JP6267785B2 - Ｃｍｐ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクター、そのベクターが導入された異種間移植用形質転換動物及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクター、そのベクターが導入された異種間移植用形質転換動物及びその製造方法に関する。

国立臓器移植センターによると、国内で一年間２万名余に達する患者が臓器移植を待っているが、寄贈件数は需要の１０％にも及ばないと報告された。また、米国の場合、臓器を必要とする待機者は１６分に一人ずつ増えているが、一日に待機者のうち１１名は手術も受けられず死亡にいたる状況である。このような状況と共に生命科学技術の発達は、異種臓器移植の技術開発の背景となる。

動物遺伝学の弛まぬ進歩は、特定遺伝子を除去または挿入することで、各遺伝子の役割の糾明と共に商業的に有用な形質転換動物の生産を可能にした。形質転換された動物製造のための方法としては、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）またはウイルス感染法（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）などを利用した無作為な遺伝子操作法と胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）または体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）を利用して特定遺伝子をタゲッティングさせられる遺伝子的中法がある。

微細注入法は、外来ＤＮＡを受精卵の前核に挿入する古典的な方法として形質転換動物を生産するために広く利用されてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。しかし、微細注入法で外来ＤＮＡが挿入された受精卵由来の形質転換された産子の生産割合は、２ないし３％で効率が非常に低く（非特許文献５）、外来遺伝子の挿入位置の調節及び特定の内部遺伝子の除去が不可能である。

ウイルス感染法も、動物の遺伝子組み換えのために広く使用される（非特許文献６；非特許文献７）。ウイルス感染法は、挿入しようとする遺伝子がウイルスベクターを通じて動物の遺伝子に導入されるので、微細注入法よりさらに効率的であるが、依然として特定位置への外来遺伝子の挿入及び特定の内部遺伝子の除去が不可能である。また、挿入しようとする遺伝子の最大サイズは７ｋｂと制限され、ウイルスにより発現されるタンパク質が問題となる（非特許文献８；非特許文献９）。

上記で言及した問題点を克服するために、特定遺伝子を除去または挿入できる遺伝子タゲッティング技術が利用される。遺伝子タゲッティング技術は、マウス胚芽幹細胞を利用した遺伝子機能研究で始めて使用された。相同組み換えを利用して特定遺伝子がタゲッティングされたマウス胚芽幹細胞を胚盤胞段階にある胚芽に挿入することで、結局、特定遺伝子が組み換えられた産者生産が可能となる。このようなマウス胚芽幹細胞に遺伝子タゲッティング法を利用しながら、多数の特定遺伝子タゲッティングされたマウスが生産された（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。遺伝子タゲッティング法が家畜に適用される時、大量の治療タンパク質を生産する動物生体反応器（ａｎｉｍａｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）または免疫拒否反応に関与する遺伝子を除去または特定位置における過多発現により、異種間臓器移植に使用可能な疾病モデル動物の生産が可能であり、これは、産業的に大きな経済的利益をもたらすことが予想されている。

遺伝子タゲッティングされた動物を生産するために、胚芽幹細胞の使用が必須的な要素として考えられていた。しかし、豚と牛を含む家畜で胚芽幹細胞と類似した細胞株らが報告されたにもかかわらず、現在まで家畜で胚芽幹細胞の使用は制限される（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。代りに、核供与細胞として一般体細胞が遺伝子タゲッティングに使用される可能性が提示されながら、形質転換されたクローン家畜の生産が可能となった（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）。

一方、異種臓器移植の最適な提供元としては、臓器の大きさ及び生理的特徴がヒトと類似し、多産性により臓器の大量供給が可能なミニ豚が考慮される。

豚臓器の成功的な移植は、一連の免疫拒否反応（超急性、急性血管性、細胞媒介性、及び晩成免疫拒否反応）の克服に依存する。移植後に水分内に発生する超急性免疫拒否反応は、アルファ−１，３−ガラクトシル抗原決定基合成に関与する遺伝子を除去し、人体補体調節遺伝子を過多発現させることで克服できることが報告された。

具体的に、２００２年、イギリスのＰＰＬ社から世界最初でアルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下、「ＧＴ」と略称する）遺伝子が異形接合的に（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）除去された体細胞クローン豚が生産された（非特許文献３１）。ＧＴ遺伝子は、異種間移植時に急速な免疫拒否反応を起こす原因遺伝子であり、この遺伝子が除去される場合、生体拒否反応が除去された異種間臓器移植用の疾患モデル動物の開発が可能である。

２００３年に同会社でＧＴ遺伝子が同形接合的に（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）除去された公開特許１０−２００９−００５６９２２で体細胞のクローンに成功することで、現在の臓器不足現象を解決できる臓器移植用の疾患モデル動物の生産のための画期的な進歩をもたらした（非特許文献３２）。２００５年、ＧＴ遺伝子が除去されたクローン豚由来の臓器は猿に移植され、その結果、急性免疫拒絶反応なく、移植後２〜６ヶ月まで生存が遅延されることを報告した（非特許文献３３）。しかし、ＧＴ遺伝子が除去されたにもかかわらず、他の経路を通じた異種抗原によって人体補体遺伝子が活性化することで、臓器移植時に深刻な拒絶反応が起こり得ることが報告された（非特許文献３４；非特許文献３５）。そのような障害を克服するために、ＧＴ遺伝子の除去と共に分解促進因子（ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＤＡＦ」と略称する）、膜補助因子タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、「ＭＣＰ」と略称する）、ＣＤ５９のような人体補体抑制遺伝子を過発現するクローン豚を生産する方法が使用された（非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９）。

一方、ヒトを除いた大部分の哺乳動物に存在するＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」と略称する）抗原決定基も異種臓器の移植時に免疫拒否反応を引き起こすことが報告された（特許文献１；非特許文献４０；非特許文献４１）。Ｎｅｕ５Ｇｃは、ＣＭＡＨによってＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「Ｎｅｕ５Ａｃ」と略称する）から転換される。

補体は、生体内で免疫作用に関係するタンパク質から構成されたタンパク質複合体（Ｃ１−Ｃ９）であり、抗原−抗体複合体が形成されれば、補体が細菌の細胞膜に結合して孔を作る補体固定と、または抗原−抗体複合体に補体が結合して食細胞作用が促進される食菌作用増進（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）がある。このような補体の活動が調節できる様々な調節タンパク質が発見され、補体の活性化を防ぐか活性化された補体の分解を促進することで、補体の作用を調節する。宿主の細胞膜にあるＤＡＦは、Ｃ２とＣ４ｂとの結合を妨害することができ、ＭＣＰは、Ｃ４ｂの分解を促進して補体が宿主細胞で活性化することを防ぐことで、補体による宿主細胞の破壊を防止することができる。宿主細胞の表面にあるＣＤ５９は、Ｃ７、Ｃ８とＣ５ｂ６の結合を妨害して、膜攻撃複合体の形成を防ぐことができる。

前記補体作用調節遺伝子の他にも、ヒトＣＤ３９遺伝子の過多発現により、異種臓器の移植時に発生する血栓症が抑制されることが報告されている（特許文献２，非特許文献４２）。

既存の報告によると、外来遺伝子の正規場所以外の発現は、腹の発達に障害を引き起こし、胚芽発達後期と出生後の初期に大部分発達する神経システムに致命的であるという問題点がある（非特許文献４３）。

関連先行特許として、特許文献３は、移植免疫反応を抑制することができるＣＤ７０発現神経幹細胞及びその利用に関し、ＣＤ７０を発現する神経幹細胞を含む、移植された臓器、組織または細胞に対する免疫反応抑制用の組成物及び前記組成物を利用した個体の免疫反応抑制方法が記載されている。

また、他の関連先行特許として、特許文献４は、補体−媒介性分解を引き起こさない兔疫グロブリンから誘導された結合分子に関し、（ｉ）標的分子に結合できる結合ドメイン及び（ｉｉ）ヒト兔疫グロブリンの中鎖のうち不変ドメインの全部または一部と実質的に同種性のあるアミノ酸序列を有する効果因子ドメイン（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ）を含む再組合ポリペプチドである結合分子であって、深刻な補体−依存性分解または標的の細胞−媒介性破壊なく前記結合分子が標的分子に結合できることを特徴とし、さらに好ましくは、効果因子ドメインがＦｃＲｎ及び／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合できる結合分子が開示されている。一般に、前記結合分子は、二つ以上のヒト兔疫グロブリン中鎖ＣＨ２ドメインから誘導されたキメラドメインに基づくものである。好ましい実施例において、領域２３３−２３６及び領域３２７−３３１が修正されており、それ以上の残基は、前記分子を効力のない（ｎｕｌｌ）対立形質（ａｌｌｏｔｙｐｉｃ）に作る。結合ドメインは、前記分子に（一般に臨床的に）適用するに適切な任意の供給源から誘導されることができ、例えば、抗体、酵素、ホルモン、受容体、サイトカインまたは抗原、リガンド、及び粘着分子から誘導される。また、核酸、宿主細胞、生成工程及び材料が開示されており、例えば、Ｂ細胞の活性化、乳房細胞の脱顆粒化、食作用を妨害するか、第２の結合分子が標的分子に結合することを妨害するための用途が開示されている。

国際公開第２００６１１３３３５６号 米国特許出願公開第２００８０００３２１２号明細書 韓国公開特許第１０２００９０１０４３２８号公報 韓国公開特許第１０２００１００３４８４７号公報

Ｈａｒｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９３（５８３３）：５４０−２，１９８１ Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５（６０２１）：６８０−６８３，１９８５ ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（５）：４８４−４８７，２００２ Ｄａｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），１４（２）：１８５−１８６，１９９６ Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，９：２６３−２７５，２０００ Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１（４）：３６６−３７５，１９８７ Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，６（１）：３１−３６，２００４ Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３７：１１９−１４１，１９９７ Ｙａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５（２）：１４９−１５９，１９９８ Ｂｒａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，５（６）：６２５−６３４，１９９５ Ｃａｐｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１２８８−１２９２，１９８９ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５６（２）：３１３−３２１，１９８９ Ｈａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（３）：３５３−３６１，２０００ Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５１（３）：５０３−５１２，１９８７ ｔｅ Ｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１１）：５１８２−５１３２，１９９２ Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６（６１９７）：３４８−３５２，１９８８ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０（３）：３２０−３２８，２００１ Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７（１）：２２４−２２７，１９８８ Ｓｔｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４（１）：１００−１１０，１９９６ Ｓｕｋｏｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３６（２）：１４８−１５８，１９９３ Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６３（１）：２８８−２９２，１９９４ Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２（８）：２３３９−２３４８，１９９６ Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（１７）：７８４４−７８４８，１９９５ Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６（５）：５６３−５６８，１９９４ Ｂｒｏｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（２）：１５７−１６２，２００３ Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０（５３６７）：１２５６−１２５８，１９９８ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０（６５６９）：６４−６６，１９９６ Ａｋｉｒａ Ｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９；１１８８−１１９０，２０００ Ｄｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，３（４）：２２１−２３１，２００１ ＭｃＣｒｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０５（６７９０）：１０６６−１０６９，２０００ Ｙｉｆａｎ Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：２５１−２５５，２００２ Ｃａｒｏｌ Ｊ．Ｐｈｅｌｐｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：４１１−４１４，２００３ Ｋｅｎｊｉ Ｋｕｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １１（１）：２９−３１，２００５ Ｔａｎｅｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３５：３５９−３６４，１９９７ Ｋｏｍｏｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１１：２３７−２４６，２００４ Ｙｏｉｃｈｉ Ｔａｋａｈａｇｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ７１：３３１−３３８，２００５ Ｃｏｚｚｉ，Ｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．，２６：１４０２−１４０３，１９９４ Ｆｏｄｏｒ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１１５３−１１１５７，１９９４ Ａｄａｍｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８：３６−４０，２００１ Ｐａｍ Ｔａｎｇｖｏｒａｎｕｎｔａｋｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ１００：１２０４５−１２０５０，２００３ Ｂａｒｂａｒａ Ｂｉｇｈｉｇｎｏｌｉ，ＢＭＣ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：２７，２００７ Ｋａｒｒｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１３：１４４０−１４４６，２００４ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２４（９）：１１８１−１１８８，１９９９

本発明は、上記の必要性に応じて案出されたもので、本発明の目的は、異種抗原決定基合成遺伝子（ＣＭＡＨ）のノックアウトされたベクターを提供することにある。

本発明の他の目的は、既存に使用したタゲッティングベクターに比べて効率性及び正確性の高いベクターを使用して形質転換体細胞株を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記形質転換体細胞株の核移植を通じて製造される非ヒトクローン動物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記非ヒトクローン動物を飼育した後、臓器を摘出する段階を含む免疫拒否反応を除去した移植用異種臓器の生産方法を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、ＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ５’アーム（ａｒｍ）、ＰＧＫｎｅｏｐｏｌｙＡ及びＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ３’アーム（ａｒｍ）を順次に含むＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクターを提供する。

本発明の一具現例において、前記ＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ５’アーム（ａｒｍ）は、序列番号１に記載された塩基序列を有することが好ましいが、これに限定されない。

本発明の他の具現例において、前記ＰＧＫｎｅｏｐｏｌｙＡは、序列番号２に記載された塩基序列を有することが好ましいが、これに限定されない。

本発明のまた他の具現例において、前記ＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ３’アーム（ａｒｍ）は、序列番号３に記載された塩基序列を有することが好ましいが、これに限定されない。

本発明のまた他の具現例において、前記ＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクターは、図４に記載された開列地図を有することが好ましいが、これに限定されない。

本発明は、上記本発明のＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクター及びジンク−フィンガーヌクレアーゼベクターを細胞にトランスフェクションさせる段階を含むＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼノックアウト細胞を製造する方法を提供する。

本発明の一具現例において、前記ジンク−フィンガーヌクレアーゼベクターは、図１に記載された開列地図を有することが好ましいが、これに限定されない。

また本発明は、上記本発明の方法によって製造されたＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼノックアウト細胞を提供する。

上記本発明のノックアウト細胞は、寄託番号ＫＣＴＣ １２４３９ＢＰで２０１３年７月２日に大韓民国大田市儒城区魚隱洞所在の韓国生命工学研究院生命資源センターに寄託した。

また、本発明は、前記ＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼノックアウト細胞の核移植を通じて、ヒトを除いた動物を製造する方法を提供する。

さらに、本発明は、上記方法によって製造されたヒトを除いたクローン動物を飼育した後、その臓器を摘出する段階を含む免疫拒否反応を除去した移植用異種臓器の生産方法を提供する。

本発明において、用語「遺伝子タゲッティングベクター（ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）」は、ゲノムの特定遺伝子位置に目的の遺伝子を除去または挿入することができるベクターをいい、相同組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるようにタゲッティングしようとする特定遺伝子に相同塩基序列を含む。

本発明において、用語「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、第１領域または第２領域と、これにあたる遺伝子の核酸序列との同一性程度を表し、少なくとも９０％以上同一であり、好ましくは、９５％以上同一である。

本発明において、用語「抗原決定基」は、異種臓器の移植時に受容体の免疫システムによって抗原として認識される部位を意味するが、細胞表面糖鎖であるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」と略称する）であり、「抗原決定基合成遺伝子」は、前記抗原決定基を生合成する酵素を暗号化する遺伝子として、Ｎｅｕ５Ｇｃの生合成に関与するＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（以下、「ＣＭＡＨ」と略称する）をいう。

本発明において、用語「選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）」とは、細胞により遺伝子タゲッティングベクターで形質転換された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用され、選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境で当該特定マーカーを発現する細胞のみを生存するようにして、陽性選択を可能にするマーカーを意味し、「選別マーカー遺伝子」は、前記陽性選別マーカーを暗号化する遺伝子を意味するが、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（以下、「ｎｅｏ」と略称する）は、抗生剤ネオマイシンが添加された培地で真核細胞が生存するようにする抗生剤耐性を付与することで、真核細胞において安定した形質感染細胞を選別することに使用される。

「形質転換」は、ＤＮＡを宿主として導入してＤＮＡが染色体外の因子として、または染色体統合完成により複製可能になることを意味する。形質転換は、核酸分子を有機体、細胞、組織または機関に導入するいずれの方法も含み、当分野で公知されたように、宿主細胞によって適合した標準技術を選択して行うことができる。プラスミドまたは非プラスミド性裸出（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）による真核細胞の形質転換を細胞の腫瘍化の意味としての形質転換と区分するために、「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」と呼ぶこともあるが、本明細書では同一の意味で使用する。

本発明において、「Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＺＦＮｓ）」とは、ＤＮＡ−切断ドメインにジンクフィンガーＤＮＡ−結合ドメインを融合して生成された人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ序列をターゲットするために操作し、これは、ジンクフィンガーｎｕｃｌｅａｓｅｓを複合体ゲノム内に独特の序列をターゲットさせる。内生的なＤＮＡリペアー機作を利用して、これらの物質は、高等生命体のゲノムを正確に変更することに使用される。

本発明において、「ＤＮＡ−切断ドメイン」は、例えば、タイプＩＩ制限酵素ＦｏｋＩから由来した非特異的な切断ドメインは、ＺＦＮｓに切断ドメインとして典型的に使用される。この切断ドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化する必要があるので、一対のＺＦＮｓが非パリンドロミック（ｎｏｎ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）ＤＮＡ部位をターゲットするために必要である。標準ＺＦＮｓは、その切断ドメインを各ジンクフィンガードメインのＣ−末端に融合する。その二つの切断ドメインが二量体化し、ＤＮＡを切断するために、その二つの個別ＺＦＮｓは、それらのＣ−末端から制限された距離を離れて反対側枝のＤＮＡに結合する必要がある。ジンクフィンガードメインと切断ドメインの間に最も一般に使用されたリンカー序列は、各結合部位の５’エッジから５から７ｂｐに離れることが必要である。

幾つか他のタンパク質工学技術は、ＺＦＮｓに使用されたｎｕｃｌｅａｓｅドメインの活性及び特異性を改善するために採択される。増加した切断活性を有するＦｏｋＩ変異体を生成するために、方向進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）が採択される。但し、意図されたヘテロダイマー種のみが活性化するために二量体化接触面を変形してＦｏｋＩの切断特異性を改善するために構造基盤考案が採択される。

各ＺＦＮｓのＤＮＡ−結合ドメインは、典型的に３から６個のジンクフィンガーリピートを有し、それぞれは、９から１８ｂａｓｅｐａｉｒｓ間を認知する。もし、そのジンクフィンガードメインがそれらの意図されたターゲット部位に完璧に特異的であれば、さらには、全体１８ｂａｓｅｐａｉｒｓを認知できる一対の３−フィンガーＺＮＦｓは、哺乳類ゲノムで単一ローカスを理論的にターゲットにすることができる。

様々な戦略が所望の序列に結合するためにＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーを操作することに開発された。これらは、把持ディスプレイ、または細胞選択システム（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ）を採択する「調節アセンブリー（ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ）」及び選択戦略の全てを含む。

新しいジンクフィンガーアレイを生成する最も簡単な方法は、公知された特異性の小さいジンクフィンガー「モジュール（ｍｏｄｕｌｅｓ）」を結合することである。最も一般的なｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ過程は、９ｂａｓｅｐａｉｒターゲット部位を認知できる３−フィンガーアレイを製造するために、各３ｂｐ ＤＮＡ序列を認知できる三つの分離したジンクフィンガーを結合することが関与する。他の方法は、６個以上の個別ジンクフィンガーを有するジンクフィンガーアレイを製造するために、１−ｆｉｎｇｅｒまたは２−ｆｉｎｇｅｒモジュールを利用する。

様々な選択方法が所望の序列をタゲッティングできるジンクフィンガーアレイを生成することに使用される。最初の頃の選択試みは、多くの草の部分的にランダム化したジンクフィンガーアレイから与えられたＤＮＡターゲットを結合したタンパク質を選択するために把持ディスプレイを利用した。最近の試みは、酵母ｏｎｅ−ハイブリッドシステム、バクテリアｏｎｅ−ハイブリッド及びｔｗｏ−ハイブリッドシステム及び哺乳類の細胞を利用する。新しいジンクフィンガーアレイを選択するさらに有望な新しい方法は、バクテリアｔｗｏ−ハイブリッドシステムを利用することであり、「ＯＰＥＮ」と命名される。このシステムは、それぞれ与えられたｔｒｉｐｌｅｔに結合するように予め選択された草の各ジンクフィンガーを結合した後、所望の９−ｂｐ序列に結合することができる３−フィンガーアレイを得るために、第二ラウンドの選択を利用する。このシステムは、操作されたジンクフィンガーアレイの商業的なソースに対する代案として、Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって開発された。

以下、本発明を説明する。

本発明者は、Ｎｅｕ５Ｇｃ抗原決定基の合成に関与するＣＭＡＨ遺伝子を除去しながら、ＣＭＡＨ遺伝子がノックアウトされた体細胞を効率的に選抜するように、Ｇ４１８（Ｎｅｏ）遺伝子が挿入された体細胞株の製造に成功した。

本発明により製造されたタケッティングベクター及び形質転換細胞株は、免疫拒否反応に関与する遺伝子の発現を複合的に調節することで、効率的に異種臓器移植用のクローン豚の生産に利用することができる。

本発明に使用されたベクターは、体細胞内で決定基遺伝子の序列を認識できるＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎと、決定基内の遺伝子を除去するＮｕｃｌｅａｓｅ機能を有したＦｏｘ１タンパク質を生産する新しい技術である。

本発明で使用されたベクターは、既存使用したタゲッティングベクターに比べて効率性及び正確性の高いベクターである。

また、前記ベクターでタゲッティングされるＣＭＡＨ遺伝子は、牛、羊、山羊、豚、馬、兎、犬、猿などの哺乳動物由来のＣＭＡＨ遺伝子であることが好ましく、豚由来のＣＭＡＨ遺伝子であることがさらに好ましく、ミニチュア豚のＣＭＡＨ遺伝子であることが最も好ましいが、これに制限されない。

また、本発明のベクターは、陽性選別マーカー遺伝子を含む。

陽性選別マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｎｅｏ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｈｙｇ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｈｉｓＤ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｐｕｒｏ）及びグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｓｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｇｐｔ）などが使用されてもよく、好ましくはＮｅｏであるが、これらに制限されない。

本発明の遺伝子タゲッティングベクターが宿主細胞内にタゲッティングされれば、宿主細胞ゲノム上の内生的（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）抗原決定基合成遺伝子とタゲッティングベクターとの間に相同組み換えが起こりながら、塩基序列が交替される。

また、他の様態として、本発明は、前記タゲッティングベクターが導入された形質転換体に関する。

前記形質転換は、核酸分子を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含まれ、当分野で公知されたように、宿主細胞によって適合した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム（ＣａＰＯ４）の沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオン性リポソーム法、及び酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが含まれるが、これらに制限されない。

また、本発明は、前記形質転換体細胞株の核移植を通じて製造される非ヒトクローン動物を提供する。

前記非ヒトクローン動物は、羊、山羊、豚、犬など、ヒトと体躯が類似した哺乳動物でもよいが、豚であることがさらに好ましく、そのうちミニアチュア豚であることが最も好ましい。

前記クローン動物の製造に利用される核移植方法は、当業界によく知られた方法を使用してもよいが、より好ましくは、ＵＳ６，７８１，０３０Ｂ、ＵＳ６，６０３，０５９Ｂ、ＵＳ６，２３５，９６９Ｂ、ＵＳ７，３５５，０９４Ｂ、ＵＳ７，０７１，３７２Ｂ、ＫＲ８６２２９８Ｂ、ＫＲ５００４１２Ｂ，ＫＲ８０７６４４Ｂ、ＪＰ４１５３８７８Ｂ、ＵＳ６，７００，０３７Ｂ、ＵＳ７，２９１，７６４Ｂ、ＵＳ６，２５８，９９８Ｂ、ＵＳ６，５４８，７４１Ｂ、ＷＯ０３／０８９６３２Ａ，ＵＳ７，３７１，９２２Ｂなどが使用されてもよく、特に豚の場合は、ＫＲ５００４１２Ｂ、ＫＲ８０７６４４、ＪＰ４１５３８７８Ｂ、ＵＳ６，７００，０３７Ｂ，公開特許１０−２００９−００５６９２２ ＵＳ７，２９１，７６４Ｂ、ＵＳ６，２５８，９９８Ｂ、ＵＳ６，５４８，７４１Ｂ、ＷＯ０３／０８９６３２ＡまたはＵＳ７，３７１，９２２Ｂに記載された方法を使用することがさらに好ましい。前記特許文献は、全て本明細書に参照として組み込まれる。

また、本発明は、前記非ヒトクローン動物を飼育した後、移植に必要な臓器を摘出する段階を含む移植用異種臓器の生産方法を提供する。前記臓器は、収容対象の性別、年、体重、身長などを考慮して、飼育時期を調節して供与体クローン動物を飼育した後、通常の外科的手術を通じて摘出することができ、摘出後、収容対象に直ぐ移植されるか、迅速に冷蔵保管される。

異種臓器移植の最適の提供元としては、臓器の大きさ及び生理的特徴がヒトと類似し、多産性により臓器の大量供給が可能なミニ豚が考慮される。このためには、先ず免疫拒否反応を制御するミニクローン豚を生産する必要がある。豚臓器の成功的な移植は、一連の免疫拒否反応（超急性、急性血管性、細胞媒介性、及び晩成免疫拒否反応）の克服に依存する。

既存の報告によると、ＧＴ遺伝子は、異種間移植時に急速な免疫拒否反応を起こす原因遺伝子であり、この遺伝子が除去される場合、生体拒否反応が除去された異種間臓器移植用の疾患モデル動物の開発が可能である。２００５年ＧＴ遺伝子が除去されたクローン豚由来の臓器は猿に移植され、その結果、急性免疫拒絶反応なしに移植後２−６ヶ月まで生存が遅延されることを報告した（Ｋｅｎｊｉ Ｋｕｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１（１）：２９−３１，２００５）。しかし、ＧＴ遺伝子が除去されたにもかかわらず、他の経路を通じた異種抗原により人体補体遺伝子が活性化されることで、臓器移植時に深刻な拒絶反応をもたらし得ることが報告された（Ｔａｎｅｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３５：３５９−３６４，１９９７；Ｋｏｍｏｄａ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１１：２３７−２４６，２００４）。一方、ヒトを除いた大部分の哺乳動物に存在するＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」と略称する）抗原決定基も、異種臓器移植時に免疫拒否反応を引き起こすことが報告された（ＷＯ２００６１１３３３５６Ａ；Ｐａｍ Ｔａｎｇｖｏｒａｎｕｎｔａｋｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ１００：１２０４５−１２０５０，２００３；Ｂａｒｂａｒａ Ｂｉｇｈｉｇｎｏｌｉ，ＢＭＣ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：２７，２００７）。Ｎｅｕ５Ｇｃは、ＣＭＡＨによってＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ、以下、「Ｎｅｕ５Ａｃ」と略称する）から転換される。これにより、ＣＭＡＨ遺伝子が除去された豚の場合、急性免疫拒否反応を制御することができ、ＧａｌＴが除去された豚と共に異種間臓器移植時に臓器移植用の疾患モデル動物の開発だけでなく活用が可能である。既存の報告によると（Ｂａｓｎｅｔ ＮＢ ｅｔ ａｌ．，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１７：４４０−４４８，２０１０；Ｌｕｔｚ ＡＪ ｅｔ ａｌ，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０：２７−３５、２０１３）、ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウス（ＧａｌＴ ａｎｄ ＣＭＡＨ）とｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ豚（ＧａｌＴ ａｎｄ ＣＭＡＨ）のＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ）またはｔｈｙｍｏｃｙｔｅとヒトの血清内のｎａｔｕｒａｌ ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ抗体に対する結合能を調査した結果、ｃｏｎｔｒｏｌ豚とＧａｌＴ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔに比べてｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスと豚でその結合能が減ることを確認することができた。このような結果からみると、異種抗原による急性免疫拒絶反応が制御されることが予想される。

既存の報告によると（Ｋａｖａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２５：１８８７−１８９３，２０１１）、肥満のＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスでｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ ｆａｉｌｕｒｅによって膵臓のサイズとインシュリンを分泌する細胞の数が減ったことを確認することができた。

従って、本発明の豚の場合、ｏｂｅｓｉｔｙやｄｉａｂｅｔｅｓモデルとしても利用可能である。

また、既存の報告によると（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，２８：４２−５４）、ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスの特性上、ヒトのデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）の実験モデル動物としての可能性について説明した。

このような報告により、本発明の豚の場合、ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙモデルとしても利用可能である。

本発明から分かるように、本発明は、Ｎｅｕ５Ｇｃ抗原決定基合成に関与するＣＭＡＨ遺伝子を除去しながら、ＣＭＡＨ遺伝子がノックアウトされた体細胞を効率的に選抜するように、Ｇ４１８（Ｎｅｏ）遺伝子が挿入された体細胞株を製造し、本発明によって製造されたタケッティングベクター及び形質転換細胞株は、免疫拒否反応に関与する遺伝子の発現を複合的に調節することで、効率的に異種臓器移植用のクローン豚の生産に利用することができる。

また、本発明のベクターは、豚ＣＭＡＨタンパク質の発現を除去するために、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）を利用してＣＭＡＨ的中ベクターとｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎによってゲノム上に挿入可能にＮＥＯ選抜因子が含まれた供与ＤＮＡを同時に製作し、既存のｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ的中ベクターに比べて、ＺＦＮの場合、的中効率が非常に高いことを確認することができ、上記のＺＦＮ及びｄｏｎｏｒ ＤＮＡを利用して、多数のＣＭＡＨ的中体細胞を選抜して、最近、これを受精卵移植してＣＭＡＨ遺伝子が的中されたミニ豚が生まれることができた。

ＺＦＮプラスミドの地図である。 ＺＦＮ活性を示したグラフである。 ＺＦＮがＺＦＮタゲッティングｆｏｒｗａｒｄ＆ＲｅｖｅｒｓｅプラスミドによってピッグＣＭＡＨエクソン８をタゲッティングすることを示す図である。 Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ（ＣＭＡＨ ｎｅｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）地図を示す図である。 ＣＭＡＨ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ序列を示す図であり、黄色；５’、白色；ＰＧＫ−ｎｅｏ−ＰｏｌｙＡ、灰色；３ａｒｍ’を表し、ｐＢＳＫ−ｓｅｑｕｅｎｃｅは含まれない（ＤＮＡは、ｐＢＳＫ−のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ ｓｉｔｅに挿入されている）。 豚でＣＭＡＨノックアウト体細胞のスクリーニング戦略を示す図である。 ＣＭＡＨ ｎｅｏ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ結果を確認した写真である。 ＣＭＡＨノックアウト豚の形質転換有無を確認するためのプライマー組合せの位置を示す模式図である。 核置換で生産されたＣＭＡＨノックアウト豚の形質転換有無を分析したＰＣＲ結果である。 核置換で生産されたＣＭＡＨノックアウト豚の写真である。 核置換で生産されたＣＭＡＨノックアウト豚で構築した体細胞株でＣＭＡＨの発現有無を分析した結果である。 ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスモデルとヒト血清との免疫認識反応の写真である。 ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスモデルでａｇｉｎｇによるｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓである。

以下、非限定的な実施例を通じて本発明をさらに具体的に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するために記載したもので、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されると解釈されない。

実施例１：ＺＦＮプラスミドの構築

本発明の構造物は、ＣＭＶ駆動され（ｄｒｉｖｅｎ）インビトロ転写反応で使用するためにＴ７プローモーターを含有した。全てのＺＦＮｓは、Ｎ−末端でｔｒｉｐｌｅ ＦＬＡＧである。制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＸｂａ Ｉが終止コドン直後で切断し、ｍＲＮＡ生産のための鋳型を直線化することに使用される。

実施例２：ＺＦＮ活性測定

ＺＦＮ活性は、酵母ＭＥＬ−１レポーターアッセイによって測定される（Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６（６）：７０２）。ＺＦＮ切断活性は、誘導前（０ｈ、青色バー）及びＺＦＮ発現の誘導後（６ｈ、赤色バー）に測定された。ＭＥＬ１レベルは、所望のターゲット部位で二重枝切断を生成するＺＦＮ活性とポジティブに相関関係を有する。誘導後（６時間）陽性対照群ＺＦＮと比べて＞５０％信号を表すＺＦＮｓをゲノムエディティング実験に有用であるとみなす（さらに、非誘導された状態（０ｈ）で活性を表すＺＦＮが優れることもある）。

実施例３：Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡの製作
ＣＭＡＨ５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏｐｏｌｙＡ−３’ａｒｍ ｖｅｃｔｏｒの構築

１）５’のＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ
５’ａｒｍは、先ず、ＸｂａＩ制限酵素ｓｉｔｅを含んでいるｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＴ）とＥｃｏＲＩ制限酵素ｓｉｔｅを含んでいるａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴ）とを利用して、シカコミニアチュアミニ豚のゲノムＤＮＡを利用してＰＣＲ増幅により確保した後、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにｌｉｇａｔｉｏｎした。ｃｌｏｎｉｎｇされたＤＮＡは、塩基配列決定によってＣＭＡＨ遺伝子領域であることを確認した。

２）３’のＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ
３’ａｒｍは、シカコミニアチュアミニ豚のゲノムＤＮＡを鋳型として利用し、ＸｈｏＩ制限酵素ｓｉｔｅを含むｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴＧＣＣ）とＫｐｎＩ制限酵素ｓｉｔｅを含むａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＣＣＡ）とを利用してＰＣＲ増幅してＴ−ｖｅｃｔｏｒにｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇした。ｃｌｏｎｉｎｇされたＤＮＡは、塩基配列決定によってＣＭＡＨ遺伝子領域であることを確認した。

３）ＣＭＡＨ ５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏｐｏｌｙＡ−３’ａｒｍ ｖｅｃｔｏｒの構築
ＣＭＡＨ ５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏｐｏｌｙＡ−３’ａｒｍ ｖｅｃｔｏｒの構築は、先ず、ｐＫＪ２ ｎｅｏ ｐｌａｓｍｉｄをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断してＰＧＫｎｅｏＰｏｌｙＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ（約２ｋｂ）を分離した後、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−のｖｅｃｔｏｒにｌｉｇａｔｉｏｎしてｐＢＳＫ−ＰＧＫｎｅｏＰｏｙＡ ｐｌａｓｍｉｄを確保した。５’の連結は、上記で確保された５ｐｌａｓｍｉｄ（Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ）からＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断して７８９ｂｐのｆｒａｇｍｅｎｔを確保した後、ｐＢＳＫ−ＰＧＫｎｅｏＰｏｙＡ ｐｌａｓｍｉｄをＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断したｖｅｃｔｏｒにｌｉｇａｔｉｏｎしてｐＢＳＫ−５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏＰｏｌｙＡ ｐｌａｓｍｉｄを構築した。そして、最終的に３’の連結は、上記でＰＣＲによって確保した３ｐｌａｓｍｉｄ（Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ）をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断して７６３ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔを確保した後、ｐＢＳＫ−５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏＰｏｌｙＡ ｐｌａｓｍｉｄをＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断したｖｅｃｔｏｒに挿入して、最終ｐＢＳＫ−５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏＰｏｌｙＡ−３’ａｒｍ ｐｌａｓｍｉｄを構築した。

実施例４：ＺＦＮ Ｖｅｃｔｏｒ及びＤｏｎｏｒ ＤＮＡのｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ及びｓｅｌｅｃｔｉｏｎ方法

ミニ豚体細胞にｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇベクターの導入は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ方法を利用して以下のように実施した。ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ方法では、培養した細胞をＴｒｙｐｓｉｎ処理によって回収した後、細胞数が５×１０^６ｃｅｌｌ／０．４ｍｌのＦ１０培養液になるように懸濁した後、０．１ｍｌのＦ１０培養液に溶かした４．５μｇの直線化Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡベクターと、それぞれ２．６μｇのｐＺＦＮ１とｐＺＦＮ２ ＤＮＡを混合して４ｍｍ ｇａｐ ｃｕｖｅｔｔｅに細胞ベクター混合液を入れた。このｃｕｖｅｔｔｅをＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｅｌｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＥＣＭ２００１）に装着した後、４８０Ｖ、４ｐｕｌｓｅｓ、１ｍｓ条件で電気衝撃を実施した。電気衝撃後、ｃｕｖｅｔｔｅを氷上に１０分間放置した後、１０ｍｌの培養液に移してよく懸濁した後、４８ｗｅｌｌにｗｅｌｌ当たり１２５０ｃｅｌｌになるように接種した。ＤＮＡ導入２４時間後、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を利用して１１日間選別過程を経た。形成されたｎｅｏ陽性クローン体細胞は、ｃｌｏｎｉｎｇ ｃｙｌｉｎｄｅｒを通じて２４−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに継代培養して分析に利用した。このように継代された体細胞は、３−４日後に９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔすれば１２−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに継代した。そして、３−４日間隔で６−ｗｅｌｌ、６０ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ、１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに継代培養して凍結保存するか実験に利用した。

実施例５：ｔａｒｇｅｔｉｎｇされた細胞のＰＣＲ選別

ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔされた細胞の選別のためのＰＣＲ分析は、下記のように行った。ＰＣＲを行うために、鋳型は細胞から分離したゲノムＤＮＡ１００ｎｇを利用し、ｐｒｉｍｅｒはＮｅｏ３−１ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴ）とＣＭＡＨ Ｓｃ ＡＳ３ ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧ）とを利用し、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑを利用してＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ条件は、９８℃で２分間１ｃｙｃｌｅ、９５℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で２分間４０ｃｙｃｌｅ、７２℃で１５分間１ｃｙｃｌｅで行った。ＰＣＲを行った後、０．８％のａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌでＤＮＡを電気泳動して、約２ｋｂのＤＮＡ ｂａｎｄ検出有無を持って最終確認した。

ＣＭＡＨ ｎｅｏ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの結果は、５×１０^６ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ＣＭＡＨ ｎｅｏ ｖｅｃｔｏｒ、ＺＦＮ ｐｌａｓｍｉｄ）、４８ｗｅｌｌの５２８個にｃｕｌｔｕｒｅして、ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ７８個のｐａｓｓａｇｅ、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ６４個のＰＣＲ分析、１^ｓｔＰＣＲで２８個のｐｏｓｉｔｉｖｅ、２^ｎｄＰＣＲで最終１９個のｐｏｓｉｔｉｖｅである。

実施例６：体細胞の核置換

核置換のためにＡＲＴ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から卵子を購入して体外で成熟させた後、卵子から核を除去した後、ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔ（ＫＯ）ベクターがタゲッティングされた供与細胞（Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ［ｐＢＳＫ−５’ａｒｍ−ＰＧＫｎｅｏＰｏｌｙＡ−３’ａｒｍ ｐｌａｓｍｉｄ］とｐＺＦＮ１とｐＺＦＮ２ ＤＮＡ［ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ］ベクター）を移植し、１．２ｋＶ／ｃｍで二回のＤＣ ｐｕｌｓｅ電気刺激で融合を実施した。生存した融合卵子のみを選別して代理母の卵管に［表２］のように移植した。

表２は、ＣＭＡＨ ＫＯ細胞を利用した核置換結果を示す表であり、＃１及び２は、ｄｏｎｏｒ ＤＮＡなしにＺＦＮ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎのみをし、＃３−９は、ｄｏｎｏｒ ＤＮＡと共にＺＦＮ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎをしたものである。

実施例７：ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔベクターがタゲッティングされた形質転換豚の生産

自然分娩で出生した子孫の耳組織を採取した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡから正確な分析のために、下記の図のようにレフトアーム領域、ライトアーム領域と、レフトとライトアームを含む領域のプライマー組合せでＰＣＲ分析を実施した後、遺伝子導入有無を確認した。

ライトアームプライマー組合せ
正方向Ｎｅｏ３−１：ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ、
逆方向ＳｃＡＳ３：ＡＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧ

レフトアームプライマー組合せ
正方向ＳｃＳ５：ＣＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＡＣ、
逆方向ＣＭＡＨＲ：ＡＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴ

レフトとライトアームプライマー組合せ
正方向ＳｃＳ５：ＣＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＡＣ、
逆方向ＳｃＡＳ３：ＡＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧ

実施例８：ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔ豚でＣＭＡＨ発現有無の確認

ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔ豚でＣＭＡＨ発現有無を確認するために、先ずｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓとｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔ豚から体細胞ラインを構築した。以後、細胞でＲＩＰＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）溶液でタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析を実施してｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔ豚ではＣＭＡＨタンパク質が全く発現されず、ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓしたＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋｏｕｔ豚では、ワイルドタイプと比較した時に発現が顕著に減ったことを確認することができた。その結果を図１１に示した。

実施例９：ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスモデルとヒト血清との免疫認識反応

本発明者がＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスモデルのｔｈｙｍｏｃｙｔｅとヒトの血清内のｎａｔｕｒａｌ ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ抗体に対する結合能を調査した結果、ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ由来の細胞とＩｇＧとの結合能は、全ての血液型（Ａ、Ｂ、ＯとＡＢ型）でその結合能がＷＴ−とｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ由来の細胞と比較した時に減ったことに対し、ＩｇＭとの結合能は、Ａ、ＯとＡＢでは有意的差異を有しなかった（図１２）。

実施例１０：ＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスモデルでａｇｉｎｇによるｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ

本発明者がＣＭＡＨ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔマウスモデルの蝸牛管を分離した後、組織学的分析をした結果、ＣＭＡＨ−／−ｏｌｄでｃｏｃｈｌｅａｒ ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍの異常を発見した（図１３）。

このような結果により、１）Ａｇｉｎｇによるｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ モデル、２）ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇモデルでも利用できる。

Claims (5)

1. 配列番号１に記載された塩基序列を有するＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ５’アーム（ａｒｍ）、配列番号２に記載された塩基序列を有するＰＧＫｎｅｏｐｏｌｙＡ、及び配列番号３に記載された塩基序列を有するＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ３’アーム（ａｒｍ）を順次に含むＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクター、並びに
   ジンク−フィンガーヌクレアーゼベクター
   を、ヒトを除く動物の細胞にトランスフェクションさせる段階を含むＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼノックアウト細胞を製造する方法。
2. 請求項１に記載の方法によって製造されたＣＭＰ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼノックアウト細胞。
3. 前記ノックアウト細胞は、寄託番号ＫＣＴＣ １２４３９ＢＰで寄託されたことを特徴とする請求項２に記載のノックアウト細胞。
4. 卵子を購入して体外で成熟させた後、卵子から核を除去した後、請求項２または請求項３の細胞を移植して融合を実施した後、生存した融合卵子のみを選別してヒトを除く動物である代理母の卵管に移植する段階を含むヒトを除いた動物を製造する方法。
5. 請求項４の方法によって製造されたヒトを除いたクローン動物を飼育した後、その臓器を摘出する段階を含む免疫拒否反応を除去した移植用異種臓器の生産方法。

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