KR100963030B1 - 이식 면역 반응을 억제할 수 있는 ｃｄ７０ 발현신경줄기세포 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD70을 발현하는 신경줄기세포를 포함하는, 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응 억제용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 개체의 면역 반응 억제 방법에 관한 것이다.

CD70, 신경줄기세포, 사멸, apoptosis

Description

이식 면역 반응을 억제할 수 있는 ＣＤ７０ 발현 신경줄기세포 및 그의 이용 {CD70 EXPRESSING NEURONAL STEM CELLS AND THEIR USE FOR PREVENTION OF IMMUNE RESPONSES IN TRANSPLANTATION}

CD70을 발현하는 신경줄기세포를 포함하는, 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응 억제용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 개체의 면역 반응 억제 방법에 관한 것이다.

장기, 조직 또는 세포 이식은 다양한 종류의 질병을 앓고 있는 환자의 생명을 구하는 데 이용될 수 있다. 인간의 신장, 간, 심장, 신장, 폐 및 췌장 등의 장기와 피부 등의 조직, 골수 등 세포 동종이식 (allotransplantation)은 말기 장기 부전 등 난치성 질환을 치료하는 방법으로 병원에서 이미 일반적으로 시행되고 있다. 또한, 인간 이외의 포유동물을 공여자로하는 이종이식 (xenotransplantation)도 동종이식 공여자 부족을 대체하는 방법으로 활발히 연구되고 있는 실정이다. 특히, 최근에는 자기 자신을 영구히 재생할 수 있고, 적절한 조건에서 신체를 구성하 는 다양한 종류의 세포로 분화 가능한 줄기세포의 이식이 다양한 난치성 질환의 세포대체 치료법의 하나로 대두되고 있다.

일반적으로 정상기능을 하는 수혜자의 면역체계는 이식된 장기, 조직이나 세포를 "비자기(non-self)"로 인식하여 이식편 (graft)에 대해 면역거부반응을 유발한다. 이러한 면역거부반응은 공여자 조직의 동종항원 (alloantigens) 또는 이종항원 (xenoantigens)을 인식하는 수혜자의 면역시스템에 존재하는 동종반응성 (alloreactive) 또는 이종반응성 (xenoreactive) T 세포에 의해 일반적으로 매개된다. 따라서, 동종 또는 이종 이식편이 장기간 생존하기 위해서는 외부 항원을 인지하는 수혜자의 면역체계를 피하거나 면역 반응을 억제할 수 있어야 한다. 이식편에 대한 수혜자의 면역 반응을 피하기 위해서 일반적으로 수혜자에게 면역억제제를 투여하게 된다. 싸이클로스포린(cyclosporin) 및 타크롤리무스 (tacrolimus, FK-506) 등과 같은 칼시네우린(calcineurin) 억제제나 아자티오프린(azathioprine), 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide) 등과 같은 항증식성 약제(anti-proliferative drug) 등이 대표적인 면역억제제들로 현재 동종 신장, 간, 췌장, 심장 이식 등에 빈번하게 사용되고 있다.

이들 면역억제제는 하루 기준으로 투여하여야 하며, 만일 투여를 중단할 경우 통상적으로 면역거부반응이 초래된다. 따라서, 장기간에 걸쳐 투여해야 하는데, 이로 인해 신장이나 간독성, 고혈압 등을 유발할 수 있다. 뿐만 아니라, 이들 약물은 이식편의 동종항원에만 반응하는 면역세포에만 선택적으로 작용하는 특이적 면 역억제제가 아니므로 비특이적 면역억제에 따른 기회감염이나 림포마와 같은 종양형성 등의 부작용을 유발할 수 있다. 또 다른 면역억제 방법으로 OKT3, 다클리주맵(Daclizumab) 또는 바실릭시맵(Basiliximab) 등의 단클론 항체를 투여하는 방법이 있는데 이들 역시 비특이적인 면역억제제로 기회감염이나 종양형성의 문제점을 지니고 있다. 따라서, 약물독성이나 기회감염 등의 문제점이 없는 새로운 면역억제법의 개발이 요구된다.

종래에 개발된 면역억제제는 주로 신규 화합물을 합성하여 사용하거나, 천연물로부터 추출한 물질을 사용한 경우가 대부분이었다. 그러나, 인위적으로 합성한 화합물의 경우 장기투여로 인해 발생하는 부작용, 안전성의 문제 및 효과적인 선택성이 결여된다는 문제점이 있으며, 천연물로부터 추출한 물질의 경우 이러한 물질자체가 주로 복합적인 천연물질이기 때문에 비용부담이 크다는 문제점이 있다.

한편, 미국공개특허 제2004/0131599호는 FasL 유전자를 도입한 수지상세포 (DC)나 조혈모줄기세포가 동종 혼합림프구 증식반응을 억제한다고 개시하고 있다. 그러나, FasL 을 발현하는 세포는 면역억제능이 있으나 FasL유전자를 인위적으로 세포에 도입해 생체내로 이식할 경우, 호중구(neutrophil)를 불러들여 면역거부반응이 오히려 촉진되는 현상을 초래하는 문제점이 있으며, 많은 세포종들이 Fas를 발현하므로 비특이적 방법이다. 따라서 보다 선택적으로 이식면역 거부반응을 억제할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 보다 선택적으로 이식면역 거부반응을 억제할 수 있는 면역억제제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 신경줄기세포가 CD70 분자를 발현한다는 것을 최초로 발견하였고, 이와 같이 CD70 분자를 발현하는 신경줄기세포가 동종 CD4⁺ T 세포를 선택적으로 사멸시킴으로써 면역억제제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

조직 및 세포를 포함하는 장기이식의 주요 목표는 수혜자에 의한 이식편 거부 면역 반응이 일어나지 않게 하는 것이며, 동시에 이식편을 제외한 다른 외부항원 (예컨대, 병원성 미생물의 항원)에 대한 면역 반응성은 유지되도록 하면서 장기의 영구적인 생착을 유도하는 것이다. 현재까지 사용되는 많은 면역억제제는 비특이적인 약물로 감염이나 종양을 포함하는 다른 질병의 감수성을 증가시키는 등 상기한 주요 목표를 달성하는 데 제한적이었다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 CD70을 발현하는 신경줄기세포를 포함하는, 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체의 면역 반응 억제 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 CD70을 발현하는 신경줄기세포를 포함하는 면역 반응 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "신경줄기세포(Neuronal stem cells: NSCs)"란 신경계에 존재하는 전구세포(progenitor cell)의 서브타입(subtype)으로 아스트로사 이트(astrocytes), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes), 마이크로글리아 (microglia), 뉴런(neurons)으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 세포를 말한다.

본 발명에서 용어, "CD70"이란, CD27의 리간드로서, 30 kDa의 분자량을 가지며 TNF 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 제2형 막당단백질을 말한다. CD70 의 핵산 핵산 염기서열(GenBank NM001252; 서열번호 1) 및 아미노산 서열(GenBank NP001243; 서열번호 2)은 당업계에 공지되어 있다. CD70은 주로 큰대식세포, 활성화된 T 및 B 세포에서 발현되며 NFAT 전사인자를 활성화시킨다고 알려져 있다. 그러나, 신경줄기세포에서 CD70이 발현된다는 것은 본원 발명자가 최초로 발견한 것으로서, 본원 발명은 CD70이 발현하는 신경줄기세포의 특성을 이용한 것이다.

한편, 용어 "CD27"이란 TNF 수용체 슈퍼패밀리(TNFR superfamily)에 속하는 분자량 55 kDa의 분자로서, CD70의 수용체이며 면역 반응동안 세포의 증식, 분화, 성숙 및 이동을 조절하는 것으로 알려져 있다. CD27은 T 및 B 세포와 NK 세포에서 주로 발현되며, 미성숙 B 및 T 세포의 분화과정에서 CD27 수용체의 발현이 조절된다고 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "면역 반응 억제"란 외부 또는 자기 항원에 의해 유발되는 생체에 유리하지 않은 면역 반응을 억제시키는 것을 말한다. 외부 또는 자기 항원에 의해 유발되는 면역 반응에 의해 염증반응이 일어날 수 있으며, 이러한 염증 반응은 급성염증 및 만성염증으로 구분될 수 있다. 특히, 만성염증은 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건 선(psoriasis), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease) 등, 및 천식(asthma), 동맥경화(atherosclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 등과 긴밀한 연관성이 있다[참조: Balkwill and Mantovani, Lancet 357(9255):539-45, 2001].

장기이식 거부반응 또는 이식편-대-숙주질환 등은 정상적인 면역 반응이지만 이식된 장기 또는 이식편을 생체와 조화시키기 위해서는 이들을 거부하는 면역 반응을 억제시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 이식편의 세포매개성 면역거부반응의 주된 매개자인 CD4⁺ T 세포를 선택적으로 사멸시킴으로써 면역 반응의 억제를 유도할 수 있는 관련 세포들, 특히 CD70 분자를 발현하는 신경줄기세포를 이용하여 목적하는 면역억제 효과를 달성한다.

구체적 실시예에서, 본 발명의 CD70를 발현하는 신경줄기세포를 CD4⁺ T 세포 또는 CD8⁺ T 세포와 혼합배양하였을 때 CD4⁺ T 세포를 선택적으로 사멸(apoptosis)시켰으며, CD4⁺ T 세포의 사멸이 신경줄기세포의 수에 비례하여 증가함으로써 신경줄기세포에 의한 선택적인 현상임을 확인할 수 있었고, 또한, 인간 섬유아세포 (Detroit 551), 배아신장세포 (HEK-293) 및 생쥐 섬유아세포 (NIH-3T3)는 사멸을 유발하지 않아, 신경줄기세포만이 선택적으로 인간 CD4⁺ T 세포를 사멸시킬 수 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 8). 또한, 이러한 선택적 사멸은 신경줄기세포가 CD70 을 발현하고 CD4⁺ T 세포가 CD27 을 발현하여, CD70-CD27 의 상호작용에 의해 CD4⁺ T 세포의 사멸이 유도되는 것임을 확인하였다 (도 14 내지 도 16).

따라서, 본 발명의 면역억제 조성물은 바람직하게는 CD4⁺ T 세포의 사멸로 기대할 수 있는 모든 바람직하지 않은 면역 반응을 억제할 수 있으며, 그러한 구체적인 예시로서 상기한 장기 이식 거부 반응[참조: Kingsley et al., J. Immunol. 168:1080-86,2 002], 이식편-대-숙주질환[참조: Hequet et al., Am. J. Transplant. 4(6):872-8, 2004], 만성염증 및 자가면역질환[참조: Thompson and Powrie, Curr. Opin. Pharmacol. 4(4):408-14, 2004] 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응을 억제시킴으로써 장기 이식 거부 반응 또는 이식편-대-숙주질환의 치료 및 예방에 효과적이다. 상기 이식된 장기, 조직 또는 세포는 동종 이식편이거나 이종 이식편일 수 있다. 본 발명에서 용어, "이식편(graft)"은 한 개체에서 다른 개체나 같은 개체의 다른 부위에 이식되는 세포, 조직 또는 기관의 일부를 의미하며, "동종(Allogeneic)"은 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편을 의미하고, "이종(Xenogeneic)"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 의미한다.

또한, 본 발명의 조성물은 만성염증 및 자가면역질환의 치료 및 예방에도 효과적이다. 자가면역질환은 상기한 류마티스 관절염[참조: Morgan et al., Arthritis Rheum. 48(5):1452-60,2003], 천식 및 알러지[참조: Robinson and Dao, J. Allergy Clin. Immunol. 114(2):296-301, 2004], 건선, 염증성 장질환[참조: Martin et al., J. Immunol. 172(6):3391-8, 2004], 당뇨병[참조: Peng et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 101(13):4572-7, 2004], 궤양성 대장염[참조: Powrie et al., Norvatis Found.Symp.252:92-8, 2003], 다발성 경화증[참조: Adorini , J.Neurol.Sci. 223(1): 13-24, 2004], 경피증, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 전신 홍반성 낭창[참조: Crispin et al., J.Autoimmun. 21(3):273-6, 2003] 등을 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 CD70을 발현하는 신경줄기세포는, CD70 발현 벡터를 도입하여 CD70 의 발현을 더욱 증진시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어,벡터란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어,작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서 열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

CD70을 코딩하는 핵산 염기서열(서열번호 1)을 갖는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA 상태로 세포내로 전달하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포 내로 전달할 수 있다. 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 면역억제가 필요한 환자에게 투여하여 면역을 억제하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 면역억제에 관여하는 CD4⁺ T 세포의 사멸에 의한 면역억제 방법에 관한 것이다. 보다 바람직한 양태에서, 본 발명은 장기이식거부반응, 이식편-대-숙주질환, 자가면역질환 또는 만성염증성 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이식편의 세포매개성 면역거부반응의 주된 매개자는 CD4⁺ T 세포이다. 본 발명은 CD70 분자를 발현하는 세포가 동종 CD4⁺ T 세포를 선택적으로 사멸시키는 연구결과를 바탕으로 한다. 따라서, 장기, 조직, 특히 세포 이식에서의 면역거부반응을 감소 또는 억제하기에 효과적인 세포로 세포표면 분자인 CD70를 발현하는 세포를 이용할 수 있다. 또한, CD70를 발현하는 세포가 동종 CD4⁺ T 세포의 증식을 유도하 지 않고, CD4⁺ T 세포의 아포토시스를 유도하여, CD70를 발현하는 세포가 온전하게 보존되므로 생체 내로 약물이나 유전자를 전달하는 운반체로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. 세포배양

Flax 등(Flax et al., 1998, Nature Biotechnology 16; 1033-1039)이 이전에 확립한 불멸화된 인간배아신경줄기세포주인 HB1.F3를 실험에 사용하였다. HB1.F3 세포를 5% 열불활성화된 우태아혈청 (FBS), 5% 열불활성화된 말혈청 (Gibco)과 1% 항생제용액 (Gibco)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에 넣어 배양하였다. 인간 섬유아세포 (Detroit 551)과 배아신장세포 (HEK-293)과 생쥐 섬유아세포 (NIH-3T3) 또한 DMEM에 넣어 5% CO₂ 와 37℃ 조건에서 배양하였다.

실시예 2. T 세포 분리

말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 건강한 혈액제공자의 혈액으로부터 Ficoll-Paque^Plus (Amersham Biosciences) 키트를 이용해 정제하였다. CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포는 MACS beads (Milteny Biotec)를 이용해 분리하였으며, 순수도는 98% 이상이었다. CD45RA⁺ 또는 CD45RO⁺ T 세포는 CD4⁺ T 세포를 MACS beads를 이용해 분리하였으며, 순수도는 90% 이상이었다.

실시예 3. 유세포 ( Flow cytometry ) 분석

분석할 신경줄기세포나 T 세포를 1차 항체와 FACS 배지 (1 x Hank's Balanced Salt Solution, HBSS) 속에서 혼합하여 30분간 얼음에 넣어 방치한 후 HBSS로 두 번 세척한 후 FITC (rat or mouse IgG, Serotec)나 PE (mouse IgG, Serotec)가 부착된 2차 항체와 HBSS 속에서 혼합하여 20분간 얼음에 방치하였다. 다시 HBSS로 두 번 세척한 후 FACS 배지에 녹여 항체로 염색된 세포를 FACS Calibur 유세포분석기 (Becton Dickinson)와 CELLQUEST 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 세포내 단백질 발현 분석을 위해 세포를 얼음으로 차갑게 한 acid alcohol로 천공 및 고정하였다.

실시예 4. 혼합배양 및 아포토시스 분석

신경줄기세포에 의한 T 세포의 아포토시스를 분석하기 위해 96 웰 배양접시의 한 웰에 5 X 10⁴개의 신경줄기세포를 분주하고, CD4⁺ T 또는 CD8⁺ T 세포는 한 웰 당 1 x 10⁵개를 분주하여 배양하였다. 일정시간 배양 후 배양접시 바닥에 부착된 신경줄기세포와 부유되어 있는 T 세포를 격리하여 수확하고 PBS로 세척하였다. 아포토시스는 아넥신 V(annexin V)와 PI(propidium iodide) 염색제에 의해 염색된 세포를 분석하여 조사하였다. 세포를 5 ㎕의 아넥신 V-FITC (BMS)와 조심스럽게 섞고 4 ℃ 암실에서 5분간 방치하였다. 세포를 결합 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂)로 세척하고 10 ㎕의 PI용액과 190 ㎕의 결합 완충액을 첨가하였다. 그리고 시료를 즉시 FACS Calibur 기기를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 우선, 신경줄기세포를 동종 CD4⁺ T 세포와 혼합배양 하였을 때 흥미롭게도 이들 동종 CD4⁺ T 세포들이 신경줄기세포의 동종항원에 대한 반응으로 증식하기보다는 오히려 배양 초기부터 아포토시스 형태(apoptotic morphology)를 보이며 사멸하는 것을 확인하였다 (도 3). 배양 72 시간까지 CD4⁺ T 세포의 사멸을 조사한 결과, 12시간에 급격히 증가한 후 24시간에 최고치를 이루며 이후로 크게 증가하지 않았다. 대조군으로 사용한 CD4⁺ T 세포만 배양한 군은 배양기간 동안 세포사멸이 크게 변화하지 않았다 (도 6).

그러나 CD8⁺ T 세포를 사용했을 경우는 신경줄기세포에 의한 CD8⁺ T 세포의 아포토시스가 CD4⁺ T 세포에 비해 상대적으로 미미하였다 (도 4).

신경줄기세포에 의해 유도되는 아포토시스가 순수(naive) CD4⁺ T 세포 또는 전에 활성화 경험이 있는 작용자(effector) 또는 기억 CD4⁺ T 세포에 선택적인 현상인지를 확인하기 위해 CD4⁺CD45RA⁺ T 세포와 CD4⁺CD45RO⁺ T 세포를 선별하여 실험한 결과 두 경우 모두 신경줄기세포에 의해 아포토시스로 사멸하며, CD45RA⁺ T 세포가 다소 더 민감하게 반응함을 확인하였다 (도 5).

또한, CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 신경줄기세포에 의한 선택적인 현상인지를 확인하기 위해 CD4⁺ T 세포의 수를 고정하고 신경줄기세포의 수를 증가시켜 혼합배양하였을 때 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 신경줄기세포의 수에 비례하여 증가함을 알 수 있었다 (도 7).

또한, 인간 배아신장세포 (HEK-293), 인간 섬유아세포 (Detroit 551), 생쥐 섬유아세포 (NIH 3T3)를 이용해 아포토시스를 조사한 결과, 신경줄기세포만이 선택적으로 인간의 CD4⁺ T 세포를 사멸시킬 수 있음을 확인하였다 (도 8).

실시예 5. Fas - FasL 상호작용 분석

CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 일반적인 세포사멸 매개방법인 Fas-FasL 상호작용에 의해 매개되는지를 확인하기 위하여, FasL 차단항체를 처리하여 T 세포의 아포토시스를 조사하였다. 그 결과, 도 9에서 보여지는 것처럼, FasL 차단항체의 처 리농도 의존적으로 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 억제되는 것을 확인하였다.

다음으로 신경줄기세포의 표면에 FasL의 발현이 있는 지를 FACS로 조사하였다. 대조군으로 IL-1b를 처리한 신경줄기세포에서는 FasL의 발현이 확인되었으나 아무것도 처리하지 않은 신경줄기세포 표면에서는 FasL 발현을 확인할 수 없었고, 신경줄기세포와 CD4⁺ T 세포 또는 CD8⁺ T 세포와 혼합배양 12시간 후 수집된 신경줄기세포의 표면에서도 FasL의 발현이 없었다 (도 10).

한편, Fas의 발현은 CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포 모두에서 95% 이상 유지되었으며, 신경줄기세포와의 혼합배양 전후에 T 세포 표면 Fas 발현의 변화가 거의 없었다 (도 11).

FasL 차단항체 처리에 의해 신경줄기세포 매개 T 세포 아포토시스가 억제되는데, 신경줄기세포에서 FasL가 발현되지 않는다는 사실은 FasL가 T 세포에서 발현될 가능성을 시사한다. 따라서, 신경줄기세포와 T 세포를 혼합배양 후 T 세포에서의 FasL 발현을 T 세포 표면과 세포 내에서 조사하였다. CD4⁺ T 세포의 경우, 아포토시스가 급격히 증가하는 시간대인 배양 후 12시간째에 FasL를 발현하는 세포가 CD4⁺ T 세포만 배양했을 때에 비해 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 반면, CD8⁺ T 세포의 경우, 신경줄기세포와의 혼합배양 전후에 FasL를 발현하는 세포수가 크게 변하지 않았다 (도 12, 13).

실시예 6. CD 70- CD 27 상호작용 분석

신경줄기세포와 T 세포의 상호작용에서 T 세포의 FasL 발현을 유도하는 매개자를 확인하기 위해 T 세포의 활성화와 억제에 작용하는 공동신호분자(co-signaling molecules)의 mRNA 발현을 신경줄기세포와 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포에서 조사하였다.

RNA 분리 키트 (Qiagen)를 이용하여 신경줄기세포와 T 세포로부터 RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 RNA를 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 다이티오트레이톨(Dithiothreitol), 0.5 mM 스퍼미딘 (spermidine), 20 U RNasin, 1 mM dNTP, 0.5 mg의 올리고 dT와 10 U AMV 역전사효소 (Promega)를 포함하는 반응용액과 혼합 후 42 ℃에서 1시간 역전사하였고, 95 ℃에서 5 분간 변성시켰다. 역전사해서 얻은 3㎍의 cDNA를 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1.75 mM MgCl₂, 0.4 mM dNTP, 0.06 pmole의 센스 및 안티센스 프라이머, 2.5 U Taq DNA 폴리머라아제를 포함하는 반응용액과 혼합하였다. CDNA의 증폭은 Thermal cycler PTC-200 (MJ Research Inc.)를 사용하였으며 94℃에서 30초 변성시키고, 58℃에서 30초간 어닐링하였으며 72℃에서 1 분간 증폭하는 방식으로 30 내지 40 회 반복하였다. PCR 산물은 TBE 버퍼에 담겨진 2% 아가로스 젤에 도입해 전기영동하였고, 전기영동 후 DNA 밴드를 UV 자외선 투시기(transilluminator)를 이용해 육안으로 확인하고 사진을 찍었다.

그 결과, 신경줄기세포의 경우 조사된 공동신호분자 중 CD70의 발현이 확인 되었고, CD4⁺와 CD8⁺ T 세포의 경우 CD70의 수용체인 CD27의 발현이 확인되었다 (도 14).

이들 분자의 단백질 발현을 확인하기 위해 FACS 분석을 시행한 결과, mRNA 분석 결과와 마찬가지로 대부분의 신경줄기세포에서 CD70가 발현되었고, CD4⁺와 CD8⁺ T 세포 모두에서 CD27이 발현되었다 (도 15). CD27 단백질 발현의 경우, CD4⁺ T 세포의 경우 90% 이상의 세포에서 발현되었으나, CD8⁺ T 세포의 경우 약 50%의 세포에서만 CD27이 발현되었다 (도 15).

이러한 결과를 바탕으로 신경줄기세포와 T 세포 사이에 CD70-CD27 상호작용이 존재할 것으로 추정하여 이들 분자의 상호작용을 차단했을 때 어떠한 현상이 발생하는지 조사하였다.

CD27 차단항체 처리시 농도 의존적으로 신경줄기세포에 의한 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 현저히 억제됨을 확인하였다 (도 16 왼쪽). 또한, CD70 차단항체 처리시 농도 의존적으로 신경줄기세포에 의한 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 현저히 억제됨을 확인하였다 (도 16 오른쪽).

CD70-CD27 상호작용의 차단에 의한 신경줄기세포 매개 T 세포의 아포토시스의 억제가 T 세포에서 유도되는 FasL의 발현 억제에 기인한 것인지를 확인한 결과, CD27 차단항체 처리에 의해 신경줄기세포와의 상호작용에 의해 유도되는 FasL 발현 CD4⁺ T 세포의 수가 현저히 감소됨을 확인하였다 (도 17).

상기한 결과를 바탕으로 조직, 세포를 포함하는 장기이식시의 면역억제를 목적으로 사용되는 면역억제제의 장기투여에서 나타나는 부작용을 피할 수 있는 선택적 면역억제 방법으로 CD70를 발현하는 세포를 사용할 수 있음을 알 수 있다.

도 1은 CD70의 핵산 염기서열(GenBank NM001252)을 나타낸 것이다.

도 2는 CD70의 아미노산 서열(GenBank NP001243)을 나타낸 것이다.

도 3은 인간 신경줄기세포 (NSC)와 T 세포의 혼합배양 6시간 후부터 T 세포가 죽어가는 모습을 보여주는 현미경 사진이다.

도 4는 인간 CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포가 인간 신경줄기세포에 의해 혼합배양 18시간과 24시간 후에 급격하게 아포토시스 (apoptosis)로 죽어가는 것을 보여주는 그래프이다.

도 5는 인간 신경줄기세포와 CD45RA⁺ T 또는 CD45RO⁺ T세포의 혼합배양 24시간 후에 아포토시스로 죽는 것을 보여주는 그래프이다.

도 6은 인간 신경줄기세포와 CD4⁺ T 세포의 혼합배양 후 72시간까지 시간 경과에 따른 CD4⁺ T 세포의 사멸을 보여준다.

도 7은 일정한 수의 T 세포에 신경줄기세포의 수를 점차 증가시켜 혼합배양 하였을 때의 T 세포의 아포토시스가 신경줄기세포수의 증가에 비례하여 증가함을 보여주는 그래프이다.

도 8은 인간의 배아신장세포 (HEK-293), 인간 섬유아세포 (Detroit 551), 생쥐 섬유아세포 (NIH 3T3), 인간신경줄기세포와 혼합배양한 인간 CD4⁺ T 세포의 아포 토시스를 보여준 그래프로 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 인간신경줄기세포에 의해서만 현저하게 일어남을 보여준다.

도 9는 인간신경줄기세포에 의한 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 FasL 차단 항체의 처리에 따라 항체농도 의존적으로 감소함을 보여주는 그래프이다.

도 10은 인간 CD4⁺ T 세포 또는 CD8⁺ T 세포와의 혼합배양 전후에 신경줄기세포의 표면에서 FasL 발현이 나타나지 않는 반면, 싸이토카인, IL-1b를 처리하면 신경줄기세포의 표면에서 FasL 발현이 유도됨을 보여주는 그래프이다.

도 11은 대부분의 인간 CD4⁺ T 세포 또는 CD8⁺ T 세포 표면에 Fas의 발현이 존재함을 보여주며, 이들 세포와 인간신경줄기세포를 혼합배양 후에도 T 세포 표면의 Fas 발현이 거의 변하지 않음을 보여준다.

도 12는 인간신경줄기세포와 혼합배양 12시간 후 일부 FasL를 발현하는 CD4⁺ T 세포가 유도됨을 보여준다. 반면, CD8⁺ T 세포는 신경줄기세포와 혼합배양 후에도 FasL를 발현하는 세포의 수가 크게 변하지 않음을 보여준다.

도 13은 도12의 결과를 그래프화한 것으로 신경줄기세포와의 혼합배양 후 FasL를 발현하는 CD4⁺ T 세포의 수가 통계적으로 유의하게 증가함을 보여준다.

도 14는 인간신경줄기세포에서 CD70의 mRNA가 발현되고 있음을 보여주고, T 세포에서는 CD70의 수용체인 CD27의 mRNA가 발현되고 있음을 보여준다.

도 15는 인간신경줄기세포의 표면에서 CD70 단백질이 96% 가량 발현되고 있음을 보여주고, CD4⁺ T 세포의 표면에서는 CD27이 92% 가량, CD8⁺ T 세포의 표면에서는 CD27이 51% 가량 발현되고 있음을 보여준다.

도 16은 인간신경줄기세포에 의한 CD4⁺ T 세포의 아포토시스가 CD27 차단 항체나 CD70 차단 항체의 처리에 의해 항체농도 의존적으로 감소함을 보여주는 그래프이다.

도 17은 신경줄기세포와 혼합배양 후에 유도되는 FasL 발현 CD4⁺ T 세포의 수가 CD27 차단 항체 처리에 의해 억제됨을 보여주는 그래프이다.

Claims (8)

1. CD70을 발현하는 신경줄기세포를 포함하는 CD4⁺ T 세포에 기인하는 면역 반응 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응을 억제하는 것인 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 이식된 장기, 조직 또는 세포는 동종 이식편인 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 이식된 장기, 조직 또는 세포는 이종 이식편인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 장기이식거부반응, 이식편-대-숙주반응, 자가면역질환 또는 만성염증성질환의 치료 및 예방에 사용되는 것인 면역 반응 억제용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 CD70을 발현하는 신경줄기세포는 CD70 발현 벡터가 도입된 신경줄기세포인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 CD70 발현 벡터는 서열번호 1의 핵산 서열을 가지는 핵산 분자를 포함하는 것인 조성물.
8. 삭제

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