CN1293188C - 一种将长期培养的可包括人工诱导基因改变的雌或雄体细胞的细胞核转移到去核受体细胞中实现靶向基因改变的克隆动物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种改进的核移植方法,采用长期培养的体细胞作为供体细胞并采用去核卵母细胞作为受体细胞得到可分裂胞质杂合体。所述胞质杂合体在合适的宿主环境中培养时中可用于培养活体动物克隆。
Description
相关技术
本申请要求2000年1月4日提交的美国专利申请60/174383和60/174424的优先权,所述专利申请的公开内容整体合并于此作为参考。
技术领域
本发明涉及一种核移植的改进方法,该方法使得用雄细胞或雌细胞作为供体得到的胞质杂合体能够有效的发育。本发明提供了一种将长期培养的、非胚胎的体细胞的核移植到一去核卵母细胞得到能生成胚胎、胎儿和/或动物的活体全能胞质杂合体。
背景技术
动物克隆研究中最近的发现在科学界引发了一场新的革命。对于克隆技术在农业、医药和基础生物研究领域中的应用潜力已不存在任何疑问。与传统的微注射方法相比克隆技术提供了一种更加经济有效的生产转基因动物的方法。
克隆动物,特别是哺乳动物的方法在过去的二十年中已经得到认真的研究和发展。目前所用的主要的克隆技术被称为“核移植”或“核转移”。核移植为本领域所熟知的一种方法并且在许多文献中都有所披露。例如,参见下列文献:Campbell et al,Theriogenology,43:181(1995);Collas et al.,Mol.Report Dev.(分子发育报告),38:264-267(1994);Keefer et al.,Biol.Reprod.(生物生殖),50:935-939(1994);Sims et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:6143-6147(1993);WO 97/07668;WO 97/07669;WO 94/26884;WO 94/24274;以及美国专利第4,944,384和第5,057,420号(介绍牛的核移植),所有这些文献都作为本发明的参考资料。
核移植的过程一般包括以下步骤:(1)卵母细胞去核;(2)将要与去核卵母细胞结合的细胞进行分离(3)将所述细胞或从所述细胞中分离出的核插入到去核卵母细胞中形成一胞质杂合体(4)将所述胞质杂合体植入动物子宫中以形成胚胎(5)使胚胎发育。
虽然我们也可以从已经死亡的动物体内得到卵母细胞,但我们一般从活体动物的输卵管和/或卵巢中分离得到它们。在去核前卵母细胞一般在本领域普通技术人员所熟知的各种培养基中发育成熟。通常,核移植技术中所用的卵母细胞处于细胞周期的中期II。一般认为卵母细胞最好是新鲜的并且未经保藏。某些卵母细胞,例如牛卵母细胞,对低温特别敏感并且发现在低温储藏后用处不大。
我们可以采用多种方法对卵母细胞去核,这些方法已经为本领域的技术人员所熟知,包括:吸取(参见Smith & Wilmut,Biol.Reprod.,40:1027-1035(1989))、用特殊的DNA荧光物质(参见,例如,Tusnoda et al.,J.Reprod.Fertil.82:173(1988))、和用紫外线照射(参见,例如,Gurdon,Q.J.Microsc.Soc.,101:299-311(1960))。用本领域中熟知的其他的方法也可以去核,例如美国专利第4,994,384中说明的方法,结合于此作为参考。在去核之前和去核过程中,卵母细胞最好在含有微丝消化剂或微管蛋白消化剂的培养基中培养一段时间。消化微丝使细胞膜和其下的周细胞质具有一定的流动性,这样在对细胞结构损伤最小的情况下就可以将包在细胞膜中的卵母细胞的一部分物质很容易的吸进移液管。
直到最近,供体核通常几乎全部从原生殖细胞和体胚胎细胞中分离得到。在发育过程中,某些基因以不被转录的方式发生改变,转录又称为“印刻(imprinted)”。对印刻的研究表明印刻在生殖细胞形成过程中已经被去除了(也就是重新编译)。
直到90年代中期关于核移植形式培养的细胞系的报告才出现。这些报道(参见,例如,Wilmut et al.,Nature(london)385,810-813(1997))表明不仅来自于胚胎的供体细胞是有用的,而且来自于胚泡、卵巢和其他与生殖和性相关的细胞/组织(例如,乳腺上皮细胞、卵丘细胞)的供体细胞也都是有用的。在本发明之前,没有发现从非胚胎和非生殖/性相关组织中获得的体细胞(以下简称为“NENS体细胞”)应用于产生活体动物克隆中。实际上,正如美国专利第5,945,577号中Stice等人所指出的,直到90年代末,人们都普遍认为只有胚胎或未分化的细胞类型能够在核移植技术中定向任何种类的胚胎发育。
Stice等人的美国专利第5,945,577号说明了通过由分化的供体体细胞到去核卵母细胞的核移植的胚胎和胎儿发育。Strelchenko等人的美国专利第6,022,197号描述了从成熟耳孔获得的纤维原细胞经培养得到的纤维原细胞在核移植过程中可用作供体。然而,这两篇文献都没有证明采用他们的方法用NENS体细胞核作为供体生产出活体动物。
在本发明成功的克隆实验之前(即指产生活体动物克隆),就体细胞供体而言,均用雌性供体提供供体核。研究者一般认为只有与生殖器官有关的雌体细胞才可能保持在卵母细胞环境中被正确的重新编译的能力(参见,例如,Capecchi,PNAS 97:956-957(2000年2月1日))。也就是说,人们相信雄细胞不允许以基因组去甲基化和甲基化的方式正确的进行复杂的变化,这种变化通常伴随早期胚胎发育的过程(该过程对保持额外胚胎和胎儿组织的平衡发育是必须的-参见,例如,Tilghman,S.M.cell 96:185-193(1999))发生),原因在于雄体细胞核与雌卵母细胞的细胞质之间存在内在的非兼容性。
减数分裂的(miotic)细胞周期一般分为四个不同的时期:G1,S,G2和M。所谓的“起始事件”,就是指处在进入另一个细胞周期的阶段,发生在G1期。一旦“起始事件”发生,细胞的剩下的G1期是DNA合成预备期。接下来的S期进行DNA合成。G2期介于DNA合成和有丝分裂之间。有丝分裂发生在M期。供体细胞核(最佳是在G0或G1期)一般通过融合或直接注射的方法转移到处于M期的受体细胞中。
供体细胞一般移植到去核卵母细胞的卵周隙产生胞质杂合体。受体卵母细胞通常在与供体细胞融合之前在第二减数分裂中期捕获。
通常用穿过接触/融合平面的直流电脉冲来诱导融合,但是附加的交流电可以用以促进供体和受体细胞的结合。电融合产生一个足够使质膜发生瞬间性的破裂的电脉冲,并且该瞬间很短,膜能够迅速恢复。是细胞暴露在促进融合的化学物质之下可以诱导融合,例如用聚乙二醇或通过灭活的病毒,例如仙台病毒(Sendai virus)。对于小的供体核而言,直接采用微注射方法将核注射入卵母细胞比融合方法更佳。
在供体核与受体卵母细胞融合之前、过程中和之后通常用电和/或非电方式激活胞质杂合体。激活方式包括电脉冲、化学的诱导震荡(shock)、精子穿透、增加卵母细胞内的二价阳离子水平、和减少卵母细胞内细胞蛋白的磷酸化作用(可以用激酶抑制剂)。激活后的胞质杂合体或胚胎通常在本领域技术人员所熟知的培养基中进行培养,包括,但不限于,组织培养基-199(TCM-199)+10%胎牛血清,Tyrodes白蛋白乳酸盐丙酮酸盐(TALP),Ham’s F-10+10%胎牛血清(FCS),合成卵管液(“SOF”),B2,CR1aa培养基和高钾单纯培养基(“KSOM”)。
二十世纪30年代Spemann首先提出通过核移植构建胚胎(Spemann,Embryonic Development and Induction(胚胎发育和诱导)210-211,Hofner Publishing Co.,New York(1938))。然而,直到二十世纪50年代才首次证明了细胞核能够控制发育(Briggs andKing,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 38 455-461(1952))。1983年McGrath和Solter报告了第一例成功的用哺乳动物细胞完成的核移植实验,其中描述了将从鼠科动物(老鼠)的受精卵中分离出的原核插入到去核的卵母细胞中得到活的后代(McGrath & Solter,Science 220:1300-1312(1983))。
1986年Willadsen报告了第一例用绵羊的胚胎细胞作为核供体的核移植实验(Willadsen,Nature 320:63-65(1986))。90年代中期报道了用绵羊的胚胎细胞作为核供体克隆动物(Campbell et al.,Nature 380:64-66(1996));专利国际申请公开号WO 95/20042)。但是直到1997年使用Wilmut等人描述的技术才使克隆羊变成现实(Wilmut et al.,Nature 385:810-813)(1997))。Wilmut等人公开的的文件描述了一种在核移植之前使供体细胞处于静止状态的方法。用哺乳动物语义性细胞(semantic cell)供体和去核卵母细胞得到绵羊。
还没有报道说明用核移植技术克隆牛象鼠和羊那样获得了成功。大部分报告都告知胎畜在脱离子宫后没有存活。然而也有单独的成功克隆牛的报道(参见,Kato et al.,Science 282:2095-2098(1998);Wells et al.,Biol.Reprod.60:996-1005(1999);和Strelchenkoet al.,U.S.Patent No.6,011,197(公布时间:2000年1月4日))
目前现有的所有核移植技术的主要问题在于它们一般需要相对难获得和保存的供体细胞,它们需要用相对新鲜的供体细胞或临时培养的供体细胞,克隆效率低并且不允许直接实施基因组改造技术。
在使用胚胎细胞或卵巢细胞作为供体细胞方面已经进行了大量的核移植研究。由于胚胎干细胞能够支持去核卵母细胞发育到期限动物,它已经成为特别有用的一种供体细胞。对鼠胚胎干细胞的基因改造已经使鼠基因研究发生了变革性的进展。然而,胚胎干细胞在其他种类中不容易获得。
已有文献报道了将有蹄类动物内细胞群细胞用于核移植中。这些细胞的分离比较麻烦,特别是为了产生胞质杂合体这些技术要求比较新鲜的供体细胞(可用的细胞量相对较少)。例如,在许多现有的核移植克隆技术中使用的胚胎细胞系一般取自孕期小于10天并且培养时间小于约5代的胚胎(参见,例如,Campbell et al.,Nature,380:64-68(1996);Stice et al.,Biol.Reprod.,54:100-110(1996))。这些细胞一般保存在滋养层(feeder layer)上来防止用于克隆过程的供体细胞发生明显的分化。因为获取这样的细胞存在很多问题,许多研究者建议用体细胞作为供体细胞。
用体细胞进行核移植的主要问题在于克隆效率较低。用Wilmut等人所描述的方法进行体细胞克隆(Wilmut et al.,Nature 385:810-813)(1997))的出生率估计为1/300,就是说,克隆效率最高为0.4%(也就是说克隆羊的数目除以用来产生克隆羊的核移植数目)。很显然这样低的克隆效率极大地限制了这种技术的经济应用前景。
体细胞克隆的成功性在很大程度上受供体细胞使用的限制,所述供体细胞必须是新鲜的(Wakayama et al.,Nature(London)394:369-374(1998))或者是在体外培养基中短期培养后的(Wilmut et al.,Nature 385:810-813(1997);Kato et al.,Science 282:2095-2098(1998);Wells et al.,Biol.Reprod.60:996-1005(1997);Schnieke et al.,Science 278:2130-2133(1997);Cibelli et al.,Science 280:1256-1258)),这种方法不允许进行靶向(定向)基因改造,使现在的技术具有局限性。
因此,需要一种体细胞核移植克隆技术,这种技术应具有以下优点:使用具有产生能发育成活体动物的胞质杂合体的能力的长期培养供体细胞;用容易获得的体供体细胞得到高的克隆效率;为在形成胞质杂合体之前应用基因改造技术,尤其是基因敲除技术提供机会。
术语定义
激活:术语“激活”的意思是指在核移植之前、过程中和之后用以刺激细胞分裂的任何物质或方法。
动物克隆:术语“动物克隆”是指一个活体动物具有与另一个动物的基因组实质上相似或等同的基因组,并且该动物不是通过精子与有核卵母细胞融合产生的。“实质上相似”是指它们的基因不同是由于通常在DNA复制过程中发生的复制错误产生的。
克隆:“克隆”是指一个生物质具有与另一个生物质(如细胞、器官、胎儿、动物等)的核DNA序列实质上相似或等同的核DNA序列。“实质上相似”是指它们的基因序列不同是由于通常在核DNA复制过程中发生的复制错误产生的。
克隆效率:“克隆效率”是指从胞质杂合体得到动物克隆的效率。
丘细胞:“丘细胞(或称卵丘细胞)”是指从卵母细胞周围的细胞和/或组织分离得到的任何经培养或未经培养的细胞。
胞质杂合体:“胞质杂合体”是指一整个核供体转移到受体细胞例如卵母细胞的细胞质中形成的一种结构。
胚胎:术语“胚胎”是指没有植入母体宿主子宫的正在发育的细胞群。术语“胚胎”包括受精卵母细胞、胞质杂合体、处于移植预备期的发育的细胞群等。
胎儿:术语“胎儿(胎)”是指已经植入母体宿主子宫的正在发育的细胞群。
纤维原细胞:“纤维原细胞”是指一种存在于脊椎动物体内结缔组织中的能分泌原胶原和黏多糖这些结缔组织的基本组成物质的细胞类型。
类纤维原细胞(fibroblast like cell):“类纤维原细胞”是指具有独特的扁平形态并能在培养物中单层生长的培养的细胞。
融合:“融合”是指细胞核供体与受体卵母细胞的相应的脂膜部分的合并。
基因改变的动物:“基因改变的动物”是指携带通过基因工程技术产生的基因突变的动物。
基因改变的细胞:“基因改变的细胞”是指携带通过基因工程技术产生的基因突变的细胞。
内细胞群:“内细胞群”是指引发胚胎的细胞。
长期培养:术语“长期培养”是指在合适的生长培养基中培养了10代或更多代的细胞。
重组核DNA:“重组核DNA”是指经过一种或多种重组DNA技术改造后的核脱氧核糖核酸。
NENS体细胞:术语“NENS体细胞”是指从非胚胎、胚泡、胎儿或与性相关的组织例如卵巢、输卵管、乳腺、生殖道等中分离的体细胞。
核移植:术语“核移植”是指将完全互补的核DNA从一个细胞植入一个去核细胞。
多能性:术语“多能性”是指正在发育的细胞群中能分化成一个亚群的细胞但是并不能分化成该细胞群中(例如一个胚胎、胎儿或动物)的全部细胞的一个细胞的能力。
静止细胞:“静止细胞”是指不分裂的细胞。
重新编译(reprogramming):“重新编译”是指能够将非全能细胞转变成全能细胞的物质或方法。
血清饥饿:“血清饥饿”是指将细胞放在血清浓度相当低的培养基中培养,以便使所培养的细胞处于静止期。
体细胞:“体细胞”是指除生殖细胞以外的细胞。
期限动物:术语“期限动物”是指在无须生命维持或医学干预的条件下脱离它发育的环境(例如子宫)能够存活一周或一周以上的动物。“全期限动物(full term Animal)”是指在为这中动物的新生儿制定的标准下生理上发育的期限动物。
全能性:术语“全能性”是指能分化成正在发育的细胞群(例如胚胎、胎儿或动物)中的全部细胞(与“多能性”的细胞相反)的一个细胞的能力。
转基因动物:术语“转基因动物”是指携带全部或部分经过人工基因改造的基因组的动物。
有蹄类动物:术语“有蹄类动物”是指四足的有蹄类动物。
活体动物:术语“活体动物(可存活体动物)”是指在无须人工生命维持或医学干预的条件下离开宿主动物能够存活365天以上的动物。
发明简述
本发明描述了从胚胎发育到胚泡阶段、胞质杂合体怀孕率和出生率三个方面得到提高的核移植克隆。这些效果是通过使用长期培养物中培养的供体细胞来实现的,培养时间大于5代,优选是大于7代,更好是大于10代,最好是大于15代。本发明还提供了在长期培养过程中保持核供体细胞的全能性和克隆能力的方法。这种方法使核供体细胞在培养10代或更多代后与新获得的核供体细胞克隆能力相当或更强。这种方法首次允许使用本领域所熟知的基因改造技术在体外培养过程中(核移植之前)对体核供体细胞进行定向基因改造。正如本领域普通技术人员可以理解的,应用经特定位点基因改造的细胞进行克隆是一种在农业、医药和基础生物研究领域中很有价值的工具。
在本发明的一个实施例中,提供了一种通过核移植克隆活体动物的改进方法,包括以下步骤:(a)将来自培养了5代或更多代的体细胞培养物的体细胞或从所述体细胞分离的细胞核插入去核卵母细胞形成胞质杂合体;(b)激活胞质杂合体;(c)培养激活的胞质杂合体;(d)将步骤(c)中得到的激活的胞质杂合体转移到合适的宿主中发育成胎儿;(e)使胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为活体动物。在该方法的这些步骤中产生的所述胞质杂合体、激活的胞质杂合体、胎儿和动物,以及能从中获得的细胞、核和其他细胞组成部分都作为本发明的实施例。
本发明的另一实施例提供了一种通过核移植克隆哺乳动物的改进方法,包括将取自哺乳动物的供体细胞或供体细胞核移植入与供体细胞同种类的去核卵母细胞中形成胞质杂合体,将所述胞质杂合体植入所述种类的宿主母体子宫中,这样该胞质杂合体移植到子宫中形成一个胎儿,并且使胎儿发育成克隆哺乳动物,其中改进之处包括将培养了5代以上的体细胞用作供体细胞或供体细胞核。
本发明进一步提供了一种克隆动物,尤其是哺乳动物,更具体是指有蹄类动物的方法,所述方法包括以下步骤:(a)得到NENS体细胞;(b)培养所述NENS体细胞5或更多代;(c)将步骤(b)得到的培养的NENS体细胞或从所述NENS体细胞分离得到的核移植入去核卵母细胞形成胞质杂合体;(d)激活胞质杂合体;(e)培养激活的胞质杂合体;(f)将步骤(e)中得到的激活的胞质杂合体转移到合适的宿主中发育成胎儿;(g)使胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为活体动物。在该方法的这些步骤中产生的所述胞质杂合体、激活的胞质杂合体、胎儿和动物,以及能从中获得的细胞、核和其他细胞组成部分都作为本发明的实施例。
本发明中优选的供体细胞是体细胞,尤其是NENS体细胞。更好的供体细胞是NENS类纤维原细胞,尤其是NENS纤维原细胞。使用纤维原细胞(例如皮肤细胞)克隆的优点是其容易获得并且没有入侵性,同时没有动物性别或年龄的限制。
在本发明之前,用体细胞克隆的各种类型的总体克隆效率比较低,范围为0-接近10%。用供体NENS体细胞和受体细胞通过核移植进行可重复性的活体动物的成功克隆还未见报道。本发明的克隆效率可高于10%,范围为15%或更高。与现有的体细胞核移植克隆相比较怀孕率和出生率都有明显提高。
因此,本发明提供了一种克隆效率高于10%的克隆动物(尤其是哺乳动物)的方法,所述方法包括以下步骤:(a)将来自培养了5代或更多代的体细胞培养物的体细胞或者从所述体细胞分离出的细胞核插入一去核卵母细胞形成胞质杂合体;(b)激活胞质杂合体;(c)培养激活的胞质杂合体;(d)将步骤(c)中得到的激活的胞质杂合体转移到合适的宿主中发育成胎儿;(e)使胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为活体动物。在该方法的这些步骤中产生的胞质杂合体、激活的胞质杂合体、胎儿和动物,以及能从中获得的细胞、细胞核和其他细胞组成部分都作为本发明的实施例。
本发明的一个优选实施例中,体细胞在合适的生长培养基中培养时间为5代或以上(细胞数目约10倍),优选为7代或以上(细胞数目约14倍),更好是10代或以上(细胞数目约20倍),最好是15代(细胞数目约30倍)。最好将细胞培养至汇合,用化学和/或机械方法使细胞分散,在每代分配到新的生长培养基中。
本发明的供体细胞在融合或微注射入受体细胞之前最好经诱导处于静止状态。根据Roslin研究所(Edinburgh)的PCT/GB96/02099和WO 97/07668中教授的方法,在转移时供体核最好处于细胞周期的G0或G1期。为了保持胞质杂合体的正确的染色体倍数,在核移植时供体细胞必须处在二倍体期。供体细胞最好处在细胞周期的G0期。
本发明应用核移植技术提供了一种克隆雄性动物(尤其是雄性哺乳动物)的方法。可以相信是本发明的发明人首次利用来自雄性供体的核成功克隆出活的雄性动物,特别是活的雄性哺乳动物(参见,Capecchi et al.,PNAS 97:956-957,at page 957(2000年2月1日))。虽然美国专利第6,011,197表明用胚胎生殖细胞作为供体细胞产生了一只雄性黑白花牛(荷尔斯坦因种),但是不能肯定所述动物为这里所定义的活体(可存活的)动物。而且所述动物是用来自胚胎的生殖细胞产生的并且采用双重核移植方法,使得这种方法的商业应用性大大降低。
本发明的发明人注意到美国专利第6,011,197号声称“事实上任何类型的原细胞(precursor)”都能用来形成它的“不灭、全能性”的供体细胞(美国专利的第6,011,197号第30栏,24-25行(例如用白血病抑制因子(LIF)和纤维原细胞生长因子(FGF)培养的经重编码的细胞),这些细胞可用来进行核移植产生克隆胚胎(美国专利第6,011,197号第37栏,19-20行),产生的胚胎能够移植入子宫或人造子宫环境(美国专利第6,011,197号第41栏,59-60行),并且所述胚胎能发育成期限动物(美国专利第6,011,197号第42栏,17行),但仅报道了用胚胎生殖细胞得到胚胎。Stice等的美国专利第5,945,577号还声称能够通过在胚胎和成熟的纤维原细胞中插入外源异种DNA而将改变的DNA移植入去核卵母细胞来获得基因改变的动物。在Stice等的专利中没有报道活体动物。申请人进一步注意到专利中报道的转基因胎儿是用取自发育中期的胚胎的胚胎细胞产生的(也就是说包括双核移植)。申请人还注意到Stice等人获得的胎儿中对胎儿DNA基因改变是非靶向的基因改变,而是非特异性、随机的改变。申请人断言除非认识到来自长期体细胞培养物的体细胞在核转移中的实用性,并且认识到这些长期培养细胞的优良特性,靶向基因改变是不可能实现的。
本发明进一步提供了一种用取自雄性动物的体细胞,优选纤维原细胞或类纤维原细胞的细胞核克隆雄性动物,尤其是雄性哺乳动物的方法。该方法包括以下步骤:(a)将来自培养了5代或更多代的体细胞培养物的体细胞或者从所述体细胞分离出的细胞核插入去核卵母细胞形成胞质杂合体;(b)激活胞质杂合体;(c)培养激活的胞质杂合体;(d)将步骤(c)中得到的激活的胞质杂合体转移到合适的宿主中,这样该激活的胞质杂合体发育成胎儿;(e)使胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为活体动物。在该方法的这些步骤中产生的胞质杂合体、激活的胞质杂合体、胎儿和动物,以及能从中获得的细胞、细胞核和其他细胞组成部分都作为本发明的实施例。
由于供体细胞核的受体最好是处于中期I到中期II的卵母细胞,本发明也可用本领域技术人员所熟知的其他受体,包括受精卵和二细胞胚胎。卵母细胞的激活可采用精子授精或本领域中熟知的单性生殖激活方式。受体最好去核。优选的卵母细胞是去核的中期II卵母细胞,非激活的或预激活的。当受体是去核的中期II卵母细胞时,激活可以在移植时进行。
在移植入宿主体内之前,胞质杂合体最好用本领域技术人员所熟知的技术进行激活,如电刺激。本领域中熟知的非电激活方式包括乙醇、蛋白激酶抑制剂(例如,6-二甲基嘌呤(6-dimethylpurine(DMAP))、离子载体(例如离子霉素)、温度变化、蛋白合成抑制剂(例如环己酰亚胺)、毒胡萝卜素、佛波醇酯(例如,佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(“PMA”))、和机械方法(参见,例如,Susko-Parrish et al.,U.S.Patent No.5,496,720,1996年3月5号公布)。
正如本领域人员可以理解的那样,激活技术应该针对所用的特定细胞系要进行相应的优化。例如,参见Ozil et al.,Development109:117-127(1990),其中报道了只有一系列选择性的脉冲和Ca2+控制才能促进兔二倍体卵母细胞发育到中妊娠期。据报道对兔的电脉冲激活的脉冲间隔大约是4分钟(Ozil et al.,Development 109:117-127(1990)),然而就鼠而言大约为10-20分钟(Cutberson et al.,Nature 316:541-542(1985)),就牛而言大约为20-30分钟(Robl et al.,in Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation(Seidel ed.),Colorado State University,24-27(1992))。
本发明的发明人发现对于一种日本黑公牛先在融合期用电细胞c操纵器200(BTX,San Diego)输出2.5kV/cm的直流电刺激两次,每次10微秒,然后在含环己酰亚胺(10μg/ml,Sigma化学公司生产)的CR1aa培养基中培养5小时来激活胞质杂合体,发现所述细胞不仅发育成胚泡,而且能发育成可长成期限动物的胎儿。
本发明的发明人已经发现要提高胞质杂合体细胞发育成胚泡的活性(但不是需要发育到期限动物的活性),可以先对胞质杂合体或去核卵母细胞(所述胞质)施加蛋白激酶抑制剂,例如6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine(DMAP)),然后用电脉冲刺激。然而,用这种方法产生的胚泡可能在供体核的DNA重新编译(对胚泡发育成胎儿时必须的)时存在缺陷。然而本发明提供了一种促进通过供体细胞和去核卵母细胞进行核移植得到的胞质杂合体发育成胚泡的方法,所述方法包括在与供体细胞核融合之前用蛋白激酶抑制剂激活去核卵母细胞并且在融合中或融合后电刺激胞质杂合体。
培养的供体细胞可用本领域技术人员所熟知的方法进行基因改变。参见,Molecular Cloning a Laboratory Manual(分子生物学实验室手册),2nd Ed.,1989,Sambrook,Fritsch and Maniatis,ColdSpring Harbor Laboratory Press;U.S.Patent No.5,612,205,Kay et al.,issued March 18,1997;U.S.Patent No.5,633,067,to DeBoer et al.,issued May 27,1997。任何已知的插入、删除或修饰哺乳动物细胞目标基因的方法都可以来改变核供体。其中包括允许插入、删除或修饰基因或特定位点基因或细胞基因组中的位点的同源重组技术。对靶向DNA基因组通过删除、插入和/或突变操作进行修饰的实例有反转录病毒插入、人造染色体技术、基因插入、用组织特异性启动子进行随机插入、基因打靶、可换位元素和/或其他引入外源DNA或产生修饰的DNA/修饰的核DNA的方法。其他修饰技术包括从基因组中删除DNA序列和/或改变核DNA序列。例如,改变核DNA序列可以用位点导向诱变来实现。
按这个思路,本发明进一步提供了通过基因工程靶向基因改变产生动物克隆的方法,所述方法包括以下步骤:(a)培养体细胞5代或更多代得到长期培养物;(b)以靶向方式改变步骤(a)中得到的长期培养物中体细胞的核DNA;(c)将步骤(b)中得到的体细胞的改变过的核DNA插入一去核卵母细胞形成胞质杂合体;(d)激活胞质杂合体;(e)培养激活的胞质杂合体形成胚胎;(f)将所述胚胎转移到合适的宿主中,这样胚胎发育成胎儿;(e)使胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为活体动物。在该方法的所有这些步骤中产生的胞质杂合体、激活的胞质杂合体、胚胎、胎儿和动物,以及能从中获得的细胞、核和其他细胞组成部分都是本发明的实施例。
本发明的另一实施例提供了一种通过核移植克隆哺乳动物的经过证实的改进方法,包括将取自哺乳动物的供体细胞或供体细胞核移植入与供体细胞同种类的去核卵母细胞中形成胞质杂合体,将所述胞质杂合体植入所述种类的宿主母体子宫中以便完成胞质杂合体的移植得到胎儿,并且使胎儿发育成克隆动物,其中改进之处包括使用供体细胞、供体细胞核、培养了5代以上的体细胞,并且其中该供体细胞或供体细胞核已经经过基因改造,包括至少一个附加的、替换或删除的一个核酸或核酸序列。
理论上本发明对所有动物均适用,包括鸟类、两栖动物和鱼类。然而,目前可以预见的最大的商业用途在于非人类的哺乳动物方面。它的适用范围不仅包括属于有角(Bos)类的反刍动物家族(称为“牛族动物”,包括牛、公牛、绵羊和山羊),还包括其他有蹄类动物如骆驼、猪和水牛。
附图简要说明
本申请的文件至少包含一幅彩色图片。带有彩色图片的专利申请文件副本在提出请求并交纳必要的费用后由专利和商标局提供。
附图作为说明书的一部分并与说明书结合在一起,说明本发明的优选实施例,并且与前面的一般性说明和后面对实施例的详细说明一起对本发明的原理进行解释。所述附图不应解释成对本发明的限制。
图1是用取自17岁大公牛的供体细胞克隆的四只小牛的照片。
图2是用23微卫星做标记对来自供牛供体、不同培养代的供体体细胞和六个克隆的DNA进行DNA微卫星分析的图片。
图3A是用免疫细胞化学Vimentin-FITC标记的牛纤维原细胞的图片。
图3B是用免疫细胞化学细胞角蛋白-异硫氰酸荧光素标记的牛纤维原细胞图片。
图4A是处于第5代的非血清饥饿的牛纤维原细胞培养物中各个细胞周期的细胞数目百分比的柱状图;
图4B是处于第5代的血清饥饿的牛纤维原细胞培养物中各个细胞周期的细胞数目百分比的柱状图。
发明详述
本发明涉及用核移植技术获得特定位点基因修饰动物。它还涉及从雄性或雌性体供体获得的体细胞,特别是NENS体细胞成功的和可重复的克隆活体动物。
本发明的发明人发现经过5代或更多代,尤其是在长期培养,最好是在培养15代或更多代之后,细胞仍具有基因全能性。所述发现是在面对盛行的对长期培养的供体细胞(尤其是体细胞)是否具有产生健康动物克隆的能力持怀疑态度的情况下作出的。与这些盛行的想法相反,本发明的发明人发现在供体细胞(尤其是体细胞(最好是NENS纤维原细胞或NENS类纤维原细胞))培养5代或更多代后克隆效率提高,当所述细胞经长期培养后克隆效率有意料之外的提高。现在还不清楚为什么连续培养可以提高供体细胞的全能性。
本发明的方法尤其适用于以皮肤细胞作为细胞供体来产生克隆。使用皮肤细胞克隆的主要优点是其容易获得并且没有入侵性,同时没有动物性别或年龄的限制。在此之前,成年动物的成功克隆很大地局限于使用雌性动物生殖系统细胞:例如,哺乳动物上皮细胞(Wilmut et al.,Nature(London)385:810-813)(1997))、丘细胞(Kato et al.,Science 282:2095-2098(1998);Wells et al.,Biol.Reprod.60:996-1005(1999))、或输卵管上皮细胞(Kato et al.,Science282:2095-2098(1998))。尽管用2星期大的小牛的皮肤细胞的克隆成功了,但该项研究中产生的小牛个体只存活了7个星期并且死于淋巴组织发育不全(Renard et al.,Lancet 353:1489-1491(1999))。就老鼠而言,10-12周大的老鼠的尾尖细胞已经用于克隆,但274例胚胎中只有一个存活的克隆(Wakayama et al.,Nat.Genet.22:127-128(1999))。因此,本发明对于组织保藏和濒危物种的保护有很重要的意义。
鼠胚胎干细胞的基因改造引发了鼠基因研究的革命。然而,对于其他物种胚胎干细胞并不容易获得。由于以前成功的克隆都局限于新鲜的细胞(Wakayama et al.,Nature(London)394:369-374(1998))或是在体外培养基中短期培养(小于10代)的细胞(Wilmutet al.,Nature(London)385:810-813(1997);Kato et al.,Science 282:2095-2098(1998);Wells et al.,Biol.Reprod.60:996-1005(1999);Schnieke et al.,Science 278:2130-2133(1997);Cibelli et al.,Science280:1256-1258(1998)),这样在除老鼠以外的物种中的靶向基因改造都不能够进行。
本发明的发明人对长期培养细胞的基因全能性的证明对特定位点的基因改造和克隆很重要。本发明的发明人指出成熟动物的纤维原细胞仍具有克隆的能力并且长期培养并不影响成年体供体细胞的克隆能力。
供体细胞的长期培养使本发明的发明人能够有选择性的利用现有的基因改变或基因敲除方法对供体细胞基因组进行靶向基因改变或选择性的关闭基因。通过基因靶向技术我们不但可以使基因失活,而且可以用任何有目的的方式改变基因活性。取自所述基因改变的供体细胞的细胞核可用于这里描述的核移植技术来最终产生携带靶向基因改变基因组的活体动物。用这种基因靶向和克隆技术产生的动物可用来研究被关闭的特定基因的功能、保持基因序列的重要性和作为疾病研究的模型以及其他为本领域人员所熟知的已经很明显的目的。例如,可以改变与特定免疫识别蛋白有关的基因使来自宿主动物的组织能被其他动物免疫接受(例如,猪的组织用于人类),或用改变基因生产更具有经济价值的动物(例如,使牛生产更多的牛奶)。
本发明的一方面提供了一种产生基因改变和非基因改变动物的方法,该方法包括以下步骤:(a)分离二倍体供体细胞;(b)在能使二倍体供体细胞增殖的培养基上培养二倍体供体细胞至细胞数量超过10倍,更好的是超过20倍,最好是超过30倍;(c)有选择的改变(优选采用基因靶向方式)步骤(b)中的二倍体供体细胞中的一个或多个细胞的基因组;(d)从步骤(c)的细胞中有选择的筛选和选择所需要的稳定的突变体;(e)用步骤(b)中得到的细胞(或选择步骤(c)或(d)中的细胞)的核通过核移植产生胚胎;(f)将所述胚胎在体内或体外培养成胚泡;(g)从步骤(f)的胚泡中有选择的筛选和选择所需的稳定的突变体;(h)将胚泡转移到能使所述胚泡发育成期限动物的培养基中。
优选的供体细胞是纤维原细胞或类纤维原细胞。纤维原细胞可以从耳朵皮肤切片中收集。在实验准备阶段一种比较有利的方法是将组织切片切成小片(3mm2)并且把所述小片作为组织外植体放入DMEM(Gibco,15)加10%胎牛血清(FBS)和抗生素(Gibco,目录号15240-013))中培养,培养条件为37.5℃、含有5%CO2和95%空气的潮湿的空气中。培养一星期后,在组织外植体周围形成纤维原细胞的单层。该外植体转入新的培养基并且将每星期收集所得的纤维原细胞冷冻。为了长期保存,培养的细胞可以在收集后用胰岛素处理,在10%的二甲基亚砜(Sigma)冷冻并保存在液氮中。在用于核移植时,细胞被解冻并培养一代至汇合。对每一代而言(估计每代细胞增殖2倍),细胞培养至发生汇合,在37℃用0.1%(w/v)胰岛素(Difco)和EDTA(Nacalai)溶液培育1分钟用来分散细胞,然后分配到三个新的培养皿中继续传代。一般每次传代持续6天。
供体细胞的纤维原细胞表形的确定可用单克隆抗体进行免疫细胞化学着色的方法,主要是针对细胞骨架波形纤维蛋白丝(对纤维原细胞)或细胞角蛋白(对上皮细胞)。更佳的确定方法是,细胞在Lab-Tek小室玻片(Nalge Nunc International)中培养至汇合。细胞用PBS洗涤并在4℃甲醇中固定20分钟。细胞固定后用PBS洗涤,然后用含有3%BSA的PBS在37℃阻断15分钟。去除阻断物并加入100微升的1∶40稀释的抗波形纤维蛋白的clone V9(Sigma,目录号6630)或1∶400稀释的抗盘状细胞角蛋白的clone-11(Sigma,目录号2931)。玻片在37℃下培养1小时。细胞用PBS洗涤并用100微升1∶300稀释的FITC-标记的抗鼠IgG处理1小时。细胞用PBS洗涤后用含50%甘油的PBS覆盖,加盖盖玻片并在荧光显微镜下观察。自身荧光和二级抗体的正确控制是必要的。
细胞所处周期的分析可采用Kubota et al.,PNAS 97:990-995(2000)中描述的方法。简而言之,处于不同代的细胞培养物可生长至汇合状态或不处于此状态,也可采用血清饥饿或不采用。在胰蛋白酶化后,细胞用DMEM+10%FBS洗涤并在4℃下用含有葡萄糖(6.1mM)的1ml PBS以5×105细胞数/毫升的浓度将细胞重新悬浮。细胞在3ml冰冷的乙醇中固定过夜。为了进行核染色,将细胞粒化,接着用PBS洗涤并在含有30微克/毫升的碘化丙锭(Sigma)和0.3mg/ml核糖核酸酶(Rnase)A(Sigma)的PBS中重新悬浮。在用30微米孔径的网筛过滤之前先将细胞在黑暗中室温下培养1小时。细胞用荧光激活细胞分类器(Bacton Dickenson FACsCaliber)收集并用Cell Quest 3.1软件分析。
为了检查处于不同代的培养的体供体细胞的倍数性,可以用中期分散物的标准制备来对不同代的培养物进行染色体记数(参见,例如,Kubota et al.,PNAS 97:990-995(2000))。在一个实施例中,平板接种后24小时,细胞用低渗的KCl溶液(0.075M)在37℃下处理15分钟。所述细胞用乙酸的甲醇溶液(acetic methanol)(体积比1∶3)固定,并将几滴细胞悬浮物分散到干净的显微玻片上。染色体用5%Giemsa染色10分钟。用光学显微镜的100倍油镜观察记数有清晰细胞边界并且染色体分散良好的染色体数目。至少记数100个中期的分散物/组。
供体细胞核的优选受体细胞为去核卵母细胞。优选的去核技术参见Kubota et al.,《分子生殖学进展》Mol.Repro.Dev.51:281-286(1998)和Kubota et al.,PNAS 97:990-995(2000)中的说明。简而言之,可以用玻璃针切除透明带(zona pellucida)并将极体和周围的胞质拉出来达到去核的目的。可以对胞质进行Hoechst 3342荧光染色来确认是否成功去核。也可用本领域技术人员所熟知的其他技术完成去核。例如,通过吸取极体和相临细胞质来去除成熟卵母细胞中的中期染色体以达到去核的目的。在去核过程中用5微克/毫升的Hoechst 33342(加入5微克/毫升细胞松弛素B)处理卵母细胞5-10分钟,然后在荧光显微镜下进行去核操作。
一种优选的方法是通过核融合(而不采用,例如,微注射)来实现核移植,并且激活胞质杂合体。在这种方法中,将直径大约10-15微米的细胞单个挑出并转入去核卵母细胞的卵周隙。通常用电脉冲(例如先用交流系列脉冲,接着用直流电脉冲)完成膜融合,这些技术已经为本领域技术人员所熟知。
虽然只用电脉冲也能激活胞质杂合体,但是优选对细胞进一步激活。优选的去核技术参见Kubota et al.,Mol.Repro.Dev.51:281-286(1998)和Kubota et al.,PNAS 97:990-995(2000)中的说明。简而言之,先用直流脉冲激活胞质杂合体,接着用环己酰亚胺(一种有效的蛋白合成抑制剂)处理5小时。也可用本领域技术人员所熟知的其他激活技术。一种优选的激活技术如下,去核后的卵母细胞放在Zimmerman细胞融合培养基中并且用BTX 200设备先通5-10秒0.1kV/cm的交流电,然后再通30微秒的1.2kV/cm的直流脉冲。融合可以通过显微镜确定并且将融合后的卵在加入10微克/毫升的细胞松弛素D的KSOM培养基中培养1小时进行激活,接着在只含有10微克/毫升的环己酰亚胺的相同培养基中进一步培养4小时。
经激活的胞质杂合体或胚胎在植入宿主(例如子宫)之前最好先在合适的培养基中培养。激活的胞质杂合体最好培养至大于2细胞的发育阶段。在一优选实施例中,在38.5℃、5%CO2、5%O2和90%N2的潮湿的环境下将胚胎放在CR1aa培养基中培养48小时。分裂的胚胎在加入5%FBS的CR1aa培养基中与丘细胞一起培养5天。将胚泡可以不通过手术或通过手术转移入同步受体的子宫中。使用本领域技术人员所熟知的技术和介质的其他培养基也可以使用。其中的一个过程如下,克隆胚胎用新鲜的KSOM洗三次并且在含有0.1%BSA的KSOM中培养4天,接着在含1%BSA的培养基中再培养3天,培养条件为39℃、5%CO2、5%O2和90%N2。胚胎发育的检查和分级用本领域所熟知的标准方法进行。在第二天记录分裂率并将分裂的胚胎再培养7天。在第7天,记录胚泡的发育并将一或两个胚胎(胚胎和/或动物的实用性未定)不通过手术转移入每一个同步宿主母体的子宫中。
最好对宿主母体周期性的进行直肠触诊或超声波扫描的方法来检查怀孕情况,例如妊娠40、60、90和120天时。最好在整个孕期仔细观察并用超声波监控(每月)以便评价在怀孕的不同阶段胚胎损失情况。流产的胎儿如果可能都应该保存起来进行DNA类型检测,以此来确定克隆状态和进行常规病理研究。
在本发明之前的报道中(Shiels et al.,Nature London 399:316-317(1999))指出克隆羊会继承成年核供体动物的缩短的端粒(shortened telomeres)(所述端粒在供体细胞的短期细胞培养中进一步缩短)。这些发现预示着要从成年的供体动物得到健康的克隆是不可能的。本发明的发明人用他们从17岁大的牛身上取得的细胞成功克隆出的四只活的小牛否认了这一观点(Kubota et al.,PNAS97:990-995(2000年2月1日))。
在本发明报告(Kubota et al.,PNAS 97:990-995(2000))之前,许多本领域的人员相信只有雌性体细胞核能够成功的重新编译并促进正常的胚胎发生(参见,Capecchi,PNAS 97:956-957(2000年2月1日))。对雄体细胞也能有效的重新编译并促进正常的胚胎发生并产生活体动物的发现是本领域意料之外的。因此,本发明的一个方面就是用雄体细胞作为核供体在核移植中应用。
到今天为止,用体细胞克隆的总体效率较低,据报道其效率范围是0-接近10%。本发明的总克隆效率超过15%,明显高于之前用体细胞克隆的效率。
用核移植技术克隆期限动物的改进方法包括如下步骤:(a)将来自培养了5代或更多代的体细胞培养物的体细胞或所从述体细胞分离出的核插入去核卵母细胞形成胞质杂合体;(b)有选择地激活胞质杂合体;(c)培养所述胞质杂合体;(d)将步骤(c)中的胞质杂合体转移到合适的宿主中发育成胎儿;(e)使胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为期限动物。在本方法的所有这些步骤中产生的胞质杂合体、激活的胞质杂合体、胎儿和动物、以及可以从中获得的细胞、核和其他细胞组成部分都是本发明的时实施例。该期限动物优选是活体动物。
为了使本发明的说明更清楚,下面列出一些实施例及相关的原料和方法。下面的实施例并非限制而仅仅作为本发明的多个方面和特征的代表。
实施例1:用长期培养的成熟雄纤维原细胞克隆牛
材料和方法
成熟体细胞的收集和培养:
从一只基因优良的17岁大的日本黑公牛的耳朵上获取皮肤活组织切片。将该组织切片切成小片(3mm2)并且把小片作为外植体放入DMEM(GIBCO,目录号12100-061)(其中加入10%FBS和抗体(GIBCO,目录号15240-013))中培养,培养条件为37.5℃、含有5%CO2和95%空气的潮湿的环境。培养一星期后,在组织外植体周围形成纤维原细胞的单层。移去所述外植体并将纤维原细胞培养至发生汇合。将细胞株保存在培养皿上直至第17代,然后用下面的方法冷冻储存。对每一代而言(估计每代细胞增殖2倍),细胞培养至发生汇合,在37℃用0.1%(wt/vol)胰岛素(Difco)和EDTA(Nacalai Tesque,Kyoto)溶液处理1min用来分散细胞,然后分配到三个新的培养皿中继续传代。一般每代培养6天。为了长期储存,不同代的细胞用胰岛素处理后收集,然后在10%二甲亚砜(Sigma)中冷冻,在液氮中储存。
细胞特殊标记:
供体细胞的纤维原细胞类型(表型)的确定可用单克隆抗体进行免疫细胞化学着色的方法,针对细胞骨架波形纤维蛋白丝(对纤维原细胞)或细胞角蛋白(对上皮细胞)。简而言之,细胞在Lab-Tek小室玻片(Nalge Nunc)中培养至汇合。细胞用PBS洗涤并在4℃甲醇中固定20分钟。细胞固定后用PBS(139mM NaCl/2.7mMKCl/4.3mM Na2HPO4.7H2O/1.48nM KH2PO4)洗涤,然后用含有3%BSA的PBS在37℃阻断(凝集)15分钟。去除阻断物并加入100微升的1∶40稀释的抗波形纤维蛋白的clone V9(Sigma,目录号6630)或1∶400稀释的抗盘状细胞角蛋白(antipan cytokeratin)的clone-11(Sigma,目录号2931)。玻片在37℃下培养1小时。细胞用PBS洗涤并用100微升1∶300稀释的FITC-标记的抗鼠IgG处理1小时。细胞用PBS洗涤后用含50%甘油的PBS覆盖,加盖盖玻片,并在荧光显微镜下观察。自身荧光和二级抗体的正确控制是必要的。
细胞周期分析:
细胞所处周期的分析可采用Boquest et at,Biol.Reprod.60:1013-1019(1999)中描述的方法。简而言之,处于不同代的细胞培养物可生长至汇合状态或不处于此状态,可采用血清饥饿或不采用血清饥饿并且经胰蛋白酶化。经胰蛋白酶化后,细胞用DMEM+10%FBS洗涤并在4℃下用含有葡萄糖(6.1mM)和0.5mMEDTA的1ml PBS以5×105个细胞/毫升的浓度将细胞重新悬浮。细胞在3ml冰冷的乙醇中固定过夜。为了进行核染色,将细胞粒化,接着用PBS洗涤并在含有30微克/毫升的碘化丙锭(propidiumiodide)(Sigma)和0.3mg/ml核糖核酸酶A(Sigma)的PBS中重新悬浮。在用30微米孔径的网筛(Spectrum Laboratories)过滤细胞之前先将细胞在黑暗中室温下培养1小时。细胞用荧光激活细胞分类器(Bacton Dickenson FACs Caliber)收集1万个细胞并用CellQuest 3.1软件分析(Becton Dickenson)。
细胞繁殖检验:
为了检验血清饥饿的供体细胞是否处于静止期,细胞的增殖能力用萤光免疫检验法检测细胞的DNA中的5-溴-2′-去氧尿苷(BrdUrd)(Gratzner,Science 218:474-475(1982);Ellwart et al.,Cytometry 6:513-520(1985))来确定。取第5、10和15代的汇合细胞进行血清饥饿(0.5%FBS),用BrdUrd结合来检测在第1、2、3、4、5和6天的细胞增殖。非汇合的细胞用作对照。简而言之,BrdUrd标记的培养基(Boehringer Mannheim,目录号1296-736)在37℃加入培养物中培养24小时。通过胰蛋白酶化获取细胞并用Carnoy固定液固定细胞。固定后的细胞选悬浮液放在干净的显微镜玻片上并覆盖抗BrdUrd的溶液,然后在37℃培养30分钟。用抗鼠Ig荧光素溶液洗三次后在37℃培养。将所述玻片装上荧光显微镜并观察。没有经血清饥饿的第5代汇合细胞和对照组相似。另外,第5、10和15代的非汇合的细胞培养一天后也进行处理,计数结合BrdUrd的细胞。
染色体分析:
为了检查处于不同代的培养的体供体细胞的倍数性,可以用中期分散物的标准制备来对第5、10和15代的培养物进行染色体记数(Verma et al.,Human Chromosomes(Pergamon,York),pp.26-27(1989))。简而言之,就是细胞在平板培养24小时后用低渗的KCl溶液(0.075M)在37℃下处理15分钟。所述细胞用乙酸的甲醇溶液(acetic methanol)(体积比1∶3)固定并将细胞悬浮物分散到干净的显微玻片上。染色体用5%Giemsa染色10分钟。用光学显微镜的1000倍油镜观察记数在清晰细胞边界中染色体分散良好的染色体数目。至少记数100个中期的分散物/组。
供体细胞和受体卵母细胞的制备和和核移植:
供体细胞(第5、10和15代)在达到汇合后在血清饥饿(0.5%FBS)条件下培养5天或汇合后(仅对第5代细胞而言)用10%的血清多培养5天(Wilmut et al.,Nature(London)385:810-813(1997);Campbell et al.,Nature 380:64-66(1996))。在核移植之前,供体细胞胰蛋白酶化,离心洗涤,用含0.5%FBS的PBS重新悬浮。收集受体卵母细胞,使之成熟并在培养成熟后大约24小时用Kubota et al.,Mol.Repro.Dev.51:281-286(1998)介绍的方法去核。用Hoechst 33342荧光染色来确定是否成功去核。将直径大约10-15微米(Wells et al.,《生物生殖》(Biol.Reprod.)57:385-393(1997))的细胞用Kubota et al.,《分子生殖学进展》Mol.Repro.Dev.51:281-286(1998)描述的方法移入去核卵母细胞的卵周隙。在转移后,细胞胞质联合体用电细胞仪200(BTX,San Diego)输出2.5kV/cm的直流电刺激两次,每次10微秒,以此来诱导融合。这些电脉冲也同时诱导最初卵母细胞的激活。用显微镜检测确认融合。所有融合的胚胎在含有环己酰亚胺(10微克/毫升;Sigma)的CR1aa培养基(Rosenkrans et al.,Theriogenology 35:266(1991))中培养5小时进行进一步激活。
克隆胚胎的体外培养和胚胎转移:
在38.5℃下,5%CO2、5%O2和90%N2的潮湿的环境下将核移植后的胚胎放在CR1aa培养基中培养48小时。记录分裂率并将分裂的胚胎在含有5%FBS的CR1aa培养基中与丘细胞共同培养5天。在第7天,记录胚泡的发育并将一或两个高质量的胚泡非手术转移入每一个同步受体的子宫中。在妊娠40、60、90和120天时对受体进行直肠触诊或超声波检查法来检查怀孕情况。
基因型微卫星标记:
为了确定新生体的克隆状态,用Inoue et al.,《动物科学技术》(Animal Sci.Technol.)68:443-449(1997)中的23-微卫星标记进行个体确证和亲本分析。从供体牛、第5、10和15代细胞、六只克隆动物和六个宿主母体中得到的总基因组DNA是用QIA-amp血试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)从外周血白细胞制备的。用来进行微卫星标记的PCR(聚合链式反应)引物用荧光染料[6-FAM、HEXand TET(Applied Biosystems/Perkin-Elmer)]标记,并且用Inoue etal.,《动物科学技术》(Animal Sci.Technol.)68:443-449(1997)中描述的方法进行DNA定型。用ABI373A DNA序列分析仪(AppliedBiosystems/Perkin-Elmer)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定基因型,然后用GENSCAN 672和GENOTYPER软件进行分析(AppliedBiosystems/Perkin-Elmer)。
统计分析:
胚胎发育实验最少重复3次。处理组之间的差异用x2(test)法进行分析。
结果:
供体细胞的特征:
用(i)细胞类型标记染色、(ii)细胞周期分析、(iii)细胞繁殖检验和(iv)染色体分析四种方法对用于克隆的细胞进行系统地特征标示。
为了检查体供体细胞的特征细胞类型,对第2、5、10、15代培养细胞用特定细胞标记物(细胞角蛋白18和波形蛋白)染色(图3A和3B)。图3A显示牛纤维原细胞用免疫细胞化学波形蛋白-FITC标记后的特征,而图3B则是这些细胞用细胞角蛋白-FITC标记后的特征。我们在图3中看到,所有处于第10和15代的皮肤细胞是波形蛋白阳性但细胞角蛋白阴性,说明它们是纤维原细胞。第2和5代的细胞绝大多数是波形蛋白阳性但细胞角蛋白阴性的,但是有一小部分细胞表现出细胞角蛋白染色阳性,说明在传代培养早期有皮肤上皮细胞的污染。所述现象可能是用第5代细胞获得的克隆胚胎相对发育不良的原因。
图4A和图4B显示经血清饥饿和未经血清饥饿培养的第5代细胞(两者相对照)的代表性细胞周期FACs柱状图。图4A是处于第5代的非血清饥饿的牛纤维原细胞培养物中各个细胞周期的细胞数目百分比,而图4B是处于第5代的血清饥饿的牛纤维原细胞培养物中各个细胞周期的细胞数目百分比。
在非血清饥饿培养物中,64.9±1.0%的细胞处于G0+G1期;在血清饥饿培养中,处于G0+G1期的细胞显著提高到84.5±8.1%(非血清饥饿培养物:S=7.3±1.6%和G2+M=19.7±0.3%;血清饥饿培养:S=1.1±0.8%和G2+M=7.6±2.0%。在不考虑细胞每代数量或血清饥饿处理的情况下,第10和15代大约有82%-90%的培养至汇合的体供体细胞处于G0+G1期。
为了确定培养细胞对血清饥饿的反应,通过BrdUrd结合检查细胞增殖率。在第5、10和15代的汇合细胞进行血清饥饿并每天进行BrdUrd结合检查直至血清饥饿的第6天。表1如下:
表1
采用血清饥饿或不采用血清饥饿的不同代汇合细胞的细胞增
殖率(BrdUrd结合)
计数的总细胞数(结合有BrdUrd的细胞百分数)
细胞代 | 血清饥饿 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 | 第6天 |
5 | 否 | 656(17) | 673(11) | 453(4) | 457(8) | 124(7) | 437(5) |
5 | 是 | 455(3) | 271(4) | 369(4) | 389(4) | 200(2) | 321(4) |
10 | 是 | 436(2) | 298(3) | 379(0) | 262(0) | 278(0) | 333(0) |
15 | 是 | 301(2) | 278(1) | 269(0) | 161(0) | 143(0) | 263(0) |
用以防止BrdUrd结合的血清饥饿方法对第10和15代的细胞比第5代细胞要有效得多,对于汇合和非汇合的培养物都一样。
尽管对第10和15代细胞进行血清饥饿3-6天后发现对BrdUrd结合的完全抑制,有一小部分(约4%)的第五代细胞在进行血清饥饿6天以上都对血清饥饿没有任何响应(表1),这再一次表明可能在传代早期有其他类型细胞的污染。
对不同代供体细胞的染色体分析表明染色体互补正常。正如表2中显示的那样,在不考虑检验的细胞代数的情况下大多数细胞(70%-80%)显示染色体互补正常(60个染色体包含X和Y染色体)。
表2
对不同代供体细胞的染色体分析
细胞代数 | 含有染色体的细胞数(%): | 分散物记数 | ||
<60 | 60 | >60 | ||
5 | 8(8) | 77(75)* | 17(17) | 102 |
10 | 7(6) | 98(82)* | 14(12) | 114 |
15 | 19(16) | 84(72)* | 13(11) | 116 |
*没有明显的差别(P>0.05).
供体细胞代数对于克隆能力的影响:
为了检验长期培养后成熟体细胞的克隆能力,17岁大公牛的皮肤纤维原细胞培养5、10和15代,然后的进行核移植试验。表3列出了皮肤纤维原细胞的融合率、分裂率核胚泡形成率。
表3
由不同代的成熟纤维原细胞得到的胚胎体外发育的各种比率
代数 | 血清饥饿 | 转移入卵母细胞的个数 | 融合数(%) | 分裂数(%) | 胚泡数(%) |
5 | 否 | 282 | 102(36) | 79(78) | 28(28)a |
5 | 是 | 288 | 114(40) | 75(66) | 24(21)a |
10 | 是 | 269 | 115(43) | 72(63) | 43(37)b |
15 | 是 | 264 | 109(41) | 81(74) | 36(33)b |
如表中所示,不考虑供体细胞的处理或传代数,融合率较低(36%-43%,P>0.05)。在第5代检验了血清饥饿对核移植的影响。从血清饥饿的或非血清饥饿的供体细胞得到的胚胎之间的分裂率(66:78%)和胚泡发育(21:28%)没有明显的区别(表3;P>0.05)。
如表4所示,没有经血清饥饿的供体细胞(n=10个受体)怀孕率为0,而经血清饥饿的供体细胞(n=10个受体;表4)有30%的怀孕率。
表4
经血清饥饿的不同代的成熟纤维原细胞的胚胎转移和克隆
胚胎的怀孕率
细胞代 | 胚胎数 | 受体数 | 怀孕率(%) | 流产率(%) | 发现流产的天数 |
5 | 15 | 10 | 3(30) | 3(100) | 61,88,123 |
10 | 22 | 14 | 9(64) | 5(56) | 39,67,69,76,119 |
15 | 17 | 12 | 3(25) | 1(33) | 113 |
总共 | 54 | 36 | 15(42) | 9(60) |
因此对于第10和15代的所有供体细胞进行血清饥饿处理。进行回顾比较,从第10和15代得到的供体细胞比第5代的供体细胞的胚泡发育率有显著提高(37%和33%:21%,P<0.05)。在胚胎移植后,第10代细胞有9个怀孕(n=14个受体),第15代细胞有3个怀孕(n=12个受体),在期限动物发育中分别发育成四个和两个克隆牛。小公牛分别出生在1998年12月21、23、24和30日以及1999年2月7和8日(表3;图1)。总体而言,从第10代细胞(64和29%)比从第15代细胞(25和17%)得到的胚胎的怀孕率和产犊率更高。
克隆分析:
在出生的六个克隆中,有两个来自第10代细胞的克隆在出生后不久就死亡了。一个死因是由于感染赤羽根病毒(Akabane virus),另一个是由于分娩时难产。死后尸体解剖没有发现这两个克隆存在总体或组织病理学上的异常。克隆孕期(平均294天;范围:291-299天)比正常品种的孕期(285天)长了9天。克隆的出生重量(平均36kg;范围:30.7-42.5kg)比本品种的雄性小牛出生平均重量(30kg)高出20%。存活下来的克隆和供体牛在图1中显示。这些克隆牛在本专利申请时已经22-24个月大。对它们进行兽医学方面的检查表明它们和用传统生殖方式得到的同年龄的小牛一样健康和正常。克隆牛的生长曲线和多于30项的血液参数表明小牛的健康状况和同年龄的小牛没有任何区别。
为了确定所述牛的克隆状态,用23微卫星标记(Inoue et al.,《动物科学技术》(Animal Sci.Technol.)68:443-449(1997))对六个克隆、供体牛和第5、10和15代的供体细胞进行DNA定型。克隆的各自宿主母体也包括在化验中。正如图2中所示,用23DNA标记分析表明这六个克隆与供体牛、核供体细胞以及它们相互之间都是相同的(第1条:供体牛;第2-4条:第5、10和15代的供体细胞;第5-10条:所述6个克隆;第11-16条:六个宿主母体)。在第1-10条中发现11套相等的微卫星标记。红条带,DNA分子量标记(用碱基对)。用来进行微卫星标记的聚合链式反应(PCR)引物(primer)用荧光染料标记,例如:6-FAM(兰色)、β-氨基己糖苷酶(HEX黄色)和TET(绿色)。在此之前的研究表明所述23微卫星标记可以区分31万亿个个体和排除37百万个祖先(参见Inoue et al.,《动物科学技术》(Animal Sci.Technol.)68:443-449(1997))。
实施例2:从长期培养的成熟兔纤维原细胞制备克隆胚胎
我们已经用下面的方法使用长期培养的纤维原细胞成功的克隆出兔胚胎。
原料和方法
卵母细胞和受精卵的来源:
给成熟的荷兰雌条纹兔皮下注射两次0.3mg和四次0.4mg的卵泡刺激素(FSH)(FSH-P,Schering-Plough Animal Health,Kenilworth,NJ),每次间隔12h,以此来刺激其过度排卵(Yang et al.,《分子生物发育》(Mol.Reprod.Dev.)27:110-117(1990))。在最后一次注射FSH后12小时,静脉注射100IU人体绒(毛)膜促性腺激素(hCG)(Sigma,St Louis,MO)来诱导排卵。在hCG注射后13.5小时,将动物开腹并用Dulbecco-修正的含有3mg/ml BSA(Fraction V,Sigma A-9418)的PBS将排出的卵母细胞冲洗出来。在含有10微克/毫升的透明质酸酶(Sigma)的D-PBS溶液中短时处理除去丘细胞,接着用20微孔巴斯德(Pasteur)移液管移液。
卵母细胞去核:
卵母细胞去除卵丘细胞并且用非侵入性的微操作方法去核(Collas et al.,Biol.Reprod.43:877-884(1990))。简而言之,卵母细胞放入位于下陷玻片的一小滴PBS+15%胎牛血清(FBS,Hyclone,目录号10099-41)和5微克/毫升的细胞松弛素B的混合液中并在上面覆盖油。用配置Nomarski镜头的Nikon倒置显微镜可以观察到绝大多数卵母细胞的核染色体,并且在去核时视觉监控。然而,特定个体的胞质颜色和颗粒使染色体在常规光学显微镜下不可见。对这样的情况,采用短的(2-3秒)紫外照射后再用Hoechst 33342染色来确定核的位置。去除核及周围约10%的胞质,最好连同第一极体一起去除。用短紫外照射的方法确证是否成功去核。
供体细胞制备:
从成年雄兔耳朵的活组织切片中获取纤维原细胞。切片区域先刮掉毛然后用70%酒精清洗。从耳朵切下的小组织片用含有10X的抗生素-抗真菌溶液(Gibco BRL,目录号15240-062)的PBS清洗数次,然后切成1mm立方,并且把所述小片作为外植体放入装有DMEM(其中加入10%胎牛血清(FBS))的有盖培养皿中培养。在约14天后纤维原细胞从外植体中长出,用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤两次,然后胰蛋白酶化。离心洗涤,重新悬浮,然后用来核移植(未传代细胞)或在DMEM(其中加入10%FBS)中进一步培养至第15代。将汇合细胞的培养物加入到含0.5%FBS的DMEM培养基中培养3-5天获取血清饥饿的细胞。单层细胞胰蛋白酶化后用含0.5%FBS或10%FBS的DMEM离心清洗,然后在39℃悬滴培养直到使用前一个小时。挑选小的(直径10-15微米)光滑膜细胞进行核移植。
核移植,胚胎培养和胚胎转移:
核移植:供体细胞转入去核卵母细胞的卵周隙形成胚胎。为了进行电融合,卵母细胞-纤维原细胞联合体放在含有0.1mM氯化钙和0.1mM氯化镁的0.3M甘露醇溶液中(所述溶液在BTX 200电细胞仪的3.5mm缝隙小室中),然后施加短的、2-3秒的交流电(0.1kV)脉冲,接着立即输出2.4kV/cm的直流电脉冲60微秒。胞质杂合体在含有5.0微克/毫升的细胞松弛素B和2.5mM DMAP的TCM 199中培养2小时进行进一步激活。
胚胎培养:含有0.1%BSA的100微升KSOM悬滴培养2天,接着在含有1%BSA的KSOM中再培养(培养条件为39℃、5%CO2、5%O2和90%N2的潮湿环境)。记录胚泡的发育并用Hoechst 33342表面荧光(epifluorescein)染色来记数胚泡细胞数目。
胚胎转移:缩短培养时间并在预定的受精卵阶段(在融合评价之后)或过夜培养后的二细胞阶段进行胚胎转移。所有受体均施加15微克促性腺激素释放激素(GnRH)类似物(Cystorelin,AbbottLabs,Athens,GA)促进排卵,以便与卵母细胞供体同步。为了增加克隆胚胎怀孕的机会,将一些胚胎转入同步受精且有特殊颜色标记的受体(白化雌性与白化雄性配对,但接受荷兰雌条纹兔的克隆胚胎)。
供体细胞的特征:
细胞特定标记染色:用于核转移所培养的细胞的纤维原细胞类型的确定可用单克隆抗体进行免疫细胞化学着色的方法,主要是针对细胞骨架波形纤维蛋白丝(纤维原细胞特征细胞标记)或细胞角蛋白(上皮细胞特征细胞标记)(Franke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,75:5034-5038(1978);Franke et al.,《细胞实验研究》(Exp.Cell Res.123:25-46(1979))。细胞在Lab-Tek小室玻片中培养至汇合(NalgeNunc International,Napemille,IL)。细胞用PBS洗涤三次并在4℃甲醇中固定20分钟。细胞固定后用PBS洗涤三次,然后用含有3%BSA的PBS在37℃阻断(凝集)15分钟。去除阻断物并加入100微升的1∶40稀释的抗波形纤维蛋白(波形纤维蛋白clone V9,Sigma)或1∶400稀释的抗细胞角蛋白(盘状细胞角蛋白Pan-cytokertin clone-11,Sigma)。玻片在37℃下培养1小时。细胞用PBS洗涤3次并用100微升1∶300稀释的FITC-标记的抗鼠IgG处理1小时。细胞用PBS洗涤3次后用含50%甘油的PBS覆盖,并在荧光显微镜下观察。自身荧光和二级抗体的正确控制是必要的。
用流动血细胞计数确定细胞周期:
用流动血细胞计数确定细胞周期的阶段可采用本领域人员所熟知的技术(Boquest et al.,《生物生殖》(Biol.Reprod.)60:1013-1019(1999);Prather et al.,《克隆》(Clonging)1:17-24(1999))。简而言之,细胞经胰蛋白酶化后,用DMEM+10%FBS以大约5×105个细胞数/管的浓度将细胞重新悬浮。细胞粒化并在4℃下用1ml“saline GM”(含6.1mM葡萄糖、137mM NaCl、5.4mM KCl、1.5mMNa2HPO4 7H2O、0.9mM KH2PO4、0.5mM EDTA)重新悬浮。细胞在搅拌中慢慢加入4℃乙醇并在4℃培养过夜。细胞用PBS、0.5mM
EDTA洗涤后粒化。细胞粒化物在30微克/毫升的碘化丙锭(Sigma)中室温染色1小时并在进行流动血细胞计数之前用30微米孔径的网筛(Spectrum,Los Angeles,CA)过滤。细胞用荧光激活细胞分类器FAC Calibur(Becton Dickenson,San Jose,CA)分析。收集一万个细胞用Cell Quest程序(Becton Dickenson)做进一步的细胞周期分析。可以用单参数的DNA柱状图来区分细胞周期中G0/G1(2CDNA含量),S(在2C和4C之间)和G2+M(4C)期的细胞数量。根据与细胞周期阶段相关的显示荧光的细胞计算百分比。
结果:
在58例核移植融合中,可观察到16个胞质杂合体发育成胚泡。未传代的细胞发育成胚泡的可能性明显减小。
尽管本发明已经用优选的实施例进行了具体说明,本领域技术人员在不偏离由附加的权利要求所定义的本发明的原理或范围的情况下可以对本发明进行多种变化和/或修改。这里引用的所有文献整体合并于此作为参考。
Claims (12)
1.一种通过核移植克隆活体非人类的动物的方法,所述方法包括以下步骤:
a)获取组织样品得到一定数量的NENS体细胞来作为核供体材料;
b)在血清饥饿条件下培养所述细胞10-15代;
c)将所述细胞或取自所述细胞的细胞核插入去核卵母细胞中形成胞质杂合体;
d)激活所述胞质杂合体;
e)培养激活的胞质杂合体至发育成胚胎;
f)将所述胚胎转移到合适的宿主中发育成胎儿;和
g)使所述胎儿在宿主中发育直到它能脱离所述宿主存活并发育成熟为活体动物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述核供体材料来自牛。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述核供体材料来自兔。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述体细胞为雄性NENS体细胞。
5.根据权利要求1所述的方法,其中步骤c)中的所述细胞或取自所述细胞的细胞核经过基因改造。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法还进一步包括从体细胞群中选取分组细胞并将分组细胞进一步培养的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法,其中对取自分组细胞的细胞进行基因修饰产生转基因细胞。
8.根据权利要求1所述的方法,其中经培养的所述细胞是雄体细胞或从雄体细胞分离的细胞核,并且其中将所述激活的胞质杂合体培养至大于2细胞状态。
9.根据权利要求8所述的方法,还包括如下步骤:
a)在与供体细胞核融合之前、过程中或之后,从蛋白激酶抑制剂和蛋白合成抑制剂组成的组中选择一种抑制剂来激活去核卵母细胞;并且
b)在融合之前、过程中或之后用电刺激胞质杂合体。
10.根据权利要求1所述的方法,还包括如下步骤:
a)以靶向方式改变体细胞的核DNA产生基因改变的细胞;
b)在血清饥饿条件下培养所述转基因细胞10-15代后得到足够数量的细胞来进行能控制的基因修饰并且通过后续的培养对基因修饰进行确认。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述非人类的动物是哺乳动物。
12.一种产生基因改变和非基因改变的非人类的动物胚泡的方法,所述方法包括以下步骤:
a)分离二倍体供体细胞;
b)在血清饥饿条件下培养二倍体供体细胞至10-15代;
c)有选择的用基因靶向方式改变一个或多个步骤b)中得到的二倍体供体细胞的基因组;
d)从所述细胞中有选择的筛选和选择所需的转基因细胞;
e)用步骤b)中得到的细胞、或步骤c)中的细胞、或步骤d)中的细胞通过核移植产生胚胎;
f)将所述胚胎在体内或体外培养成胚泡。
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PB01 | Publication | ||
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CX01 | Expiry of patent term | ||
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20070103 |