およびNOTCH1駆動性レポーター遺伝子シグナルの標準化阻害の比較により、アナログのライブラリーについて、生化学的活性と細胞ベースの活性との間の強い相関関係が明らかになった(図5a、図9)。この分析により、E21〜T36およびE21〜Y41の両方のスカフォールドからのより強力なアナログは、ほぼ完全にレポーターを抑制可能であることが示された(図5b)。興味深いことに、より短いスカフォールドからの最適化アナログ(SAHM1−31、SAHM1−56)での用量依存的試験は、AcW−SAHM1と比較して僅かに低いEC50値が明らかになったのみである。より長いE21〜Y41スカフォールドに基づくアナログ(SAHM1−25、SAHM1−62)は、それぞれ約10μMおよび5μMの有意に低いEC50値を示した。注目すべきは、最も長いスカフォールドクラス(E21〜L49)からのペプチドがSAHM1−25およびSAHM1−62に類似したALPHAスクリーニングIC50値を示したのに対し、これらはNOTCH1/CSLレポーターシグナルの中程度の抑制しかもたらさなかったことである(図5a)。
多くの試験により、γセクレターゼ阻害剤、モノクローナル抗体およびステープルドペプチドを用いたNotch経路の抑制が、活性化NOTCH1変異を抱える多くのヒトT−ALL細胞株で増殖抑制およびアポトーシスを引き起こすことが実証されている46、5232、37。これと一致して、本発明者らは、2つの確立されたNOTCH1依存性T−ALL細胞株SUPT1およびHPB−ALLの最適化SAHMアナログでの処理が、3日後に有意に低下した細胞生存率をもたらすことを発見した(図5c)。HPB−ALL細胞およびSUPT1細胞とは対照的に、ジャーカットT−ALL細胞は、代替シグナル伝達経路への増加した信頼性に起因してNotch阻害剤への感受性の低下を示した53〜55、37。ジャーカット細胞のアナログSAHMペプチドのパネルでの処理は、3日後の細胞増殖に穏やかな効果を与えた(図5c)。加えて、HPB−ALL細胞の用量依存的処理は、アナログペプチドのレポーターアッセイで観察されたのと同様の有効濃度で増殖を阻害した(図5d)。まとめると、これらの結果により、E21〜T36およびE21〜Y41スカフォールドクラスからの最適化SAHMペプチドはNOTCH/CSL駆動性転写およびNOTCH1依存性T−ALL細胞株の細胞増殖を阻害することが確認された。これらは更に、E21〜Y41スカフォールドからの最適化ペプチドが、確立されたE21〜T36スカフォールドおよび新規なE21〜L49スカフォールドからのペプチドよりも強力であることを示す。
転写因子は、多くの疾患において最も注目される立証された標的のいくつかを代表する。それにもかかわらず、このタンパク質クラスの合成モジュレーターの発見は、従来の創薬努力にとって困難な課題を維持している。タンパク質治療剤の認識性能を小分子の合成アクセシビリティとともに組み込むことによって、炭化水素ステープルドペプチドは、治療上の潜在性に関する多くの細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を標的化する性能を実証した。今日までの新規なステープルドペプチドの設計および特徴を詳述した報告は、主に、構造的安定化の程度が最も高いペプチドの同定および細胞透過性に着目したものである41〜43、37。すべての場合において、これらの2つの特性は細胞内および生体内で最も活性の高いステープルドペプチドと関連していた。更に、これらの研究は主に、結合相互作用を変化させたり最適化するような試みをせずに天然ペプチド配列を安定化することに着目していた。これは、高親和性短ペプチドがこれらの標的の大部分に関して以前に説明されていたことに起因していると思われる。本研究では、NTCのアセンブリに関与するタンパク質−タンパク質接触を定量的に説明するために、分子モデリングおよび構造に基づく設計を使用し、これらの知見を、NOTCH複合体の一層強力なステープルドペプチド阻害剤を設計するために使用することを試みた。タンパク質−タンパク質結合立体構造および相互作用親和性の予測は、これまで常に困難な課題であった。その理由は、結合表面の大部分が比較的大きく平坦かつフレキシブルであるためである。これらの特性は、遥かに大きい立体構造空間の調査および多くの弱い相互作用が寄与する結合親和性の予測を必要とするため、スコアリング関数の適用は困難である。本願では、dnMAML1、ANK1およびCSLの各残基が複合体形成および安定性に寄与する程度を算定するため、ヒトX線構造に基づくNTCの分子ダイナミクスシミュレーションおよび結合自由エネルギー分解を採用した。得られたモデルは、dnMAML1接触残基が大きいヘリックス接触面全体に分布しているものの、複合体形成に強く寄与する接触の大多数はN末端ヘリックスにあることを示した。これらの計算は変異の研究45および本発明者らの報告したステープルドペプチドスクリーニング37と合致し、この領域に由来する安定化ペプチドが最も高いリガンド効率を有し得ることを示唆する。本発明者らはその後、表面プラズモン共鳴を用いて合成dnMAML1ペプチド(s−dnMAML1)の予め形成したRAMANK1−CSL複合体への結合親和性を測定した。本発明者らは、s−dnMAML1(ヒトX線構造において明白な接触残基をすべて含む)が高い親和性(KD=0.04μM)で複合体に結合すること、およびN末端ヘリックスの短縮化(snt−dnMAML1)が単独で親和性を約10倍低下させることを発見した。これらの結果は、以前に提案された「クランプ様の(clamp−like)」モデル56を介した高親和性複合体結合への両方のヘリックスの寄与を裏付けるが、N末端ヘリックス単独では強固な特異的結合を保持する。全体では、これらの結果はdnMAML1ポリペプチドのNOTCH−CSL複合体への結合親和性を最初に報告するものであり、NTC複合体形成の定量的モデルを提供する。本明細書に提示したように、構造に基づくリガンド最適化のためにこのモデルを適用することに加え、本発明者らは、これが、MAML1−3およびNOTCH1−4におけるアイソフォーム特異的残基の定量的解析を通して、アイソフォーム特異的NTCの選択的形成への知見を提供可能であると仮定した。更に、これらのモデルは、小分子ドッキングのような将来のコンピュータによるリガンド発見努力に適用可能であろう。
NTCのMDモデルを用いて、本発明者らは、SAHM1において、変異させると結合親和性が高まる可能性のあるいくつかの疎水性残基を同定した。これらの位置における変異の相対的効果を算定するために、本発明者らは、非修飾天然ペプチド配列(MAML1[21〜36])、既知のステープルドペプチド(SAHM1)、変異を含むステープルドペプチドスカフォールド、およびMAML1に由来する新規なステープルドペプチドスカフォールドを比較するために採用することのできるステープルドペプチドMDシミュレーションモデルを開発した。ステープルドペプチドSAHM1およびその対応する非修飾ペプチドのシミュレーションにより、20ns間に亘ってペプチドにステープルされた中心となる炭化水素の有意な安定化効果が判明した。これは、以前の円偏光二色性実験と合致している。その後、疎水性点突然変異、ならびにMAML1のE21〜Y41およびE21〜L49に由来する延長SAHMスカフォールドを含む一連のSAHM1誘導体の相対的BFEDスコアを算出するために、このモデルを適用した。このコンピュータによるスクリーニングの結果は、残基L23およびC30の変異(両方ともCSL上の疎水性表面を標的とする)が結合を向上させ得るという見解を支持した。更に、MDシミュレーションにより、E21〜Y41に由来するステープルドペプチドが、主にY41の追加を介してNTC結合を向上させ得ることを示した。
本発明者らのMDモデルの予測が、活性の向上した化合物を生じるか否かを決定するために、合成ビオチン化dnMAML1ペプチドとGSTタグ付きRAMANK1−CSLタンパク質複合体との会合を測定する小型化ハイスループットALPHAスクリーニング競合アッセイを開発した。このアッセイは、すべての複合体メンバーの存在に特異的であることが判明し、優れたシグナル対ノイズ比を示し、更に非標識dnMAML1またはSAHM1ペプチドによる競合への感度が高かった。そのため、NTC拮抗作用のためにSAHMアナログを定量的に特徴分析するために、このアッセイを採用した。この具体的な適用の域を超えて、このアッセイはNOTCH複合体形成を測定するための新規な形式を表し、小分子や他の化学物質群のハイスループットスクリーニングに適切であるはずである。
概して、本発明者らの競合的ALPHAスクリーニングアッセイ特徴分析の結果は本発明者らのMDシミュレーションと合致した。L23W、C30F、I27LおよびL29W点突然変異を含むアナログは、これらのそれぞれの位置において、NTC形成の最も大きい阻害を示した。これらの変異を、SAHM1およびE21〜Y41スカフォールド内の関連する組合せに後に取り込ませると、IC50値がおよそ3〜7倍向上したペプチドが得られた。両方のスカフォールドにおいて、L23W/C30F、L23W/L29W、およびL23W/C30F/L29Yの変異の組合せは一貫したALPHAスクリーニングIC50の向上をもたらした。最も大きいE21〜L49スカフォールドに由来するペプチドも、SAHM1およびSAHM1−24に対して向上した生化学的活性を示すことが分かった。最後に、本発明者らのMDモデルにおけるステープルドペプチドアナログの柔軟な設計の利点を活用して、本発明者らは、非天然アミノ酸の多数の位置への組み込みが活性を保持または向上させるか否かを決定することを試みた。市販のライブラリーをスクリーニングすることによって、タンパク質を構成しない有望な変異を少数同定し、対応するアナログペプチドを合成した。注目すべきことに、これらの残基のいくつかは活性を保持したのに対し、他の残基では活性が有意に減少した。これらの結果により、本発明者らのモデルがいくつかの場合では有効な相互作用を同定可能であるが、他の場合では提案される結合立体構造は利用できないかも知れないということを示した。非天然残基に関する本発明者らの調査は比較的小さい市販のライブラリーに限られていた。恐らく、幅広い化学的多様性のライブラリーのサンプリングを将来行うことで、より有効な相互作用が得られるであろう。
文献で報告されたステープルドペプチドの細胞ベースの活性は、結合親和性のみにではなく、ヘリックスの安定化の程度および細胞透過性に強く関連していることが判明した。この現象は、ステープルドペプチドが能動的なエンドサイトーシス機構を介して細胞に入り込むという観察結果に起因し、受動拡散により細胞に入り込む大部分の小分子とは対照的である。この点を考慮し、本明細書の研究の大きな目標は、SAHMペプチドの生化学的性能が最適化可能か否かを決定すること、そして、細胞ベースの活性が影響を受ける程度を決定することであった。すべてのアナログペプチドを、確立されたNOTCH1レポーター遺伝子アッセイを用いてNotchシグナル伝達の阻害に関してスクリーニングした。結果として得られた標準化レポーター阻害を各ペプチドのALPHAスクリーニングIC50と比較すると、ライブラリーについて、生化学的活性と細胞ベースの活性との間に正の相関がみられた。
4個の代表的なアナログペプチドを用いた用量依存的研究では、すべてのペプチドでSAHM1に対して細胞ベースの活性が増加したが、IC50の改善の度合いはALPHAスクリーニングアッセイの時よりも穏やかであった。最も有望なペプチドであるSAHM1−25およびSAHM1−62の2つは、それぞれ、SAHM1よりも約2倍および4倍低いIC50値を示した。E21〜T36スカフォールドからのこの2つのアナログは、1.5〜2倍の改善を示した。更に、アナログペプチドは、レポーター遺伝子アッセイの時と同じ有効濃度で、NOTCH1依存性T−ALL細胞株に対し抗増殖作用を持つことが分かった。総合すると、これらの結果は、本研究で開発されたいくつかのステープルドペプチドアナログはNotchシグナル伝達のより強力な阻害剤であるという見解を支持する。更に、本発明者らの研究によれば、改善された生化学的性能は細胞ベースの活性の上昇に寄与する可能性があり、一方で、ステープルドペプチドの能動的細胞取り込みの現象はNTCのステープルドペプチド阻害剤に関するこれらの改善に制限を課す可能性があることが示唆される。
実験手順
(ステープルドペプチド分子モデリング)
ヒトNOTCH複合体39(PDBid:2F8X)におけるE21〜T36dnMAML1に基づくステープルドペプチドSAHM1の最初の構造を、E28およびR32を結合α,α−二置換「S5」アミノ酸に変異させることにより得た。「S5」非天然アミノ酸の立体構造の調査は、SAHM1の最も低いエネルギーの立体構造を作り出すためのMacromodelで行い、続いてこれをエネルギー最小化、平衡化および20ns分子ダイナミクスシミュレーションのための出発座標として使用した。部分的電荷計算のパラメータ、非天然アミノ酸のための力場およびMDシミュレーション設定は下記のとおりである。
(ステープルドペプチド分子モデリング)
ヒトNOTCH複合体39(PDBid:2F8X)におけるE21〜T36dnMAML1に基づくステープルドペプチドSAHM1の最初の構造を、E28およびR32を結合α,α−二置換「S5」アミノ酸に変異させることにより得た。「S5」非天然アミノ酸の立体構造の調査は、SAHM1の最も低いエネルギーの立体構造を作り出すためのMacromodelで行い、続いてこれをエネルギー最小化、平衡化および20ns分子ダイナミクスシミュレーションのための出発座標として使用した。部分的電荷計算のパラメータ、非天然アミノ酸のための力場およびMDシミュレーション設定は下記のとおりである。
(NOTCH複合体モデリング)
HES1プロモーター配列を含有するオリゴに結合したdnMAML1−ANK1−CSLのX線結晶構造(PDBid:2f8x、3.25Å)をNTC MDシミュレーションのための出発座標として使用した。最初の構造はMaestro(登録商標)8.5のProtein Preparation Panelで処理した。DNAおよび溶媒分子を構造から除去した。プロトン化状態をHis、Gln、Asn残基に割り当て、手動で調査した。その後、構造をAmber10のantechamber suite内で調製した。LEaPモジュールにおいて、Amber10内のff03力場を用いてこの系をシミュレートした。Na+を添加して系を中和し、続いてこれを、複合体から10Å延長しているTIP3P水ボックス内に溶媒和させた。最終的な系は約700アミノ酸残基を含んでいた。Amber10のSANDER.MPIモジュールを用いて、タンパク質最小化、平衡化および分子ダイナミクスシミュレーションを実施した。温度を300Kに制御するためにランジュバン(Langevin)ダイナミクスを適用しながら、長期の相互作用を処理するためにParticle−Mesh−Ewald(PME)総和を採用した。SHAKEアルゴリズムを用いて、2fsの積分時間ステップを許容した。35nsMDシミュレーションを実施して、dnMAML1とANK1−CSLとの間の柔軟な相互作用を調査した。NTCのスナップショットを、MDシミュレーション軌跡の最後の30nsから毎10psで抽出した。
HES1プロモーター配列を含有するオリゴに結合したdnMAML1−ANK1−CSLのX線結晶構造(PDBid:2f8x、3.25Å)をNTC MDシミュレーションのための出発座標として使用した。最初の構造はMaestro(登録商標)8.5のProtein Preparation Panelで処理した。DNAおよび溶媒分子を構造から除去した。プロトン化状態をHis、Gln、Asn残基に割り当て、手動で調査した。その後、構造をAmber10のantechamber suite内で調製した。LEaPモジュールにおいて、Amber10内のff03力場を用いてこの系をシミュレートした。Na+を添加して系を中和し、続いてこれを、複合体から10Å延長しているTIP3P水ボックス内に溶媒和させた。最終的な系は約700アミノ酸残基を含んでいた。Amber10のSANDER.MPIモジュールを用いて、タンパク質最小化、平衡化および分子ダイナミクスシミュレーションを実施した。温度を300Kに制御するためにランジュバン(Langevin)ダイナミクスを適用しながら、長期の相互作用を処理するためにParticle−Mesh−Ewald(PME)総和を採用した。SHAKEアルゴリズムを用いて、2fsの積分時間ステップを許容した。35nsMDシミュレーションを実施して、dnMAML1とANK1−CSLとの間の柔軟な相互作用を調査した。NTCのスナップショットを、MDシミュレーション軌跡の最後の30nsから毎10psで抽出した。
(MDシミュレーションのための非天然アミノ酸のコンピュータ設計)
非標準残基については、MDシミュレーションの力場パラメータに加え、電荷を算出する必要がある。この非標準残基はペプチドの中心的な残基であるため、本発明者らはACEおよびNMEキャップをそれに追加した(CH3CO−(NH−X−CO)−NHCH3)。幾何学的最適化の後、HF/6−31G*における単一点電荷算出をGaussian(登録商標)03において適用した。antechamber suiteのRESPプログラムを用いて、キャップの総電荷をゼロに規制することにより電荷を原子に適合させた。Amber10のLEaPモジュールを用いて構造を調製した。非天然残基を他の残基に結合させ、角度や二面角のような欠失しているパラメータを、parm99からの存在するパラメータを用いて注意深く割り当てた。これは非常に類似した環境における原子を表現する。ff03を標準残基の力場として用いた。非天然残基を含む複合体は、NTCシミュレーションに関して説明した手順と同様に、その後Na+を用いて中和し、TIP3P水内で溶媒和させた。
非標準残基については、MDシミュレーションの力場パラメータに加え、電荷を算出する必要がある。この非標準残基はペプチドの中心的な残基であるため、本発明者らはACEおよびNMEキャップをそれに追加した(CH3CO−(NH−X−CO)−NHCH3)。幾何学的最適化の後、HF/6−31G*における単一点電荷算出をGaussian(登録商標)03において適用した。antechamber suiteのRESPプログラムを用いて、キャップの総電荷をゼロに規制することにより電荷を原子に適合させた。Amber10のLEaPモジュールを用いて構造を調製した。非天然残基を他の残基に結合させ、角度や二面角のような欠失しているパラメータを、parm99からの存在するパラメータを用いて注意深く割り当てた。これは非常に類似した環境における原子を表現する。ff03を標準残基の力場として用いた。非天然残基を含む複合体は、NTCシミュレーションに関して説明した手順と同様に、その後Na+を用いて中和し、TIP3P水内で溶媒和させた。
(dnMAML1 BFED計算)
結合自由エネルギー分解(BFED)計算は、dnMAML1の収束5〜35ns MDシミュレーションから10ps毎に抽出したスナップショットの集合の平均MMGBSAスコアに基づく。BFED計算は、Amber10のMMGBSAを用いて実施した。分子力学法(MM)を適用して、dnMAML1とANK1−CSLとの間の気相相互作用エネルギーを算出した。溶媒和エネルギーの静電成分を、Generalized Born(GB)法を用いて算出し、一方、非極性溶媒和エネルギーは溶媒露出面積(SASA)から推定した。本発明者らの計算には、エントロピー項は含めなかった。エントロピー項はペプチドアナログを比較するのに正確でも必要でもないため、類似の単純化手法が他の研究者によって用いられている。BFEDは、2つのコンポーネント(dnMAMLまたはCSL/ANK)からの各残基の、総結合自由エネルギーへの寄与を評価する。そのため、対相互作用エネルギー(例えば静電相互作用)の半分は、2個の残基にそれぞれ属する2個の相互作用する原子の各々に配分される。各残基の結合自由エネルギーへの非極性の寄与は、自由分子および複合体における各残基の露出表面の差に比例する。
結合自由エネルギー分解(BFED)計算は、dnMAML1の収束5〜35ns MDシミュレーションから10ps毎に抽出したスナップショットの集合の平均MMGBSAスコアに基づく。BFED計算は、Amber10のMMGBSAを用いて実施した。分子力学法(MM)を適用して、dnMAML1とANK1−CSLとの間の気相相互作用エネルギーを算出した。溶媒和エネルギーの静電成分を、Generalized Born(GB)法を用いて算出し、一方、非極性溶媒和エネルギーは溶媒露出面積(SASA)から推定した。本発明者らの計算には、エントロピー項は含めなかった。エントロピー項はペプチドアナログを比較するのに正確でも必要でもないため、類似の単純化手法が他の研究者によって用いられている。BFEDは、2つのコンポーネント(dnMAMLまたはCSL/ANK)からの各残基の、総結合自由エネルギーへの寄与を評価する。そのため、対相互作用エネルギー(例えば静電相互作用)の半分は、2個の残基にそれぞれ属する2個の相互作用する原子の各々に配分される。各残基の結合自由エネルギーへの非極性の寄与は、自由分子および複合体における各残基の露出表面の差に比例する。
(SAHMアナログ結合計算)
SAHMアナログ複合体のMDシミュレーションのための出発構造は、NOTCH複合体X線構造(PDBid:2F8X)に基づいて、dnMAMLの個々の残基を変異させることにより得た。複合体における変異ペプチドの最も低エネルギーの立体構造の検索方法、部分的電荷の計算方法、ならびにエネルギー最小化、平衡化およびMDシミュレーションの設定方法は上述したものと非常に近い。18nsMDシミュレーションを各SAHMアナログ複合体に適用した。MMGBSA結合自由エネルギー計算を、収束MD軌跡に基づいて実施した。MD軌跡は、複合体の動的挙動を理解するため、また、変異がどのように結合親和性に影響するのかを説明するためにも分析した。
SAHMアナログ複合体のMDシミュレーションのための出発構造は、NOTCH複合体X線構造(PDBid:2F8X)に基づいて、dnMAMLの個々の残基を変異させることにより得た。複合体における変異ペプチドの最も低エネルギーの立体構造の検索方法、部分的電荷の計算方法、ならびにエネルギー最小化、平衡化およびMDシミュレーションの設定方法は上述したものと非常に近い。18nsMDシミュレーションを各SAHMアナログ複合体に適用した。MMGBSA結合自由エネルギー計算を、収束MD軌跡に基づいて実施した。MD軌跡は、複合体の動的挙動を理解するため、また、変異がどのように結合親和性に影響するのかを説明するためにも分析した。
(タンパク質発現および精製)
C末端ヘキサヒスチジンタグ(残基9〜435)を有するヒトCSL、RAMANK1(残基1761〜2127)およびGST標識RAMANK1をBL21(DE3)pLysS細胞(Stratagene)で発現させ、以前に説明されたように精製した37。
C末端ヘキサヒスチジンタグ(残基9〜435)を有するヒトCSL、RAMANK1(残基1761〜2127)およびGST標識RAMANK1をBL21(DE3)pLysS細胞(Stratagene)で発現させ、以前に説明されたように精製した37。
(ペプチド合成および精製)
ステープルペプチドは、Tetrasマルチチャネル自動ペプチド合成装置(Thuramed)で、標準Fmocベース固相ペプチド合成(SPPS;solid−phase peptide synthesis)法により合成した。オレフィン含有「S5」および「B5」アミノ酸および非天然アミノ酸はAnaspec Inc.社から購入した。合成後、ジクロロエタン中のグラブスI触媒(ベンジリデン−ビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ジクロロルテニウム)を用いて、窒素下で閉環メタセシスを行った。その後、すべてのステープルドペプチドをβアラニンスペーサおよびN−アセチルトリプトファンでキャップして、ペプチドを280nmの吸光によって定量できるようにした。トリプトファンおよびチロシンには、それぞれ5500M−1cm−1および1490M−1cm−1の理論吸光係数を使用した。注目すべきことに、以前に報告されたN末端FITCラベルを含有するペプチドは、ALPHAスクリーニングアッセイでスペクトル干渉があったために、これらの調査には適切でなかった。合成後、ステープルドペプチドを樹脂から切断し、C18カラムでの逆相HPLCにより精製し、定量し、凍結乾燥し、DMSO(5〜10mM)に再懸濁して−20℃で保存した。化合物一致度および純度を液相クロマトグラフィー質量分析法(LCMS)によって評価した。
ステープルペプチドは、Tetrasマルチチャネル自動ペプチド合成装置(Thuramed)で、標準Fmocベース固相ペプチド合成(SPPS;solid−phase peptide synthesis)法により合成した。オレフィン含有「S5」および「B5」アミノ酸および非天然アミノ酸はAnaspec Inc.社から購入した。合成後、ジクロロエタン中のグラブスI触媒(ベンジリデン−ビス(トリシクロヘキシルホスフィン)ジクロロルテニウム)を用いて、窒素下で閉環メタセシスを行った。その後、すべてのステープルドペプチドをβアラニンスペーサおよびN−アセチルトリプトファンでキャップして、ペプチドを280nmの吸光によって定量できるようにした。トリプトファンおよびチロシンには、それぞれ5500M−1cm−1および1490M−1cm−1の理論吸光係数を使用した。注目すべきことに、以前に報告されたN末端FITCラベルを含有するペプチドは、ALPHAスクリーニングアッセイでスペクトル干渉があったために、これらの調査には適切でなかった。合成後、ステープルドペプチドを樹脂から切断し、C18カラムでの逆相HPLCにより精製し、定量し、凍結乾燥し、DMSO(5〜10mM)に再懸濁して−20℃で保存した。化合物一致度および純度を液相クロマトグラフィー質量分析法(LCMS)によって評価した。
合成dnMAML1ポリペプチドを、低ローディングNovaPEG樹脂(EMD)を用いて、CEM Liberty Microwaveペプチド合成装置でのSPPSによって合成した。β分岐アミノ酸、疎水性残基の伸長部およびアルギニンには、延長した結合時間または二重結合を用いた。50℃で結合するヒスチジンおよびシステインのラセミ化の抑制を期待して、すべての結合は70℃で行った。ビオチン化ペプチド(ビオ−s−dnMAML1およびbio−snt−dnMAML1)をβアラニンスペーサ、20原子ジエチレングリコール(EMD)スペーサおよびビオチンでキャップした。非標識競合ペプチド(Ac−s−dnMAML1)はアセチル化βアラニンスペーサでキャップした。すべてのペプチドを、ステープルペプチドの時と同じように切断、精製および定量した。
(ALPHAスクリーニング競合アッセイ)
簡単に説明すると、ALPHAスクリーニングアッセイは、Perkin Elmer 384ウェル光学プレートを用いて行い、測定はALPHAスクリーニング性能を有するPerkin Elmer 384ウェル光学プレートリーダーで行った。精製GST−RAMANK1およびCSLを結合バッファー(20mM トリス pH8.4、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTAおよび0.05%透析BSA)中に透析し、各実験用に別々に保管した。簡単に説明すると、結合バッファー中の(望ましい最大濃度の)4Xステープルドペプチド原料15μLを、最上段以外のウェルにはすべて10μLの結合バッファーを入れてあるプレートの最上段に添加した。すべてのウェルに10μLを残すことで段階的に3倍希釈した。注目すべきことに、予備実験では中間ナノモラー濃度でフルオロフォアがALPHAスクリーニングシグナルに干渉することが示されたため、非蛍光性ペプチドのみをこれらのアッセイに用いた。CSL(80nM)、GST−RAMANK1(80nM)およびBio−sdnMAML1(80nM)の2X原料を、結合バッファーを溶媒として作成し、直ちに希釈ペプチド原料を含むウェルに添加した。この30μL溶液を室温に30分間置くことでインキュベートした。これとは別に、抗GSTアクセプタービーズ(160μg/mL、最終濃度20μg/mL)の8X原料を、暗室で結合バッファー中に再懸濁した。5μLのアクセプタービーズ溶液をウェルに添加し、プレートを1分間500rpmで遠心分離し、更に30分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズの8X原料(160μg/mL、最終濃度20μg/mL)を暗室で結合バッファーを溶媒として作成し、5μLのドナービーズ溶液をバッファーに直接加え(遠心分離なし)、40μLの混合液を、暗室で更に30分間室温でインキュベートした。プレートを標準ALPHAスクリーニング設定を用いて読み取り、データをPrizm5ソフトウェアを用いて、非線形回帰分析およびデータを3パラメータS字曲線への適合を適用することにより処理した。
簡単に説明すると、ALPHAスクリーニングアッセイは、Perkin Elmer 384ウェル光学プレートを用いて行い、測定はALPHAスクリーニング性能を有するPerkin Elmer 384ウェル光学プレートリーダーで行った。精製GST−RAMANK1およびCSLを結合バッファー(20mM トリス pH8.4、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTAおよび0.05%透析BSA)中に透析し、各実験用に別々に保管した。簡単に説明すると、結合バッファー中の(望ましい最大濃度の)4Xステープルドペプチド原料15μLを、最上段以外のウェルにはすべて10μLの結合バッファーを入れてあるプレートの最上段に添加した。すべてのウェルに10μLを残すことで段階的に3倍希釈した。注目すべきことに、予備実験では中間ナノモラー濃度でフルオロフォアがALPHAスクリーニングシグナルに干渉することが示されたため、非蛍光性ペプチドのみをこれらのアッセイに用いた。CSL(80nM)、GST−RAMANK1(80nM)およびBio−sdnMAML1(80nM)の2X原料を、結合バッファーを溶媒として作成し、直ちに希釈ペプチド原料を含むウェルに添加した。この30μL溶液を室温に30分間置くことでインキュベートした。これとは別に、抗GSTアクセプタービーズ(160μg/mL、最終濃度20μg/mL)の8X原料を、暗室で結合バッファー中に再懸濁した。5μLのアクセプタービーズ溶液をウェルに添加し、プレートを1分間500rpmで遠心分離し、更に30分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズの8X原料(160μg/mL、最終濃度20μg/mL)を暗室で結合バッファーを溶媒として作成し、5μLのドナービーズ溶液をバッファーに直接加え(遠心分離なし)、40μLの混合液を、暗室で更に30分間室温でインキュベートした。プレートを標準ALPHAスクリーニング設定を用いて読み取り、データをPrizm5ソフトウェアを用いて、非線形回帰分析およびデータを3パラメータS字曲線への適合を適用することにより処理した。
(表面プラズモン共鳴)
Biacore3000SPR装置(Biacore−GE、スウェーデン国ウプサラ)を用いて、RAMANK1およびCSLの可溶性複合体へのBio−sdnMAML1ペプチド、Bio−sntMAML1ペプチドおよびBio−SAHM1ペプチドの結合を測定した。ペプチドはbiacore結合バッファー(20mM トリス pH8.4、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTAおよび0.05% P−20)に溶解し、ストレプトアビジン−CM5 Biacoreチップの個別フローセル上に、10μL/分で10分間注入することにより固定化した。RAMANK1およびCSLの等モル希釈物(1μMから0.03125μMまでの2倍希釈、ブランク2つを含む)をbiacore結合バッファー中に混合し、NTC会合キネティクスを測定するために、ペプチド官能化表面上に120〜180秒間注入した。その後、NTC流を止め、ペプチド解離キネティクスを測定するためにバッファーを注入した。適切な解離時間の経過後(概ね6分以上)、高塩濃度再生バッファーを(500mM NaCl、20mM トリス pH8.4、1mM DTTおよび0.05% P−20)用いてチップ表面を再生することにより全結合複合体を除去し、実験のキャリーオーバーを防止した。結合データは参照細胞で標準化し、ClampXPソフトウェアを用いて処理した:(http://www.cores.utah.edu/interaction/clamp.html)。処理したデータセットに2サイト結合モデルを適用して、ペプチド−NTC相互作用の動態パラメータを決定した。
Biacore3000SPR装置(Biacore−GE、スウェーデン国ウプサラ)を用いて、RAMANK1およびCSLの可溶性複合体へのBio−sdnMAML1ペプチド、Bio−sntMAML1ペプチドおよびBio−SAHM1ペプチドの結合を測定した。ペプチドはbiacore結合バッファー(20mM トリス pH8.4、150mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTAおよび0.05% P−20)に溶解し、ストレプトアビジン−CM5 Biacoreチップの個別フローセル上に、10μL/分で10分間注入することにより固定化した。RAMANK1およびCSLの等モル希釈物(1μMから0.03125μMまでの2倍希釈、ブランク2つを含む)をbiacore結合バッファー中に混合し、NTC会合キネティクスを測定するために、ペプチド官能化表面上に120〜180秒間注入した。その後、NTC流を止め、ペプチド解離キネティクスを測定するためにバッファーを注入した。適切な解離時間の経過後(概ね6分以上)、高塩濃度再生バッファーを(500mM NaCl、20mM トリス pH8.4、1mM DTTおよび0.05% P−20)用いてチップ表面を再生することにより全結合複合体を除去し、実験のキャリーオーバーを防止した。結合データは参照細胞で標準化し、ClampXPソフトウェアを用いて処理した:(http://www.cores.utah.edu/interaction/clamp.html)。処理したデータセットに2サイト結合モデルを適用して、ペプチド−NTC相互作用の動態パラメータを決定した。
(ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ)
U2OS細胞を、10%FBS添加DMEMを含有する白色96ウェルプレート(Corning社)に播種し、一晩順化させた。空のpcDNA3またはΔEGFΔLNR−NOTCH1プラスミド(5ng/ウェル)を、CSL調節ホタルルシフェラーゼレポーター構築物および構成的に活性なウミシイタケルシフェラーゼ(pRLTK)対照プラスミド(10:1のウミシイタケ:ホタルプラスミド比率)で、Lipofectamine3000(Invitrogen社)を用いて一過性に共トランスフェクションした。46、37。トランスフェクション後約24時間の細胞を、10%FBSを補足した新鮮なDMEM中で、DMSOビヒクル対照、または所与の濃度のステープルドペプチドで処理し、18〜24時間インキュベートした。その後、ルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼアッセイキット(Promega社)を用いて測定し、NOTCH依存性拮抗作用を、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼシグナルの標準化により測定した。
U2OS細胞を、10%FBS添加DMEMを含有する白色96ウェルプレート(Corning社)に播種し、一晩順化させた。空のpcDNA3またはΔEGFΔLNR−NOTCH1プラスミド(5ng/ウェル)を、CSL調節ホタルルシフェラーゼレポーター構築物および構成的に活性なウミシイタケルシフェラーゼ(pRLTK)対照プラスミド(10:1のウミシイタケ:ホタルプラスミド比率)で、Lipofectamine3000(Invitrogen社)を用いて一過性に共トランスフェクションした。46、37。トランスフェクション後約24時間の細胞を、10%FBSを補足した新鮮なDMEM中で、DMSOビヒクル対照、または所与の濃度のステープルドペプチドで処理し、18〜24時間インキュベートした。その後、ルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼアッセイキット(Promega社)を用いて測定し、NOTCH依存性拮抗作用を、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼシグナルの標準化により測定した。
(細胞増殖およびアポトーシスアッセイ)
5×104個の細胞を、白色96ウェルCorningプレートにおいて、総量125μLのRPMI−1640培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBSおよび指定濃度のDMSOまたはSAHMアナログペプチドを含む)中に播種した。3日後、Cell Titer−Gloアッセイ(Promega社)を用いて細胞のATP含量を測定することにより、細胞生存率を決定した。
5×104個の細胞を、白色96ウェルCorningプレートにおいて、総量125μLのRPMI−1640培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10%FBSおよび指定濃度のDMSOまたはSAHMアナログペプチドを含む)中に播種した。3日後、Cell Titer−Gloアッセイ(Promega社)を用いて細胞のATP含量を測定することにより、細胞生存率を決定した。
アナログステープルドペプチドに使用された非天然アミノ酸の構造、名称、略称および導入部位は下記のとおりである。
いくつかの例において、本明細書に記載の炭化水素架橋は更に操作されてもよい。一例において、炭化水素アルケニル架橋の二重結合(例えば、ルテニウム触媒閉環メタセシス(RCM)を用いて合成されたもの)を(例えばエポキシ化やジヒドロキシ化により)酸化して下記の化合物のうちの一方を提供してもよい。
炭化水素架橋を説明したが、他の架橋も想定される。例えば、架橋は1個以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、1,4−トリアゾール、1,5−トリアゾール、ヒドラゾンまたはアミド部分を含んでいてもよい。いくつかの例において、天然アミノ酸側鎖が架橋に包含されてもよい。例えば、セリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第1級アミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸中の酸、あるいはアスパラギンまたはグルタミン中のアミドのような官能基に架橋を結合してもよく、いずれも内部架橋部分を含んでいてもよいし含んでいなくてもよい(例えば、一対のシステインを伴うビス求電子剤含有アルカンのように)。したがって、2個の非天然アミノ酸を結合させて作った架橋を用いるのではなく、天然アミノ酸を用いて架橋を形成することが可能である。また、単一の非天然アミノ酸を天然アミノ酸と共に使用することも可能である。
更に、架橋の長さを変えられることも想定される。例えば、長さの短い架橋は、αヘリックス二次構造に比較的高度の制約を課すのが望ましい場合に使用することができる。一方、場合によってはαヘリックス二次構造に少ない制約を課すことが望まれ、その場合には長い架橋が望まれ得る。
更に、主にαヘリックスの単一面上の架橋を提供するために、アミノ酸iからi+3、iからi+4、およびiからi+7に及ぶ架橋の例を説明したが、アミノ酸の任意の個数の組合せに及ぶ架橋を合成することができる。
いくつかの例において、α−二置換アミノ酸は、αヘリックス二次構造の安定性を向上させるために、ポリペプチドにおいて用いられる。しかしながら、α−二置換アミノ酸は必須ではなく、(例えば、架橋アミノ酸において)α−一置換基も想定される。
当業者には理解可能であるように、本明細書に記載の化合物の合成方法は、当技術分野における通常の技術者には明白である。更に、所望の化合物を得るために、様々な合成工程を代替の順序で、あるいは順序を交替して実施可能である。本明細書に記載の化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基方法論(保護および脱保護)は当技術分野において既知であり、例えば、R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989);T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3d.Ed.,John Wiley and Sons(1999);L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994);およびL.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)およびそれらのその後の版を含む。
本発明のペプチドは、通常の技術者に周知の化学合成法により製造することができる。例えば、Fields et al.,Synthetic PeptidesのChapter 3:A User’s Guide,ed.Grant,W.H.Freeman&Co.,New York,N.Y.,1992,p.77を参照されたい。したがって、ペプチドは、例えばApplied Biosystems社の430Aモデルまたは431モデルのペプチド合成装置によって、側鎖保護アミノ酸を用い、t−BocまたはFmoc化学成分のいずれかで保護したα−NH2を用いる固相合成の自動化メリフィールド技術によって合成することができる。
本明細書に記載のペプチドを製造する一つの方法は、固相ペプチド合成(SPPS)を用いる。C末端のアミノ酸を、リンカー分子と共に酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は合成に使用される溶媒には不溶であり、これにより過剰な試薬および副産物を洗い流すことが比較的簡単かつ迅速になる。N末端は酸に安定であるが塩基によって除去可能なFmoc基で保護される。任意の側鎖官能基は塩基に安定で酸に不安定な基で保護される。長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを用いて個々の合成ペプチドを結合することにより形成することができる。あるいは、長い合成ペプチドは周知の組換えDNA技術によって合成してもよい。そのような技術は周知の標準マニュアルにおいて、詳細なプロトコールと共に提示されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆転写して、好ましくはその遺伝子を発現させようとする生物に最適なコドンで、そのアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的にはそのペプチドと、必要であれば任意の調節エレメントとをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより、合成遺伝子を形成する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクションする。その後、選択された発現系および宿主に合った適切な条件下でペプチドが発現される。ペプチドを精製し、標準的な方法で特徴解析する。ペプチドはハイスループットコンビナトリアル様式で、例えばAdvanced Chemtech社から入手可能なハイスループットマルチチャネル型コンビナトリアル合成装置を用いて形成することができる。制御可能なマイクロ波装置に囲まれた反応室内において標準的固相ペプチド合成法を用いるマイクロ波支援ペプチド合成により、長いペプチドや複合ペプチドも形成可能である。これらの方法は、反応環境の急速な加熱および冷却を可能にすることにより収率を高め、他の方法では困難なペプチド合成を容易にする。
修飾ポリペプチドにおいて、1個以上の通常のペプチド結合は、体内でのポリペプチドの安定性を高め得る異なる結合によって置換される。ペプチド結合は、レトロ−インベルソ(retro−inverso)結合(C(O)−NH);還元アミド結合(NH−CH2);チオメチレン結合(S−CH2またはCH2−S);オキソメチレン結合(O−CH2またはCH2−O);エチレン結合(CH2−CH2);チオアミド結合(C(S)−NH);トランスオレフィン結合(CH=CH);フルオロ置換トランスオレフィン結合(CF=CH);ケトメチレン結合(C(O)−CHR)またはCHR−C(O)(ただしRはHまたはCH3);およびフルオロ−ケトメチレン結合(C(O)−CFRまたはCFR−C(O)(ただしRはHまたはFまたはCH3))で置換されてもよい。
ポリペプチドは更に、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、蛍光化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化(Ser、TyrまたはThr)、ステアロイル化、サクシニル化およびスルフリル化によって修飾されてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG);アルキル基(例えばC1〜C20の直鎖または分岐鎖アルキル基);脂肪酸ラジカル;およびそれらの組合せに結合することもできる。
(治療方法)
本発明は、異常な(例えば過剰な)Notch活性に関連する疾患もしくは遺伝子、遺伝子産物、あるいはNotchタンパク質(アイソフォーム1〜4)、MAMLタンパク質(アイソフォーム1〜3)および/またはCSLによって(正にまたは負に)調節される分子シグナル伝達経路の異常な活性に関連する疾患のリスクのある(またはその疾患に罹りやすい)対象者またはその疾患を有する対象者を治療するための予防方法および治療方法の両方を提供する。その理由は、ポリペプチドがNotchファミリー、MAMLファミリーおよびCSLタンパク質ファミリーのドミナントネガティブインヒビターとして作用すると予測されるためである。本明細書において使用される用語「治療」とは、疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい性質に対し、治療、治癒、緩和、軽減、変化、是正、改良、改善または影響を与える目的で、その疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい性質を有する患者に治療剤を適用または投与すること、あるいはそのような患者から単離した組織または細胞株に治療剤を適用または投与することと定義される。
本発明は、異常な(例えば過剰な)Notch活性に関連する疾患もしくは遺伝子、遺伝子産物、あるいはNotchタンパク質(アイソフォーム1〜4)、MAMLタンパク質(アイソフォーム1〜3)および/またはCSLによって(正にまたは負に)調節される分子シグナル伝達経路の異常な活性に関連する疾患のリスクのある(またはその疾患に罹りやすい)対象者またはその疾患を有する対象者を治療するための予防方法および治療方法の両方を提供する。その理由は、ポリペプチドがNotchファミリー、MAMLファミリーおよびCSLタンパク質ファミリーのドミナントネガティブインヒビターとして作用すると予測されるためである。本明細書において使用される用語「治療」とは、疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい性質に対し、治療、治癒、緩和、軽減、変化、是正、改良、改善または影響を与える目的で、その疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい性質を有する患者に治療剤を適用または投与すること、あるいはそのような患者から単離した組織または細胞株に治療剤を適用または投与することと定義される。
本発明のポリペプチドは、癌および腫瘍性疾患の治療、予防、および/または診断に使用することができる。本明細書において、「癌」、「過剰増殖性」および「腫瘍性」という用語は、自律的増殖をする能力を持つ、すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状態または条件にある細胞を指す。過剰増殖性および腫瘍性の病気の状態は、病理学的なもの、すなわち病気の状態を特徴付けまたは構成するものとして分類されてもよいし、または非病理学的なもの、すなわち病気の状態とは関係しないが正常からは逸脱したものとして分類されてもよい。この用語は全種類の癌の増殖または腫瘍形成過程、転移組織または悪性形質転換した細胞、組織、または30の器官、病理組織学的種類または侵襲性のステージとは無関係のものを包含するものとする。「病理学的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴付けられる病状において生じる。非病理学的過剰増殖性細胞の例としては、創傷治癒に伴う細胞の増殖が挙げられる。
細胞増殖性疾患および/または細胞分化性疾患の例としては、例えば上皮性悪性腫瘍、または非上皮性悪性腫瘍のような癌が挙げられる。上記の化合物(すなわちステープルドポリペプチド)は、乳癌、T細胞癌およびB細胞癌をコントロールする新規な治療剤として作用し得る。これらのポリペプチドは、粘表皮癌や髄芽腫の治療にも有用である可能性がある。増殖性疾患の例としては、造血腫瘍性疾患が挙げられる。本明細書において、「造血腫瘍性疾患」という用語は造血起源の、例えば、骨髄、リンパまたは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる過形成性/腫瘍性細胞に関与する疾患を包含する。疾患の例としては、急性白血病、例えば赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病が挙げられる。他の骨髄疾患の例としては、急性前骨髄性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)(Vaickus,L.(1991)Crit Rev.in Oncol.Hematol.11:267−97に説明されている)が挙げられるがこれらに限定されない。リンパ性悪性疾患には、急性リンパ芽球性白血病(ALL)(B系列ALLおよびT系列ALLを含む)、慢性リンパ性白血病(eLL)、前リンパ性白血病(PLL)、多発性骨髄腫、有毛細胞白血病(HLL)、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症(WM)が挙げられる。悪性リンパ腫の他の例には、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大顆粒リンパ球性白血病(LGF)、ホジキン病およびリード−スタンバーグ病が挙げられるがこれらに限定されない。胸部の細胞増殖性疾患および/または細胞分化性疾患の例としては、上皮過形成、硬化性乳管増生症、小管乳頭腫等の増殖性胸部疾患;線維腺腫、葉状腫瘍、および非上皮性悪性腫瘍のような間質性腫瘍、大管乳頭腫のような上皮性腫瘍等の腫瘍;非浸潤性乳管癌(ページェット病を含む)および上皮内小葉癌を含む(非侵襲性)上皮内癌、および、侵襲性乳管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様(粘液性)癌、管状腺癌、および侵襲性乳頭癌を含むがこれらに限定されない侵襲性(浸潤性)上皮性悪性腫瘍を含む胸部の上皮性悪性腫瘍、および種々の悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。男性の胸部の疾患には、女性化乳房および上皮性悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。治療可能な他の増殖性疾患には、肺、膵臓、卵巣、消化管および肝臓の癌または転移性播種性腫瘍ならびに黒色腫および髄芽腫が挙げられるがこれらに限定されない。ポリペプチドは、血管新生(血液供給の維持)のためにNotchを必要とするシグナル伝達および転移細胞の癌幹細胞様特性に基づく任意の転移性腫瘍の治療にも用いられ得る。NotchおよびCSL以外のMAMLと相互作用するタンパク質はNF−κ−Bを含み、そのようなタンパク質の過剰活性に関連する癌。
本明細書に記載のポリペプチドは、骨粗鬆症、自己免疫疾患、炎症性アテローム性動脈硬化症および肺高血圧症を含む過剰に活性なNotchシグナル伝達に関連する多くの非癌性疾患の治療に用いられ得る。また、免疫不全のようなNF−κ−Bシグナル伝達に関連する他の疾患が、本明細書のポリペプチドで治療され得る。更に、本明細書のポリペプチドは、再生医療や幹細胞治療のために、患者からの組織または細胞を(生体内または生体外で)治療するのに用いられ得る。
(医薬組成物および投与経路)
本明細書において、本明細書に記載の式の化合物を含む本発明の化合物は、それらの薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグを含むものとして定義される。「薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグ」とは、レシピエントに投与すると、本発明の化合物を(直接的にまたは間接的に)提供可能な本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、または他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体およびプロドラッグは、本発明の化合物が哺乳類に投与された時に(例えば、経口投与された化合物がより血液に吸収され易くさせることにより)、その化合物のバイオアベイラビリティを増大させるもの、または親化合物の生物学的区分(例えば脳またはリンパ系)への送達を、親の種に対して促進するものである。好ましいプロドラッグは、水溶性または消化管膜を通る能動輸送を高める基が、本明細書に記載の式の構造に付加された誘導体を含む。
本明細書において、本明細書に記載の式の化合物を含む本発明の化合物は、それらの薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグを含むものとして定義される。「薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグ」とは、レシピエントに投与すると、本発明の化合物を(直接的にまたは間接的に)提供可能な本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、または他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体およびプロドラッグは、本発明の化合物が哺乳類に投与された時に(例えば、経口投与された化合物がより血液に吸収され易くさせることにより)、その化合物のバイオアベイラビリティを増大させるもの、または親化合物の生物学的区分(例えば脳またはリンパ系)への送達を、親の種に対して促進するものである。好ましいプロドラッグは、水溶性または消化管膜を通る能動輸送を高める基が、本明細書に記載の式の構造に付加された誘導体を含む。
本発明の化合物は、選択した生物学的特性を高めるために適切な官能基を付加することにより修飾されてもよい。そのような修飾は当技術分野において既知であり、所与の生物学的区分(例えば、血液、リンパ系、中枢神経系)への生物学的浸透を促進し、経口利用率を高め、注射による投与を可能にするように可溶性を高め、代謝を変化させ、また排泄率を変化させるものを含む。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基に由来するものを含む。適切な酸性塩の例として、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホナート、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩(hemisulfate)、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモ酸塩(palmoate)、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシラート、トリフルオロメチル硫酸塩、およびウンデカン酸塩(undecanoate)が挙げられる。適切な塩基に由来する塩には、アルカリ金属(例えばナトリウム)、アルカリ土類金属(例えばマグネシウム)、アンモニウムおよびN−(アルカリ)4 +塩が挙げられる。本発明は、本明細書に開示された化合物の任意の窒素含有基の四級化も想定している。水または油に可溶性あるいは分散性の産物が、そのような四級化により得られる場合がある。
本明細書に記載の式の化合物は、例えば、注射により、静脈内に、動脈内に、皮下に(subdermally)、腹腔内に、筋肉内に、または皮下に(subctaneously)、または経口的に、口腔内に、経鼻的に、経粘膜的に、局所に、眼科用製剤により、または吸入により、約0.001〜約100mg/kg体重の範囲の用量で、または特定の薬剤の要求に従って投与することができる。本明細書の方法は、望ましいまたは記述された効果を達成するための有効量の化合物または化合物の組成物の投与を考慮している。典型的には、本発明の医薬組成物は約1〜6回/日あるいは継続的な点滴で投与される。このような投与は長期治療または救急治療として使用できる。単一用量形態を提供するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、治療の受給者および投与の特定の様式によって異なる。典型的な調剤は約5%〜約95%の活性化合物(w/w)を含有する。あるいは、そのような調剤は約20%〜約80%の活性化合物を含有する。
上記の用量よりも少ないまたは多い用量が要求される場合もある。任意の特定の患者のための特定の用量および治療計画は、採用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄率、薬剤の組合せ、疾患の重症度および経過、状態または症状、患者の病気に対する体質、状態または症状および担当医の判断を含む様々な要因に依存するであろう。
患者の状態を改善する際、必要であれば、本発明の化合物、組成物または組合せの維持用量を投与してもよい。その後、投与の用量または頻度あるいはそれらの両方を、症状に応じて、改善した状態が維持されるレベルまで低減させてもよい。しかしながら、患者は病状の再発があれば、長期的に断続的な治療を必要とする場合がある。
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の式の化合物またはその薬学的に許容される塩と、例えばモルヒネまたはコデインを含む追加の薬剤と、任意の薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤とを含む。本発明の代替的な組成物は、本明細書に記載の式の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤とを含む。本明細書に記述された組成物は、本明細書に記述された式の化合物と、存在する場合は追加の治療剤とを、疾患または病状の変調を達成するのに有効な量で含む。「薬学的に許容される担体またはアジュバント」という用語は、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、かつその薬理活性を失わせず、更にその化合物の治療量を送達するのに十分な用量で投与された時に非毒性である担体またはアジュバントを指す。
本発明の医薬組成物に使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバントおよび賦形剤は、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、d−α−トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸エステルのような自己乳化型ドラッグデリバリーシステム(SEDDS)、Tween(登録商標)や他の類似のポリマーデリバリーマトリックスのような医薬剤形で用いられる界面活性剤、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムのような塩または電解質、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含むがこれらに限定されない。α−、β−、およびγ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンも、本明細書に記載の式の化合物の送達を促進するために有利に用いることができる。
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、経膣的にまたは埋め込まれたリザーバを介して、好ましくは経口投与または注射により投与され得る。本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含有してもよい。いくつかの場合、調製される化合物またはその送達形態の安定性を高めるために、製剤のpHは薬学的に許容される酸、塩基または緩衝剤で調整されてもよい。本明細書において、非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨下、髄腔内、病巣内および頭蓋内への注射または点滴技術を含む。
医薬組成物は、無菌の注射可能な製剤の形態、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液としてもよい。この懸濁液は、当技術分野において既知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤(例えばTween(登録商標)80のような)および懸濁剤を用いて調製することができる。無菌の注射可能な製剤は、非毒性かつ非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液、例えば1,3−ブタンジオール中の溶液とすることもできる。使用され得る許容される賦形剤および溶媒の中では、マンニトール、水、リンガー液および等張の塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌固定油は溶媒または懸濁媒体として従来用いられている。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の無菌固定油が使用され得る。オレイン酸やそのグリセリド誘導体のような脂肪酸、オリーブ油やヒマシ油、天然の薬学的に許容される油脂、特にそれらのポリオキシエチレン化物は、注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、あるいはカルボキシメチルセルロースまたは乳液や懸濁液のような薬学的に許容される剤形の調製に一般に用いられる類似の分散剤を含んでもよい。Tween(登録商標)やSpansのような他の一般に用いられる界面活性剤および/または、薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形を製造するために一般に使用される他の類似の乳化剤またはバイオアベイラビィティ促進剤は、調剤の目的で用いることもできる。
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、乳液および水性の懸濁液、分散液および溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口用途の錠剤の場合、一般に使用される担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も、典型的に添加される。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液および/または乳液が経口投与されるとき、活性成分は、乳化剤および/または懸濁剤と組み合わされた油性相内に懸濁または溶解される場合がある。所望の場合、ある種の甘味剤および/または香料および/または着色剤を添加してもよい。
本発明の医薬組成物は、直腸投与のために坐薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。したがって、直腸内で溶融して活性成分が放出される。このような材料は、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールを含むがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物は鼻用エアロゾルまたは吸入によって投与されてもよい。そのような組成物は、医薬調剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための促進剤、フルオロカーボン、および/または当技術分野で既知の他の可溶化剤または分散剤を用いつつ、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
本発明の組成物が本明細書に記載の式の化合物と、1つ以上の追加の治療剤または予防剤との組合せを含む場合、化合物および追加の薬剤の両方とも、単剤治療レジメンで通常投与される用量の約1〜100%、より好ましくは約5〜95%の用量レベルで存在するべきである。追加の薬剤は、多数の用法の一部として、本発明の化合物とは別に投与されてもよい。あるいは、これらの薬剤は、本発明の化合物と一緒に混合されて単一の組成物とされる単一剤形の一部であってもよい。
(ポリペプチドの修飾)
ステープルドポリペプチドは、薬剤、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体;第2のポリペプチド;炭化水素、などを含んでもよい。ポリマーまたはほかの作用物質がステープルドペプチドに結合している場合、組成物は実質的に均質であることが好ましい場合がある。
ステープルドポリペプチドは、薬剤、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体;第2のポリペプチド;炭化水素、などを含んでもよい。ポリマーまたはほかの作用物質がステープルドペプチドに結合している場合、組成物は実質的に均質であることが好ましい場合がある。
ポリエチレングリコール(PEG)分子の添加により、ポリペプチドの薬物動態および薬力学的特性を向上させることができる。例えば、PEG化は腎クリアランスを低下させ、より安定な血漿濃度をもたらし得る。PEGは水に可溶のポリマーであり、下記式のポリペプチドに結合される:
XO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−Y ここで、nは2〜10,000およびXはHまたは末端修飾、例えば、C1〜4アルキル;およびYはポリペプチドのアミン基(リシンのイプシロンアミンまたはN末端を含むがこれらに限定されない)とのアミド結合、カルバメート結合または尿素結合である。Yはチオール基(システインのチオール基を含むがこれに限定されない)とのマレイミド結合であってもよい。PEGをポリペプチドに直接または間接的に結合させる他の方法は当業者に既知である。PEGは直鎖でも分岐鎖でもよい。様々な官能化誘導体を含む様々な形態のPEGが市販されている。
XO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−Y ここで、nは2〜10,000およびXはHまたは末端修飾、例えば、C1〜4アルキル;およびYはポリペプチドのアミン基(リシンのイプシロンアミンまたはN末端を含むがこれらに限定されない)とのアミド結合、カルバメート結合または尿素結合である。Yはチオール基(システインのチオール基を含むがこれに限定されない)とのマレイミド結合であってもよい。PEGをポリペプチドに直接または間接的に結合させる他の方法は当業者に既知である。PEGは直鎖でも分岐鎖でもよい。様々な官能化誘導体を含む様々な形態のPEGが市販されている。
主鎖に分解性結合を有するPEGを用いてもよい。例えば、PEGは加水分解に供されるエステル結合を伴って調製されてもよい。分解性PEG結合を有する複合体は、国際公開第99/34833号、国際公開第99/14259号、および米国特許第6348558号に記載されている。
ある実施形態において、巨大分子ポリマー(例えばPEG)は、中間リンカーを介して本明細書に記載の作用物質に結合される。ある実施形態において、リンカーはペプチド結合でつながった1〜20個のアミノ酸から形成され、これらのアミノ酸は20個の天然アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者によく理解されているようにグリコシル化されてもよい。他の実施形態において、1〜20個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態において、リンカーはグリシンおよびアラニンのような、立体障害のないアミノ酸から大部分が形成される。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−NH(CH2)nC(O)−(n=2〜20)のようなアルキルリンカーを用いることができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル(例えばC1〜C6)、低級アシル、ハロゲン(例えばCl、Br)、CN、NH2、フェニル等の非立体障害基で更に置換されてもよい。米国特許第5446090号には、二官能性PEGリンカー、およびPEGリンカーの各末端にペプチドを有する複合体の形成にそれを使用することが記載されている。
いくつかの場合、溶解度および/またはαヘリシティは、ペプチドのアミノ末端をスペルミンを結合させて修飾することにより改善してもよい(Muppidi et al.2011 Bioorg Med.Chem Lett 7412)。
(スクリーニングアッセイ)
本明細書に記載のアッセイは、個々の候補化合物とともに実施可能であるか、複数の候補化合物とともに実施可能である。アッセイが複数の候補化合物とともに実施される場合、アッセイは候補化合物の混合物を用いて実施可能であるか、またはそれぞれ1つの候補化合物を有する複数の反応を並行して行うことができる。試験化合物または作用物質は、当技術分野において既知であるコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを用いて得ることができる。
本明細書に記載のアッセイは、個々の候補化合物とともに実施可能であるか、複数の候補化合物とともに実施可能である。アッセイが複数の候補化合物とともに実施される場合、アッセイは候補化合物の混合物を用いて実施可能であるか、またはそれぞれ1つの候補化合物を有する複数の反応を並行して行うことができる。試験化合物または作用物質は、当技術分野において既知であるコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを用いて得ることができる。
(他の適用)
本発明の多くの実施形態を説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
本発明の多くの実施形態を説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
参考文献
Claims (28)
- 内部架橋されたポリペプチドであって、配列番号12〜20のいずれかのアミノ酸配列を含み、3個または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも2個のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されている、内部架橋されたポリペプチド。
- (a)第1、第2および第3のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されており、
(b)第1および第2のアミノ酸が3個または6個のアミノ酸で隔てられ、かつ第2および第3のアミノ酸が3個または6個のアミノ酸で隔てられており、
(c)第1のアミノ酸と第2のアミノ酸との間に内部架橋が存在し、かつ第2のアミノ酸と第3のアミノ酸との間に内部架橋が存在する
請求項1に記載の内部架橋されたポリペプチド。 - Xaa8およびXaa12の側鎖が内部架橋で置換されているか、Xaa4およびXaa8の側鎖が内部架橋で置換されているか、またはXaa12およびXaa16の側鎖が内部架橋で置換されている、請求項1に記載の内部架橋されたポリペプチド。
- 式(I)の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、
R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
R3はそれぞれ独立して、それぞれ0〜6個のR5で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル;[R4−K−R4’]nであり;
R4およびR4’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、
R5はそれぞれ独立してハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
Kはそれぞれ独立してO、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、または
R6はそれぞれ独立してH、アルキル、または治療剤であり、
nは1〜4の整数であり、
xは2、3または6であり、
yおよびwは独立して0〜100の整数であり、
zは1〜10の整数であり、
Xaaはそれぞれ独立してアミノ酸であり、
前記修飾ポリペプチドは、配列番号12〜20のいずれかの少なくとも8個の連続するアミノ酸のうち、(a)前記連続する8アミノ酸のうち、3、4または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも1対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されているもの、および(b)そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR2で置換されているもの、を除くものを含む修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。 - 修飾ポリペプチドがICN1−CSLに結合する、請求項1に記載の修飾ポリペプチド。
- xが2である、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- xが3である、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- xが6である、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- xが2、3または6であり、R3が1個の二重結合を含むアルケニルであり、R1および独立してR2の両方がHまたはメチルである、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- yが独立して3〜15の整数である、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号12〜20のいずれかの少なくとも16個の連続するアミノ酸のうち、(a)前記連続する8アミノ酸のうち、3、4または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも1対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されているもの、および(b)そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR2で置換されているもの、を除くものを含む請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- Glu1Arg2Xaa3Xaa4Arg5Arg6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Arg11Xaa12His13His14Ser15Xaa16(配列番号12)の少なくとも16個の連続するアミノ酸を含み、
Xaa4およびXaa8の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されており、そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(I)に示されるようにR2で置換されている、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。 - ポリペプチドがpH7で正味の負電荷を持たない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
- ポリペプチドがpH7で正電荷を持つ少なくとも1個のアミノ酸を含む、請求項17に記載の修飾ポリペプチド。
- ポリペプチドがPEGに共有結合している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
- R1およびR2がそれぞれ独立してHまたはC1〜C6アルキルである、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- R1およびR2がそれぞれ独立してHまたはC1〜C3アルキルである、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- R1およびR2がメチルである、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- R3がアルケニルである、請求項1に記載の修飾ポリペプチド。
- xが3である、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- R3がC8アルケニルである、請求項20に記載の修飾ポリペプチド。
- xが6である、請求項4に記載の修飾ポリペプチド。
- R3がC11アルケニルである、請求項22に記載の修飾ポリペプチド。
- R3がアルケニルである、請求項1に記載の修飾ポリペプチド。
- 式(II)の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、
R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはC1〜C10アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
R3はそれぞれ0〜6個のR5で置換されたアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは[R4’−K−R4]nであり、
R4およびR4’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり(例えば、それぞれ独立してC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9またはC10アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり)、
R5はハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
KはO、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、または
R6はH、アルキル、または治療剤であり、
xは2〜10の整数であり、
wおよびyは独立して0〜100の整数であり、
zは1〜10の整数(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)であり、
Xaaはそれぞれ独立してアミノ酸(例えば20個の天然のアミノ酸のうちの1つまたは任意の天然非天然のアミノ酸)であり、
R7はPEG、tatタンパク質、アフィニティーラベル、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、例えばチオカルバメートまたはカルバメート結合を介して結合した蛍光プローブ(例えばフルオレセインまたはローダミン)であり、
R8はH、OH、NH2、NHR8a、NR8aR8bであり、
前記ポリペプチドは、配列番号12〜20のいずれかまたはその異型の少なくとも8個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、(a)配列番号12〜20の連続する8アミノ酸のうち、3、4または6個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも1対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式(I)に示されるように結合する結合基R3で置換されているもの、および(b)そのアミノ酸の対のうち第1のアミノ酸のα炭素が、式(II)に示されるようにR1で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第2のアミノ酸のα炭素が、式(II)に示されるようにR2で置換されているもの、を除くものを含む、修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。 - 1個以上のXaaがαメチルアミノ酸である、請求項1〜25のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
- 請求項1に記載の修飾ポリペプチドを含み、PEGまたはスペルミンに結合された複合ペプチド。
- PEGまたはスペルミンが修飾ポリペプチドのアミノ末端に結合されている、請求項27に記載の複合ペプチド。
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