CN1871341A - 提高胚胎生存力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高胚胎生存力的方法，其包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。

Description

提高胚胎生存力的方法
技术领域
总体上，本发明涉及提高胚胎生存力的方法和组合物，具体地，涉及通过辅助生殖技术产生胚胎。本发明进一步涉及保护胚胎不受遗传或后天缺陷正选择压力的方法。
背景技术
胚胎在其存在的最初几周不能存活被认为是哺乳动物低受精能力和不育的主要原因。这一点尤其在通过辅助生殖技术(ART)，包括人工受精(IVF)及所有相关技术产生的胚胎中得到例证。大部分的ART胚胎在植入前和刚植入后的时期由于细胞凋亡而死亡。
2000年在澳大利亚进行了共计27,067个ART治疗周期(Hurst和Lancaster，2001，AIHW National Perinatal Statistic Unit，Sydney，ISSN1038-7234)，产生了4,319例能成活的妊娠(成功率16％)。假定在每次治疗周期中平均转移2.1个胚胎(90％以上的成功的治疗周期转移了2个或者更多个胚胎)，这相当于ART产生的胚胎中具有长期生存能力的低于10％。ART是昂贵的。在美国每个治疗周期的平均费用为US$9547(Collins，2002，Human Reproduction Update.8：265-77)。
人们确定ART过程中胚胎生存力的丧失多数发生在植入前阶段或者刚植入之后。ART导致特征性的胚胎发育迟缓，使得在发育程序中受精96-120小时后胚胎通常比它们天然产生的对应物晚至少一整天。每个胚胎中的细胞也较少，而且胚胎中许多细胞经历调亡(Jurisicova等人，1996，Molecular Human Reproduction.2：93-8；O’Neill，1997，Biology of Reproduction.56，229-237)。在许多情况下表现型便足以导致整个胚胎的退化。这种迟缓是与培养条件有关的细胞应激物的后果。植入前的胚胎组成性地表达细胞凋亡的部件并具有细胞调亡的效应器和调控元件。胚胎的成功发育看起来要求对这种调亡部件的抑制。处理各种应激物的尝试仅取得有限的成功。例如，胚胎氧化损伤和还原刺激之间通过自分泌和旁分泌生长/存活因子的相互作用是IVF导致胚胎死亡的重要原因。但是，减轻氧化应激并提供宽范围的推定胚胎存活/生长因子仅部分改善了IVF的效果。这表明存在其它作用于胚胎的相关应激物，并且/或者应激物对胚胎作用的本质尚未很好地明确。
细胞生存力的丧失是限制ART成功的重要因素，人们明确需要更完整地阐明导致ART过程中细胞死亡率降低的因素，并设计提高ART胚胎生存力的适当策略。
关于体细胞对各种环境应激的反应，人们知之甚多。例如，细胞通过稳定和增加转录因子p53的表达而响应于多种形式的基因毒性和非基因毒性应激(例如，参见Agarwal等人，1998，Journal of BiologicalChemistry 273，1-4)。p53是在基因组正常稳定性的维持中起重要作用的细胞应激“传感物”。p53在相互连接的细胞途径的复杂网络内发挥作用，细胞通过其感觉并响应于不适当的应激。其它在该网络内发挥作用的肿瘤抑制因子包括但不限于Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
p53能够(通过CDK抑制因子如p21的诱导)诱导周期细胞级数降低，或者(通过诱导前细胞凋亡介体如Bax、PUMA、AIF等的合成)诱导细胞凋亡。p53突变导致对细胞过程的调节丧失，并与多种癌症的发生有关。半数以上的人类癌症中发现有p53突变。现在人们相信许多成年人疾病至少部分源于胚胎和胎儿发育(包括胚胎植入前阶段)过程中的约束因素。因此，对作用于胚胎的应激和对这些策略的胚胎反应的理解在使许多成年人疾病的发作降至最低的策略设计中是十分重要的。
植入前哺乳动物胚胎通常产生一批可以刺激胚胎生长并存活的营养因子(Hardy和Spanos(2002)Journal of Endocrinology 172，221-236)。ART产生的胚胎生存力降低的主要原因是这些生长因子产生的数目减少。例如，已经观察到血小板活化因子(PAF；1-0-烷基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)和胰岛素样生长因子II(IGF-II)在IVF源胚胎中产生迟缓(O’Neill等人，1987，Fertility and Sterility 47，969-975；和Stojanov等人，1999，Molecular Human Reproduction 5，116-124)。
这些观察结果已经导致发展了一系列为体外胚胎培养基补充包括PAF在内的外源营养因子的方案(Ryan等人，1990，Journal ofReproduction and Fertility 89，309-315；O’Neill等人，1989，The Lancetii，769-772)，以致力于增加胚胎的生存力。但是，这种培养基补充的效力是有限的。澳大利亚专利申请第608530号描述了使用外源PAF或PAF类似物来增加植入率。但是，观察到的效果不如预期的显著。假使有正常胚胎发育中需要自分泌和旁分泌营养因子的实验证据(O’Neill，1997，Biology of Reproduction 56，229-237)，这一临床成果是令人惊讶的。
因此，需要提高胚胎生存力的改进方法。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了一种提高胚胎生存力的方法，该方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
抑制剂可以是以下的一种或多种的抑制剂：p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。在一个实施方式中抑制剂为p53抑制剂。抑制剂可以选自：小分子抑制剂、核酸基抑制剂、肽基抑制剂及其任意组合。
可以将至少一种抑制剂加入到含胚胎和/或配子的培养基中作为补充。
可以将p53或p53相关途径的两种或多种抑制剂给药。两种或多种抑制剂可以是相同或不同分子的抑制剂。分子可以选自：p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
根据本发明的第二个方面，提供了一种提高胚胎生存力的方法，该方法包括将至少一种p53抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
p53抑制剂可以选自小分子抑制剂、核酸基抑制剂、肽基抑制剂及其任意组合。抑制剂可以是例如p53抑制素(PFT-α)的小分子抑制剂或其衍生物或类似物。抑制剂可以是p53特异性反义分子，如p53-特异性siRNA。
在一个实施方式中，可以将两种或多种p53抑制剂给药。两种或多种p53抑制剂可以是小分子抑制剂和p53特异性siRNA。
根据本发明的第三个方面，提供了一种提高胚胎生存力的方法，该方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
促生长剂可以是营养因子或其类似物或衍生物，或者是能够激活营养因子相关的信号传导途径的制剂。可以通过将胚胎瞬时暴露于例如离子霉素的钙离子通道来实现这一点。
营养因子可以选自血小板活化因子(PAF)、胰岛素样生长因子-I(EGF-I)和-II(IGF-II)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、自血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一个实施方式中，营养因子是PAF或其类似物或衍生物。
在一个实施方式中，营养因子是IGF-II或其类似物或衍生物。
抑制剂可以是以下的一种或多种的抑制剂：p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
根据本发明的第四个方面，提供了一种提高胚胎生存力的方法，该方法包括将至少一种p53抑制剂和至少一种促生长剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
在一个实施方式中，至少一种p53抑制剂是PFT-α，至少一种促生长剂是PAF。
在一个实施方式中，至少一种p53抑制剂是PFT-α，至少一种促生长剂是IGF-II。
在一个实施方式中，至少一种p53抑制剂是p53特异性siRNA，至少一种促生长剂是PAF。
在一个实施方式中，至少一种p53抑制剂是p53特异性siRNA，至少一种促生长剂是IGF-II。
根据本发明的第五个方面，提供了一种提高胚胎生存力的组合物，该组合物包含至少一种p53或p53相关途径的抑制剂，及一种或多种药物可接受的载体。
根据本发明的第六个方面，提供了一种提高胚胎生存力的组合物，该组合物包含至少一种p53抑制剂，及一种或多种药物可接受的载体。
根据本发明的第七个方面，提供了一种提高胚胎生存力的组合物，该组合物包含至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂，及一种或多种药物可接受的载体。
根据本发明的第八个方面，提供了一种提高胚胎生存力的组合物，该组合物包含至少一种p53抑制剂和至少一种促生长剂，及一种或多种药物可接受的载体。
可以将根据第五到第八个方面的组合物给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
根据本发明的第九个方面，提供了一种提高胚胎生存力的方法，该方法包括将有效量的根据第五到第八个方面中任意一个方面的组合物为胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物中的一种或多种给药。
根据本发明的第十个方面，提供了一种卵母细胞体外受精的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从雌性动物中采集至少一个卵母细胞；
(b)将卵母细胞在体外与精子培育，产生至少一个胚胎；和
(c)在适当的胚胎培养基中培养胚胎，
其中用有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂对雌性动物、采集的卵母细胞(或多个卵母细胞)、精子、从中分离精子的雄性动物和/或培养的胚胎中的至少一种进行处理。
根据本发明的第十一个方面，提供了一种卵母细胞体外受精的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从雌性动物中采集至少一个卵母细胞；
(b)将卵母细胞在体外与精子培育，产生至少一个胚胎；和
(c)在适当的胚胎培养基中培养胚胎，
其中用有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂对雌性动物、采集的卵母细胞(或多个卵母细胞)、精子、从中分离精子的雄性动物和/或培养的胚胎中的至少一种进行处理。
第十或第十一个方面的方法可以进一步包括以下步骤：
(d)将胚胎转移到雌性动物的生殖道中。
根据本发明的第十二个方面，提供了一种用作体外配子或胚胎生长培养基的组合物，该组合物包含有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂，及一种或多种适当的盐和/或营养物。
根据本发明的第十三个方面，提供了一种用作体外配子或胚胎生长培养基的组合物，该组合物包含有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂，及一种或多种适当的盐和/或营养物。
根据本发明的第十四个方面，提供了一种防止胚胎中细胞凋亡的方法，该方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
该方法进一步包括将有效量的至少一种促生长剂给药。
根据本发明的第十五个方面，提供了一种提高辅助生殖技术导致的妊娠率的方法，其中该方法包括暂时抑制p53或p53相关途径的表达或活性。
所述表达或活性的暂时抑制可以通过将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：体外培养的胚胎、分离的卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
根据本发明的第十六个方面，提供了一种提高经受体外受精的雌性动物妊娠率的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从雌性动物中采集至少一个卵母细胞；
(b)将卵母细胞在体外与精子培育，产生至少一个胚胎；
(c)在适当的胚胎培养基中培养胚胎；和
(d)将胚胎转移到雌性动物的生殖道中，
其中用有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂对雌性动物、采集的卵母细胞、精子、从中分离精子的雄性动物和/或培养的胚胎中的至少一种进行处理。
该方法可以进一步包括将有效量的至少一种促生长剂给药。
根据本发明的第十七个方面，提供了一种提高雌性动物排卵率的方法，该方法包括将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂为雌性动物给药。
该方法可以进一步包括将有效量的至少一种促生长剂和/或诱排卵剂给药。
根据本发明的第十八个方面，提供了一种提高精子受精能力的方法，该方法包括将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂为雄性动物或分离的精子给药。
该方法可以进一步包括将有效量的至少一种促生长剂给药。
根据本发明的第十九个方面，提供了一种鉴别提高胚胎生存力的制剂的方法，该方法包括使细胞、细胞提取物或胚胎与候选制剂接触，确认该制剂是否导致对p53或p53相关途径组分的表达或活性的暂时抑制，从而确认制剂是否能够提高胚胎生存力。
根据本发明的第二十个方面，提供了一种提高胚胎生存力的方法，该方法包括将有效量的至少一种经第十九个方面的方法鉴别的制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
根据本发明的第二十一个方面，提供了一种保护胚胎不受遗传或后天缺陷正选择压力的方法，该方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
根据本发明的第二十二个方面，提供了一种防止或降低发育中的胚胎中p53中失功能突变累积的方法，该方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
根据第十至第二十二个方面，所述的抑制剂可以是p53抑制剂。
根据本发明的上述方面和实施方式，典型地雌性动物是选自灵长类动物、羊、牛、犬、猫科动物、猪、马或鼠科动物的哺乳动物。根据特定的实施方式，雌性动物是人类或牛。类似地，典型地精子、卵母细胞和胚胎是选自灵长类动物、羊、牛、犬、猫科动物、猪、马或鼠科动物的哺乳动物胚胎。在特定的实施方式中，精子、卵母细胞和胚胎是人类的精子、卵母细胞和胚胎或者牛的精子、卵母细胞和胚胎。
                         定义
在本说明书的上下文中，术语“包含”是指“主要包括，但并非必然仅仅包括”。而且，单词“包含(comprising)”的各种变体，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”的意思相应地变化。
在本说明书的上下文中，术语“p53相关途径”是指任何形成与p53有关的途径的互连网络一部分的细胞途径。这种途径可以在p53下游、p53上游发挥作用，或者另外可以在p53活性之前、与p53活性相结合或者作为p53活性的后果而发挥作用，并且因此包括可以与p53直接相互作用、与p53间接相互作用，或者另外在p53上游、p53下游发挥作用或者另外可以在p53活性之前、与p53活性相结合或者作为p53活性的后果而发挥作用的组分或成员。本文中提到p53相关途径因此包括该途径的组分或成员。
在本说明书的上下文中，术语“p53或p53相关途径的抑制剂”是指任何能够抑制p53或p53相关途径组分的表达或活性的制剂或动作。因此抑制剂可以直接或间接地作用于p53或p53基因，或者另外通过任何一种或多种p53相关途径组分的直接或间接抑制而起作用。这种组分可以是在p53活性之前、与p53活性相结合，或者作为p53活性的后果被激活、抑制或者其它被调节的分子。因此，抑制剂可以发挥作用，以防止转录、翻译、转录后或翻译后加工，或者另外以任何方式通过直接或间接作用抑制p53或p53相关途径组分的活性。抑制剂可以是，例如，核酸、肽、任何其它适当的化学化合物或分子，或者这些物质的任意组合。另外，应当理解到在直接削弱p53或p53相关途径组分的活性时，抑制剂可以影响其它可以反过来作为分子本身调节物的细胞分子的活性。类似地，抑制剂可以影响本身经受p53或p53相关途径组分的调节或调控的分子的活性。
在本发明的上下文中，术语“特异性”当与核酸基抑制剂有关时，如p53特异性反义分子，它是指基本上呈特异性，但是并非必然专有地是这样。抑制剂应当表现出足够的对所讨论基因的特异性，以暂时抑制该基因的表达或活性。例如，根据本发明的反义分子的核苷酸序列可以表现出与p53编码核苷酸低于100％的序列同源性，而且可以在保留p53特异性的同时与其它序列交叉杂交。
在本发明的上下文中，术语“活性”当与p53或p53相关途径组分有关时，它是指任何由p53或组分通过编码产物的核酸序列或其片段，或者通过基因产物本身或其任意片段而施加的细胞功能、作用、效应或影响。“活性”因此可以涉及p53相关途径的p53组分对作用于其下游的基因或基因产物的活性，术语“活性”因此可以理解为还包括依赖p53或相关途径的表达和这些下游基因和基因产物的活性。
本文使用的术语“表达”可以交换地指基因或基因产物的表达，其包括所编码的蛋白。举例来说，基因的表达可以通过测量信使RNA(mRNA)转录产物的水平来确定。举例来说，多肽基因产物的表达可以通过使用与多肽结合的抗体(或多种抗体)进行的免疫测定来确定。
本文使用的术语“片段”是指编码全长基因或蛋白的构成部分或者是其构成部分，并且具有同样于全长分子的定性生物活性的核酸或多肽序列。
在本发明的上下文中，术语“提高胚胎的生存力”和“提高胚胎生存力”是指与没有直接或间接地用根据本发明的制剂或组合物处理过的或者在其中暴露过的胚胎(或多个胚胎)的存活可能性相比，提高或者增加直接或间接地用这种制剂或组合物处理过的或者在其中暴露过的胚胎(或多个胚胎)的存活可能性。
在本发明的上下文中，术语“有效量”在它的含义之内包括无毒但是足以提供期望效果的制剂或抑制剂的量。所需要的精确量取决于例如被处理的物种、受试者年龄和全身状况、给予的具体制剂或抑制剂和给药方式等等的因素根据具体的受试者而不同。
在本发明的上下文中，术语“暂时抑制”是指抑制并非是永久性的，而是短期并且可逆的。也就是说，基因或基因产物的活性或表达并非被永久性灭活，而是表达或活性被抑制足以产生期望效果的一段时间，并且当抑制剂的效果减弱或停止时，分子可以执行它的正常细胞功能。
在本发明的上下文中，术语“促生长剂”是指营养因子或其类似物或衍生物，或者是能够激活或刺激营养因子相关的信号传导途径的化合物。术语“营养因子”是指能够刺激或促进胚胎的生长和/或发育和/或存活的生长因子，或者刺激胚胎活性增加的生长因子。营养因子可以是自分泌、旁分泌或内分泌营养因子。也就是说，营养因子可以是胚胎自身正常产生或者正常源自母体的营养因子。
附图说明
现在通过实施例的方式结合附图对本发明进行说明。
图1 p53表达的蛋白质印迹分析。(A)稀释到获能培养基之后精子的p53产物。(B)从合子阶段培养至标明的发育阶段或者在标明的发育阶段从生殖道中新鲜收集的p53+/+小鼠胚胎中的p53表达。每个印迹显示了30个胚胎当量所表达的p53。(C)蛋白质印迹检验的特异性。(D)不同的胚胎发育阶段和T47D细胞中p53和Lis-1表达的对比。
图2从生殖道新鲜收集的胚胎(A&D)、在生殖道内受精但是随后在体外培养的胚胎(B&E)和通过体外受精并随后在体外培养产生的胚胎(C&F)的p53+/+小鼠胚泡(A-C)和桑椹胚(D-F)中p53的免疫定位。胚胎分别在10μL培养基中培养。图像是通过个图像的单个共焦界面。对于所有的胚胎，染色、成像、激光设定和图像捕获均在相同条件下进行。
图3胚胎中p53被PFT-α短期抑制对(A)发育至胚泡阶段的胚胎的比例和(B)每个胚泡中细胞数目的影响。将p53抑制素(PFT-α)作为培养基补充加入向通过原位受精(ISF)或体外受精(IVF)产生的合子。
图4配子中p53被PFT-α短期抑制对(A)受精卵母细胞的比例、(B)发育至胚泡阶段的胚胎的比例和(C)每个胚泡中细胞数目的影响。
图5用p53特异性siRNA(A)或非特异性合成(对照)siRNA(B)处理之后用抗p53抗体进行胚泡染色。
图6在授精之前用PFT-α对牛精子处理1小时对随后形成胚泡的卵母细胞比例的影响(各条中显示了每次处理中卵母细胞的数目)。
图7胚胎对加入外源PAF的反应。胚胎从生殖道新鲜收集(新鲜)、在生殖道中受精并体外培养(ISF)或者体外受精并培养(IVF)。反应通过细胞内钙浓度的振幅(A)和2-细胞胚胎反应的比例(B)测量。
图8 PAF和PFT-α共处理对体外培养的胚胎发育的影响，其通过进行至胚泡的胚胎比例(A)和每个胚泡细胞平均数目(B)测量。胚胎用单独的PAF、单独的PFT-α或者PAF和PFT-α二者进行处理。对照胚胎在不存在PAF和PFT-α的条件下培养。
图9 p53基因型对配子和胚胎生存力的影响。(A)精子基因型对ISF后受精率的影响。(B)精子基因型对IVF和ISF产生的胚胎基因型的影响。(C)雌性动物p53基因型对超数排卵后收集的卵数目的影响。
具体实施方式
已知p53基因作为肿瘤抑制基因发挥着至关重要的作用——预计半数以上的人类癌症中发现有p53失功能突变。p53的其它功能和正常细胞和组织中的类似肿瘤抑制基因也正在越来越多地得到确认，例如作为细胞周期关卡调节子(Sherr，2004，Cell 116，235-246)。因此，p53的失活通常被视为是不希望发生的。
p53形成使细胞可以感知并响应于不适当应激的途径互连网络的一部分。作用于p53相关途径的肿瘤抑制物的例子包括但不限于Rb、PTEN、P21、P27ARF和INK。
本发明部分基于发明人如下令人惊讶的发现而预测：p53的表达在辅助生殖技术(ART)例如体外受精(IVF)产生的胚胎中被增量调节，而且这一增量调节与ART后胚胎生存力差有关。认识到对发育中的胚胎中p53的永久抑制是不希望发生的，发明人在此阐明，在配子或胚胎的体外培养过程中对p53加以短期抑制可以提高胚胎的生存力。例如，发育成形态正常的胚泡的胚胎比例得以增加，每个胚泡中的细胞数目增加，而且胚胎中经历凋亡的细胞数目降低。
一方面，本发明提供了通过将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂为胚胎、卵母细胞、雌性动物、精子和雄性动物中的一种或多种给药来提高胚胎生存力的方法。该抑制剂可以是以下的一种或多种的抑制剂：p53、Rb、PTEN、P21、P27ARF和INK。根据本发明的方法可以将多于一种抑制剂或以上的一种或多种给药。
已经显示大量营养因子对植入前哺乳动物胚胎的生长、发育和存活有影响，许多营养因子是胚胎自身产生的(综述于Hardy和Spanos(2002)Journal of Endocrinology 172，221-236)。这些营养因子包括但不限于血小板活化因子(PAF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和-II(IGF-II)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
研究表明，ART胚胎缺少几种营养因子，但是外源提供这些营养因子在恢复发挥功能提高植入率和/或胚胎生存力的正常营养因子方面仅有很少的有益效果。如本文所公开，将PAF作为例子研究，当前发明人已经发现ART胚胎对外源加入营养因子的响应差是由于体外培养的胚胎响应营养刺激的能力降低。这一响应能力降低表现为响应幅度减小以及响应胚胎的比例降低。
有力的证据表明胚胎营养因子对胚胎发挥作用的多种机制彼此高度重复(Lu等人(2003)Journal of Cell Science 15，1567-1576)，其涉及多种机制当中的phosphosphatidylinositol-3-激酶途径，并进一步表明几种营养因子的作用是类似的，但是并不是明显累积的。因此可以合理地指出，并且本领域技术人员将会很容易理解，ART胚胎中观察到的与外源PAF给药有关的营养缺乏对于许多胚胎营养因子同样发生，其包括IGF-I、IGF-II、TGF-α、EGF、LIF、CSF-I和GM-CSF。
如本文所公开，发明人现已阐述，ART所致胚胎中观察到的p53增量调节有助于导致在体外向胚胎中加入外源营养因子益处有限。用p53抑制剂和营养因子处理体外培养的胚胎，导致了与单独用营养因子或单独用p53抑制剂处理胚胎相比，胚胎存活力大为显著地增加。
因此，进一方面，本发明提供了通过将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂为胚胎、卵母细胞、雌性动物、精子和雄性动物中的一种或多种给药来提高胚胎生存力的方法。在具体实施方式中，促生长剂是营养因子，例如PAF、其类似物或衍生物，或者IGF-II、其类似物或衍生物。
p53形成使细胞(包括配子和胚胎)可以感知并响应于不适当应激的途径互连网络的一部分。如本文所公开，本发明的实施方式表明，中断这一网络的关键组分能够提高配子和胚胎的生存力。尽管以下的公开内容主要集中于p53抑制，但是本领域技术人员可以很容易地认识到p53相关途径的其它组分(包括例如Rb、PTEN、P21、P27ARF和INK)也可以被抑制以实现期望的效果。因此，本发明的方法和组合物实施方式考虑使用p53和p53相关途径的抑制剂。
为了本发明的目的，胚胎生存力可以以若干指标反映。例如，胚胎生存力提高可以导致体外受精后胚胎植入率增加，植入前和植入后胚胎致死率降低，临床妊娠率增加或者出生率增加。因此本发明还涉及防止胚胎中细胞凋亡或发育迟缓的方法，并涉及增加动物妊娠率的方法。
本发明特别有利于提高ART尤其是IVF后的胚胎生存力。其它适当的可以应用本发明的ART技术包括但不限于配子输卵管内移植(GIFT)、合子输卵管内移植(ZIFT)、胚泡移植(BT)、胞浆内精子注射(ICSI)、配子、胚胎和细胞的冷藏、胚胎的体外制备(如卵母细胞体外成熟)、胚胎活组织检查和其它形式的胚胎显微操作(包括通过核移植形成胚胎)和转基因系与基因修饰系的产生。它还可应用于胚胎干细胞系的产生。
本领域技术人员将会认识到本发明带来的优势并不限于ART生成的胚胎。相反，本发明的方法和组合物可以同样用于进行处理，以提高所有胚胎的生存力，无论它们是通过ART在体外产生，还是在动物生殖道内产生。因此本发明的方法还可应用于提高其它未辅助妊娠的胚胎生存力和妊娠率。本发明的实施方式还提供了增加雌性动物排卵率的方法和增加雄性动物精子受精能力的方法。
本发明的方法和组合物不仅对人类生殖有用，而且对多种物种均有用。例如，本发明的方法和组合物可以用于在具有农业价值物种的畜牧业中，以及在出于保护目的的物种繁殖中提高胚胎生存力和妊娠。具体地，本发明在脊椎动物中获得应用，更具体地为哺乳动物。例如，如本文所公开，本发明的方法和组合物实施方式在牛生殖中获得应用。
而且，本发明的方法和组合物不仅可以应用于为了增加妊娠成功率而提高细胞生存力，而且还可以在所有提高细胞生存力有益的情形中获得应用，例如胚胎干细胞的产生、克隆胚胎的产生、胚胎嵌合体的产生、转基因或基因修饰细胞系和器官的产生、冷藏及所有相关技术。
为了实现期望的效果，可以直接地将根据本发明实施方式的制剂和抑制剂为胚胎给药，例如作为胚胎在其中被体外培养的培养基的补充。另外，可以在受精之前对雄性配子或雌性配子中的一个或二者进行处理。而且，本发明还考虑用本发明的组合物对雌性动物或雄性动物直接进行处理。
本文还公开了筛选和鉴别提高细胞生存力的制剂的方法，该方法包括使细胞、细胞提取物或胚胎与候选制剂接触，确认该制剂是否导致对p53或p53相关途径组分的表达或活性的暂时抑制，从而确认制剂是否能够提高胚胎生存力。典型地，候选制剂是此前尚未已知能够抑制所讨论分子的表达或活性的化合物。例如，细胞可以是精子细胞、卵母细胞或者胚胎干细胞。
p53和p53相关途径的抑制
根据本发明的实施方式，适于实现期望效果的对p53或p53相关途径的抑制是暂时抑制。也就是说，抑制是短期并可逆的。例如，由于p53活性的重要性，p53永久抑制是不希望发生的。但是如本文所公开，在胚胎体外培养的过程中对p53的短期抑制可以增加胚胎的生存力。例如，发育成形态正常胚胎的胚胎比例得以增加，每个胚泡中的细胞数目增加，而且胚胎中经历凋亡的细胞数目降低。
对于体外培养的胚胎和配子，用至少一种适合的抑制剂来处理优选进行胚胎或配子体外培养期间的持续时间，或者进行这段时间的一部分。本领域技术人员可以根据常规地实验方法很容易地确定暴露于适合的抑制剂的适当时间。
对于ART产生的胚胎，至少一种抑制剂可以作为补充加入到胚胎在其体外培养，或者配子在其中被培养的培养基中。另外或额外地，可以用至少一种抑制剂对从中采集卵母细胞的雌性动物和/或从中收集精子的雄性动物进行处理。将会认识到可以使用任何适当的抑制剂浓度，适当的浓度可能取决于若干因素，其包括但不限于抑制剂作用和毒性的性质、方式，以及有关的动物物种。也就是说，例如，抑制剂的最佳浓度、输送的最佳时间和方式可以在物种间有所不同。本领于技术人员将能够在任何指定的情况下通过常规的实验方法确定适当的参数。
在所有情况下，适当的浓度是足以减轻或预防p53或p53相关途径组分对胚胎存活负面影响的浓度。作为例子，可以将抑制剂以约0.01μM至约50μM，约0.1μM至约20μM，约0.5μM至约15μM，约1μM至约10μM，或者2μM至约10μM的浓度给药。适用于本发明的方法的精确浓度将会取决于若干因素，其包括，例如，给药的受试者(即胚胎、分离的细胞或个体)、待处理的物种、给药方式和给药的抑制剂。本领域技术人员将能够在任何指定的情况下通过常规的实验方法确定所使用的适当浓度。
以下具体参考p53抑制剂提供了适当抑制剂的说明。但是该说明绝不应当理解为对本发明做出限定。相反，本领域技术人员将很容易地认识到，可以使用类似机制来抑制p53相关途径和这些途径的组分或成员以实现期望效果，并且这些抑制落入本发明的范围之内。
p53抑制
适用于本发明方法的p53抑制剂是提供可逆抑制，提供足够长时间的抑制以防止发育中的胚胎中p53诱发的存活力丧失，并且毒性低的抑制剂。根据本发明适用的p53抑制剂可以是小分子抑制剂、核酸基抑制剂、肽基抑制剂或其任意组合物。
这种抑制剂可以直接或间接地作用于p53。例如，抑制剂可以作用于削弱或防止p53的核输入和/或输出，可以降低p53稳定性，或者可以阻断若干其它作用的任意一种或多种，例如下游作用基因的转录激活。例如，p53激活若干编码凋亡前和细胞周期败育介体的基因的转录，其包括，例如bax、p21/waf1、IGF-BP3和PUMA(Agarwal等人，1998，Journal of Biological Chemistry 273，1-4)。本发明涉及防止胚胎中p53引发的细胞凋亡或细胞败育，并因此考虑抑制被p53调节的凋亡或败育诱导因子(如上文所提到的)的转录或功能。
另外，适当的抑制剂可以通过它与p53调节物的相互作用或者对p53调节物的影响而对p53活性发挥其抑制作用。例如，p53活性的关键调节物是MDM-2(Momand等人，1992，Cell.69：1237-45)。MDM-2导致p53的核输出、泛素化和降解，从而限制了它的作用。MDM-2活性的规范调节物是其通过PI3K/Akt信号传导途径发生的磷酸化(Ogawara等人，2002，Journal of Biological Chemistry.277：21843-50)。
在本发明的一个实施方式中，p53抑制剂是小分子抑制剂。一种特别适用于本发明方法的小分子抑制剂是p53抑制素(PFT-α；2-(2-氨基-4，5，6，7-四氢苯并噻唑-3-基)-1-对甲苯基ethanone)(Komarov等人，1999，Science.285：1733-1737)或其变体或衍生物。当前发明人阐明，向培养的胚胎中加入0.1至20μM的PFT-α对于增加胚胎存活具有显著效果。
本领域技术人员将会认识到可以通过使用化学抑制剂如PFT-α以外的多种方式来实现暂时抑制。例如，还可以考虑核酸基和肽基抑制剂，而且本发明的方法可以使用若干另外的途径实现暂时的p53抑制。
例如，本发明的实施方式可以利用反义技术通过阻断蛋白质翻译来抑制p53的表达。反义技术利用了核酸以互补序列成对出现这一事实。可以通过化学合成制造适当的p53特异性反义分子，或者在反义RNA的情况下，当连接在启动子上时通过体外或体内转录用本领域技术人员公知的方法进行制造。若干因素可以促使改变使用根据本发明的反义结构实现的抑制水平，其包括，例如，结构设计(核苷酸序列)、所用结构的剂量、任何所用转染制剂的剂量，以及处理的是配子、卵母细胞还是个体。
例如，可以生成典型地长度为18-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其基本上沿其长度与p53基因核苷酸序列的某一区互补。反义寡核苷酸与其互补细胞核苷酸序列的结合可以干扰转录、RNA加工、转运、反义和/或mRNA稳定性。适当的反义寡核苷酸可以通过该领域技术人员公知的方法制备，并可以设计成靶向并结合核苷酸序列的调控区，或者结合编码(外显子)或非编码(内含子)序列。典型地，反义寡核苷酸在自动合成仪上合成。适当的反义寡核苷酸可以包括为了改善其向细胞中的输送至细胞内、其一旦进入细胞内的稳定性和/或其与适当靶底的结合而设计的修饰。例如，可以通过加入一个或多个硫代磷酸酯(phosphorothioate)键，或者在骨架中包括吗啉(所谓的“吗啉代”寡核苷酸)对反义寡核苷酸进行修饰。
仅仅作为例子，可以将p53特异性反义分子以约0.01nM至约200nM，约0.1nM至约100nM，约0.5nM至约50nM，约1nM至约25nM，或者约2nM至约20nM的浓度给药。但是，本领域技术人员将会很容易地认识到，任何指定情况下均应当根据经验确定使用任意指定反义分子的精确浓度，该浓度取决于若干因素，其包括，例如，给药用的分子、转染方法、所用的转染制剂(或多种转染制剂)(如果使用的话)、处理的受试者(即胚胎、分离的细胞、个体)和待处理的物种。本领域技术人员将能够在任何指定的情况下通过常规的实验方法确定所使用的适当浓度。
可以使用一种根据本领域公知方法(例如WO 99/49029和WO01/70949，再次结合其公开内容作为参考)的称为RNA干扰(RNAi)的适当反义技术，以根据本发明的方法和组合物抑制p53的表达。RNAi是指一种通过小干扰RNA分子(SiRNA)破坏特定mRNA来进行选择性转录后基因沉默的方式。siRNA通过双链RNA的切割生成，其中一条链与待钝化的信息链相同。双链RNA分子可以合成为其中一条链与p53mRNA转录产物的特定区域相同，并直接引入。另外，可以使用相应的dsDNA，其一旦在细胞内被呈递便转化成dsRNA。用于RNAi的适当分子的合成方法以及实现转录后基因沉默的方法是本领域技术人员公知的。本领域技术人员可以基于已知的p53核苷酸序列并使用公知技术很容易地设计并生成根据本发明实施方式适用的p53特异性siRNA分子。适当的p53特异性siRNA分子也有市售，例如来自SantaCruz Biotechnology，Inc.。
通过引入能够切割mRNA转录产物并从而防止野生型蛋白产生的催化反义核酸结，例如核糖核酸酶，可以实现另一种抑制p53基因表达的方式。由于两个区域与核糖核酸酶催化位点两侧靶底的序列互补性，核糖核酸酶靶向特定序列并由其复性。特异性识别并切割p53序列的核糖核酸酶的设计和测试可以通过本领域技术人员公知的技术实现(例如Lieber和Strauss等人，1995，Molecular and Cellular Biology，15：540-551，在此结合其公开内容作为参考)。
任何其它适于实现对p53或p53相关途径暂时抑制的抑制剂均包括在本发明的范围之内。另外，本领域技术人员将会很容易认识到，多于一种的直接/或间接抑制p53或其作用，或者p53相关途径的方式之组合可以提供最好的益处。
营养因子
本发明的实施方式提供了促生长剂的使用和给药。典型地，这些促生长剂是营养因子。
适用于本发明方法和组合物的营养因子可以是任何能够对配子或植入前或植入后的胚胎发挥作用的营养因子。营养因子可以是蛋白基、多肽、肽或脂质基的营养因子或其任意组合。
营养因子可以是提取白适当来源的天然化合物，可以是具有相同结构和功能的合成或半合成化合物，或者是天然营养因子的合成类似物或模拟物。在具体的实施方式中，营养因子可以是以下的一种或多种：PAF、IGF-I、IGF-II、TGF-α、EGF、LIF、CSF-I和GM-CSF，或者上述因子中的一种或多种的类似物或衍生物。在一个特定的实施方式中，促生长营养因子是PAF或其类似物或衍生物，如PAF的C2-氨甲酰基衍生物。在另一特定的实施方式中，促生长营养因子是IGF-II或其类似物或衍生物。本领域技术人员将会很容易地认识到，任何指定情况下均应当根据经验确定使用任意指定营养因子的精确浓度，该浓度取决于若干因素，其包括，例如，给药用的营养因子、给药方式、处理的受试者(即胚胎、分离的细胞、个体)和待处理的物种。本领域技术人员将能够在任何指定的情况下通过常规的实验方法确定所使用的适当浓度。仅仅作为例子，营养因子可以是PAF。可以将PAF以约0.01nM至约50nM，约0.1nM至约20nM，约0.5nM至约15nM，约1nM至约10nM，或者约2nM至约10nM的浓度给药。
本发明还考虑通过营养因子下游信号传导途径的人工刺激来提供营养支持。例如在PAF的情况下，可以通过将胚胎瞬时暴露于例如离子霉素的钙离子通道来刺激细胞内钙浓度的瞬时增加。例如，可以在0.1至1μM的离子霉素浓度下暴露近似30秒。另外，由于若干营养因子通过依赖phosphosphatidylinositol-3-激酶(PI3K)的途径起作用(Lu等人(2004)Journal of Cell Science 15，1567-1576)，本发明的实施方式中可以激活这一途径，以作为刺激营养因子信号传导途径的方式。
制剂(或多种制剂)的给药
在本发明的实施方式中，当它们涉及ART产生的胚胎时，用至少一种p53或p53相关途径的抑制剂，并任选地与至少一种促生长剂一起对体外培养的胚胎进行直接处理。抑制剂和/或制剂可以作为补充加入到胚胎在其中被培养的生长培养基中。但是，本发明在其范围之内还包括其中在其它阶段加入适当抑制剂和制剂的实施方式。例如，可以用制剂从经历ART的雌性动物中采集的卵母细胞进行处理。类似地，同样也可以处理精子。
另外，可以直接将适当的制剂为雌性和/或雄性动物给药。例如，动物可以尝试自然受孕，或者经历ART处理，例如进行IVF程序处理。另外，可以将处理给予妊娠的雌性动物。
对于其中的方法提供至少一种促生长剂和至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给药的实施方式，可以将至少一种促生长剂和至少一种抑制剂分别给药，或者另外地，它们可以是单个组合物的多种组分。如果分别给药的话，给药可以是依次或同时的。
可以根据本领域技术人员公知的方法制备根据本发明实施方式的含有适当制剂的组合物。这种组合物可以包含药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。载体、稀释剂和佐剂在与组合物其它成分相容以及对其受体无害方面必须是“药物可接受的”。这些组合物可以通过标准途径给药。通常，组合物可以通过肠胃外或口服途径给药。更优选通过口服途径给药。另外，给药可以是局部的或阴道的，例如以软膏、霜剂、洗剂或凝胶的形式，或者通过插入阴道栓剂的方式。
应当理解到，任何特定个体的具体剂量水平将会取决于多种因素，其包括，例如，所用具体制剂的活性、年龄、体重、全身健康、饮食、给药时间、排泄率以及与其它处理或治疗方式的结合。可以以处理医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次的制剂或组合物给药。无论如何，用于本发明的制剂或组合物应当提供足以提高胚胎生存力的制剂量。
药物可接受载体或稀释剂的例子有脱矿质水或蒸馏水；盐溶液；植物油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅氧烷；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级醇，例如乙醇或异丙醇；低级aralkanol；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如软脂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄芪树胶或阿拉伯树胶；和石油凝胶。典型地，载体或多种载体形成组合物的10wt％酯99.9wt％。
本发明的组合物可以是适于肠胃外给药的形式，或者是适于口服摄入剂型的形式(例如，如胶囊、片剂、囊片、酏剂)。
作为可注射溶液或悬浮液给药时，无毒的肠胃外可接受稀释剂或载体可以包含林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2-丙二醇。
一些口服适用的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的例子包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、褐藻酸钠、阿拉伯树胶、黄芪树胶、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服剂型可以含有适当的调味剂或着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可以涂覆有延迟分解的化合物，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
佐剂典型地包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
口服给药的固体剂型可以含有人类和兽医药物实践中可接受的粘合剂、甜味剂、分解剂、稀释剂、调味剂、涂层剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。适当的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄芪树胶、褐藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适当的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天门冬酰苯并氨酸甲酯或糖精。适当地分解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜耳树胶、黄原胶、皂土、褐藻酸或琼脂。适当的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢钙。适当的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或覆盆子调味剂。适当的涂层剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物/或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或谷蛋白。适当的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适当的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉。适当的延时剂包括甘油单硬脂酸酯和甘油二硬脂酸酯。
口服给药的液体剂型在上述制剂之外可以含有液体载体。适当的液体载体包括水、油，例如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酸酯或其混合物。
口服给药的悬浮液可以进一步包含分散剂和/或悬浮剂。适当的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、褐藻酸钠或乙酰基醇。适当的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸(如硬脂酸)的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯以及类似物。
口服给药的乳液可以进一步含有一种或多种乳化剂。适当的乳化剂包括上文例证的分散剂或天然树胶，如瓜耳树胶、阿拉伯树胶和黄芪树胶。
可肠胃外给药组合物的制备方法对于该领域技术人员来说是显而易见的，例如，在Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，MackPublishing Company，Easton，Pa.中得到更详细的说明，因而在此将其引入作为参考。
组合物中可以加入任何适当的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，如山梨糖醇酐酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂，例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料，如silicaceoussilica和其它例如羊毛脂的成分。
适于局部或阴道给药的剂型包含活性成分连同一种或多种可接受的载体，而且任选地包含其它治疗成分。适于局部或阴道给药的剂型包括适于穿过皮肤渗透到需要处理部位的液体或半液体制剂，例如洗剂、霜剂、软膏、糊剂或凝胶。
根据本发明的霜剂、软膏或糊剂是用于外敷或者阴道内应用的活性成分半固体剂型。它们可以通过将单独的或者水或非水流体中溶液或悬浮液中的极细或粉末状形式的活性成分与油性或非油性基底混合而制成。基底可以包括烃类(如硬蜡、软蜡或液体石蜡)、甘油、蜂蜡、金属皂；黏胶；源自天然的油，如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸(如硬脂酸或油酸)连同醇(丙二醇或聚乙二醇)。组合物中可以加入任何适当的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，如山梨糖醇酐酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂，例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料，如silicaceous silica和其它例如羊毛脂的成分。
凝胶尤其适用于阴道给药。本领域技术人员可以将凝胶设计成在将渗漏降至最小的同时提供长期接触并促进活性成分可控持续的释放。
还可以将组合物以脂质体的形式给药。脂质体通常获自磷脂或其它脂质物质，由分散在水相介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用任何无毒、生理可接受并且可代谢的能形成脂质体的脂质。脂质体形式的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂以及类似物。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，天然和合成的均可。脂质体的形成方法在本领域中是公知的，与此相关可以具体参考：Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，第33页起，在其结合起内容作为参考。
前体药物也包括在本发明所用的制剂范围之内。典型地，前体药物是很容易在体内转化成如本文所述本发明所需制剂的本发明制剂的功能衍生物。选择和制备前体药物的典型方法是本领域技术人员公知的，例如，其描述于H.Bundgaard(Ed)，Design of Prodrugs，Elsevier，1985，在此结合其公开内容作为参考。
体外培养基
本发明提供了用作培养基的组合物，其中培养基包括有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂，任选地除配子或胚胎体外生长和发育所需的必要营养物和辅因子之外还包括至少一种促生长剂。
在ART过程中进行配子或胚胎的体外培育和培养可以使用一系列的适当培养基，其类型和组成对于本领域技术人员是公知的。优选地，培养基含有至少水、盐、营养物、必需氨基酸、维生素和激素，还可以包括一种或多种生长因子。市售有一系列的培养基，例如Earle’s培养基、Ham’s F10培养基和人输卵管液(HTF)培养基。
本发明还考虑通过本领域的公知方法在一层“饲养细胞”上进行胚胎的体外共培养。适当的共培养“饲养细胞”可以包括，例如，牛输卵管细胞或人输卵管上皮细胞。
失功能突变
当前发明人的结果表明，ART导致对p53的增量调节，这是ART诱发的胚胎途径的主要原因。P53导致若干细胞凋亡效应物和调节元件(包括Bax蛋白)的合成，导致胱天蛋白酶的激活和随之发生的细胞死亡。因此，p53或p53相关途径组分中失功能(LOF)突变的呈现可以有利于ART胚胎的存活。
因此ART可以提供p53基因或者编码p53相关途径组分的基因中的失功能(LOF)突变正选择压力，即使是在半合子的状态下。有利于LOF突变的选择可以导致ART产生的子代中肿瘤易感性的过量呈递。尽管这种LOF突变的种系频率不高，小鼠模型中观察到的选择压力范围可能导致基因频率随着时间而显著转变。应用于人类ART实践时，LOF突变累积对于该技术的应用将会具有重大的意义。
因此，本发明提供了保护胚胎，尤其是辅助生殖技术产生的胚胎不受遗传或后天缺陷的正选择压力，或者p53基因或编码p53相关途径组分的基因中LOF突变的正选择压力影响的方法。
现在参考以下具体实施例对本发明进一步更详细地说明，具体实施例不应当理解为限定本发明的范围。
                      实施例
                     一般方法
小鼠：p53基因敲除小鼠由B6.129S2-Trp53tm1Tti株系(p53-/-)与C57BL/6J回交。变异株系在Massachusetts Institute of Technology的Center for Cancer Research处Dr.Tyler Jacks的实验室中发育，现在取得许可饲养于Gore Hill Research Laboratory，Royal North Shore Hospital。通过使杂合雌性与纯合雄性交配来保持株系，根据需求设定具体交配以产生p53-/-、p53+/-和p53+/+小鼠。从所有离乳仔中收集尾部组织，并使用以下引物通过PCR进行基因型扩增：5’-CTT ggg Tgg AgA ggCTAT TC-3’& 5’-Agg TgA gAT gAC Agg AgA TC-3’(敲除等位基因)和5’-ATA ggT Cgg Cgg TTC AT-3’& 5’-CCC gAg TAT CTg gAA gACAg-3’(野生型等位基因)。
小鼠IVF：通过5IU妊娠雌马血清促性腺激素，之后48小时后为5IU人绒毛膜促性腺激素，使雌性超数排卵。hCG处理后13-15小时后收集卵母细胞并洗涤。将从证实有受精能力的雄性小鼠(14-35周龄)附睾中收集的附睾精子立即置于1ml培养基中。使精子在37℃下分散10分钟，然后将其加入到0.1×106ml的卵母细胞中。受精在最终体积为1ml的培养基中进行。将卵母细胞和精子在37℃下5％CO2的气氛下一起培养5小时。然后重新收回卵母细胞，用Hepes缓冲的HTF洗涤，通过原核和极体的显微检测，评估它们的受精状态。将受精的卵母细胞转移至数滴矿物油修饰的HTF培养基，并且每隔24小时评估它们的发育状态。
                     实施例1
               小鼠胚胎中p53的表达
实施例1(A)-mRNA表达
使用RT-PCR比较新鲜p53+/+小鼠胚胎(在生殖道中受精并生长的胚胎)和IVF小鼠胚胎中p53mRNA的表达。ForIVF胚胎，模型使用了IVF和生长因子剥夺渐增条件下的培养物诱发的梯度范围应激。引物设计成5’-GGA GTC TTC CAG TGT GAT GAT，3’-GGG ACA GCCAAG TCT GTT ATG，其成功地产生了大小(429个碱基对)和序列(SUPAMAC)正确的p53基因的RT-PCR产物。混合多组5个胚胎、卵母细胞或精子。提取mRNA并进行RT-PCR扩增。
检测从生殖道中而不是从附睾精子中收集的卵母细胞、合子、8-细胞、桑椹胚和胚泡阶段的小鼠胚胎中的p53产物。2细胞胚胎中，检测是不定的。在转录抑制剂α-鹅膏毒环肽中培育合子对p53RNA在合子中的定性表达没有影响，但是在α-鹅膏毒环肽中培育2-细胞胚胎在24小时后生成p53mRNA阴性的胚胎(通常为8-细胞阶段)。这一结果表明，合子和早期胚胎中的p53mRNA是配子(可能主要为卵母细胞)的产物，但是其在2-细胞阶段后的连续性表达则需要从合子基因组进行新的转录。进行p53的定量RT-PCR，以比较新鲜胚胎和IVF胚胎中p53mRNA的表达。新鲜胚胎的卵母细胞、合子、桑椹胚和胚泡中发现了等水平的RNA；晚期2-细胞胚胎比其它发育阶段(数据未显示)中的水平低50-70％。新鲜胚胎和IVF胚胎中观察到类似的mRNA表达模式。
实施例1(B)-蛋白表达
使用F1(C57BL/6j X CBA/J)、C57BI6j和p53-/-胚胎或精子考查p53蛋白表达水平。使用T47D乳腺细胞系作为阳性对照进行p53的检测。通过i.p.注射10IU妊娠雌马血清促性腺激素(Folligon，IntervetInternational，Boxmeer，荷兰)，之后48小时后注射10IU人绒毛膜促性腺激素(hCG，Chorulon，Intervet)，使4至8周龄的雌性超数排卵。雌性或者未交配，或者与证实有受精能力的雄性配对。通过次日清晨阴道塞的存在确定妊娠第一天。
样品收集
通过颈椎脱臼杀死小鼠。用Hepes缓冲的含3mg BSA/mol的人输卵管液培养基(Hepes-HTF-101.6mM NaCl、4.69mM KCl、0.2mMMgSO4、0.37mM KH2PO4、21.4mM乳酸钠、2.78mM葡萄糖、2.04mMCaCl2、5mM NaHCO3、0.33mM丙酮酸钠和21mM Hepes pH7.4)将丘物质(Cumulus masses)或胚胎从生殖道中冲出。所有的培养基成分均为组织培养级别，来自Sigma(St.Louis，MO)，除非另外指出，均含有3mg BSA组分V/ml(CSL Ltd，Melbourne，Vic，澳大利亚)。合子在hCG后20-21小时收集，并通过在Hepes-HTF中简单暴露于300IU透明质酸酶(Sigma)，使其不含丘细胞。分别在48小时、72小时和96小时的时候从生殖道中收集胚胎、桑椹胚和胚泡。
从证实有受精能力的雌性小鼠(10-15周龄)附睾中收集小鼠精子，并立刻将其置于1ml培养基中(HTF培养基)。。使精子在37℃下分散10分钟。通过血细胞计(haemocytometer)评估精子的浓度和活力，在含3mg/ml清蛋白的HTF培养基中将精子悬浮液稀释至0.5×106/ml。将精子培育1、2、3或4小时，然后通过离心收集。
蛋白质印迹分析
收集胚胎或精子，以冷PBS洗涤3次，在最大体积为1.5ul的PBS中转移至1.5μl的2X提取缓冲液(2X PBS、2％ Triton X-100、24mM脱氧胆酸、0.2％十二烷基硫酸钠、20mM NaF、20mM Na4P2O7、2mMPMSF、3.08μM抑肽酶、42μM亮肽素和2.91μM胃蛋白酶抑制剂)中。通过三次在液氮中冷冻和解冻(具涡流)的循环将细胞溶解。将蛋白样品用1ul 5X Laemmli buffer(50mM Tris-HCl、5mM EDTA pH8.0、12.5％十二烷基硫酸钠、0.05％溴酚蓝和25％β-巯基乙醇)稀释，在60℃下保温10分钟，使用PhastSystem仪器分离和控制单元(Pharmacia)在20％的均质SDS聚丙烯酰胺凝胶(Pharmacia；瑞典)上进行凝胶电泳。在半干印迹装置中使用转移缓冲液(12mM Tris PH7.0，96mM甘氨酸和20％甲醇)将蛋白在PVDF膜(Hybond-P，Amersham Pharmacia)中印迹过夜。非特异性结合在室温下被补充有0.05％吐温-20的PBS(PBST)中5％的脱脂乳阻断1小时。在4℃下将膜在2.5％的脱脂乳中用1∶5000稀释的单克隆抗LIS-1抗体标记过夜，并用结合辣根过氧化物酶(Jackson ImmuneResearch Laboratories，West Grove，PA，美国)的第二抗体检测。在室温下将膜用Femto SuperSignal ChemiluminescentSubstrate(Pierce，Rockford，IL，美国)显影5分钟。
图1清楚地说明当精子在获能培养基中培育时p53的表达随时间而增加。类似地，图1B说明胚胎中的p53表达至少在从1-细胞胚胎到胚泡过程中随着胚胎的发育而增加，体外培养的胚胎中p53表达高于从生殖道中新鲜收集的胚胎。
图1C和1D确认了检验的特异性。来自p53-/-胚胎的胚泡中没有检测到p53表达，而在来自p53+/+胚胎的胚泡中很容易便检测到p53蛋白(图1C)。而且，图1D确认体外培养后观察到的p53表达增加并不是胚胎中蛋白表达模式完全改变的后果，组成性表达的蛋白LIS-1的表达得以保持证实了这一点。
                       实施例2
              p53在小鼠胚胎中的免疫定位
使用免疫荧光研究植入前小鼠胚胎中的p53表达模式。
将胚胎洗涤3次(洗涤培养基：含0.1％ BSA、0.1％吐温-20的PBS)，并在室温下在PBS PH7.4中用新鲜的2％多聚甲醛(Sigma)固定1小时。将胚胎在室温下在含2％BSA、0.2％吐温-20和0.2％Triton X-100的PBS中渗透30分钟，在2％BSA和30％阻断血清中阻断1-3小时。在4℃下将p53抗原在含2％BSA的PBS中用2μg抗-p53绵羊多克隆抗体/ml(Oncogene Research Porducts(PC35)或家兔多克隆抗-Bax(Santa-Cruz Biothechnology，N-20)染色过夜，然后在室温下用5μg结合家兔抗-绵羊FITC的抗体/ml染色1小时(绿色信道)。对照为2μg代替第一抗体的非免疫IgG/ml。使用采用Nikon PlanApo 60X/1.40油浸物镜的BioRad Radiance共焦显微镜(Australian KeyCentre for Microscopy and Microanalysis，University of Sydney)观察免疫荧光图像。使用LaserSharp 20004.0版(build 365)软件捕获图像。将显微镜和激光设定调节成非免疫对照观察不到荧光。用这些设定和相同设定观察所有测试样品。使用NIH图像软件进行染色定量分析。为使整个胚胎呈现使用显微镜z-切片工具进行1μM切片。
从生殖道中新鲜收集的植入前小鼠胚胎(新鲜胚胎)中(图2A和2D)可免疫检测的p53蛋白的表达(图2)很低。通过IVF产生并单独在10μl培养基(图2C和2F)中培养的胚胎或者在生殖道中受精，然后一组10个在10μl培养基中体外培养的胚胎(图2B和2E)显示了不同的p53表达模式。新鲜胚胎中桑椹胚至胚泡阶段可免疫检测的p53极少，没有证据表明胚胎细胞核内有蛋白积聚。8-细胞阶段之前p53中仅有中等差异，但是之后的各个阶段表达大为增加。从8-细胞阶段后，许多IVF细胞显示出主要染色模式的核染色，胞质染色相对较少。这一蛋白表达模式与ART后胚胎病的模式有关，与8-细胞阶段后发生的多数胚胎丧失有关。
对蛋白表达(实施例1B和2)而不是mRNA水平(实施例1A)的调节表明p53调节处于转录后水平。
                     实施例3
          具有p53失功能突变的胚胎的生存力
高水平p53表达和ART后的胚胎生存力差(实施例1B和2)之间的关联表明p53是胚胎对细胞应激响应的主要效应物。如本文所公开，这一假设被具有p53失功能(LOF)突变的胚胎生存力得以提高的观察结果证实。p53+/-X p53+/-或者p53+/+X p53+/+亲体的交配通过IVF进行，生成的合子培养96小时。与野生型杂交产生的胚胎相比，p53+/-X p53+/-杂交产生的胚胎中有更多的比例达到胚泡阶段(75％与57％)，胚胎具有更多的细胞(P＜0.01)，而且凋亡细胞更少(P＜0.001)。p53+/-X p53+/-杂交还导致了发育显著迟缓或显示出片段形态退化的胚胎数目降低(5％与19％)，培养96小时后从其透明带中孵化的p53-/-胚胎(36％)是p53+/+胚胎(11％)的3倍。
p53+/-X p53+/-杂交的合子在体外培养96小时后，选择形态正常的胚泡进行转移。比起p53+/+Xp53+/+杂交的胚胎，妊娠率显著更高，而且存活胎儿的比例更高。+/+；+/-和-/-基因型分别观察到每个转移胚胎4.7％；9.9％；和60.0％的胎儿存活率。由于相同的亲本系的自然交配导致正常的孟德尔初生分离(Mendelian segregation at birth)，这一基因型的高度显著偏移并非小鼠株系的正常性质。当从生殖道新鲜收集+/+胚胎并立刻转移至假孕待孕母亲时，胎儿存活率为57％。因此p53基因的缺乏看起来补偿了ART的不良影响，并因此导致胎儿存活率增加。
                       实施例4
                 p53抑制和胚胎生存力
p53具有多种重要的细胞功能，因此对它进行永久抑制作为提高胚胎生存力的方法是不希望发生的。上述结果表明，生殖道内胚胎中的p53正常表达是非常低的，因此可以预计如果抑制是短期的，将不会有不良影响，而且可以提高胚胎生存力。
使用两种不同类型的p53抑制剂——小分子抑制剂(实施例4A)和其为p53特异性siRNA分子的核酸基抑制剂(实施例4B)验证这一假说。
实施例4(A)-小分子抑制剂
一种最近发展的选择性p53抑制剂p53抑制素(PFTα[2-(2-氨基-4，5，6，7-四氢苯并噻唑-3-基)-1-对甲苯基ethanone]，Sigma-Aldrich)是可逆地阻断依赖p53的转录激活和细胞凋亡的小分子(Komarov等人，1999，Science.285：1733-1737)。最初通过在二甲亚砜中溶解至10mM的浓度，然后稀释至工作浓度制备PFT-α。
(i)用PFT-α处理胚胎
通过体外受精(IVF)或原位受精(ISF)产生合子，并分别以10μl滴在修饰的HTFM培养基中培养96小时。以0.1-20μM的剂量范围加入PFT-α作为培养基补充。评价发育至胚泡阶段的胚胎比例(图3A)、每个正常胚泡的细胞数目和经历凋亡的细胞比例(图3B)。
结果显示，PFT-α导致了对IVF胚胎发育至胚泡阶段比例的显著二次效应，而且ISF和IVF二者在每个正常胚泡的细胞数目上均有显著增加，在经历凋亡的细胞数目上均有显著降低。这一显著增加的胚胎和细胞的存活在临床上是相关的。
(ii)用PFT-α处理配子
体外制备精子进行受精导致p53合成的增加(见实施例1B；图1A)。而且，通过IVF产生胚胎导致生成的胚胎中p53合成显著增加(实施例1B；图1B)。设计本实验，以确定在体外受精过程中对精子和卵母细胞进行处理是否导致它们的受精率及随后所生成胚胎的发育改善。
之前说明了PFT-α制备、IVF和胚胎培养。该研究使用F1C57BI6jx CBAj)雄性和雌性。在其获能过程中及体外受精过程中向精子中加入PFT-α。
向卵母细胞加入精子4-5小时后，将卵母细胞洗去精子和PFT-α。考查它们存在2个原核，作为成功受精的证据。将成功受精的卵母细胞置于10μl修饰HTF培养基中培养，每10μL滴中1个合子。将它们培养120小时，记录形成形态正常的胚泡的比例。将胚泡固定在2％多聚甲醛中，并用5G Hoechst染剂/ml染色。染色对核进行标记，用于对每一胚泡进行细胞计数。
记录PFT-α剂量对受精卵母细胞的比例、发育成形态学胚泡的合子比例和每个胚泡中的细胞数目的影响，其分别示于图4A、B和C。使用SPSS统计程序包评价PFT-α剂量的影响。使用二元对数回归分析(binary logistic regression analysis)评价受精率和发育率，同时使用一般线性模型评价通过单变量分析评价细胞数目。
图4A表明在存在PFT-α的情况下受精率有依赖剂量的增加(P＜0.01)。在受精的卵母细胞中，发育至胚泡阶段的合子比例有进一步依赖剂量的增加(图4B)(P＜0.05)。在发育至胚泡阶段的胚胎中，每个胚胎中存在的细胞平均数目有依赖剂量的显著增加(P＜0.05，图4C)。
结果说明，在受精之前或受精过程中进行降低配子中p53表达的处理导致了受精的改善和随后胚胎发育的改善。
实施例4(B)：siRNA抑制
作为使用小分子抑制剂暂时抑制p53的替代方法，研究了用p53特异性siRNA对细胞进行瞬时处理抑制p53表达的能力。使用设计成针对小鼠p53的siRNA或者对照的无义siRNA序列的寡核苷酸，二者均获自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。用含3mg聚乙烯吡咯烷酮/mlPVP(Sigma)的siMHTF培养基(102mM NaCl、4.6mM KCl、0.20mMMgSO4、0.4mM KH2PO4、21.4mM乳酸钠、1mM谷氨酰胺、0.33mM丙酮酸钠、2.78mM葡萄糖、2.0mM CaCl2、25mM NaHCO3，pH7.35；285mOsm/l)将siRNA寡核苷酸制备为90nM。所有培养基均用0.1μm的滤器灭菌。然后在存在25％(v/v)oligofectamine(Invitrogen)的情况下用siRNA分子转染细胞。在siMHTF中制备oligofectamine，轻轻混合，在室温下保温5-10分钟。向3μl 25％ oligofectamine中加入17ul siRNA，轻轻混合，并在室温下保温15-20分钟。然后将其用siMHTF稀释至100μL，得到的最终寡核苷酸浓度为15nM。
从F1(C57BL6x CBA/i)小鼠中收集胚胎。用PMSG和HCG(5I.U.)使雌性超数排卵。交配10小时后收集合子，在37℃下在5％CO2的气氛中在modHTF培养基加青霉素和酚红(pH7.35；285mOsm/l)中培养96小时。
在37℃下在5％CO2的气氛中将胚胎用p53siRNA或对照siRNA培育。然后彻底清洗胚胎，将其置于传统培养物中，分析所生成胚胎的发育和p53表达。
将胚胎洗涤3次(洗涤培养基：含0.1％PBS、0.1％吐温-20和0.2％叠氮化钠的PBS)，并在室温下在PBS PH 7.4中用新鲜的2％多聚甲醛(Sigma)固定1小时，进行p53染色。在室温下将胚胎在含2％BSA、0.3％吐温-20的PBS中在存在2％多聚甲醛的情况下渗透30分钟，洗涤之后在2％BSA和30％山羊血清(Sigma)中阻断1-3小时。在4℃下将p53抗原在含2％BSA的PBS中用新制备的1∶50绵羊多克隆抗人类p53抗体(Oncogene Research Porducts)染色过夜，然后在室温下用结合抗-绵羊FITC的抗体(Sigma)染色1小时。染色在Nikon表面荧光显微镜下可见。
图5显示，即使对发育中的胚胎单次应用p53 siRNA也会导致对p53表达的显著减量调节，以及它的主要作用部位核中p53染色的丧失。
用p53 siRNA或对照siRNA处理合子4小时后，在标准条件下体外培养之后，在生成的胚泡中观察到更少的p53染色。而且，用p53siRNA处理生成的胚泡每个胚胎中的细胞数目显著更多——平均增加12.5％(P＜0.05)(数据未显示)。使用oligofectamine或对照siRNA对于胚胎发育至胚泡阶段没有有害影响。
这些结果表明通过PFT-α或者基因缺失以外的方式抑制p53表达活性也能够改善胚胎发育。
                      实施例5
        用PFT-α处理牛精子对胚胎生存力的影响
实施例4论述了p53暂时抑制对小鼠胚胎生存力的有利影响。如下文所述，接下来进行实验以研究用PFT-α处理牛精子对牛胚胎生存力的影响。
所有的胚胎操作在39℃下进行，除了卵母细胞的收获和激活是在室温下进行。除非另外指出，所有的过程均在4-孔Nunc板中在补充有HEPES(TCM-H TCM-199；GibcoTMBRL/Life Technologies，Melbourne，Victoria，澳大利亚)且无矿物油覆盖的组织培养基199(TCM-199)中进行。
从2个不同的当地屠宰场收集牛卵巢，在30-35℃下运输至实验室，以39℃的生理盐水(0.9％ NaCl；Baxter Healthcare Pty.，Ltd.，NSW，澳大利亚)洗涤。
使用18-gauge针抽吸卵巢腔卵泡，并收集至含30IU ml-1肝素(Pharmacia & Upjohn Pty，Ltd.，，Perth，WA，澳大利亚)和2％γ-辐射胎儿牛血清(FBS；JRH Bioscience Pty，Ltd.，Melbourne，Victoria，澳大利亚)的TCM-H中。从卵泡液中收集表现出均匀胞质并且被至少3层紧密的丘细胞围绕的丘卵母细胞复合体(COC)。COC分50组在600μL补充有5μg ml-1 LH(Lutropin-V，Bioniche Animal Health，A/Asia Pty.Ltd.，Armidale，Victoria，澳大利亚)、1μg ml-1β-雌二醇、100IU/100μgml-1青霉素/链霉素和10％ FBS的TCM-199(GibcoTM BRL/LifeTechnologies，Melbourne，Victoria，澳大利亚)中在39℃下在空气中5％CO2的气氛中在无油层的情况下培育和成熟18-22小时。
将取自原种公牛的冷冻/解冻精液梯度放置于珀可上，并在600xg下离心20分钟。除去顶层，测定沉淀的精子浓度和活力。以0.3至3μM之间的浓度向精子制剂种加入PFT-α制剂，培育1小时。然后在39℃下在5％CO2的气氛中向补充有肝素(0.5mg ml-1)、亚牛磺酸(1.65μgml-1)、肾上腺素(0.27μg ml-1)和青霉素(4.5μg ml-1)的Bovine VitroFert(CookAustralia，Brisbane，QLD，澳大利亚)培养基中的COC(1×106精子ml-1)中加入精子24小时。
24小时的精子-卵共培育之后，通过在15ml离心管(Becton-Dickinson Labware，NJ，USA)中涡流90秒，从假定的合子中除去丘细胞。在转移至含Bovine Vitro Cleave(Cook Australia)的4-孔Nunc板(NuncTM，Roskilde，丹麦)中之前，在5％O2；5％CO2和90％N2的气氛中将裸露的胚胎在补充有5％FBS的TCM-H中洗涤5天。第5天将胚胎转移至补充有4％活性炭处理过的牛血清、4％从含成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)的胚胎癌细胞获得的上清液和20μgml-1肝素的Bovine Vitro Cleave(Cook Australia)培养基中。
体外成熟和受精在2个不同的地方使用不同的卵母细胞源由不同的操作人员进行。
第7天测定胚泡的比例(第0天＝受精)。结果如图6所示。结果表明，与对照相比，精子的PFT-α处理对生成的胚胎发育成形态学胚泡的比例有显著的正面效果。该效果的发生不依赖于过程地点和操作人员。这些结果与用p53抑制剂处理小鼠胚胎得到的结果一致，从而表明了本发明的方法和组合物的广泛应用性。
                     实施例6
             ART降低胚胎响应PAF的能力
哺乳动物胚胎表达PAF受体，该受体的激活则引起胚胎细胞内钙浓度的瞬时增加(Emerson等人，2000，Journal of Biological Chemistry275，21905-21913；Lu等人，2003，Biology of Reproduction 69，106-116)。
将小鼠胚胎与外源PAF一起培育，测定细胞内Ca2+浓度，如Emerson等人(2000)所述。所测的胚胎为：(i)在生殖道中受精并从生殖道中新鲜收集的胚胎(新鲜)；(ii)通过IVF和体外培养产生的胚胎(IVF)；和(iii)在生殖道中受精并体外培养的胚胎(ISF)。图7说明，与新鲜和ISF胚胎相比，2-细胞IVF胚胎响应于外源加入PAF的比例大大减少。这一信号传导降低与胚胎体外发育差相关。
                     实施例7
           胚胎与PAF和PFT-α在体外共培养
为了验证p53的增量调节可能是提供外源营养因子实现的益处有限的原因这一假设，进行如下处理后监控体外培养的小鼠胚胎的发育：(i)通过合成的小分子p53抑制剂PFT-α来抑制p53；(ii)将细胞暴露于外源PAF；或(iii)(i)和(ii)的组合。PFT-α的制备如上文所述。PAF(1-o-十六基/十八基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；PAF十六基和十八基同种型的近似等摩尔混合物，Sigma Chemical Company)作为氯仿中10mg/ml的储备溶液在-20℃下保存。将数等份置于无菌硅化玻璃管中，并在N2下干燥。加入含3mg BSA/ml的修饰HTF将PAF溶解，之后剧烈涡流3分钟，然后在37℃下轻轻混合1小时。然后通过以修饰HTF连续稀释达到期望的PAF浓度。
通过5IU妊娠雌马血清促性腺激素，之后48小时后通过5IU人绒毛膜促性腺激素，使雌性超数排卵。将它们与成熟雄性一起放置过夜。妊娠第一天在～1300h采集合子。合子分别以10μl滴在修饰HTFM培养基中培养96小时。在含0、10nM PAF、10μM PFT-α或PAF+PFT-α的培养基中评测胚胎发育成形态正常胚泡的比例、每个胚泡中的细胞数目和每个胚泡中凋亡细胞的数目。
如图8所示，使用PFT-α和PAF单独处理均导致细胞生存力增加，如通过成功发育至胚泡阶段的胚胎比例所评测，而与单独处理相比，PFT-α和PAF结合处理则导致发育显著的进一步改善(P＜0.05)。每个胚胎中存在的细胞数目也观察到这一效应，结合处理比单独处理具有显著更多的细胞(P＜0.05)。
                      实施例8
    与IGF-II和PFT-α结合处理对体外胚胎发育的影响
早期胚胎的正常发育需要自分泌和旁分泌(可能和内分泌)营养因子的作用。这些因子发挥作用以诱导胚胎的正常存活和增殖，并降低细胞周期败育和凋亡的发生率。
自分泌营养因子的一个例子是PAF，如上文实施例6中所述，胚胎的体外培养包括胚胎响应PAF的能力。还有许多其它潜在的营养因子，其例子包括胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和-II(IGF-II)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。当前发明人之前已经显示，IGF-I和IGF-II被早期胚胎的表达由于IVF和培养而受到损害(Stojanov等人，1999，Molecular Human Reproduction5：116-124；Stojanov和O’Neil，2001，Biology of Reproduction 64：696-705)。将IGF-I和IGF-II在体外应用于胚胎对细胞发育有着有益的影响(O’Neil，1997，Biology of Reproduction 56：229-237)。
如实施例7中所述，当PAF处理与PFT-α相结合时，对发育中的胚胎具有加和的益处。由于有许多营养因子作用于胚胎，发明人考查了营养因子和p53抑制之间的加和益处是否是普遍的原理。因此，在同时存在或者不存在PFT-α的情况下分析IGF-II对胚胎发育的影响。
所用的IGF-II是人重组胰岛素样生长因子-II(在大肠杆菌中表达)(Sigma Chemical Co.)，用最小体积为0.1M的乙酸进行重组，并立刻用修饰HTF稀释至50μg/ml的浓度。将各等份在-70℃下冷冻。一经解冻，用修饰HTF连续稀释各个等份。
如上文所述制备并培养从F1杂交通过IVF产生的合子，每10μl滴的培养基1个胚胎。合子分别以10μl滴在修饰的HTFM培养基中培养96小时。在含10ng/ml IGF-II、1μM PFT-α或IGF-II+PFT-α的培养基中评测胚胎发育成形态正常胚泡的比例、每个胚泡中的细胞数目和每个胚泡中凋亡细胞的数目。结果如表1所示。
                          表1
  处理   对照   IGF-II   PFT   IGF+PFT
  ％胚泡   31   42   44   52
  细胞/胚泡   23±4   29±2   32±4   35±3
  显著性   0.01   0.01   0.005
                     实施例9
        p53基因型对配子和胚胎生存力的作用
通过评价从p53+/-小鼠中收集的配子和胚胎的受精能力和发育，研究p53基因型对配子和胚胎生存力的作用。
胚胎、配子和胚胎收集如之前的实施例中所述。
将雌性与野生型(p53+/+)或杂合(p53+/-)雄性交配。交配后12小时，冲刷生殖道，评价受精卵的比例。图9A的结果显示，与p53+/+雄性相比，与p53+/-雄性交配之后的受精发生率显著地(P＜0.001)更高。实验重复4次。通过IVF受精之后实现了类似的受精率提高(数据未显示)。
分析每个所生成的合子的基因型，以确定受精率提高是否归因于无p53精子的受精能力更强。图9B显示通过IVF或ISF受精之后，p53+/+合子的比例出乎意料地大于p53+/-，这表明缺少p53的小鼠产生的精子比野生型动物的精子具有更强的受精能力。这些结果表明，在精子发生的重要阶段中或者精子成熟的过程中降低雄性中p53表达的作用或制剂提高了精子的受精能力。
另外研究了p53基因型对排卵诱导后雌性释放卵母细胞数目的影响。图9C显示仅有1个功能性p53基因的雌性在排卵诱导后释放出显著更多的卵母细胞。这些结果表明，在卵泡发育和排卵过程中降低雌性中p53表达的作用或制剂提高了排卵率。
为了评价具有不同剂量p53基因的胚胎的生存力和发育潜力，进行p53+/-X p53+/-交配，在合子阶段从生殖道中收集胚胎并在体外96小时内评价其发育，或者在交配4天后从生殖道中收集胚泡。评价每个胚胎的发育阶段和形态，然后通过PCR对各个胚胎进行基因型扩增。下文表2所示的结果表明，降低p53基因剂量与从合子阶段收集的胚胎发育潜力提高之间有强烈的关联(A)，但是当从生殖道中新鲜收集胚胎时这种关联便不再存在(B)。这些结果表明，降低早期胚胎中p53表达或活性的处理将具有增强其体外发育的作用。
表2-来自p53+/-x p53+/-杂交的基因型。(A)第1天收集合子胚胎并在体外培养96小时或者(B)第4天收集胚泡
96小时后发育阶段(％) +/+   基因型结果+/- -/-
  A
  孵化中的胚泡***   2(4)   24(48)   24(48)
  胚泡**   15(19.7)   53(69.7)   8(10.5)
  桑椹胚   14(21.5)   38(58.5)   13(20)
  破裂或退化   20*(47.6)   22*(52.4)   0*(0)
  共计*   51*(21.9)   137*(58.8)   45*(19.5)
  B
  胚泡   20(24.3)   35(42.7)   27(32.9)
·P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与预计的孟德尔分离相比。
·在基因型扩增之前除去胚胎的透明带，以确保不存在粘附的母体细胞或精子。98％的胚胎得以成功的基因型扩增。
为了评价降低p53表达是否还导致这种胚胎的胎儿生存力提高，通过使p53+/-X p53+/-亲代交配产生胚胎。96小时或24小时收集胚胎，产生胚泡。将生成的胚泡转移到第3天假孕雌性的子宫中。胚胎转移9天后检查假孕母体妊娠，评价存活胎儿的数目和基因型。下文表3中的结果表明，延长胚胎的体外培养降低了它们形成存活胎儿的能力，但是在p53基因剂量的存在和基因形成存活胎儿的可能性之间有强烈的负相关性。当细胞仅培养很短一段时间时这一关联便不再存在。
因此，这些结果表明，p53基因的缺乏有助于保护胚胎不受体外培养的有害影响，这表明在其培养或操作过程中降低胚胎内p53表达的作用或制剂对胚胎的发育和生存力具有有益的影响。
表3
 培养时间   96小时   24小时
 植入率(％)   113/195(58)   121/196(62)
 存活胎儿   26/195(13)   94/196(48)
 基因型   +/+   +/-   -/-   +/+   +/-   -/-
 胎儿基因型(总数的％)   3(11.5)   11(42.3)   12(46.2)   25(26.6)   44(40.8)   25(26)
 从表3推测转移胚胎(总数的％)基因型   38(19.7)   136(69.7)   20(10.5)   48(24.3)   84(42.7)   64(32.9)
 估计胎儿成活率(％)*   7.9   8.1   60.0   52.1   52.4   39.1
*通过形成的胎儿总数乘以转移胚胎基因型的相对推测频率来计算估计胎儿成活率。
                       实施例10
                      体外培养基
根据本文提供的本发明最佳实施方式，以下概述了具体的典型培养基。下文应当理解为仅仅是适当培养基的说明性例子，而绝非限定本发明的范围。
适当培养基是含101.6mM NaCl、4.69mM KCl、0.2mM MgSO4、0.37mM KH2PO4、21.4mM乳酸钠、2.78mM葡萄糖、2.04mM CaCl2、25mM NaHCO3、0.33mM丙酮酸钠、0.11mmol/L EDTA和1mmol/L谷氨酰胺的修饰HTF培养基，pH7.4，其补充有3mg血清白蛋白/ml，补充有10μM PFT-α，并任选地补充有10nM PAF。
                       实施例11
                        组合物
根据本文提供的本发明最佳实施方式，以下概述了具体的典型组合物。下文应当理解为仅仅是组合物的说明性例子，而绝非限定本发明的范围。
实施例11(A)-胶囊组合物
可以通过向标准2-片式硬明胶胶中装入50mg粉末形式的适当抑制剂，其任选地包括50mg营养因子、100mg乳糖、35mg滑石粉和10mg硬脂酸钠，制备胶囊形式的口服给药用组合物。
实施例11(B)-可注射肠胃外组合物
可以通过将1wt％的各适当的抑制剂，任选地和适当营养因子在体积10％的丙二醇和水中混合，制备注射给药用组合物。通过过滤将溶液灭菌。
实施例11(C)-肠胃外给药用组合物
肌肉注射用组合物可以制备成含有1ml无菌缓冲水和1mg各适当抑制剂，任选地，含有适当营养因子。
类似地，静脉注入用组合物可以包括250ml无菌林格氏溶液和5mg各适当的抑制剂，任选地可以包括适当营养因子。
实施例11(D)-局部霜剂剂组合物
以下概述了典型的局部霜剂输送组合物：
        适当抑制剂                       1.0g
        (适当营养因子                    1.0g)
        Polawax GP200                    25.0g
        无水羊毛脂                       3.0g
        白蜂蜡                           4.5g
        羟苯甲酸甲酯                     0.1g
        去离子&无菌水                    100.0g
将polawax、蜂蜡和羊毛脂一起在60℃下加热，加入羟苯甲酸甲酯溶液，使用告诉搅拌实现均化。然后使温度降至50℃。然后加入p53抑制剂，任选地可加入营养因子，并分散于各处，在低速搅拌下使组合物冷却。
实施例11(E)-阴道给药用凝胶组合物
典型的阴道输送凝胶组合物包括将1.0g适当抑制剂，任选地和适当营养因子一起与水溶性生物粘合性聚合物和pH缓冲物质在纯净水中混合。向上述溶液中加入凝胶化温度低的琼脂至100.0g，同时进行连续轻柔的搅拌，直至形成均一混合物。

Claims (68)

1.一种提高胚胎生存力的方法，所述方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的抑制剂是以下的一种或多种的抑制剂：p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述的抑制剂选自：小分子抑制剂、核酸基抑制剂、肽基抑制剂及其任意组合。
5.根据权利要求1-4中任意一项的方法，其中将所述的至少一种抑制剂加入到含胚胎和/或配子的培养基中作为补充。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中给予p53或p53相关途径的两种或多种抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的两种或多种抑制剂是不同分子的抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的分子选自p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
9.一种提高胚胎生存力的方法，所述方法包括将至少一种p53抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的p53抑制剂选自：小分子抑制剂、核酸基抑制剂、肽基抑制剂及其任意组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的p53抑制剂是小分子抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的小分子抑制剂是p53抑制素(PFT-α)或其衍生物或类似物。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述的抑制剂是p53特异性反义分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的反义分子是p53-特异性siRNA。
15.根据权利要求9-14中任意一项所述的方法，其中给予两种或多种所述的p53抑制剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的两种或多种抑制剂是小分子抑制剂和p53特异性siRNA。
17.一种提高胚胎生存力的方法，所述方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的促生长剂是营养因子或其类似物或衍生物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的营养因子选自：血小板活化因子(PAF)、胰岛素样生长因子-I(EGF-I)和-II(IGF-II)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子-I(CSF-I)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的营养因子是PAF或其类似物或衍生物。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述的营养因子是IGF-II或其类似物或衍生物。
22.根据权利要求17-21中任意一项所述的方法，其中所述的抑制剂是以下的一种或多种的抑制剂：p53、Rb、PTEN、p21、p27、ARF和INK。
23.一种提高胚胎生存力的方法，所述方法包括将至少一种p53抑制剂和至少一种促生长剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的至少一种p53抑制剂是PFT-α，所述的至少一种促生长剂是PAF或其类似物或衍生物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述的至少一种p53抑制剂是PFT-α，所述的至少一种促生长剂是IGF-II或其类似物或衍生物。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述的至少一种p53抑制剂是p53特异性siRNA，所述的至少一种促生长剂是PAF或其类似物或衍生物。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述的至少一种p53抑制剂是p53特异性siRNA，所述的至少一种促生长剂是IGF-II或其类似物或衍生物。
28.根据权利要求16-27中任意一项所述的方法，其中将所述的至少一种抑制剂和所述的至少一种促生长剂加入到含胚胎和/或配子的培养基中作为补充。
29.根据权利要求1-28中任意一项所述的方法，其中所述的胚胎在雌性动物的生殖道中受精。
30.根据权利要求1-28中任意一项所述的方法，其中所述的胚胎通过辅助生殖技术产生。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的辅助生殖技术是体外受精。
32.根据权利要求1-31中任意一项所述的方法，其中所述的胚胎用于胚胎干细胞、克隆胚胎、胚胎嵌合体、基因修饰细胞系和基因修饰生物体的产生。
33.根据权利要求1-32中任意一项所述的方法，其中所述的胚胎是冷藏的。
34.根据权利要求1-33中任意一项所述的方法，其中所述的动物选自：人、非人灵长类动物、羊、牛、犬、猫科动物、猪、马和鼠科动物。
35.根据权利要求34的所述方法，其中所述的动物是人和牛。
36.一种提高胚胎生存力的组合物，所述的组合物包含至少一种p53或p53相关途径的抑制剂，及一种或多种药物可接受的载体。
37.一种提高胚胎生存力的组合物，所述的组合物包含至少一种p53抑制剂，及一种或多种药物可接受的载体。
38.一种提高胚胎生存力的组合物，所述的组合物包含至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂，及一种或多种药物可接受的载体。
39.一种提高胚胎生存力的组合物，所述的组合物包含至少一种p53抑制剂和至少一种促生长剂，及一种或多种药物可接受的载体。
40.一种提高胚胎生存力的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求36-39中任意一项的组合物给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
41.一种卵母细胞体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从雌性动物中采集至少一个卵母细胞；
(b)将卵母细胞在体外与精子培育，产生至少一个胚胎；及
(c)在适当的胚胎培养基中培养所述胚胎，
其中用有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂对雌性动物、采集的卵母细胞(或多个卵母细胞)、精子、从中分离精子的雄性动物和/或培养的胚胎中的至少一种进行处理。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
43.一种卵母细胞体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从雌性动物中采集至少一个卵母细胞；
(b)将卵母细胞在体外与精子培育，产生至少一个胚胎；及
(c)在适当的胚胎培养基中培养胚胎，
其中用有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂对雌性动物、采集的卵母细胞(或多个卵母细胞)、精子、从中分离精子的雄性动物和/或培养的胚胎中的至少一种进行处理。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
45.根据权利要求41-44中任意一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(d)将胚胎转移到雌性动物的生殖道中。
46.一种用作体外配子或胚胎生长培养基的组合物，所述的组合物包含有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂，及一种或多种适当的盐和/或营养物。
47.一种用作体外配子或胚胎生长培养基的组合物，所述的组合物包含有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂和至少一种促生长剂，及一种或多种适当的盐和/或营养物。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
49.一种防止胚胎中细胞凋亡的方法，所述方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括给予有效量的至少一种促生长剂。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
52.一种提高辅助生殖技术导致的妊娠率的方法，其中所述方法包括暂时抑制p53或p53相关途径的表达或活性。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述表达或活性的暂时抑制可以通过将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：体外培养的胚胎、分离的卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
54.一种提高经受体外受精的雌性动物妊娠率的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从雌性动物中采集至少一个卵母细胞；
(b)将卵母细胞在体外与精子培育，产生至少一个胚胎；
(c)在适当的胚胎培养基中培养胚胎；及
(d)将胚胎转移到雌性动物的生殖道中，
其中用有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂对雌性动物、采集的卵母细胞、精子、从中分离精子的雄性动物和/或培养的胚胎中的至少一种进行处理。
55.根据权利要求54所述的方法，其进一步包括给予有效量的至少一种促生长剂。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
57.一种提高雌性动物排卵率的方法，所述方法包括将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予雄性动物。
58.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括给予有效量的至少一种促生长剂和/或诱排卵剂。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
60.一种提高精子受精能力的方法，所述方法包括将有效量的至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予雄性动物或分离的精子。
61.根据权利要求60所述的方法，其进一步包括给予有效量的至少一种促生长剂。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
63.一种鉴别提高胚胎生存力的制剂的方法，所述方法包括使细胞、细胞提取物或胚胎与候选制剂接触，确认该制剂是否导致p53或p53相关途径组分的表达或活性的暂时抑制，从而确认所述制剂是否能够提高胚胎生存力。
64.一种提高胚胎生存力的方法，所述方法包括将有效量的至少一种经权利要求63的方法鉴别的制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
65.一种保护胚胎不受遗传或后天缺陷正选择压力的方法，所述方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
67.一种防止或降低发育中的胚胎中p53失功能突变累积的方法，所述方法包括将至少一种p53或p53相关途径的抑制剂给予以下的一种或多种：胚胎、卵母细胞、精子、雌性动物或雄性动物。
68.根据权利要求68所述的方法，其中所述的抑制剂是p53抑制剂。
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