KR20180050413A - Hiv 감염을 치료하기 위해 t 세포를 리디렉션시키는 방법 - Google Patents

Hiv 감염을 치료하기 위해 t 세포를 리디렉션시키는 방법 Download PDF

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KR20180050413A
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제임스 엘. 라일리
레이첼 라이브먼
에이미 에스. 페인
크리스토프 티. 엘리브릭트
마이클 씨. 밀론느
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 CD4 막-결합 키메라 수용체 또는 HIV 특이적 scFvs CAR을 사용하여 HIV 감염된 포유류를 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 하나의 양태는 변형된 T 세포 및 입양 세포 치료를 위한 변형된 세포를 포함하고 HIV 감염과 관련된 질병 또는 상태를 치료하는 약학 조성물을 포함한다.

Description

HIV 감염을 치료하기 위해 T 세포를 리디렉션시키는 방법
연관 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 (e)에 의거하여 2015년 9월 22일자로 출원된 미국 가출원 제 62/222,132 호 및 2015년 11월 11일자로 출원된 미국 가출원 제 62/253,790 호에 대한 우선권으로 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 수여한 허가 번호 AI104280, AI117950 및 AR064220에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
인간 면역 결핍 바이러스 유형 (HIV) 복제를 최소화하고 환자의 삶의 질과 지속 기간을 늘리는 항레트로바이러스 요법의 능력에도 불구하고, 평생 치료법과 관련된 건강상의 결과와 재정적 부담은 영구적 치료법을 매우 매력적으로 만든다. T 세포는 바이러스 복제를 제어하는 데 중요한 역할을 하지만, 그 자체가 HIV 매개 파괴의 표적이다.
면역 증강에 의한 것이든 또는 결손 보호에 의한 것이든 CD4 T 세포 활성의 복원은 고활성 항레트로바이러스 요법 (highly active antiretroviral therapy; HAART)이 없는 경우 HIV 복제를 장기간 조절할 수 있는 중요한 요소이다. HIV를 치료하기 위한 치료제로서 T 세포를 제조하려는 시도는 20년 이상 계속되어왔다. T 세포는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor; CAR)로 알려진 세포외 표적 항체 및 세포내 시그널링 영역으로 구성된 합성 면역 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다. 이 새로운 연구 영역은 입양 T 세포 요법으로 불리며 최근에는 많은 기술 발전을 거쳤다. 중요한 점은, T 세포 요법은 항레트로바이러스 요법의 부재시에 HIV 특이적 세포 독성을 개선하고 HIV 복제에 대한 제어를 달성하는 데 중요할 수 있는 헬퍼 CD4 T 세포를 보호하고 이들에게 항바이러스 기능을 직접적으로 부여할 잠재력을 가진다는 것이다. 안전성과 실현 가능성의 입증을 포함한 입양 요법을 위한 T 세포 공학 분야의 주요 진보가 이미 이루어졌지만, HAART가 없는 경우 HIV 복제에 대한 내구성이 있고 일관된 제어가 임상 시험에서 나타나지 않았다.
환자 자신의 신체 내에서 HIV 특이적 림프구의 생산 및 프라이밍에 의존하는 백신 접종과는 달리, 입양 T 세포 요법은 투여 전에 치료용 T 세포를 맞춤화할 수 있는 기회를 제공한다. 따라서 T 세포의 직접적인 유전자 조작을 이용한 치료 시도가 실패 했음에도 불구하고, 입양 세포 치료법은 HIV에 저항성이 있는 세포를 생성하고 HIV 특이적 면역 반응을 재조정하거나 두가지 전략을 조합하여 기능적 치료를 촉진할 수 있다는 것은 명백하다. 그러나 현재 항바이러스 요법이 없는 경우 HIV 복제에 대한 지속적인 제어가 이루어지도록 T 세포를 최적으로 조작하는 방법은 명백하지 않다.
HIV 복제를 억제하고 유전자 요법-매개 기능 치료를 제공하는, 보다 효과적인 T-세포 유전자-공학 및 유전자-편집 전략에 대한 당업계의 큰 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 다룬다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명은 CD4 막-결합 키메라 수용체 또는 HIV 특이적 단일 사슬 가변 단편 (single chain variable fragments; scFvs) CAR을 사용하여 HIV 감염된 포유류를 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 막-결합 키메라 수용체를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함한다. 분리된 핵산 서열은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하며, CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 막-결합 키메라 수용체를 암호화 (encoding)하는 분리된 아미노산 서열을 포함한다. 분리된 아미노산 서열은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하며, CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 CD4 세포외 도메인은 서열번호 3 또는 64를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시 양태에서, CD4 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 46을 포함한다. 일부 다른 실시 양태에서, CD4 세포외 도메인은 HIV 엔벨로프 (Env) 당단백질에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 상기 막 횡단 도메인은 핵산 서열 서열번호 4 또는 65에 의해 암호화되는 CD8 알파 힌지 및 서열번호 5 및 8로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 막 횡단 도메인을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 서열번호 47의 CD8 알파 힌지를 포함하는 막 횡단 도메인, 및 서열번호 48 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 막 횡단 도메인을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 서열번호 6 또는 68을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 CD3제타 시그널링 도메인을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 서열번호 51을 포함하는 CD3제타 시그널링 도메인을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산 또는 아미노산 서열은 보조-자극 시그널링 영역을 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 상기 양태 또는 임의의 다른 양태의 다양한 실시 양태에서, 보조-자극 시그널링 영역은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), DAP12, OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 유래 보조-자극 시그널링 영역, 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 보조-자극 시그널링 영역은 CD28이고 서열번호 9 또는 67을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 다른 실시 양태에서, 보조-자극 시그널링 영역은 CD28이고 서열번호 49를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 막-결합 키메라 수용체를 코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 벡터의 분리된 핵산 서열은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하며, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 벡터의 핵산 서열은 서열번호 1, 7, 62 및 63으로 구성되는 군으로부터 적어도 하나를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 막-결합 키메라 수용체를 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 벡터의 막-결합 키메라 수용체는 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하며, CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있으며, 상기 벡터는 서열번호 44 및 45로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 벡터는 EFα 프로모터를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 CAR을 암호화하는 분리된 핵산 서열은 HIV 특이적 결합 도메인, 막 횡단 도메인, 보조-자극 시그널링 영역 및 시그널링 도메인을 포함하며, 상기 HIV- 결합 도메인은 항-HIV 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 HIV-특이적 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 HIV-특이적 결합 도메인은 인간 항체, 인간화 항체 및 그의 단편이다. 다른 실시 양태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 및 단일 사슬 Fv (scFv)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 scFv는 서열번호 13, 17, 21, 25, 29, 57 내지 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시 양태에서, 상기 scFv는 핵산 서열번호 12, 16, 20, 24, 28, 75 내지 78 및 79로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 HIV-특이적 결합 도메인은 HIV 감염 세포의 표면, 또는 HIV 비리온 (virion)에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 CAR의 보조-자극 시그널링 영역은 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 통상적인 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, KIR 패밀리 단백질, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 이들의 어떠한 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 CAR의 시그널링 도메인은 핵산 서열 서열번호 6 또는 68에 의해 암호화되는 CD3제타 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시 양태에서, CAR은 서열번호 10, 14, 18, 22, 26, 34, 70 내지 73 및 74로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 다른 실시 양태에서, CAR은 서열번호 11, 15, 19, 23, 27, 35, 52 내지 55 및 56으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 변형된 세포를 포함하며, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있다; 또는 HIV 특이적 결합 도메인, 막 횡단 도메인, 보조-자극 시그널링 영역 및 시그널링 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하고, 상기 HIV 결합 도메인은 항-HIV 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 세포의 변형된 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 세포 독성 T 림프구 (CTL) 및 조절 T 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 실시 양태에서, 상기 변형된 세포의 핵산 서열은 DNA 및 mRNA로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 핵산 서열은 전기천공법 (electroporation), 렌티바이러스 (lentivirus)의 사용, 레트로바이러스의 사용 및 화학적 기반의 형질 감염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 상기 세포 내로 도입된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 HIV 감염의 치료를 필요로하는 대상체에서 HIV 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 변형된 세포의 용도를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HIV 감염된 포유 동물에서 세포 면역 반응을 자극하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 변형된 세포의 유효량을 상기 포유 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HIV 감염 포유 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 변형된 세포를 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 변형된 세포는 상기 포유 동물에게 자가 유래이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 상기 포유 동물에게 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 변형된 세포 및 HAART는 포유류에 동시 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명하기 위해, 도면에 바람직한 실시 양태가 도시되어있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시 양태의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는다는 것을 이해해야한다.
도 1a 및 1b는 시험관 내에서 CD4 CAR이 HIV 특이적 엘리트 컨트롤러 TCR보다 100배 이상 강력함을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 1a: HLA-B57+ 정상 공여자로부터 CD4 및 CD8 T 세포를 수득하였다. CD4 T 세포는 HIV Bal에 감염되었고, 24 시간 후에 둘 다 EF1α 프로모터하에 발현된 비-형질전환 CD8 T 세포 (NTD)인, KAFSPEVIPMF-B57-KF11 (KF11)에 특이적인 HLA-B57 제한 TCR을 발현하는 CD8 T 세포, 또는 EF1α-CD8αTM CD4 CAR 구조체 (CD4z)를 발현하는 CD8 T 세포를 지시된 이펙터에서 목표 비율로 혼합하였다. 형질 전환 효율은 공동 배양 전에 40%로 표준화되었다. 6일간 공-배양한 후, CD8 음성 T 세포에 대한 Gag p24 및 CD4 염색이 나타났다. CD4 멤브레인-결합 키메라 수용체 (CD4 제타 또는 CD4 제타 구조체라고도 함)는 HLA-B*57 제한 KF11 엘리트 컨트롤러 TCR보다 NL4-3 HIV-1 복제를 잘 제어한다. KF11 TCR은 환자의 HIV-1 복제에 대한 더 나은 제어와 관련이 있으며 HIV-1에 대한 가장 유력한 환자 유래 TCR 중 하나이다. 이것은 TCR 기반 전략으로 달성할 수 있는 HIV-1에 대한 최상의 제어를 나타낸다. KF11 TCR과 달리, CD4 제타는 모든 Effector Cell to Target Cell (E:T) 비율에서 HIV-1 복제를 완전히 제어할 수 있었다. 도 1b: CD8 음성 세포에서 게이팅을 3회 반복 수행한 단일 실험에 대한 요약 데이터. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 이 데이터는 3가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 2a 내지 2g는 프로모터 및 막 횡단 변화가 CD4 막-결합 키메라 수용체 효능을 향상시키고 HIV-1에 대한 조절을 증가시키는 것을 나타내는 일련의 개략적인 표현 및 그래프이다. 도 2a: PGK 프로모터 및 CD4 TM 도메인을 포함하는 임상 시험에 들어간 구조체 (아래)와 비교하여, CD8α 막 횡단 (TM) 및 EF1α 프로모터를 갖는 새롭고, 개선된 CD4 멤브레인-결합된 키메라 수용체 구조체 (위)의 개략도. 도 2b: 형질 도입된 CD8에서 CD4 제타의 표면 발현. 임상 실험에 들어간 레트로바이러스 벡터-기반 구조체 (맨 오른쪽)와 비교하여, 렌티바이러스 벡터가 사용되었을 때 동일한 구조체가 더 높은 수준으로 발현되었다 (왼쪽에서 두 번째). 상기 발현은 EF1α 프로모터가 렌티바이러스 벡터로 치환될 때 더욱 증가하였다 (왼쪽에서 두 번째). 도 2c: 프레젠테이션에 표시된 모든 데이터의 실험 일정. 건강한 공여자의 CD4 및 CD8 T 림프구를 αCD3/CD28 코팅된 비드 및 100-300IU/ml IL-2로 자극하였다. 24시간 후 CD8은 렌티바이러스로 형질 도입되거나 3일과 5일에 레트로바이러스로 형질 도입되었다. 5일 후 비드를 제거하고 48시간 후 CD4 T 세포를 감염시켰다. CD4 T 세포를 감염시킨지 24시간 후, CD8을 다양한 E:T 비율로 공-배양하였다. 상기 배양은 HIV-1 복제가 NTD 웰에서 최대 복제 용량에 도달할 때 (일반적으로 약 10 내지 12일)까지 격일로 배양액과 IL-2를 공급하고 CD4, CD8 및 세포내 p24에 대해 염색하였다. 도 2d 및 2e: HIV-1 Bal로 CD4 T 세포가 감염된지 8일 후 세포내 p24가 염색되었다. 도 2d, CD4 T 세포에 게이팅 및 도 2e, CD8 T 세포에 게이팅. 렌티바이러스 벡터, EF1α 프로모터, 및 CD8α 막 횡단 도메인을 갖는 새롭고 개선된 CD4 제타 구조체는 PGK 프로모터 및 CD4 막 횡단 도메인을 갖는 구조체 (1:5 및 1:10에서 조절 상실)보다 훨씬 낮은 E:T 비율 (약 1:100까지)에서 HIV-1을 조절하였다. 레트로바이러스 PGK CD4 TM 구조체와 비교하여 렌티바이러스 PGK CD4 TM 구조체의 더욱 높은 발현이 관찰되었지만, HIV-1 복제에 대한 제어 측면에서 작은 이점이 나타났다. CD8s가 약 1:100의 비율까지 감염되지 않은 채 남아있는 반면, PGK CD4 TM+ CD8s는 더욱 낮은 E:T 비율로 감염됨에 따라, EF1α CD8 TM 구조체의 높은 발현은 더 높은 감염율을 촉진시키지 못했다. 도 2f: CD8 음성 세포에서 게이팅한 세번 반복 수행된 단일 실험에 대한 요약 데이터. 오차 막대는 평균 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 도 2g: 실험 시간 경과에 따른 CD8 음성 T 세포의 세포내 p24 수준 측정. 각 그래프는 상이한 E:T 비율을 나타낸다. 이 데이터는 세가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 3a 내지 3b는 EF1α 프로모터 및 CD8α 막 횡단 변화가 CAR 발현 및 HIV-1 복제의 조절을 개선하는 중요한 변형인 것을 나타내는 일련의 개략적인 표현 및 그래프이다. 도 3a: 프로모터 및 막 횡단 성분의 변화가 각각 개별적으로 HIV-1 복제에 대한 제어에 영향을 주는 것을 비교하기 위해 생성된 4 가지 렌티바이러스 벡터 키메라 수용체 구조체의 개략도. 위 구조체는 임상 시험에서 사용되었으나 이제는 렌티바이러스 벡터에 삽입된 것을 의미한다. 도 3b: 활성화 후 8일째의 CD8 T 세포상의 CD4 CAR 발현. 일차 인간 CD8 T 세포를 αCD3/αCD28로 코팅한 비드로 활성화 시켰고, 비-형질 도입 (NTD)을 유지하거나 지시된 렌티바이러스 벡터로 형질 도입 하였다. 배양 8일 후, CAR 발현을 CD4 염색으로 측정하였다. 각 구조체의 중앙 형광 강도 (MFI)는 각 그래프에 표시되었다. 도 3c: CD4 T 세포에 HIV-1 Bal 감염 후 8일째의 세포내 p24 염색. 컬럼의 왼쪽 세트를 CD4 T 세포에 게이팅하고 컬럼의 오른쪽 세트를 CD8 T 세포에 게이팅하였다. 이전에 보았듯이, EF1α CD8TM은 가장 낮은 E:T 비율로 HIV-1을 조절했다. EF1α 프로모터로 CD4 TM (중간 컬럼)의 발현을 단순히 증가시키는 것은 HIV-1 복제에 대한 제어를 향상시켰지만, EF1α 프로모터 및 CD8α 막 횡단 치환으로 증가된 발현의 조합은 HIV-1에 대한 최적의 제어를 만들었다. CD8α TM는 키메라 수용체로 조작된 CD8 T 세포 (컬럼의 오른쪽 세트)의 감염을 감소시키는 것으로 나타났으며, 특히 EF1α 구조체에 대해 1:50의 비율 및 PGK 구조체에 대해 1:25의 비율에서 나타났다. 도 3d: CD8 음성 세포에서 게이팅한 세번 반복 수행된 단일 실험의 요약 데이터. 오차 막대는 평균 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 도 3b: 실험 시간 경과에 따른 CD8 음성 T 세포의 세포내 p24 수준 측정. 각 그래프는 상이한 E:T 비율을 나타낸다. 이 데이터는 세가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 4a 내지 4c는 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 광범위 중화 항체 (broadly neutralizing antibody; bnAb)-기반 CAR 및 CD4 막-결합 키메라 수용체 모두가 HIV-1 감염을 조절할 수 있음을 입증하는 일련의 표 및 그래프이다. 도 4a: HIV-1 특이적 bnAb로부터 적응된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) CAR의 패널은 이러한 강력하고 광범위 중화성인 HIV-특이적 항체가 HIV에 감염된 세포를 표적화하는 대체 수단을 제공한다는 가정하에 생성되었다. 그들의 HIV-1 결합 폭 및 중화 효능 범위의 scFv 패널 (도 4a 참조)을 CD4 막-결합 키메라 수용체와 동일한 EF1α-CD8α TM-제타 구조체 골격 내로 클로닝하고 HIV-1 복제를 제어하는 이의 능력에 대해 평가하였다. 활성화 2주 후, 이들 T 세포를 표시된 이펙터 (indicated effector) 대 표적 비율에서 HIV-1 YU2 GP160을 발현하는 Cr51 표지된 K562 표적 세포와 혼합 하였다. 표적의 특이적 용해를 표시하였다. 표시된 데이터는 세번의 독립적인 실험의 평균을 보여준다. 4시간 공동 배양으로부터의 Cr51 방출 살해능 분석 (Cr51 release killing assay)은 scFv CAR 또는 CD4 막-결합된 키메라 수용체를 발현하는 CD8 T 세포가 비-형질 도입된 (NTD) T 세포는 아니지만 Env-발현 표적 세포를 용해시킴을 보여주었다. 이것은 scFv CAR이 적절한 접힘/구조로 표현되어 Env에 결합할 수 있음을 나타낸다. 도 4b: 일차 인간 CD8 T 세포를 αCD3/αCD28 코팅된 비드로 활성화시키고, 비-형질 도입되어 (NTD) 남기거나 또는 VRC01, 3BNC60, PG9, PGT128 또는 PGDM1400 항체 또는 CD4 CAR로부터 유래된 HIV 특이적 CAR을 암호화하는 EF1α-CD8α TM 렌티바이러스 벡터로 형질 도입되었다. 활성화 2주 후, HIV-1 YU2 GP160을 발현하는 K562 세포와 CD8 T 세포를 1:1 비율로 6시간 동안 공-배양하고 세포내 IFNγ 및 MIP-1β 생산을 측정하였다. 형질 도입 효율은 공-배양 전에 60%로 표준화되었다. 도 4c: 도 2c에 요약된 실험 설계를 사용하여, HIV 특이적 CAR을 일차 인간 CD4 T 세포에서 HIV-1 복제를 조절하는 능력에 대해 시험하였다. 전달 효율은 공-배양 전에 70%로 표준화되었다. CD4 T 세포가 HIV-1 Bal에 감염된 후 세포내 Gag p24 및 CD4 염색 9일째에, CD4 T 세포가 나타난다. CD4 막-결합된 키메라 수용체 및 scFv CAR 모두 NTD 대조군에 비해 Env 표적 세포의 1:50 내지 1:200의 E:T 비율까지 용해를 나타내었으며, 이것은 최대 1:25 E:T 비율의 효능을 보여준 도 1a에 나타낸 KF11 TCR의 활성보다 우수하다. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 데이터는 세가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 5a 및 5b는 CD28 보조-자극이 HIV-1 Bal에 대한 조절을 촉진하고 CD28 및 4-1BB 보조-자극이 시험관 내에서 HIV-1 복제의 조절에 반대 효과를 갖는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 5a: CD4 T 세포가 HIV-1 Bal에 감염된 후 세포내 p24 염색 10일째에 CD4 T 세포가 나타난다. 보통의 CAR 디자인에서 이용된 보조-자극 도메인 패널을 CD4 막-결합 키메라 수용체 골격에 클로닝하여 시험관 내에서 HIV-1에 대한 보조-자극 효과를 측정하였다. CD4 제타 구조체보다 HIV-1을 일관되게 제어하는 유일한 막-결합 키메라 수용체는 CD4 CD28 제타 구조체였다. 대조적으로, 4-1BB, ICOS 및 CD27의 첨가는 HIV-1에 대한 조절을 상실시켰고, OX40 및 CD28-4-1BBzeta 조합은 거의 효과가 없는 것으로 나타났다. 도 5b: CD8 음성 T 세포에 게이팅된 세번 반복 수행된 실험에 대한 요약 데이터. 오차 막대는 평균 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 데이터는 세가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 6은 CD4 막-결합 키메라 수용체 (CD4 제타 구조체; 서열번호 1)의 뉴클레오티드 서열이다. 이 서열은 EF1α 프로모터 (서열번호 2)에 대해서는 적색으로, CD4 세포외 도메인 (서열번호 3)에 대해서는 황색으로, CD8α 세포외 힌지 (서열번호 4)에 대해서는 녹색으로, CD8α 막 횡단 도메인 (서열번호 5)에 대해서는 청록색, CD3 제타 (서열번호 6)에 대해서는 분홍색으로 나타냈다.
도 7은 CD4 CD28 막-결합 키메라 수용체 (CD4 CD28 제타 구조체; 서열번호 7)의 뉴클레오티드 서열이다. 이 서열은 EF1α 프로모터와 관련된 섹션에 대해서는 적색으로, CD4 세포외 도메인에 대해서는 노란색으로, CD8α 막 횡단 도메인에 대해서는 녹색으로, CD28 막 횡단 도메인 (서열번호 8)에 대해서는 청록색으로, CD28 보조-자극 도메인 (서열번호 9)에 대해서는 청색으로 및 CD3 제타에 대해서는 분홍색으로 나타냈다.
도 8은 5개의 항체 기반 CAR 구조체의 뉴클레오티드 및 아미노산 (aa) 서열의 목록이다: PGDM1400 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 10 및 11), PGDM1400 scFv 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 12 및 13), PGT128 KIR 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 14 및 15), PGT128 scFv 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 16 및 17) VRC01 KIR 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 18 및 19), VRC01 scFv 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 20 및 21), 3BNC60-KIR 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 22 및 23), 3BNC60 scFv 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 24 및 25), VRC01c-mut-KIR 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 26 및 27), VRC01c-mut scFv 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 28 및 29), CD4 Dap12-KIRS2 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 30 및 31), CD4-KIR 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 ( 각각 서열번호 32 및 33), 및 VRC01 IgG4 bbz 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열번호 34 및 35).
또한, 도 9a 내지 9c는 scFv 기반 CAR (scFv-CARs)의 세포 독성이 특이적이고 강력하다는 것을 입증하는 일련의 그래프 및 히스토그램이다. VRC01 CAR은 HIV YU-2 균주를 발현하는 표적 세포에 대하여 특이적 세포 독성을 나타내지만 (도 9a) CD19를 발현하는 세포에는 나타나지 않았다 (도 9b); 세포 독성은 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR) 세포질 도메인을 사용함으로써 증가될 수 있다 (도 9a). 살해 효과는 CAR T 세포에 의한 인터페론 감마 (IFNg) 방출과 상관관계가 있었다 (도 9c). 51Cr 방출 분석 기간은 4시간이었다. KIR 구조체는 DAP12 및 KIRS2 막 횡단 도메인에 연결된 scFv로 구성되었다. G4-bbz 구조체는 IgG4 힌지, CD8 막 횡단 도메인 및 4-1BB 및 CD3 제타 세포내 꼬리에 연결된 scFv로 구성되었다. bn01 = VRC01; NTD = 비-형질 도입 조절 T 세포.
도 10a 내지 10c는 scFv-CAR에 대한 세포 특이적 세포 독성의 또 다른 예를 나타내는 일련의 그래프 및 히스토그램이다. 3BNC60 및 VRC01c-CAR은 HIV-1 엔벨로프 gp120/41 (YU-2 분리체) (도 10a)을 발현하는 K562 세포의 특이적 용해를 나타내지만, CD19를 발현하는 K562 세포는 그렇지 않았다 (도 10b). 도 9c에 도시된 바와 같이, CAR T 세포에 의한 특이적인 IFN감마 생산은 살해 효능과 상관 관계가 있었다 (도 10c). 3BNC60은 광범위 중화 항체인 다른 CD4 결합 부위와 관련이 있다. VRC01-c는 HCDR3와 HCDR1 사이에 디설파이드 결합이 없는 VRC01의 유도체이므로 추가적인 비-정규적 (non-canonical) 디설파이드 결합이 포함된 원래의 VRC01 scFv와 비교하여 정확하게 접힌 scFv의 비율이 더 높을 수 있다. 3BNC60 및 VRC01-c의 경우, KIR 및 IgG4-bbz (G4라고도 함) 구조체 사이의 살해 측면에서 차이점이 검출되지 않았다.
도 11a 내지 11c는 CD4 CAR이 MHC 클래스 II+ 세포가 아닌 Env+ 세포에 특이적으로 반응한다는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. 도 11a: 일차 인간 CD8 T 세포를 αCD3/αCD28 코팅된 비드 (bead)로 활성화시키고, 비-형질 도입되어 (NTD) 남기거나 CD3-제타 시그널링 영역을 발현하는 CD4 CARs를 코딩하는 EF1α-CD8αTM 렌티바이러스 벡터를 단독으로 또는 CD28 또는 4-1BB 보조-자극 도메인과 조합하여 형질 도입시켰다. 활성화 2주 후, CD8 T 세포를 변형되지 않은 K562 세포, 높은 수준의 HLA-DR을 발현하는 K562 세포 (도 14 참조), 또는 HIV-1 YU2 GP160을 발현하는 K562 세포와 1:1의 비율로 6시간 동안 공-배양하였다. 세포내 IFNγ와 MIP-1
Figure pct00001
발현은 왼쪽에 나타나 있으며, 세포내 IL-2 발현과 CD107a 표면 형성 (surface mobilization)이 오른쪽에 나타나 있다. 도 11b: 공-배양 분석은 CD4 CAR+ CD8 T 세포가 MHC 클래스 II 발현 표적 세포를 죽이지 않는다는 것을 입증하기 위해 고안되었다. 간략하게, 도 6a로부터 NTD 또는 CD4 28z CAR가 형질 도입된 CD8 T 세포는 HLA-A2 및 GFP뿐만 아니라 HLA-DR*0401 및 mCherry를 발현하는 K562를 1:1:1 비율로 발현하는 K562 세포와 공-배양하였다. GFP와 mCherry 발현을 측정하는 유세포분석법은 혼합 직후 (0 시간)와 3일 간의 공-배양 (72 시간) 후에 수행하였다. 도 11c: 24시간, 48시간 및 72시간 배양 후 HLA-DR*0401/mCherry-발현 세포에 대한 HLA-A2/GFP-발현 세포의 비율을 측정한 세번 반복 수행한 단일 실험에 대한 요약 데이터. 오차 막대는 평균 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 데이터는 세가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 12a 내지 12f는 최적화된 CD4 CAR 조절 HIV-1 복제를 발현하고 생체 내에서 더욱 더 큰 수준으로 원래의 CD4 CAR보다 팽창된 T 세포를 나타내는 일련의 그래프이다. 7마리의 NSG 마우스 집단 (NOD-scid IL2Rgnull)에 8백만개의 CD4 T 세포와 2백만개의 CD8 T 세포를 주입하였다. CD8 T 세포는 비-형질 도입되어 (NTD) 남기거나, 4-1BB 또는 CD28 세포내 보조-자극 도메인을 포함하는 최적화된 (EF1α-CD8αTM, 렌티바이러스 벡터) CD4-zeta CARs, 또는 각각 NTD, BBz, 28z 및 CD4z로 표시된 임상 시험 (MMLV-기반, PGK-CD4TM) CD4 CAR로 형질 도입되었다. CD8 T 세포 형질 도입 효율은 마우스에 주사하기 전에 50%로 표준화되었다. 주사 후 3주 째에, 접종을 측정하여 기준 말초 CD4 T 세포 수 (도 12a) 및 CAR+ CD8 T 세포 수 (도 12c)를 결정하였다. 이틀 후, 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에게 HIV-1 Bal을 감염시켰다. 감염 후 22일 째에, (도 12b) 말단 말초 CD4 T 세포 수 및 (도 12d) CAR+ CD8 T 세포 수를 얻었다. 감염 후 7일째 (도 12e) 및 18일째 (도 12f)에 혈장 HIV RNA의 복제물을 측정하였다. Mann Whitney Test는 통계적 유의성을 결정하는데 사용되었다 (p 값: ns> 0.05, * <0.05, ** <0.01, *** <0.0001).
도 13a 내지 13c는 CCR5-ZFN 변형된 CD4 CAR CD8 T 세포가 생체 내에서 풍부하다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 7에 기재된 NSG 마우스 실험 디자인에서, CD8 T 세포를 활성화 및 CD4 CAR 전달 48시간 전에 CCR5 ZFN RNA로 전기천공시키거나 비-형질 도입 (NTD)으로 남긴 4개의 추가 집단을 첨가하였다. 도 13a: HIV 감염 22일 후, HIV 감염 마우스로부터 비장 CD8 T 세포를 분리하고 CCR5 분열 빈도를 분석하였다. 도 13b: CD4 CAR-발현 CD8 T 세포 대 비-형질 도입된 CD8 T 세포의 비율은 인간 CD4 및 CD8을 염색하고 HIV 또는 모의 감염 22일 후에 분리된 말초 혈액에서 유세포 분석을 수행하여 결정하였다. 유세포분석법의 구성을 도 15에 나타내었다. 도 13c: 감염 후 18일 째에, 도 12f에서와 같으나 4개의 ZFN-처리된 군이 혼입된 HIV-감염 마우스에서 혈장 HIV RNA의 복제물이 측정되었다. 유의성은 Mann Whitney Test (p값: ns> 0.05, * <0.05, ** <0.01, *** <0.0001)를 사용하여 검출되었다.
도 14는 HLA-DR-형질 도입된 K562 세포에서 MHC 클래스 II 발현의 높은 수준을 나타내는 그래프이다. HLA-DR*0401 형질 도입된 K562 세포에서 MHC 클래스 II의 높은 발현을 확인하기 위해 HLA-DR 발현을 유세포 분석법으로 측정하였다. 게이팅 대조군 (gating control)으로서, HLA-A2로 형질 도입된 K562 세포뿐만 아니라 높은 MHC 클래스 II 발현 Raji B 세포가 염색되었다. 3개의 세포 집단을 중첩하는 히스토그램이 묘사된다.
도 15는 4-1BB 보조-자극 도메인이 항원의 부재하에 더욱 큰 T 세포 지속성을 생성하는 것을 나타내는 일련의 그래프이다. 모의 감염 22 일 후, BBz 또는 28z로 형질 도입된 말초 혈액 세포 또는 비장 세포에서 ZFN-처리된 마우스 집단을 CAR 발현을 위해 αCD4 및 αCD8 항체로 염색하였다. 위 패널은 말초 혈액을 보여주고 아래 패널은 비장 세포를 보여준다. 하나의 대표적인 흐름 구성은 HIV-감염 마우스의 모든 경우에 표시된다.
도 16a 및 16b는 CCR5 ZFN 처리가 CD4 T 세포를 생체 내에서 보호하거나 CAR+ CD8 T 세포 수를 확장시키는 CD4 CAR CD8 T 세포의 능력을 개선시키지 않음을 입증하는 일련의 그래프이다. 도 16a: 도 12b에 나타낸 바와 같으나, 이제는 CCR5 ZFN 변형된 CD8 T 세포를 받은 마우스의 데이터를 포함하는 말단 말초 혈액 CD4 T 세포 수는 HIV 감염 22일 후에 수집되었다. (B) 말단 말초 혈액 CAR+ CD8 T 세포 수는 모든 집단에서 감염 후 22일 째에 열거되었다. 유의성은 Mann Whitney Test (p값: ns> 0.05, * <0.05, ** <0.01, *** <0.0001)를 사용하여 검출되었다.
도 17a 내지 17d는 기존의 임상 시험 벡터에 대해 본 발명에서 이루어진 개선점을 요약한 일련의 표 및 그래프이다. 도 17a: 기존의 임상 시험인 MMLV-기반 구조를 개선하기 위해 확인된 수정 사항의 전체 목록을 묘사하는 표와 개략도. 도 17b: 도 2c에 요약된 실험 설계를 사용하여, 일차 인간 CD8 T 세포를 αCD3/αCD28 코팅된 비드로 활성화시키고 비-형질 도입되어 (NTD) 남기거나, PGK 프로모터에 의해 유도된 기존의 MMLV-기반 CD4 기반 CAR로 형질 도입시키거나 (임상 실험 CAR), 또는 HIV-기반 렌티바이러스 벡터에 배치된 최적화된 EF1α-CD8α TM CAR를 형질 도입시켰다. 형질 도입 효율은 공-배양 전 60%로 표준화되었다. HIV Bal에 감염된 CD4 T 세포와 7일간 공-배양한 후, 표면 CD4 및 세포내 Gag p24의 발현을 유세포 분석기로 측정하여 CD8 음성 T 세포를 게이팅하였다. 도 17c: CD8 양성 세포에 게이팅을 보여준다. 도 17d: CD8 음성 세포에서 게이팅을 세번 반복 수행한 단일 실험에 대한 요약 데이터. 오차 막대는 평균 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 이 데이터는 세가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 18은 본 발명의 최적화된 HIV CD4 CAR 및 HIV 항체 기반 CAR (서열번호 44 내지 61) 중 일부에 대한 주석된 아미노산 서열의 목록이다.
도 19는 본 발명의 최적화된 HIV CD4 CAR 및 HIV 항체 기반 CAR (서열번호 63 내지 79) 중 일부에 대한 주석된 핵산 서열의 목록이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 실시하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본 명세서에 기재되어있다. 본 발명을 설명하고 청구할 때, 다음의 용어가 사용될 것이다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시 양태를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 제한하려는 의도는 아니라는 것을 이해해야한다.
용어 "한" 및 "하나"는 본 명세서에서 용어의 문법적 목적물 중 하나 또는 둘 이상 (즉, 적어도 하나)을 언급하는데 사용된다. 예를 들어, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양, 일시적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 "약"은 특정 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 구체적으로는 ±5%, 더욱 더 구체적으로는 ±1%, 및 가장 구체적으로는 ±0.1%일 수 있으며, 이러한 변형은 개시된 방법을 수행하기에 적절하다.
본 명세서에서 사용되는 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기에 충분하게 자극된 T 세포의 상태를 의미한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산 및 검출 가능한 이펙터 기능과 관련될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 무엇보다도 세포 분열을 진행하는 T 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "어댑터 분자 (adaptor molecule)"는 2개 이상의 분자와의 상호 작용을 가능하게 하는 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하고, 특정 실시 양태에서는 세포 독성 세포의 활성화 또는 불활성화를 촉진한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 말한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합원으로부터 유래된 손상되지 않은 면역글로불린일 수 있으며 손상되지 않은 면역 글로불린의 면역 반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 4량체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 단일 사슬 항체 (scFv) 및 인간화 항체뿐만 아니라 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
용어 "항체 단편"은 손상되지 않은 항체의 일부분을 말하며 손상되지 않은 항체의 항원 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 중쇄"는 자연 발생하는 형태의 모든 항체 분자에 존재하는 두가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 경쇄"는 자연 발생하는 형태의 모든 항체 분자에 존재하는 두가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 나타낸다. α 및 β 경쇄는 두가지 주요 항체 경쇄 아이소타입 (isotype)을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체와 같은 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체 단백질 및 항체 단백질을 발현하는 DNA 분자 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석되어야하며, 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 이용 가능하고 공지된 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 (antigen)"또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산 또는 특정 면역학적으로 유능한 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대 분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 유전체 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것을 쉽게 알 수 있다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 전혀 암호화될 필요가 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성된 것으로 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것이 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항-종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수 감소, 전이 수 감소, 기대 수명의 증가, 또는 암 상태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선에 의해 나타낼 수 있는 생물학적 효과를 명시한다. "항-종양 효과"는 또한 처음 장소에서 종양 발생의 예방에 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 명시될 수 있다.
용어 "자가-항원 (auto-antigen)"은 본 발명에 따라 면역계에 의해 외래성인 것으로 인식되는 임의의 자기-항원 (self-antigen)을 의미한다. 자가 항원은 세포 단백질, 인산 단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 세포 표면 수용체를 포함한 당단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "자가 면역 질환 (autoimmune disease)"은 자가 면역 반응으로부터 기인하는 장애로 정의된다. 자가 면역 질환은 자기 항원에 대한 부적절하고 과도한 반응의 결과이다. 자가 면역 질환의 예로서 이에 제한되지 않으나, 애디슨 병 (Addison's disease), 원형 탈모증 (alopecia areata), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 자가 면역성 간염 (autoimmune hepatitis), 자가 면역성 이하선염 (autoimmune parotitis), 크론 병, 당뇨병 (유형 I), 부고환염 (epididymitis), 사구체 신염 (glomerulonephritis), 그레이브스 병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 병 (Hashimoto 's disease), 용혈성 빈혈 (hemolytic anemia), 전신 홍반 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris), 건선, 류마티스성 열, 류마티스성 관절염, 유육종증 (sarcoidosis), 피부경화증 (scleroderma), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 척추관절병증 (spondyloarthropathies), 갑상선염, 혈관염 (vasculitis), 백반증 (vitiligo), 점액 부종 (myxedema), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) 등이 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "자가 (autologous)"라는 용어는 추후 개개인에게 재-도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 의미한다.
"동종 이계 (Allogeneic)"는 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 이식편을 가리킨다.
"이종발생성 (Xenogeneic)"은 다른 종의 동물로부터 유래된 이식편을 가리킨다.
용어 "광범위 중화 항체 (broadly neutralizing antibody; bnAb)"는 그 효과를 중화시킴으로써 특정 바이러스의 여러 변종에서 세포를 방어하는 항체를 가리킨다. 일부 실시 양태에서, 광범위 중화 HIV-1 항체 (bnAbs)는 다중 HIV-1 바이러스 균주를 중화시키는 중화 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 비정상 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예로서 이에 제한되지 않으나, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 대장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등이 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "CD4"는 CD4를 코딩하는 핵산 서열의 코돈 최적화를 통해 생성된 CD4의 아미노산 서열을 포함하여, 임의의 공급원으로부터의 CD4를 특정하는 임의의 아미노산 서열을 의미한다. 코돈 최적화는 아미노산 서열에서 코돈을 최적화하도록 고안된 임의의 이용 가능한 기술 및 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor)" 또는 "CAR"은 면역 이펙터 세포에서 발현하도록 조작되고 항원에 특이적으로 결합하는 인공 T 세포 수용체를 말한다. CAR은 입양 세포 전이를 갖는 치료제로 사용될 수 있다. T 세포는 환자에게서 제거되고 그들이 항원의 특정 형태에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형된다. 일부 실시 양태에서, 예를 들어, CAR은 종양 관련 항원에 대한 특이성으로 발현되었다. CAR은 또한 세포내 활성화 도메인, 막 횡단 도메인 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CAR은 막 횡단 및 세포내 도메인에 융합 된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 유래 단일 클론 항체의 융합체를 포함한다. CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드 (예를 들어, 펩티드)로부터 유도될 수 있다. 일부 실시 양태에서, CAR은 HIV 관련 항원에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포의 특이성을 리디렉션 시킴 (redirecting)으로써 HIV 감염 세포를 표적화할 수 있다.
용어 "키메라 세포내 시그널링 분자"는 하나 이상의 보조-자극 분자의 하나 이상의 세포 내 도메인을 포함하는 재조합 수용체를 지칭한다. 키메라 세포내 시그널링 분자는 세포외 도메인을 실질적으로 결여한다. 일부 실시 양태에서, 키메라 세포내 시그널링 분자는 막 횡단 도메인, 검출 가능한 태그, 및 스페이서 도메인과 같은 추가 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형 (conservative sequence modifications)"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 큰 영향을 미치지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존 적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위 특이적 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당 업계에 공지된 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당 업계에 정의되어있다. 이러한 계열에는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루타민산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를들어 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있다. 따라서, 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체는 본 명세서에 기술된 기능적 분석을 사용하여 항원에 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "보조-자극 리간드 (Co-stimulatory ligand)"는 T 세포상의 동족 촉진 분자를 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 (예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등)상의 분자를 포함한다 예를 들어, 펩티드가 로딩된 MHC 분자와의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 부가하여 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는데, 이에 제한되는 것은 아니나, 증식, 활성화, 분화 등을 포함한다. 보조-자극 리간드는 이에 제한되는 것은 아니나, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조-자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 보조-자극 리간드는 또한 그 중에서도 이에 제한되지 않으나 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같은 T 세포 상에 존재하는 보조 자극 분자와 특이 적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"보조-자극 분자"는 보조-자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포상의 동족 결합 파트너를 말하며, 이에 의해 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 증식과 같은 T 세포에 의한 보조-자극 반응을 매개한다. 보조-자극 분자는 이에 제한되지 않으나, TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 일반적인 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 본 명세서에 기재된 다른 보조-자극 분자, 이의 임의의 유도체, 변이체 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 보조-자극 분자의 임의의 합성 서열 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "보조-자극 시그널"은 TCR/CD3 결합과 같은 주요 신호와 결합하여 주요 분자의 T 세포 증식 및/또는 상향 조절 또는 하향 조절을 유도하는 신호를 의미한다.
"세포 독성"또는 "세포 독성의"란 용어는 세포를 죽이거나 손상시키는 것을 의미한다. 하나의 실시 양태에서, 예를 들어, T 세포의 세포 용해 활성 증가와 같이, 변형된 세포의 세포 독성이 개선된다.
"질병"은 동물이 항상성을 유지할 수없는 동물의 건강 상태이며, 질병이 호전되지 않으면 동물의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있는 건강 상태이지만, 동물의 건강 상태는 장애가 없는 경우보다 덜 바람직하다. 치료하지 않고 방치하면 장애가 동물의 건강 상태를 더 이상 감소시키지 않는다.
"유효량"또는 "치료학적 유효량"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하기에 효과적인 본 명세서에 기재된 화합물, 제제, 물질 또는 조성물의 양을 지칭하거나 치료학적 또는 예방적 이점을 제공한다. 이러한 결과는 당 업계에 적합한 임의의 수단에 의해 결정된 바와 같은 항 종양 활성을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"코딩 (encoding)"은 정의된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 그로부터 생기는 생물학적 성질을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대 분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성한다면, 유전자는 단백질을 암호화한다. 그 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하며 일반적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 스트랜드 (coding strand), 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 스트랜드는 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "내인성 (endogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "외인성 (exogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "팽창"은 T 세포의 수의 증가에서처럼 증가하는 것을 의미한다. 하나의 실시 양태에서, 생체 외에서 확대된 T 세포는 배양물에 원래 존재하는 수에 비해 수적으로 증가한다. 다른 실시 양태에서, 생체 외에서 확대된 T 세포는 배양물 내의 다른 세포 유형에 비해 수적으로 증가한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체 외 (ex vivo)"는 생물체 (예를 들어, 인간)로부터 제거되어 생물체 외부로 전파된 세포 (예를 들어, 배양 접시, 시험관 또는 생물 반응기에서)를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현"은 그의 프로모터에 의해 유도된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 말한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함한다; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입시키는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 노출되었거나 또는 리포솜에 함유되어있음) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 당 업계에 공지된 모든 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "인간 면역 결핍 바이러스"또는 "HIV"라는 용어는 HIV-1 및 HIV-2를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 당 업계에 공지되거나 지금까지 알려지지 않은 임의의 HIV 균주 또는 변이체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "상동성 (homologous)"은 2개의 중합체 분자, 예를 들어, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 또는 2개의 폴리펩티드 분자 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서브 유닛 서열 동일성을 나타낸다. 두 분자 모두의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유 될 때; 예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 이들은 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 간의 상동성은 일치 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 2개의 서열에서 위치의 절반 (예를 들어, 중합체 10개 서브유닛 길이의 5개 위치)이 상동이면, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 일치되거나 상동이면, 2개의 서열은 90% 상동이다. 핵산 또는 단백질에 적용되는 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 "상동성"은 약 50% 서열 동일성을 갖는 서열을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 상 동성 서열은 약 75% 이상의 서열 동일성을 가지며, 더욱 더 구체적으로는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는다.
"인간화 (Humanized)" 형태의 비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 부분 서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수혜자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정제하고 최적화하기 위해 만들어졌다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 아미노산 및 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 가변 영역에 상응하는 적어도 하나, 전형적으로 두개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992] 참조.
"완전 인간 (Fully human)"은 전체 분자가 사람 기원이거나 인간 항체 형태와 동일한 아미노산 서열로 구성되는 항체와 같은 면역글로불린을 말한다.
본 명세서에 사용된 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 특히 2개의 폴리펩티드 분자 사이와 같은 2개의 아미노산 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 나타낸다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 분자 각각의 위치가 아르기닌에 의해 점유되면, 그 위치에서 동일하다. 2개의 아미노산 서열이 정렬하여 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 동일성 또는 정도는 종종 퍼센트로 표현된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 일치 또는 동일한 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 두 서열의 위치 중 절반 (예를 들어, 10 아미노산 길이의 중합체에서 5개 위치)이 동일하면, 두 서열은 50% 동일하고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 일치하거나 동일하면, 2개의 아미노산 서열은 90% 동일하다.
"실질적으로 동일한"이란 용어는 기준 아미노산 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 핵산 서열)과 적어도 50%의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 구체적으로는, 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 서열에 대한 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 더욱 구체적으로는 80% 또는 85%, 더욱 더 구체적으로는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
가이드 핵산 서열은 이중 가닥 DNA 표적 부위의 한 가닥 (뉴클레오티드 서열)에 상보적일 수 있다. 가이드 핵산 서열과 표적 서열 사이의 상보성 퍼센트는 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 가이드 핵산 서열은 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 가이드 핵산 서열은 10 내지 40 뉴클레오티드의 인접 스트레치 (contiguous stretch)를 포함한다. 가변 표적 도메인은 DNA 서열, RNA 서열, 변형된 DNA 서열, 변형된 RNA 서열 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형예 참조), 또는 이의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다.
서열 동일성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다 (예를 들어, Genetics Computer Group의 Sequence Analysis 소프트웨어 패키지, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램). 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 그룹 내 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, e-3과 e-100 사이의 확률 스코어와 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질의 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 종종 BCR (B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이 종류의 단백질에 포함된 다섯 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 호흡기 및 비뇨 생식 기관의 타액, 눈물, 모유, 위장 분비액 및 점액 분비물과 같은 신체 분비물에 존재하는 일차 항체이다. IgG는 가장 흔한 순환 항체이다. IgM은 대부분의 대상에서 일차 면역 반응에서 생성되는 주요 면역글로불린이다. 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며 박테리아 및 바이러스 방어에 중요하다. IgD는 알려진 항체 기능이 없는 면역글로불린이지만 항원 수용체 역할을 할 수 있다. IgE는 알레르기 항원에 노출되면 비만 세포와 호염기구에서 중재자가 방출되어 즉각적인 과민 반응을 매개하는 면역 글로불린이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 림프구가 외래 분자로서 항원 분자를 동정하고 항체의 형성을 유도하고/하거나 림프구를 활성화시켜 항원을 제거할 때 발생하는 항원에 대한 세포 반응으로 정의된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "설명 자료 (instructional naterial)"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 출판물, 기록물, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교시 재료는, 예를 들어, 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기 (container)와 함께 수송될 수 있다. 대안으로, 설명 자료는 수령인이 설명자료와 화합물을 협력하여 사용할 수 있도록 용기와 별도로 수송될 수 있다.
"분리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "분리"되지 않지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "분리된다". 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비-자연적 환경에 존재할 수 있다.
"KIR"은 살해 세포 면역글로블린 유사 수용체를 의미하며, KIR은 인간 및 비인간 영장류에서 특징지어졌으며 NK 세포 및 일부 T 세포를 포함하여 특정 서브세트의 림프구에 존재하는 다형성 1형 막 분자이다. KIR은 MHC 클래스 I 분자의 알파 1 및 2 도메인에서 결정 인자와 상호 작용함으로써 NK 세포의 살해 기능을 조절한다. 이러한 상호 작용으로 바이러스 감염 세포나 종양 세포를 검출할 수 있다. 대부분의 KIR은 억제적이며, MHC를 인식함으로써 이들을 발현하는 NK 세포의 세포독성 활성을 억제한다. 제한된 수의 KIR만이 세포를 활성화시킬 수 있다. KIR 유전자 군은 적어도 15 개의 유전자좌 (gene loci) (KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3)와 2개의 가성 유전자 (KIR2DP1 및 KIR3DP1)가 19번 염색체 (19q13.4)에 위치한 백혈구 수용체 복합체 (LRC)의 100-200Kb 영역 내에 존재한다. LRC는 급속하게 진화하는 면역 유전자의 대형, 1 Mb의 조밀한 집단을 구성하며, 특이 Ig와 같은 세포외 영역을 갖는 다른 세포 표면 분자를 부호화하는 유전자를 포함한다. 또한, 확장된 LRC는 막 횡단 어댑터 분자 DAP10 및 DAP12를 코딩하는 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과 (Retroviridae)의 속 (genus)을 의미한다. 렌티바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 중에서 독특하다. 이들은 상당량의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으므로 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체 내에서 상당 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변형된"은 본 발명의 분자 또는 세포의 변화된 상태 또는 구조를 의미한다. 분자는 화학적, 구조적 및 기능적으로 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산의 도입을 통해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물의 부재하에 환자에서의 반응 수준과 비교하여 환자에서의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 중재하는 것을 의미하고, 및/또는 그렇지 않으면 동일하지만 치료되지 않은 피험자에서의 반응의 수준과 비교된다. 상기 용어는 기존 신호 또는 반응에 혼란 및/또는 영향을 미치고, 이에 의해 환자, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 중재하는 것을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 공통적으로 발생하는 핵산 염기에 대한 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신, "C"는 시토신, "G"는 구아노신, "T"는 티미딘, "U"는 우리딘을 의미한다.
달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 퇴행한 버전 (version)이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 절편 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 어떤 버전에서 인트론을 포함할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"이란 용어는 조절 서열과 이종 핵산 서열의 발현을 유도하는 이종 핵산 서열 간의 기능적 연결을 의미한다. 예를 들어, 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능 관계에 놓일 때 제 1 핵산 서열은 제 2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 두개의 단백질 코딩 영역을 동일한 판독 프레임에서 결합시킨다.
"과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"이란 용어는 그 조직 또는 기관으로부터의 정상 세포에서의 발현 수준에 비해 환자의 특정 조직 또는 장기 내의 고형 종양과 같은 질병 영역으로부터의 세포에서 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 나타내는 것을 의도한다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액 학적 악성 종양을 갖는 환자는 당 업계에 공지된 표준 분석에 의해 결정될 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구적" 투여는 예를 들어, 피하 (s.c.), 정맥 내 (i.v.), 근육 내 (i.m.), 또는 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 사슬로서 정의된다. 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호 교환 가능하다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 갖는다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용하여, 그리고 합성 수단에 의해 수행될 수 있는 재조합 라이브러리 또는 세포 유전체로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 이용 가능한 임의의 수단에 의해 수득된 모든 핵산 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드", "폴리펩티드"및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 짧은 사슬을 모두 지칭하며, 펩티드, 올리고 펩티드 및 올리고머, 예를 들어, 일반적으로 당 업계에서 단백질로 지칭되는 긴 사슬 또한 많은 종류가 있으며, 당 업계에서 일반적으로 언급된다. 예를 들어, 생물학적 활성 단편인 "폴리펩티드"는, 실질적으로 동종의 폴리펩티드, 올리고 펩티드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 기계 또는 도입된 합성 기계에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 유전자 생성물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어, 조직 특이적 방법으로 유전자 산물을 발현하는 서열일 수 있다.
"구성적 (constitutive)" 프로모터는 유전자 산물을 암호화 또는 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결될 때 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건 하에서 세포에서 유전자 산물이 생산되도록 하는 염기 서열이다.
"유도성 (inducible)" 프로모터는 유전자 산물을 암호화 또는 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결될 때 프로모터에 상응하는 유도제가 세포 내에 존재할 때만 실질적으로 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 염기 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결되어 유전자에 의해 코딩되거나 특정될 때, 세포가 실질적으로 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 생성물을 세포에서 생성시킨다.
"면역 억제에 대한 내성"이라는 용어는 면역 체계 활동 또는 활성화 억제의 억제 또는 감소된 억제를 의미한다.
"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전송하는 데 중요한 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 간의 생화학적 관계를 나타낸다. "세포 표면 수용체"라는 용어는 세포의 원형질 막을 통해 신호를 전달하고 신호를 전달할 수 있는 분자와 분자의 복합체를 포함한다.
"단일 사슬 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편이 아미노산의 조작된 범위를 통해 Fv 영역에 연결되는 재조합 DNA 기술에 의해 형성된 항체를 지칭한다. 단일 사슬 항체를 생성시키는 다양한 방법이 공지되어 있으며, 이는 하기 기술된 것을 포함한다; U.S. Pat. No. 4,694,778; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041.
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 특정 항원을 인식하지만 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 이종간 반응은 그 자체로 항체의 분류를 구체적으로 바꾸지 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립 형질에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응만으로는 항체의 분류를 구체적으로 변경하지 않는다. 일부 예에서, 용어 "특이적 결합 (specific binding)" 또는 "특이적인 결합 (specifically binding)"은 항체, 단백질 또는 펩티드와 제 2 화학 종의 상호 작용과 관련하여 상호 작용이 화학 종상 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미하기 위해 사용될 수 있다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A (또는 유리된, 비 표지된 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합 된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
"자극"이란 용어는 이에 제한되지 않으나, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달과 같은 신호 전달 사건을 매개하는 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)의 동종 리간드와의 결합에 의해 유도된 일차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-β의 하향 조절 및/또는 세포 골격 구조의 재조직 등과 같은 특정 분자의 변화된 발현을 매개할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자극 분자"는 항원 제공 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포상의 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "자극성 리간드"는 항원 제시 세포 (예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때 동족 결합 파트너 (본 명세서에서 "자극 분자"로 언급됨)와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 의미한다. 따라서 T 세포에 의한 1차 반응을 매개하는데, 이에 한정되지는 않지만 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등이 포함된다. 자극성 리간드는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 특히, 펩티드, 항-CD3 항체, 과작용제 (superagonist) 항-CD28 항체, 및 과작용제 항-CD2 항체가 로딩된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다.
"대상"이란 용어는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유류)를 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "대상" 또는 "환자"는 인간 또는 비인간 포유류일 수 있다. 비인간 포유류는 예를 들어, 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 쥐 포유 동물과 같은 가축 및 애완 동물을 포함한다. 구체적으로는, 환자는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 세포외 도메인이 결여된"은 용어는 세포외로 돌출하는 도메인이 본질적으로 없는 분자를 말한다. 한 실시 양태에서, 키메라 세포내 시그널링 분자는 항원 결합과 같은 세포외 도메인에 의해 수행되는 임의의 기능을 결여한다. 또 다른 실시 양태에서, 키메라 세포내 시그널링 분자는 막 횡단 도메인을 포함하나, 기능적 세포외 도메인이 결여되어있다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 결합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 의미한다. 다른 경우, 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 연관된 세포와 분리된 세포를 의미한다. 일부 실시 양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 다른 실시 양태에서, 세포는 생체 외에서 배양되지 않는다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합하기에 충분한 조건 하에서 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 한정하는 유전체 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원의 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 관여하는 막 단백질의 복합체를 나타낸다. TCR은 주요 조직 적합성 복합체 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 한다. 일부 세포에서는 TCR이 감마 및 델타 (γ/δ) 사슬로 구성되어 있지만 TCR은 알파 (a) 및 베타 (β) 사슬의 이합체로 구성된다. TCR은 구조적으로 유사하지만 독특한 해부학적 위치와 기능을 가지고 있는 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있다. 각 사슬은 두개의 세포외 도메인, 즉 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성된다. 일부 실시 양태에서, TCR은 예를 들어, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 세포상에서 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 상태의 억제, 완화 또는 박멸에 의해 얻어진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질 감염된" 또는 "형질 전환된" 또는 "형질 도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 말한다. "형질 감염된" 또는 "형질 전환된" 또는 "형질 도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질 감염되거나 형질 전환되거나 형질 도입된 세포이다. 세포는 주요 대상 세포와 그 자손을 포함한다.
본 명세서에서 용어로서 질병을 "치료"한다는 것은 환자가 경험하는 질병 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "종양"은 양성, 전 암성, 악성 또는 전이성 일 수 있는 조직의 비정상적인 성장을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "전사 조절하에" 또는 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 세포의 내부에 분리된 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하는 다수의 벡터가 당 업계에 공지되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 핵산의 세포로의 전달을 용이하게 하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포좀 등을 포함하는 것으로 해석되어야한다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
범위: 본 명세서 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양상이 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 형식에서의 설명은 편의상 및 간략화를 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위 및 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 또는 4와 같은 하위 범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 하며, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6과 같은 해당 범위 내의 개별 숫자를 의미할 수 있다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
기술
본 발명은 CD4 막-결합 키메라 수용체 또는 HIV 특이적 scFV 키메라 항원 수용체 (CARs)를 사용하여 HIV 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명에 따르면, T-세포는 HIV 감염 세포를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 CD4 또는 scFV의 단편을 발현시킴으로써 양자 택일 T 세포 요법을 위해 변형된다. 본 발명의 변형된 T 세포는 HIV 감염 세포에 특이적이고 향상된 세포 독성 및 HIV 감염에 대한 효능을 갖는다.
HIV 특이적 CD4 막-결합 키메라 수용체
본 발명은 CD4 도메인, 특히 HIV 비리온 또는 HIV 감염 세포에 특이적으로 결합하는 CD4 세포외 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 CD4 막-결합 키메라 수용체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 특정 아미노산 서열 또는 펩티드와 같은 특정 구조적 특징을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 수용체를 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명의 막-결합 키메라 수용체는 예를 들어, 면역 요법으로 사용하기 위해 환자를 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 관련 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하며, CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 코딩하는 분리된 아미노산 서열을 포함하며, CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있다.
하나의 실시 양태에서, CD4 세포외 도메인은 서열번호 3, 46 또는 64를 포함하고, 막 횡단 도메인은 CD8 알파 힌지 (서열번호 4, 47 또는 65), 및 CD8알파 막 횡단 도메인 (서열번호 5, 48 또는 66) 및 CD28 막 횡단 도메인 (서열번호 8, 49 또는 67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 포함하는 막 횡단 도메인을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 CD3 제타 시그널링 도메인 (서열번호 6, 51 또는 68)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 보조 자극 시그널링 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원 -1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 보조 자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 보조 자극 시그널링 영역 CD28 (서열번호 9, 49 또는 67)이 구조체 내에 존재한다. 추가의 실시 양태에서, CD4 세포외 도메인은 HIV 엔벨로프 (Env) 당 단백질에 특이적으로 결합한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 진핵 세포 신장 인자 (EF1α) 프로모터, CD4 세포외 도메인, CD8 알파 힌지, CD8 알파 막 횡단 도메인 및 CD3 제타 시그널링 도메인 (서열번호 1)을 포함하는 벡터를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 EF1α 프로모터, CD4 세포외 도메인, CD8 알파 힌지, CD28 막 횡단 도메인, CD28 보조 자극 도메인 및 CD3 제타 시그널링 도메인 (서열번호 7)을 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있으며, 상기 벡터는 서열번호 44, 45, 62 및 63으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, 막-결합 키메라 수용체는 서열번호 30, 32 또는 64의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 다른 실시 양태에서, 막-결합 키메라 수용체는 서열번호 31, 33 또는 46의 아미노산 서열을 갖는다.
CD4 세포외 도메인
CD4는 면역글로불린 상과 (superfamily)의 구성원이며 4개의 세포외 면역글로불린 도메인 (D1 내지 D4)을 포함한다. D1 및 D3는 면역글로불린 가변 도메인과 유사하고 D2 및 D4는 면역글로불린 불변 도메인과 유사하다. D1에는 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II 분자의 베타 2-마이크로글로불린과 상호 작용하는 CD4 영역이 포함된다.
하나의 실시 양태에서, 막-결합 키메라 수용체는 CD4 또는 그의 단편의 세포외 도메인을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 막-결합 키메라 수용체는 CD4의 적어도 하나의 면역 글로불린 도메인을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, CD4 세포외 도메인은 서열번호 3 또는 64를 포함한다.
본 명세서에 기술된 CD4 세포외 도메인, 예를 들어, CD4의 적어도 하나의 면역글로불린 도메인 또는 서열번호 3 또는 64를 포함하는 CD4 세포외 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 막 횡단 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 시그널링 도메인, 또는 막-결합 키메라 수용체에 포함될 수 있는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 도메인을 포함한다.
막 횡단 도메인
하나의 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD4 키메라 항원 수용체 구조체 내의 도메인 중 하나와 관련된다. 일부 경우에, 막 횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막 횡단 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막 횡단 도메인은 천연 또는 합성 소스로부터 유도될 수 있다. 상기 소스이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막 횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 특정 용도의 막 횡단 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 막 횡단 영역을 포함한다). 어떤 경우에는 인간 Ig (면역글로불린) 힌지를 포함하여 다양한 인간 힌지를 사용할 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD8 알파 힌지 및 막 횡단 도메인을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD8 알파 막 횡단 도메인 (서열번호 5 또는 66)을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD28 막 횡단 도메인 (서열번호 8 또는 67)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD8 알파 힌지 (서열번호 4 또는 65)와 같은 힌지 도메인을 포함한다. 막 횡단 도메인은 임의의 힌지 도메인과 조합될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 하나 이상의 막 횡단 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 적어도 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154의 막 횡단 영역과 같은 막 횡단 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 CD4 세포외 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 시그널링 도메인 또는 본 명세서에 기재된 막-결합 키메라 수용체에 존재하는 임의의 도메인과 조합할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이러한 경우 그것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 바람직하게는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막 변이 도메인의 각 말단에 존재한다. 선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10 개의 아미노산 길이가 막 횡단 도메인 및 세포질 시그널링 도메인 사이의 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿(doublet)은 특히 적합한 링커를 제공한다.
시그널링 도메인
시그널링 도메인 또는 세포내 시그널링 도메인은 CD4 키메라 항원 수용체 구조체가 발현되는 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. "이펙터 기능"이란 용어는 세포의 특수 기능을 의미한다. 예를 들어, T 세포의 작용 인자 기능은 세포 용해 활성 또는 사이토카인 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 시그널링 도메인" 또는 "시그널링 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 시그널링 도메인을 사용할 수 있지만, 대부분의 경우 전체 분자를 사용할 필요는 없다. 시그널링 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도까지, 상기 절단된 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 시그널링 도메인이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 시그널링 도메인의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하기 위한 시그널링 도메인의 예는 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열 및 항원 수용체 결합 후 시그널링을 개시하기 위해 함께 작용하는 보조 수용체, 및 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 동일한 기능적 역량을 갖는 합성 서열을 포함한다.
TCR만으로 생성된 신호는 T 세포의 완전 활성화에 불충분하며 2차 또는 보조-자극 신호가 또한 필요하다는 것이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 시그널링 서열의 2개의 별개의 부류, 즉 TCR (1차 세포질 시그널링 서열)을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하고, 항원-독립적인 방식으로 작용하여 2차 또는 보조 자극 신호 (2차 세포질 시그널링 서열)를 제공한다.
1차 세포질 시그널링 서열은 TCR 복합체의 일차적 활성화를 자극적인 방식으로 또는 억제적인 방식으로 조절한다. 자극적인 방식으로 작용하는 1차 세포질 시그널링 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성 모티프 또는 ITAM으로 알려진 시그널 모티프를 포함할 수 있다.
본 발명에서 특히 사용되는 일차 세포질 시그널링 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 본 발명의 면역 수용체에서 세포질 신호 분자는 CD3-제타로부터 유래된 세포질 시그널링 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 실시 양태에서, CD4 키메라 항원 수용체 구조체의 시그널링 도메인은 CD3-제타 시그널링 도메인을 단독으로 또는 면역수용체와 관련하여 유용한 임의의 다른 바람직한 시그널링 도메인과 조합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 면역 수용체의 시그널링 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 보조 자극 시그널링 영역을 포함할 수 있다. 보조 자극 시그널링 영역은 보조 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 면역수용체의 일부를 나타낸다. 보조 자극 분자는 항원 수용체 또는 그 리간드가 아닌 세포 표면 분자로서 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요하다. 이러한 분자의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), DAP12, OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 항원 -1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 따라서, 본 발명은 주로 보조-자극 시그널링 요소로서 CD28로 예시되지만, 다른 보조 자극 요소도 본 발명의 범위 내에 있다.
하나의 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 CD3 제타 시그널링 도메인 (서열번호 6, 51 또는 68)을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 CD4 CD28 제타 (서열번호 7 또는 62)를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 CD28 보조 자극 도메인 (서열번호 9 또는 67)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 CD4 4-1BB 보조 자극 도메인 (서열번호 63)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 4-1BB (CD137) 보조 자극 도메인 (서열번호 69)을 포함한다. 상기 시그널링 도메인은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 시그널링 도메인을 포함할 수 있다.
TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), DAP12, OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 세포질 시그널링 서열과 같은 본 명세서에 기재된 시그널링 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 CD4 세포외 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 막 횡단 도메인, 또는 본 명세서에 기재된 막-결합 키메라 수용체에 포함될 수 있는 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
키메라 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor; CAR)
이론에 얽매이지 않기를 바라며, HIV를 표적으로하는 CAR의 사용은 항-IGF scFv를 포함하는 CAR이 HIV-감염 세포의 비축 집단을 갖는 대상의 치료에 유익할 것이라는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 하나의 양태로서 이러한 용도를 위한 CAR을 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, T 세포는 CAR을 그 안에 발현함으로써 생성된다. 따라서, 본 발명은 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항-HIV 항체를 코딩하는 scFv), 막 횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 CAR 및 CAR을 코딩하는 핵산 구조체을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 변형된 세포를 포함하며, 여기서 CAR은 항-자극 분자의 항원 결합 도메인, 막 횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함하고, 상기 세포는 표적 이펙터 활성을 갖는 T 세포이다. 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 세포를 포함하며, 상기 핵산 서열은 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 막 횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열 및 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 세포는 CAR을 발현하고 표적화된 이펙터 활성 (예를 들어, 표적화된 세포 독성 및 항원 제시)을 보유하는 T 세포이다. 하나의 실시 양태에서, 표적 이펙터 활성은 CAR의 항원 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 표적 세포상의 항원에 대한 것이다. 하나의 양태에서, 표적 항원은 HIV 특이적 항원이고, CAR은 항-HIV 항체 또는 그의 단편을 포함하는 HIV 특이적 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, CAR은 서열번호 10, 14, 18, 22, 26, 34, 70 내지 73 및 74로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩된다. 다른 실시 양태에서, CAR은 서열번호 11, 15, 19, 23, 27, 35, 52 내지 55, 또는 56의 아미노산 서열을 갖는다.
항원 결합 도메인
하나의 실시 양태에서, 본 발명의 항원 결합 도메인은 HIV 엔벨로프 당 단백질 (Env) (예를 들어, gp120) 및/또는 HIV 감염 세포와 같은 HIV 비리온에 결합하는 HIV 특이적 결합 도메인을 포함한다. 항원으로 작용할 수 있는 다른 세포 표면 마커의 예로는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가 면역 질환 및 암 세포와 관련된 것들이 있다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 항원 결합 도메인은 scFv 항체와 같은 HIV 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 HIV 단백질, 예를 들어, HIV Env에 결합하는 scFv 항체이다. 유용한 특이적 scFv는 도 4a, 도 8, 도 18 및 도 19에 나타내었다 (서열번호 11, 12, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 57 내지 61, 75 내지 78 또는 79).
항원 결합 도메인의 선택은 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원의 유형 및 수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포상의 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다.
항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함할 수 있으며, 단클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 비인간 항체 및 이의 임의의 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 하나의 실시 양태에서, 항원 결합 도메인 부분은 포유류 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 실시 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 항-HIV 항체 및 그의 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 항원 결합 도메인이 CAR이 궁극적으로 사용되는 동일한 종으로부터 유도되는 것은 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인이 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 인간 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
항원 결합 도메인이 세포 내에서의 발현을 위해 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 막 횡단 도메인 또는 세포내 도메인과 같은 CAR의 다른 도메인에 작동 가능하게 연결되는 것이 또한 유익하다. 하나의 실시 양태에서, 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 막 횡단 도메인을 코딩하는 핵산 및 세포내 도메인을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다.
HIV 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편과 같은 본 명세서에 기술된 항원 결합 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 막 횡단 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 세포내 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 본 명세서에 기재된 CAR에 포함될 수 있는 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
막 횡단 도메인
막 횡단 도메인과 관련하여, CAR (또는 막-결합 키메라 수용체 구조체)은 CAR의 항원 결합 도메인을 세포내 도메인에 연결시키는 막 횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 자연적으로 CAR의 하나 이상의 도메인과 결합한다. 일부 경우에, 막 횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막 횡단 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
막 횡단 도메인은 천연 또는 합성 소스으로부터 유도될 수 있다. 소스가 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막 횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 막 횡단 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, and TLR9로부터 유래된 것일 수 있다 (즉, 적어도 상기 막 횡단 영역을 포함한다). 어떤 경우에는 Ig (면역글로불린) 힌지를 포함하여 다양한 힌지를 사용할 수 있다.
하나의 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD8 알파 막 횡단 도메인 (서열번호 5, 48, 66)을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD28 막 횡단 도메인 (서열번호 8, 49 및 67)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 CD8 알파 힌지 (서열번호 4, 47 및 65)와 같은 힌지 도메인을 포함한다. 막 횡단 도메인은 임의의 힌지 도메인과 조합될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 하나 이상의 막 횡단 도메인을 포함할 수 있다.
T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 및 TLR9의 막 횡단 영역과 같은, 본 명세서에 기재된 막 횡단 도메인은, 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 세포내 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 CAR에 포함될 수 있는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
하나의 실시 양태에서, 막 횡단 도메인은 합성일 수 있고, 이러한 경우 그것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막 횡단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
세포내 도메인
세포내 도메인 또는 CAR (또는 막-결합 키메라 수용체 구조체)의 세포질 도메인은 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 키메라 세포내 시그널링 분자와 유사하거나 동일한 세포내 도메인을 포함하고, 이는 CAR이 발현에 대한 상기 세포의 활성화의 원인이 된다.
하나의 실시 양태에서, CAR의 세포내 도메인은 신호 활성화 및/또는 형질 도입을 담당하는 도메인을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 세포내 도메인의 예로는 이에 제한되지 않으나, 표면 수용체의 세포질 부분, 보조-자극 분자, 및 T 세포에서 시그널링을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 임의의 분자뿐만 아니라 이들 요소의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 역량을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
세포내 도메인의 예는 하나 이상의 분자 또는 수용체로부터의 단편 또는 도메인을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니나, TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 통상적인 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, a KIR 패밀리 단백질, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 본 명세서에 기재된 다른 보조-자극 분자, 임의의 유도체, 변이체, 또는 이의 단편, 동일한 기능적 역량을 가진 보조-자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이의 조합을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, CAR의 세포내 도메인은 CD3, CD8, CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, PD-1, 이의 임의의 유도체 또는 변이체, 동일한 기능적 역량을 갖는 이의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합으로부터 적어도 하나의 시그널링 도메인과 같은 하나 이상의 보조-자극 분자의 부분을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타 시그널링 도메인 (서열번호 6, 51 또는 68)을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 세포내 도메인은 CD4 CD28 제타 (서열번호 7 또는 62)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 세포내 도메인은 CD28 보조 자극 도메인 (서열번호 9 또는 67)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 CD4 4-1BB 보조 자극 도메인 (서열번호 63)을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 시그널링 도메인은 4-1BB (CD137) 보조 자극 도메인 (서열번호 69)을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 세포내 도메인은 DAP12 도메인을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 세포내 도메인은 KIR 도메인을 포함한다. 상기 세포내 도메인은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 통상적인 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, a KIR 패밀리 단백질, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 또는 다른 보조-자극 분자 유래 단편 또는 도메인과 같은 본 명세서에 기재된 세포내 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 막 횡단 도메인 또는 CAR에 포함될 수 있는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
CAR의 항원 결합 도메인과 막 횡단 도메인 사이 또는 CAR의 세포내 도메인과 막 횡단 도메인 사이에는 스페이서 도메인이 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 항원 결합 도메인 또는 폴리펩티드 사슬의 세포 내 도메인 중 어느 하나에 막 횡단 도메인을 연결시키는데 작용하는 임의의 올리고 또는 폴리펩티드를 의미한다. 하나의 실시 양태에서, 스페이서 도메인은 300개 이하의 아미노산, 구체적으로는 10 내지 100개의 아미노산 및 더욱 구체적으로는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 구체적으로는 2 내지 10개의 아미노산 길이는 막 횡단 도메인과 CAR의 세포내 도메인 사이의 결합을 형성할 수 있다. 링커의 예로는 글리신-세린 더블릿을 포함한다.
인간 항체
CAR의 항원 결합 도메인을 사용할 때 인간 항체 또는 그의 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 완전한 인간 항체는 인간 피험자의 치료학적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이들 기술에 대한 개선을 포함한다. 또한, 미국 특허 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741; 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 형질 전환 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 대안으로, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 비 기능성이 될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형 접합 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다고 기재되어 있다. 수정된 배아 줄기 세포를 확대 배양기에 미세주입 (microinject)하여 키메라 마우스를 생산한다. 그런 다음, 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형 접합 자손을 생산한다. 형질 전환 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 정상적인 방식으로 면역화시킨다. 통상적인 하이브리도마 (hybridoma) 기술을 사용하여 면역화된 형질 전환 마우스로부터 원하는 표적에 대한 항체를 수득할 수 있다. 형질 전환 마우스가 보유하고 있는 인간 면역글로불린 형질 전환 유전자는 B 세포 분화 동안 재배열하고, 이어서 계급 전환 및 체세포 변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, IgG1 (감마 1) 및 IgG3를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체 생산을 위한 이 기술의 개요는 Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995))를 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론 항체를 생산하는 기술 및 그러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 상세한 설명은 예를 들어 PCT 공보 WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 및 5,939,598에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 또한 Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) 및 Genpharm (San Jose, Calif.)과 같은 회사는 위에서 설명한 기술과 유사한 기술을 사용하여 선택한 항원에 대한 인간 항체를 제공할 수 있다. 항원 문제시 인간 항체의 생성을 초래할 수 있는 생식선 돌연변이 마우스에서의 인간 생식계 면역글로불린 유전자 어레이의 전달에 대한 구체적인 논의는 예를 들어 문헌 Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); 및 Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992)에 기재되어있다.
인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (Hoogenboom 등, J. Mol. Biol., 227:381 (1991), Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). ); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)]. 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 생체 외에서 생산하는데 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990))을 사용할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 섬유상 (filamentous) 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 중 하나에 프레임 내 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 표시된다. 섬유상 입자가 파지 유전체의 단일 가닥 DNA 복제물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 초래한다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 그들의 검토를 위해, 예를 들어 Johnson, Kevin S 및 Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993) 참조. V-유전자 단편의 여러 소스가 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)은 면역되지 않은 마우스의 비장에서 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체를 분리하였다. 면역되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 항원 (자가 항원을 포함함)에 대한 항체는 본질적으로 Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) 또는 Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993) 참조. 또한, 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905에 기재되어 있으며, 이들 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
인체 항체는 또한 시험관 내 활성화된 B 세포 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조, 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다)에 의해 생성될 수 있다. 인간 항체는 또한 시험관 내에서 이에 제한되지 않으나, Roder et al. (Methods Enzymol., 121:140-167 (1986))와 같은 하이브리도마 기술에 의해 생성될 수 있다.
인간화 항체
대안적으로, 일부 실시 양태에서, 비인간 항체는 인간화될 수 있으며, 여기서 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생산되는 항체와의 유사성을 증가시키도록 변형된다. 예를 들어, 본 발명에서, 항체 또는 그의 단편은 비-인간 포유 동물 scFv를 포함할 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 항원 결합 도메인 부분은 인간화된다.
인간화 항체는 당 업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있는데, 이에 제한되지 않으나, CDR 그래프트 (예를 들어, 유럽 특허 EP 239,400; PCT 특허 WO 91/09967; 및 미국 특허 5,225,539, 5,530,101 및 5,585,089; 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다), 베니어링 (veneering) 또는 리서페이싱 (resurfacing) (예를 들어, 유럽 특허 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology,28(4/5):489-498, Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814 및 Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다), 체인 셔플링 (chain fuffling) (예를 들어, 미국 특허 제 5,565,332 호 참조; 이는 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다) 및 예를 들어, 미국 공개 특허 US2005/0042664, 미국 공개 특허 US2005/0048617, 미국 특허 6,407,213, 미국 특허 5,766,886, PCT 특허 WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), and Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)에 개시된 기술들이 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다. 종종, 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시키기 위해 CDR 공여자 항체 (donor antibody)로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 프레임워크 치환은 당 업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호 작용을 모델링하여 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기 및 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. (예를 들어, Queen et al., 미국 특허 5,585,089; 및 Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323 참조, 이들은 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다).
인간화 항체는 비인간 원천으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트 (import)" 잔기로 지칭되며, 이는 일반적으로 "임포트" 가변 영역에서 취해진다. 따라서, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린 분자로부터의 하나 이상의 CDR 및 인간으로부터의 프레임워크 영역을 포함한다. 항체의 인간화가 당 업계에 공지되어 있으며, 본질적으로 예를 들어, CDR-그래프트 (EP 239,400; PCT 특허 WO 91/09967; 및 미국 특허 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640, 이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다)와 같이 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써, 윈터 및 동료 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))의 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 인간화 키메라 항체에서, 실질적인 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 것은 비인간 동물 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능한 일부 프레임워크 (FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 항체의 인간화는 또한 베니어링 (veneering) 또는 리서페이싱 (resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) 또는 체인 셔플링 (미국 특허 5,565,332)에 의해 달성될 수 있으며, 상기 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
인간화 항체를 만드는데 사용되는, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 것이다. 소위 "최적" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 알려진 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 인간 서열과 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로 받아들여진다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), 상기 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇몇 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992), Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993) 상기 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다).
항체는 표적 항원 및 다른 바람직한 생물학적 성질에 대한 높은 친화성을 유지하면서 인간화될 수 있다. 본 발명의 일면에 따라, 인간화 항체는 부모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능, 즉 표적 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석에서 잔기의 가능한 역할의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용체 및 임포트 서열로부터 선택되고 결합되어 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성이 달성될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미친다.
인간화 항체는 원래 항체와 유사한 항원 특이성을 유지한다. 그러나, 특정 인간화 방법을 사용하여, 항체가 표적 항원에 결합하는 친화도 및/또는 특이성은 Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999)에 의해 기술된 바와 같은 "방향 진화 (directed evolution)"의 방법을 사용하여 증가될 수 있으며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다
벡터
본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 키메라 세포내 시그널링 분자 또는 CAR을 T 세포 내로 도입시키기 위해 벡터를 사용할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 키메라 세포내 시그널링을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 하나의 실시 양태에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 레트로트랜스포존 (retrotransposon) (예를 들어, 피기백 (piggyback), 슬리핑 뷰티 (sleeping beauty)), 부위 특이적 삽입 벡터 (예를 들어, CRISPR, ZN 핑거 핵산 효소, TALEN) 또는 자살 발현 벡터, 또는 당 업계에 공지된 벡터를 포함한다.
위에 언급된 모든 구조체는 3세대 렌티바이러스 벡터 플라스미드, 다른 바이러스 벡터 또는 인간 세포에서의 사용이 승인된 RNA와 함께 사용할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 다른 양태에서, 상기 벡터는 RNA 벡터이다.
본 명세서에 기재된 임의의 분자의 생산은 시퀀싱 (sequencing)에 의해 입증될 수 있다. 전장 단백질 (full length protein)의 발현은 면역블롯 (immunoblot), 면역조직화학법 (immunohistochemistry), 유세포 분석 또는 당 업계에 널리 공지된 다른 기술을 사용하여 검증할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터를 포함하는 벡터는 도입 유전자의 장기간 안정된 통합 및 딸세포에서의 전파를 허용하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하기 위한 적절한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비-증식 세포를 형질 도입할 수 있다는 점에서 마우스 백혈병 바이러스와 같은 온코-레트로바이러스 (onco-retrovirus)로부터 유래된 벡터에 비해 부가적인 이점을 갖는다. 그들은 또한 그들이 도입되는 대상에서 낮은 면역원성을 초래한다는 부가적인 이점을 갖는다.
천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 핵산 또는 그의 일부를 프로모터에 작동 가능하게 연결시키고 발현 벡터 내로 구조체를 도입시킴으로써 달성된다. 벡터는 일반적으로 포유 동물 세포에서 복제할 수 있는 벡터 및/또는 포유류의 세포 유전체에 통합될 수 있는 벡터이다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다.
발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1 내지 4권, Cold Spring Harbor Press, NY), 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 하나 이상의 유기체에서 기능하는 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 효소 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 6,326,193).
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서 (enhancer)는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 하류에 기능적 요소를 포함하는 것으로 최근에 밝혀졌지만, 개시 부위의 상류 30 내지 110bp 영역에 위치한다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 유연하기 때문에 요소가 서로 반전되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나아제 (thymidine kinase; tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성의 감소가 시작하기 전에 50bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 것으로 보인다.
프로모터의 예는 전초기 (immediate early) 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강한 구성적인 프로모터 서열이다. 그러나, 시미언 바이러스 40 (simian virus 40; SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 (avian leukemia virus) 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) 전초기 프로모터, 루스 육종 바이러스 프로모터, EF-1 알파 프로모터 및 인간 유전자 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나아제 프로모터를 포함한다. 또한, 본 발명은 구성형 프로모터의 사용에 제한되지 않아야한다. 유도성 프로모터 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 그러한 발현이 요구될 때 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는 분자 스위치를 제공하거나, 발현이 바람직하지 않을 때 발현을 차단할 수 있다. 유도 성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 (metallothionine) 프로모터, 글루코코르티코이드 (glucocorticoid) 프로모터, 프로게스테론 (progesterone) 프로모터 및 테트라사이클린 (tetracycline) 프로모터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리펩티드 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘다를 포함하여 바이러스 벡터를 통해 형질 감염되거나 감염될 수 있는 탐색하고자 하는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 동정 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 마커는 별도의 DNA 단편 상에 보유될 수 있고, 동시 형질 감염 과정에서 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두는 숙주 세포에서 발현할 수 있도록 적절한 조절 서열을 가질 수 있다. 유용한 선별 마커는 예를 들어 네오 (neo) 등의 항생제 내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질 감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수혜 생물체 또는 조직에 존재하지 않거나 발현되지 않고 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수혜 세포에 도입된 후 적당한 시간에 평가된다. 적절한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비 알칼리 포스파타제 (secreted alkaline phosphatase) 또는 녹색 형광 단백질 유전자 (예를 들어, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479:79-82)를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 공지되어 있고 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 구조체가 프로모터로 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있으며 프로모터-주도 전사를 조절하는 능력에 대한 제제를 평가하는데 이용될 수 있다.
핵산의 도입
키메라 세포내 시그널링 분자 또는 CAR과 같은 유전자를 세포 내로 도입 및 발현시키는 방법은 당 업계에 공지되어있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 세균, 효모 또는 곤충 세포 내로 당 업계의 임의의 방법으로 용이하게 도입될 수있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키는 물리적 방법은 인산 칼슘 침전 (calcium phosphate precipitation), 리포펙션 (lipofection), 유전자 총법 (particle bombardment), 미세주입 (microinjection), 전기천공법 (electroporation) 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당 업계에 잘 알려져있다. 예를 들어 Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1-4 권, Cold Spring Harbor Press, NY). 핵산은 전기천공법 (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, MA) 또는 Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 표적 세포로 도입될 수 있다. 리포펙션 (lipofection)을 이용한 양이온성 리포좀 매개 형질 감염, 중합체 캡슐화 (polymer encapsulation) 사용, 펩티드 매개 형질 감염 (peptide mediated transfection) 사용, 또는 "유전자 총 (gene gun)" (예를 들어, Nishikawa, et al., Hum Gene Ther., 12 (8):861-70 (2001) 참조)과 같은 생물학적 입자 전달 시스템을 사용하여 세포 내로 핵산을 도입할 수 있다.
해당 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. RNA 벡터는 RNA 전사체의 생성을 위한 RNA 프로모터 및/또는 기타 관련 도메인을 갖는 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터 및 특히 레트로바이러스 벡터는 인간 세포와 같은 포유류 세포에 유전자를 삽입하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,350,674 및 5,585,362 참조.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 거대 분자 복합체 (macromolecule complex), 나노 캡슐 (nanocapsule), 미소구 (microsphere), 비드 (bead) 및 수중유 에멀젼 (oil-in-water emulsion), 미셀 (micelle), 혼합된 미셀 (mixed micelle) 및 리포좀을 포함하는 지질 기반 시스템과 같은 콜로이드성 분산 시스템을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클 (delivery vehicle)로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 계는 리포좀 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스성 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제제의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo) 또는 생체 내 (in vivo))에 대해 고려된다. 다른 측면에서, 핵산은 지질과 결합할 수 있다. 지질과 관련된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화될 수 있고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되어 있으며, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 모두와 관련된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되어 리포솜에 포획될 수 있고, 리포좀과 착화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질 중 현탁액으로서 포함되거나, 미셀과 포함 또는 복합체화되거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 결합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터와 관련된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조, 미셀 또는 "붕괴된 (collapsed)" 구조로 존재할 수 있다. 그것들은 단순히 용액에 흩어져 있어 크기나 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수도 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방성 물질이다. 예를 들어, 지질은 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드와 같은 긴-사슬 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물의 종류뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 방울을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO에서 얻을 수 있다; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, NY)에서 얻을 수 있다; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수 있다; 디미스트릴 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)로부터 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에 있는 지질의 저장 용액은 약 -20℃에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 손쉽게 증발되기 때문에 유일한 용매로 사용된다. "리포솜"은 밀폐된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특징될 수 있다. 다중층 리포좀은 수성 매질로 분리된 다중 지질층을 갖는다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 그들은 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조가 형성되기 전에 자기 재배치 (self-rearrangement)를 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용질을 포획한다 (Ghosh 등, 1991 Glycobiology 5:505-10). 그러나, 정상적인 소낭 구조보다 용액에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취하거나 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
숙주 세포 내로 핵산의 존재를 확인하기 위해, 외래 핵산을 숙주 세포에 도입하거나 또는 본 명세서에 기재된 분자에 세포를 노출시키는 것에 사용되는 방법에 관계없이, 다양한 분석을 수행할 수 있다. 이러한 검정법은 예를 들어, 서던 (Southern) 및 노던 블롯 (Northern blotting), RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 공지된 "분자 생물학적" 검정; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범위에 속하는 약제를 동정하기 위해 본 명세서에 기술된 분석에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 분석을 포함한다.
일 구현 예에서, 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 하나 이상의 핵산 서열은 세포 집단을 형질 도입하고, 세포 집단을 형질 감염시키고, 세포 집단을 전기천공하는 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 방법에 의해 도입된다. 하나의 실시 양태에서, 세포 집단은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, 세포 내로 도입된 핵산은 RNA이다. 다른 구현 예에서, RNA는 시험관 내 전사 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 mRNA이다. RNA는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 생성 템플릿을 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생성된다. 임의의 원천에서 유래된 관심 DNA는 적절한 프라이머와 RNA 중합 효소를 사용하여 시험관 내 mRNA 합성을 위한 주형으로 PCR에 의해 직접 변환될 수 있다. DNA의 원천은 예를 들어, 유전체 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관 내 전사를 위한 바람직한 주형은 키메라 세포내 시그널링 분자이다.
PCR은 세포 내로 도입된 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 생성하는데 사용될 수 있다. PCR을 수행하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. PCR에서 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로 사용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 중 염기의 다수 또는 전부가 상보적이거나 또는 하나 이상의 염기가 상보적이지 않거나 미스매치된 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR에 사용되는 어닐링 (annealing) 조건 하에서 목적하는 DNA 표적과 어닐링되거나 하이브리드화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적인 것으로 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하여 일반적으로 세포에서 전사되는 유전자 부분 (오픈 리딩 프레임 (open reading frame))을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정 관심 도메인을 코딩하는 유전자의 일부를 증폭하도록 설계될 수 있다. 일면으로, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭시키도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당 업계에 공지된 합성 방법에 의해 생성된다. "순방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형상의 뉴클레오티드와 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 암호 가닥과 관련하여 증폭될 DNA 서열에 5 위치를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류에 있는 이중 가닥 DNA 주형과 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 암호 가닥과 관련하여 증폭될 DNA 서열에 3' 위치를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증진시키는 능력을 갖는 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 구현 예에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 3000인 뉴클레오티드다. 코딩 영역에 첨가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR 용 프라이머를 디자인하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질 감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대해 자연 발생적이고 내인성인 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안으로, 목적 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 순방향 및 역방향 프라이머에 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 목적 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다는 것이 공지되어있다. 따라서, 3' UTR은 당 업계에 잘 공지된 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 디자인될 수 있다.
하나의 실시 양태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작 서열 (Kozak sequence)을 포함할 수 있다. 대안으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 전술한 바와 같이 PCR에 의해 첨가될 때, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열을 첨가함으로써 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 높일 수 있지만 모든 RNA가 효율적인 번역을 수행하는 것에 필요하지는 않다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열에 대한 요건은 당 업계에 공지되어있다. 다른 실시 양태에서, 5' UTR은 그의 RNA 유전체가 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 3' 또는 5' UTR에서 사용될 수 있다.
유전자 복제를 필요로 하지 않고 DNA 주형으로부터 RNA 합성을 가능하게 하기 위해서는, 전사의 프로모터가 전사될 서열의 상류에 있는 DNA 주형에 부착되어야한다. RNA 폴리머라제의 프로모터로서 기능하는 서열이 순방향 프라이머의 5' 말단에 첨가될 때, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사될 오픈 리딩 프레임의 상류에서 PCR 산물로 혼입된다. 하나의 실시 양태에서, 프로모터는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 당 업계에 공지되어있다.
하나의 실시 양태에서, mRNA는 세포 내에서 리보솜 결합, 번역 및 안정성 mRNA의 개시를 결정하는 5' 말단의 캡과 3' 폴리(A) 꼬리 모두를 갖는다. 원형 DNA 주형 (예를 들어, 플라스미드 DNA)에서 RNA 중합 효소는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 결합체를 생산한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사후 폴리아데닐화 되더라도 진핵 생물 형질 전환에는 효과가 없는 정상 크기의 mRNA를 생성한다.
선형 DNA 주형에서, 파지 T7 RNA 중합 효소는 주형의 마지막 염기를 넘어서 전사체의 3' 말단을 연장시킬 수 있다 (Schenborn 및 Mierendorf, Nuc Acids Res., 13 : 6223-36 (1985), Nacheva 및 Berzal-Herranz , Eur.J.Biochem., 270 : 1485-65 (2003).
polyA/T 스트레치를 DNA 주형으로 통합하는 기존의 방법은 분자 클로닝 (molecular cloning)이다. 그러나 플라스미드 DNA에 통합된 폴리 A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 야기할 수 있는데, 이는 박테리아 세포로부터 얻어진 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 기타 수차로 매우 오염되어있는 이유이다. 이로 인해 복제 절차가 힘들뿐만 아니라 시간이 오래 걸리지만 신뢰할 수 없는 경우가 있다. 이는 DNA 복제를 하지 않고도 polyA/T 3' 스트레치로 DNA 주형을 만들 수 있는 방법을 사용하는 이유이다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 100T 꼬리 (크기는 50-5000T일 수 있음)와 같은 폴리T 꼬리를 포함하는 역방향 프라이머를 사용하거나 PCR을 포함한 임의의 다른 방법에 의한 PCR 후에 PCR 동안 생산될 수 있지만 DNA 결찰 또는 시험관 내 재조합에 제한되지 않는다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고 RNA 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관 관계가 있다. 하나의 실시 양태에서, 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 대장균 폴리A 폴리머라제 (E-PAP)와 같은 폴리(A) 폴리머라제의 사용으로 시험관 전사에 이어서 추가로 연장될 수 있다. 일 구현 예에서, 폴리뉴클레오티드 (A) 꼬리의 길이를 100 뉴클레오티드에서 300 내지 400 뉴클레오티드로 증가시키면 RNA의 번역 효율이 약 2배 증가한다. 또한, 3' 말단에 다른 화학 그룹을 붙이면 mRNA 안정성이 증가할 수 있다. 이러한 부착은 개질된/인공적인 뉴클레오티드, 압타머 및 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 더욱 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당 업계에 공지되고 본 명세서에 기술된 기술을 사용하여 제공된다 (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001), Stepinski 등, RNA, 7:1468-95 (2001), Elango, et al., Biochim.Biophys.Res.Commun., 330 : 958-966 (2005) 참조).
본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry site; IRES) 서열을 포함할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 뚜껑-독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 촉진시키는 임의의 바이러스성, 염색체 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 설탕, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제 및 계면활성제와 같은 세포 투과성 및 생존력을 촉진시키는 인자를 포함할 수 있는 세포 전기천공법에 적합한 용질이 포함될 수 있다.
일부 시험관 내 전사된 RNA (in vitro-transcribed RNA; IVT-RNA) 벡터는 시험관 내 전사를 위한 주형으로서 안정화된 RNA 전사체가 생산되는 방식으로 유전자 변형된 표준화된 방식으로 이용되도록 문헌에 공지되어있다. 현재 당 업계에서 사용되는 프로토콜은 다음 구조를 갖는 플라스미드 벡터에 기초한다: RNA 전사를 가능하게 하는 5' RNA 중합 효소 프로모터, 이어서 UTR (untranslated region)에 의해 3' 및/또는 5' 및 50-70A 뉴클레오티드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트를 포함한다. 시험관 내 전사 전에, 원형 플라스미드는 타입 II 제한 효소에 의해 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다 (인식 서열은 절단 부위에 상응한다). 따라서, 폴리아데닐 카세트는 전사체의 후속 폴리(A) 서열에 상응한다. 이 과정의 결과로, 일부 뉴클레오티드는 선형화 후에 효소 절단 부위의 일부로 남아 있고 3' 말단에서 폴리(A) 서열을 연장하거나 마스킹한다. 이 비생리학적 돌출이 그러한 구조체로부터 세포 내로 생산된 단백질의 양에 영향을 주는지는 명확하지 않다.
하나의 양태에서, RNA 구조물은 전기 천공에 의해 세포 내로 전달된다. US 2004/0014645, US 2005 / 0052630A1, US 2005 / 0070841A1, US 2004 / 0059285A1, US 2004 / 0092907A1에서 교시된 포유류 세포 내로의 핵산 구조물의 전기 천공에 대한 제형 및 방법을 참조한다. 임의의 공지된 세포 유형의 전기 천공에 필요한 전계 강도를 포함하는 다양한 파라미터는 당 분야의 수많은 특허 및 응용뿐만 아니라 관련 연구 문헌에서 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,678,556, 미국 특허 7,171,264, 미국 특허 7,173,116 참조. 전기 천공의 치료적 적용을 위한 장치는 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들어, MedPulserTM DNA 전기 천공 치료 시스템 (Inovio/Genetronics, San Diego, CA)이 있으며, 미국 특허 6,567,694; 미국 특허 6,516,223, 미국 특허 5,993,434, 미국 특허 6,181,964, 미국 특허 6,241,701, 및 미국 특허 6,233,482와 같은 특허에 기재되어있다; 전기 천공법은 또한 예를 들어 US20070128708A1에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 세포의 형질 감염에 사용될 수 있다. 전기 천공법은 또한 시험관 내에서 핵산을 세포 내로 전달하는데 이용될 수 있다. 따라서, 많은 이용 가능한 장치 중 임의의 것을 이용하는 발현 구조체 및 당업자에게 공지된 전기 천공 시스템을 포함하는 핵산의 세포 내로의 전기 천공법-매개 투여는 표적 세포에 목적 RNA를 전달하는 흥미로운 새로운 수단을 제시한다.
대안적으로, 다른 양태에서, 본 발명은 키메라 세포내 시그널링 분자를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 T 세포 집단을 전기 천공하는 것을 포함하는 변형된 T 세포를 생성시키는 방법을 포함하며, 상기 핵산 서열은 세포내 도메인의 핵산 서열, 실질적으로 세포외 도메인이 결여되어있다. 하나의 실시 양태에서, 키메라 세포내 시그널링 분자를 코딩하는 핵산 서열은 세포 내로 전기 천공된다. 또 다른 실시 양태에서, CAR 또는 막-결합 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열은 세포 내에 추가로 전기 천공된다.
T 세포의 소스
변형된 T 세포는 T 세포의 임의의 공급원으로부터 생성될 수 있다. 하나의 실시 양태에서, T 세포의 소스은 대상으로부터 수득된다. 대상의 비 제한적 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이의 형질 전환 종을 포함한다. 바람직하게는, 대상은 인간이다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄 및 종양을 비롯한 여러 출처에서 얻을 수 있다. 특정 실시 양태에서, 당 업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, T 세포는 피콜 (Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상으로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 실시 양태에서 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법 (apheresis) 또는 백혈구 분리반출법 (leukapheresis)에 의해 수득된다. 분리반출법 결과물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 분리반출법에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 후속 공정 단계를 위해 인산 완충 식염수 (PBS) 또는 칼슘이 부족하거나, 마그네슘이 부족하거나 2가 양이온이 아닌 경우 많은 것이 부족한 세척액과 같은 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 놓을 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS에 재현탁시킬 수 있다. 대안으로, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁 할 수 있다.
다른 실시 양태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고 예를 들어 퍼코 (PERCOLL)?? 구배를 통한 원심 분리에 의해 단핵 세포를 고갈시킴으로써 말초 혈액으로부터 분리된다. 또는, T 세포는 제대 (umbilical cord)로부터 분리될 수 있다. 어쨌든, T 세포의 특정 하위 집단은 긍정적이거나 부정적인 선택 기술에 의해 더 분리될 수 있다.
이렇게 분리된 제대혈 단핵 세포는 CD34, CD8, CD14, CD19 및 CD56을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 항원을 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 이들 세포의 고갈은 분리된 항체, 복수 (ascites) 등의 항체를 포함하는 생물학적 시료, 물리적 지지체에 결합된 항체 및 세포 결합 항체를 사용하여 달성될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 유일한 표면 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 방법은 부정적으로 선택된 세포상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역 접합 (magnetic immunoadherence) 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선별에 의한 세포 집단의 바람직한 분리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도는 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 (즉, 세포 농도를 증가시키는) 부피를 현저히 감소시켜 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시 양태에서, 20억 cell/ml의 농도가 사용된다. 하나의 실시 양태에서, 10억 cell/ml의 농도가 사용된다. 추가의 실시 양태에서, 1억 cell/ml 이상이 사용된다. 추가의 실시 양태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만 cell/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시 양태에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억 cell/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시 양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 cell/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다.
T 세포는 단핵구 제거 단계를 필요로 하지 않는 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않기를 바라며, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구 및 세포 집단 내의 단핵 세포를 어느 정도까지는 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개 변수가 당해 기술 분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 비 제한적 실시예에서, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 포함한다. 그런 다음 셀을 분당 1℃의 속도로 -80℃로 얼려서 액체 질소 저장 탱크의 기상에 저장한다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 동결뿐만 아니라 다른 제어된 동결 방법을 사용할 수 있다.
하나의 실시 양태에서, 세포 집단은 본 발명의 T 세포를 포함한다. 세포 집단의 예는 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단 및 T 세포주를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 다른 실시 양태에서, 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포 집단을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 정제된 T 세포는 T 세포 집단을 포함한다.
T 세포의 확장
본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 T 세포는 생체 외에서 확장될 수 있다. 한 실시 양태에서, T 세포 또는 T 세포를 포함하는 세포 집단은 확장을 위해 배양된다. 일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면상의 보조 자극 분자를 자극하는 리간드를 부착시킨 표면과의 접촉에 의해 확장된다.
T 세포를 확장시키는 방법이 본 명세서에 기재되어있다. 예를 들어, T 세포는 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배 또는 그 이상, 및 그 사이의 모든 전체 또는 부분 정수를 포함한다. 하나의 실시 양태에서, T 세포는 약 20배 내지 약 50배 범위로 확장한다.
T 세포는 일정 시간 동안 또는 다른 배양 장치로 세포를 통과시키기 전에 최적의 통과를 위해 세포가 컨플루엔시 (confluency) 또는 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 배양 장치의 세포 배지에서 배양될 수 있다. 배양 장치는 시험관 내에서 세포를 배양하는데 일반적으로 사용되는 임의의 배양 장치일 수 있다. 바람직하게는, 합류 (confluence) 수준은 세포를 다른 배양 장치로 옮기기 전에 70% 이상이다. 보다 바람직하게는, 합류 수준은 90% 이상이다. 기간은 시험관 내에서 세포 배양에 적합한 임의의 시간일 수 있다. T 세포 배지는 언제든지 T 세포 배양 중에 대체될 수 있다. 바람직하게는, T 세포 배지는 약 2 내지 3일마다 대체된다. 이어서 T 세포를 배양 장치에서 수확하여 T 세포를 즉시 사용하거나 냉동 보존하여 나중에 사용할 수 있도록 보관할 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 본 발명은 확장된 T 세포를 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 동결 보존 된 T 세포는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 하나 이상의 분자를 T 세포에 도입하기 전에 해동된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 배양 단계 (본 명세서에 기재된 바와 같은 제제와의 접촉)는 매우 짧을 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 시간 이하일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 배양 단계 (본 명세서에 기재된 바와 같은 제제와의 접촉)는 더 길어질 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14일 또는 그 이상일 수 있다.
하나의 실시 양태에서, T 세포는 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 정수값의 시간 (hourly integer value) 동안 배양될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청 (예를 들어, 태아 또는 인간), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN- 감마, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF- 베타 및 TNF-알파 또는 숙련자에게 공지된 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하여 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는 X-vivo 15 (Lonza))를 포함할 수 있다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 (plasmanate), 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토 에탄올과 같은 환원제를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 배지에는 아미노산, 피루브산 나트륨 및 비타민이 첨가된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, Optimizer가 포함될 수 있으며, 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 호르몬의 한정된 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인을 보충한 것일 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되며 피험자에게 주입되는 세포 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 + 5% CO2) 조건하에 유지된다.
T 세포 배양 배지는 T 세포를 보조-자극할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, CD3를 자극할 수 있는 약제는 CD3에 대한 항체이고, CD28을 자극할 수 있는 약제는 CD28에 대한 항체이다. 이는 본 명세서에 개시된 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 분리된 세포가 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배, 또는 그 이상일 수 있다. 일 실시 양태에서, T 세포는 전기 천공된 집단을 배양함으로써 약 20배 내지 약 50배 범위 이상으로 확장한다.
치료
하나의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물의 치료 효과량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 HIV 감염과 관련된 질병 또는 증상을 치료하는 방법을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포는 HIV 감염을 치료하기 위해 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 더 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 변형된 T 세포는 감소된 면역 반응, 특히 억제된 면역 반응, 특히 세포-매개 면역 반응이 질병을 치료 또는 완화시키는데 바람직한 모든 상태의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 변형된 T 세포의 투여는 당업자에게 공지된 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 변형된 T 세포는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 체내이식 (implantation) 또는 이식 (transplantation)에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양 내, 결절 내, 골수 내, 근육 내, 정맥 내 (i.v.) 주사 또는 복강 내에 투여될 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 변형된 T 세포는 대상의 염증 부위, 대상의 국소 질환 부위, 림프절, 기관, 종양 등에 직접 주입된다.
약학 조성물
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등의 완충제; 글루코스, 만노오스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제 (예를 들어, 수산화 알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여를 위해 제형화된다.
본 발명의 약학 조성물은 치료될 (또는 예방되는) 질환에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여량 및 빈도는 환자의 상태, 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이다.
"면역학적으로 유효한 양", "항-면역 반응의 유효량", "면역 반응을 억제하는 유효량"또는 "치료량"이 지시될 때, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자의 나이, 체중, 면역 반응 및 상태의 개인차를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 T 세포를 포함하는 약학 조성물은 104 내지 109 cell/kg 체중, 바람직하게는 105 내지 106 cell/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있으며, 이들 범위 내의 모든 정수값을 포함할 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러번 투여될 수 있다. 세포는 면역 요법에서 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참조). 특정 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 계획은 질병의 징후들에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 변형된 T 세포를 대상체에 투여한 후, 혈액을 재추출하고 (또는 분리반출법을 수행함), 그로부터 본 발명에 따라 T 세포를 대사 증진시키고 환자를 이들 수정된 T 세포로 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 절차는 몇 주에 여러번 수행할 수 있다. 특정 실시 양태에서, T 세포는 약 10ml 내지 약 400ml의 혈액 추출로부터 수득될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 변형된 T 세포는 약 20ml, 30ml, 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml, 90ml 또는 100ml의 혈액 추출로부터 수득된다. 이론에 얽매이지 않기를 바라며, 이 다중 혈액 추출/다중 재주입 프로토콜을 사용하여 T 세포의 특정 집단을 선택할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 양태에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 T 세포를 변형시키고, 본 명세서에 기재된 방법 또는 T 세포를 치료 수준으로 확장시킨 당 업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 자극, 활성화 또는 확장시키고, 임의의 이용 가능한 항-HIV 요법을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께 (예를 들어, 이전에, 동시에 또는 이후에) 환자에게 투여된다.
환자에게 투여되는 상기 치료제의 투여량은 치료되는 상태의 정확한 특성 및 치료의 수령인에 따라 달라질 것이다. 본 발명에서 유용한 방법 및 조성물은 실시예에 기재된 특정 제제에 국한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예는 세포의 제조 및 사용 방법, 확장 및 배양 방법, 및 본 발명의 치료 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는한 당 분야의 숙련자에게 충분히 허용되는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌 “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002)에 충분히 설명되어 있다. 이들 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생산에 적용 가능하며, 본 발명을 제조하고 실시하는데 고려될 수 있다. 특정 실시예에 대한 특히 유용한 기술은 다음 섹션에서 논의될 것이다.
실험예
본 발명은 하기 실험예를 참조로 하여 더욱 상세하게 설명된다. 이들 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며, 달리 명시하지 않는 한 제한하려는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명없이, 당업자는 전술한 설명 및 하기 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 구체적으로 지적하며, 본 발명의 나머지 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
이 실험에 사용된 재료 및 방법을 이제 설명한다.
단일 사슬 가변 단편 (scFv) 기반 CAR 구조체:
scFv는 CD137 및 CD3 제타 시그널링 도메인을 사용하는 제 2 세대 CAR에서, 또는 DAP12와 함께 KIRS2에 의한 인공 NK 세포 수용체로서 단일 전사체로 합성되었다. 모든 구조체는 사유 코돈 적응 지수 (proprietary codon adaptation index) (Geneart, Life Techn.)에 따라 인간에서 발현용으로 코돈 최적화된 것이다.
다음의 구조체가 본 발명에서 생성되고 테스트되었다 :
V1/V2 글리칸 (서열번호 10 내지 13)을 표적으로 하는 " PGDM1400", V3/V4 글리칸 (서열번호 14 내지 17)을 표적으로 하는 "PGT128", CD4 결합 부위 (서열번호 18 내지 21 및 34 및 35)를 표적으로 하는 "VRC01", CD4 결합 부위 (서열번호 26 내지 29)를 표적으로하는 "VRC01 c-mut"(HCDR1과 HCDR3 사이의 비-카논 다이설파이드 결합 돌연변이), CD4 결합 부위 (서열번호 22 내지 25)를 표적하는 "3BNC60" 및 CD4 Dap12-KIRS2 (서열번호 30 내지 31).
벡터 제작:
기존의 임상 시험용 벡터의 골격인 pRT43.2 GFP를 수득하고 (Liu and Eiden. Retrovirology 9,51(2012)), 제한 부위 링커를 PstI 및 SalI 사이트에 삽입하여 CMV 프로모터 영역을 제거하였다. PGK 프로모터 하에서 발현된 CD4 제타 서열을 올리고 5' GTATCGATCACGAGACTAGC (서열번호 40) 및 5' TTAAACCGGTGTCTGGCCTTTGAGTGGTGA (서열번호 41)로 플라스미드 pRRL.PGK.F3로부터 증폭시키고 증폭에 의해 생성된 pRT43.2. pTRPE CD4 제타 내의 링커인 XhoI 및 AgeI 부위에 삽입하였다. CD4 세포외 도메인은 다음의 프라이머를 갖는 원래의 임상 시험 CD4-CD3ζ 구조체를 함유하는 pRRL.PGK.F3 레트로바이러스 골격으로부터 PCR에 의해 증폭되었다:
프라이머-1 센스 (서열번호 36):
5'-TTAATGGGATCCATGAACCGGGGAGTCCCTTT-3'
프라이머-2 안티센스 (서열번호 37):
5'-AAGGACTTCCGGATGGCTGCACCGGGGTGGACCATG-3'
PCR 생성물을 CD8α 세포외 힌지 및 막 횡단 도메인 및 4-1BB 및 CD3 제타 세포내 보조 자극 도메인 (ICD)을 함유하는 pELNS 렌티바이러스 골격의 BamHI 및 BspE1 제한 부위에 삽입하였다. CD8α 힌지-CD8αTM-CD3ζ를 포함하거나 CD8α 힌지-CD28TM-CD28-CD3ζICD를 포함하는 pELNS 렌티바이러스 벡터를 수득하고 다음의 프라이머로 힌지 TM 및 ICD 영역을 PCR 증폭하기 위한 주형으로서 사용 하였다:
프라이머-3 센스 (서열번호 38):
5'- GGGACACTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCG-3'
프라이머-4 안티센스 (서열번호 39):
5'-GGGACACGTCGACTTAGCGAGGGGGCA-3'
이 PCR 주형을 CD8α 힌지-4-1BB-CD3ζ 영역을 포함하는 영역을 대체하기 위해 최근에 생성된 pELNS CD4 4-1BB 제타 구조체의 BspE1 및 Sal1 부위에 삽입하였다. 그 다음 플라스미드를 대장균의 Top10 균주 내로 전기 천공시키고 증식시켰다.
TCRα 및 TCRβ 유전자 서열 (IDT)을 합성함으로써 HIV p24Gag 에피토프 KAFSPEVIPMF (서열번호 42, pTRPE B57-KF11)를 인식할 수 있는 B57 제한 TCR을 발현한 렌티바이러스 벡터를 생성하였다. TCRα 및 TCRβ 유전자 서열은 이전에 기재된 바와 같이 (Varela-Rohena et al., Nature medicine 14, 1390-1395 (2008)) 두 TCR 유전자의 좌표 발현을 허용하는 T2A에 의해 분리되었다. VRC01, 3BNC60, PGT128 및 PGDM1400 scFv CAR은 경량-링커-중쇄 구성으로 공개된 부모 항체 서열로부터 생성되었다. 링커 서열은 다음과 같다: GGSSRSSSSGGGGSGGGG (서열번호 43). 아미노산 서열을 코돈-최적화 (Geneart)하고 이중 가닥 DNA 조각 (IDT 또는 Geneart)으로 합성하고, 적절한 제한 효소 부위가 측면에 위치하도록 만든 다음 BamHI 및 BspE1 제한 효소 부위를 갖는 pTRPE 발현 플라스미드에 클로닝 하였다. PG9 scFv를 BamHI 및 BspE1 제한 부위를 갖는 pTRPE 발현 플라스미드에 클로닝시켰다. 이 연구에 사용된 최적화된 HIV CAR의 서열의 일부가 도 18 (서열번호 44 내지 61, 아미노산) 및 19 (서열번호 62 내지 79, 핵산)에 열거되어있다.
VRC01, VRC01c 및 3BNC60 scFv 기반 KIR 및 IgG4-41BB-제타 CAR의 제작.
VRC01, VRC01c-, 3BNC60 scFv를 BamHI 및 NheI로 절단한 후 EF1α 프로모터의 제어하에 3세대 렌티바이러스 발현 벡터에 클로닝하여, scFv는 KIRS2 막 횡단 및 시그널링 도메인에 따른 9 아미노산 GS-링커로 골격을 만들었다. DAP-12는 scFv 리더 서열의 5' 에 위치하며, T2A 리보솜 스킵 부위에 의해 분리된다. 유사한 전략을 적용하여 scFv 코딩 서열을 IgG4 힌지를 갖는 프레임에서 scFv의 발현을 가능하게 하는 벡터로 클로닝하고, 이어서 CD8 막 횡단 도메인 및 41BB 보조-자극 및 CD3제타 시그널링 도메인을 클로닝 하였다.
VRC01, 3BNC60, PGT128, PGDM1400 및 PG9 scFv 기반 CD3zeta CAR의 제작.
VRC01, 3BNC60, PGT128, PGDM1400 및 PG9 scFv 코딩 서열을 5' 측면 BamHI 및 3' 측면 BspEI 부위를 코딩하는 프라이머로 PCR 증폭시켜 리더 서열과 힌지 사이의 전술한 pELNS CD8α 힌지-CD8αTM-CD3ζ의 소화 및 클로닝을 허용하였다 CD8α. 모든 구조체는 서열이 확인되었다.
서열 목록
서열번호 설명
1 CD4 제타 핵산
2 EF1α 프로모터 핵산
3 CD4 세포외 도메인 핵산
4 CD8α 세포외 힌지 핵산
5 CD8α 막 횡단 도메인 핵산
6 CD3 제타 핵산
7 CD4 CD28 제타 핵산
8 CD28 막 횡단 도메인 핵산
9 CD28 보조 자극 도메인 핵산
10 PGDM1400-KIR 핵산
11 PGDM1400-KIR 아미노산
12 PGDM1400 scFv 핵산
13 PGDM1400 scFv 아미노산
14 PGT128-KIR 핵산
15 PGT128-KIR 아미노산
16 PGT128 scFv 핵산
17 PGT128 scFv 아미노산
18 VRC01-KIR 핵산
19 VRC01-KIR 아미노산
20 VRC01 scFv 핵산
21 VRC01 scFv 아미노산
22 3BNC60-KIR 핵산
23 3BNC60-KIR 아미노산
24 3BNC60 scFv 핵산
25 3BNC60 scFv 아미노산
26 VRC01c-KIR 핵산
27 VRC01c-KIR 아미노산
28 VRC01-c scFv 핵산
29 VRC01-c scFv 아미노산
30 CD4 Dap12-KIRS2 핵산
31 CD4 Dap12-KIRS2 아미노산
32 CD4KIR 핵산
33 CD4KIR 아미노산
34 VRC01 IgG4 bbz 핵산
35 VRC01 IgG4 bbz 아미노산
44 최적 CD4-CD28 제타 아미노산
45 최적 CD4 4-1BB 제타 아미노산
46 최적 CD4 세포외 도메인 아미노산
47 최적 CD8α 세포외 힌지 아미노산
48 최적 CD8α TM 아미노산
49 최적 CD28 TM 및 ICD 아미노산
50 최적 4-1BB 아미노산
51 최적 CD3 제타 아미노산
52 최적 PG9 CD3제타 아미노산
53 최적 PGT128 CD3제타 아미노산
54 최적 VRC01 CD3제타 아미노산
55 최적 3BNC60 CD3제타 아미노산
56 최적 PGDM1400 CD3제타 아미노산
57 최적 PG9 아미노산
58 최적 PGT128 아미노산
59 최적 VRC01 아미노산
60 최적 3BNC60 아미노산
61 최적 PGDM1400 아미노산
62 최적 CD4-CD28 제타 핵산
63 최적 CD4 4-1BB 제타 핵산
64 최적 CD4 세포외 도메인 핵산
65 최적 CD8α 세포외 힌지 핵산
66 최적 CD8α TM 핵산
67 최적 CD28 TM 및 ICD 핵산
68 최적 4-1BB 핵산
69 최적 CD3 제타 핵산
70 최적 PG9 CD3제타 핵산
71 최적 PGT128 CD3제타 핵산
72 최적 VRC01 CD3제타 핵산
73 최적 3BNC60 CD3제타 핵산
74 최적 PGDM1400 CD3제타 핵산
75 최적 PG9 핵산
76 최적 PGT128 핵산
77 최적 VRC01 핵산
78 최적 3BNC60 핵산
79 최적 PGDM1400 핵산
1차 CD8 T 세포의 렌티바이러스 수확, 농도 및 형질 도입:
플라스미드 제제를 VSV 당 단백질, HIV-1 Gag 및 Pol 및 Rev (pRSV.REV, pMDLg/p.RRE, pVSV-G)를 발현하는 상업적으로 입수가능한 렌티바이러스 패키징 플라스미드와 결합시키고, Lipofectamine 2000 형질 전환 시약 (Invitrogen, Life Technologies)을 사용하여 pTRPE 전달 벡터로 HEK293T 세포에 형질 감염시켰다. 레트로바이러스를 생성하기 위해 RD114 Env 및 MMLV gag/pol 플라스미드 (pMSCV RD114 및 pNGLV3g/p)를 사용하여 동일한 과정을 완료하였다. 상등액 30㎖를 24시간 및 48시간 시점에서 수집하고, 4℃에서 8,500 RPM으로 초 원심 분리에 의해 농축시켰다. 상등액을 흡인하고 세포 펠렛을 총 부피 1.2ml에 재현탁하고, 드라이 아이스로 동결시키고, 저장을 위해 -80℃로 옮겼다.
세포 배양 - 실험 프로토콜:
건강한 공여자 CD8 및 CD4 T 림프구를 획득하여 Dynabeads-αCD3/αCD28 코팅 T-확장기 비드로 활성화시켰다. T 세포를 제조사의 프로토콜 (StemCell Technologies)에 따라 RosetteSep Human CD4+ 또는 CD8+ T Cell Enrichment Cocktails을 사용하여 음성 선별법으로 정제하였다. T 세포는 10% 태아 송아지 혈청 (Seradigm), 1% Penn Strep (Life Technologies), 2mM GlutaMax (Life Technologies) 및 25mM HEPES 완충액 (Life Technologies)이 첨가된 RPMI 1640 (Life Technologies) (ThermoFisher Scientific)에서 ml당 1x106m으로 배양하였다. T 세포를 5일 동안 항 CD3/CD28 코팅된 Dynabeads (Life Technologies) 3:1 비드 대 세포 비 및 재조합 인간 인터류킨 2의 밀리리터 당 100 내지 300의 국제 단위로 자극한 다음 비드를 제거하였다. 자극 후 1일째, 200㎕의 렌티바이러스 상등액을 0.5x106 세포에 첨가하였다. MMLV 벡터 전달은 3일 및 5일에 레트로넥틴(Retronectin) (Takara) 코팅된 24웰 플레이트에 1ml의 바이러스 상층액을 첨가하고 제조자의 지시에 따라 접종하여 수행하였다. 배지는 3일에 배가 되었고 5일째 완전히 변한 다음 세포 배양을 통해 또는 필요에 따라 세포 수를 기준으로 격일로 첨가하였다.
HIV-1 감염.
항-CD3/CD28 비드를 제거한 지 이틀 후, CD4 T 세포를 CCR5-트로픽 HIV 균주 Bal에 감염시키고 24시간 후에 다양한 효과기에서 CAR+ CD8 T 세포와 (E:T) 비율을 표적으로 공-배양 하였다. 항 CD3/CD28 활성화 CD4 T 세포로부터 무세포 상층액을 수거하여 CCR5-트로픽 HIV-1 Bal 바이러스 스톡 (280ng/ml p24)을 제조하였다. 활성화 된 CD4 T 세포는 구슬을 제거한 후 2~3 일에 2천만개의 세포당 상층액 약 1ml를 첨가하여 감염시켰다. 다음날 CD4 및 CD8 T 세포를 다양한 E:T 비율로 공-배양하고 HIV 확산을 세포내 p24 염색을 통해 제조 업체의 지시에 따라 KC57 항-Gag-RD1 항체 (Beckman Coulter) 및 Invitrogen Fix 및 Perm 완충액으로 검출하였다.
시험관 내 세포 독성 및 사이토카인 분석
HIV-1 gp120/41 엔벨로프 (YU-2)를 발현하는 K562 세포의 시험관 내 살해는 51Cr-방출 분석으로 시험하였다. 5×105 표적 세포에 50μCi Na2 51CrO4 (Perkin Elmer)를 90 내지 120분 동안 넣고 두번 세척한 후 5% FBS가 포함된 페놀 레드가 없는 배지에 재현탁시켰다. CAR 또는 모의 변형된 T 세포 (초기 활성화 후 8 내지 10 일)를 다양한 이펙터:표적 (E:T) 비로 4시간 동안 부하된 표적 세포와 함께 배양하고, 상등액으로의 크롬 방출을 MicroBeta2 플레이트 카운터 (Perkin Elmer)로 측정하였다. 5×105 NTD, CD4 CAR 또는 scFv CAR로 형질 도입된 T 세포를 부모 K562s, HLA-DR*0401 형질 도입된 K562s 또는 HIV YU2 Env 형 K562s와 6시간 동안 1:1 E:T 비율로 공-배양한 후 세포내 사이토카인 생산을 측정하였다. Invitrogen Fix 및 Perm 버퍼를 포함하고, 랫트 항 인간 IL-2 APC (BD biosciences), 마우스 항 인간 MIP-1β PerCP Cy5.5 (BD biosciences), 마우스 항 인간 IFN-γ FITC (BD biosciences), 및 마우스 항 인간 CD107a PE (BD biosciences)를 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 (86), 사이토카인 생성이 검출되었다. 표적 세포 (이펙터 세포가 없는)에 의한 자연 방출은 같은 부피에서 분석되었고, 최대 방출은 표적 세포를 최종 농도 5%의 SDS로 처리하여 평가하였다. 백분율 특이적 용해 = [(실험 방출 - 자연 방출) / (최대 방출 - 자연 방출)] * 100. 모든 실험은 적어도 세번 반복 수행되었고, 3명의 다른 공여로부터의 1차 인간 T 세포로 수행하였다. 인터페론 쥐의 생산은 ELISA (R & D)에 의해 3×105 개의 이펙터 세포와 105 개의 표적 세포를 400ul에 24시간 동안 공-배양한 후 배양 상등액을 두번 반복하여 제조사의 권장 사항에 따라 정량화했다.
CCR5 ZFN 붕괴.
이전에 기술된 CCR5 특이적 ZFN은 RNA 발현 벡터에 클로닝되었다 (Beatty 등, Cancer immunology research 2, 112-120 (2014)). mMessage mMachine T7 전사 키트 (Ambion, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 RNeasy Mini Kit (Qiagen)으로 정제하고 1mg/ml의 RNase가 없는 물에서 용리시킨 시험관 전사 RNA를 생성하였다. 정상 공여자 CD8 T 세포를 OPTI-MEM 배지로 3회 세척하고 전기 천공 이전에 1×108/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 0.1ml의 10E6 T 세포를 각각의 ZFN을 인코딩하는 RNA 30㎍과 혼합하고, ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX)를 사용하여 2mm 큐벳 (Harvard Apparatus BTX)에서 전기 천공하여 αCD3/αCD28로 코팅된 Dynabeads (Life Technologies)로 활성화하기 전에 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
CCR5 ZFN에 의한 유전체 변형의 효율을 측정하기 위해, T 세포로부터 유전체 DNA를 정제하고, 일루미나 딥 시퀀싱 (Ilumina deep sequencing)을 위한 샘플을 제조하는데 사용하였다 (Wang et al., Nucleic Acids Res 44, e30 (2016). 간단히, CCR5 표적 영역을 증폭시켰고 MiSeq 어댑터는 다음 2개의 CCR5 특이적 프라이머 쌍을 갖는 중첩 PCR 방법을 사용하여 첨가하였다. CCR5 Out-Out1 프라이머: CTGTGCTTCAAGGTCCTTGTCTGC (서열번호 80) 및 CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC (서열번호 81); CCR5 MiSeq 어댑터 프라이머 : ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATG (서열번호 82) 및 GACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT (서열번호 83). 이어서, 바코드 프라이머 쌍을 사용하여 연속적인 PCR 반응에서 서열 바코드를 첨가하였다. 유전자 변형 수준의 분석을 위해 맞춤형 컴퓨터 스크립트를 사용하여 페어드-엔드 150bp 서열 및 SeqPrep (John St. John, https://github.com/jstjohn/SeqPrep)을 통해 트림된 어댑터를 병합하였다. 판독은 야생형 주형 서열에 정렬되었다. 병합 읽기에서 filt 5' 및 3' 말단 (23bp)은 예상되는 앰플리콘과 정확하게 일치해야하고, 읽은 것은 기본 설정으로 사용하는 Bowtie2 (Yu 등, Journal of virology 81 , 1619-1631 (2007))에 의해 결정된 바와 같이 표적 유전체의 다른 궤적으로 매핑되어서는 안되며 결실은 앰플리콘 크기의 70% 미만이거나 70bp 미만이어야 한다. 정렬된 서열의 Indel 사건은 길이가 1bp 인 indel도 실제 사건을 실제보다 적게 계산하는 것을 피하기 위해 참된 indel로 간주된다는 것을 제외하면 이전에 설명한대로 정의되었다 (Gabriel et al., Nat Biotech 29, 816-823 (2011)). 참된 indel은 각 파트너 ZFN에 대한 결합 부위의 끝에서 두번째 염기 (갭에 인접한) 사이에 걸친 서열내에서 발생하는 결실을 포함해야 한다.
인간형 마우스 모델.
6주령의 NSG (NOD-scid IL2Rgnull) 마우스를 The Jackson Laboratory (JAX)로부터 얻었고 7주에 Busulfan 30mg/kg과 1:1 혼합한 PBS로 처리하였다. 24시간 후 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 100ul PBS가 10×106 인간 림프구가 꼬리 정맥을 통해 주입되었다. 3주 후에 꼬리 정맥 주사를 통해 PBS와 1:1로 혼합된 HIV의 CCR5 트로픽 Bal 균주 15ng을 마우스에게 감염시켰다. 말초 혈액은 레트로-오비탈 출혈(retro-orbital bleeding)로 얻어졌고, 인간 CD4와 CAR+ CD8 백혈구 수는 BD 용해 완충액과 BD TruCount tube를 사용하여 열거되었다 (Richardson et al., Molecular therapy : The American Society of Gene Therapy 저널 22 , 1084-1095 (2014)], 마우스 항 인간 CD45 PerCp Cy5.5 (BD Biosciences), 마우스 항 인간 CD4 BV421 (Biolegend) 및 마우스 항 인간 CD8α BV711 (Biolegend)로 염색하였다.
HIV 바이러스량 분석 (viral load assay)
RNA는 (Cillo 등, J Clin Microbiol 52, 3944-3951 (2014))에 기재된 방법을 사용하여 가용성에 따라 10-30㎕의 혈장에서 추출하고 최종 부피 15㎕로 재구성하였다. 추출 전에, 일정량의 RCAS 바이러스가 각 혈장 시료에 첨가되어 별도로 증폭되어 바이러스/RNA 회수 및 PCR 저해의 부재를 확인하였다 (Palmer 등, J Clin Microbiol 41, 4531-4536 2003)). RNA를 무작위 헥사머를 사용하여 역전사시키고, 시험관 내 전사 RNA 표준을 사용하는 ABI 7500FAST 실시간 thermocycler에서 LightCycler 480 Probes Master (Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 Q-PCR로 정량화하였다. 각각의 샘플에 대해, Q-RT-PCR 반응을 5ul RNA상에서 2회 반복하여 수행하였다; 비 역전사 효소 반응 및 RCAS 증폭은 RNA당 2.5㎕를 사용하여 샘플당 하나의 웰에서 수행하였다. pol 유전자를 표적으로 하고, 모든 M 군락을 검출하는 HIV-1 프라이머/프로브는 (Cillo 등, J Clin Microbiol 52, 3944-3951 (2014))에 기재되어 있으며, RCAS 증폭에 사용된 프라이머/프로브는 (Palmer et al., J Clin Microbiol 41, 4531-4536 (2003)에 기재되어 있다. HIV-1 정량화는 초기 플라즈마의 등가 체적으로 표준화되었다.
이제 실험 결과가 설명된다.
실시예 1. 렌티바이러스 골격은 CD4 CAR 발현을 증가시키고 HIV 복제를 제어한다.
이전의 임상 시험에서 사용된 CD4 CAR을 시험하는 전임상 연구는 이 구조체를 발현하는 T 세포가 자연 발생된 HIV 특이적 T 세포와 동등한 항 바이러스 활성을 가짐을 보였다. 내약성 임상 반응을 입증하기 위한 임상 시험 실패의 가설은 이러한 임상 시험에서 사용된 T 세포가 내인성 HIV 특이성 T 세포 반응보다 더 강력하지 않다는 것이다. 본 발명은 CAR의 각 성분을 단계적으로 최적화하여 T 세포가 HIV 복제를 조절하는 효능을 증가시킨다.
1차 인간 CD8 T 세포는 기존의 쥐 레트로바이러스 벡터 (MMLV) 임상 시험 구조 및 CD4 CAR 발현을 유도하는 PGK 프로모터를 사용하는 유사 3 세대 렌티바이러스 벡터 구조체로 형질 도입되었다. 1차 인간 CD8 T 세포의 렌티바이러스 형질 도입은 쥐 레트로바이러스에 비해 CAR 발현의 평균 형광 강도 (MFI)가 ~10배 더 높았다.
렌티바이러스 벡터, EF1α 프로모터 및 CD8α 막 횡단 도메인을 갖는 새롭고 개선된 CD4 막-결합된 키메라 수용체 (CD4 제타 구조체)는 PGK 프로모터 및 CD4 막 횡단 도메인 (1:5 및 1:10에서 조절 상실)보다 더욱 낮은 E-T 비율 (대략 1:100까지)에서 HIV-1을 조절한다. 레트로바이러스 PGK CD4 TM CAR에 비해 렌티바이러스 PGK CD4 CAR의 높은 발현을 보더라도, HIV-1 복제에 대한 제어 측면에서 작은 이점이 나타났다. CD8이 약 1:100의 비율까지 감염되지 않은 채 남아있는 반면, PGK CD4 TM 조작된 CD8 세포는 보다 낮은 E:T 비율로 감염됨에 따라, EF1α CD8TM 구조체의 높은 발현은 더 높은 감염율을 촉진하지 않았다 (도 2a 내지 2d). CD4 CAR로 형질 도입된 CD8 T 세포를 E:T 비율을 낮추기 위해 희석할 경우, 렌티바이러스 벡터로 형질 도입된 T 세포는 레트로바이러스 벡터로 형질 도입된 T 세포와 비교하여 HIV 복제를 조절할 때 우수하였다 (도 2f 및 2g). 궁극적으로 형질 도입된 CD8 T 세포는 1:50 E:T 비율로 HIV 확산을 조절할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 프로모터 및 막 횡단 변화는 CD4 막-결합 키메라 수용체 효능을 향상시키고 HIV-1 감염에 대한 증가된 조절을 제공한다.
CD4 CAR로 형질 도입된 CD4 T 세포가 무세포 바이러스에 감염되기 쉽다는 최근의 보고와는 달리 (Liu et al., Journal of virology 89, 6685-6694 (2015); Zhen et al., Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 1358-1367 (2015)), 본 결과는 HIV 감염된 CD4 T 세포와 함께 낮은 E:T 비율로 희석한 후 CAR CD8 T 세포에서 세포내 gag를 검출하는 것을 보여준다 (도 2e). 비-형질 도입된 CD8 T 세포와 비교하여, 높은 수준의 세포내 gag가 CAR-형질 도입된 CD8 T 세포에 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 CD4 CAR이 이들 세포를 감염에 민감하게 만든다는 것을 나타낸다 (도 2e). 중요한 것은, 렌티바이러스가 CD8 T 세포로 형질 도입된 CD4의 발현이 높으면 더 높은 E:T 비율에서의 감염 또는 이들 세포의 더 높은 수준의 감염을 촉진시키지 않는다는 것이다. 이 데이터는 렌티바이러스 벡터가 HIV를 표적으로 하기 위해 T 세포를 리-디렉트(re-direct)하는 구조를 도입하는 것에 선호되는 방법임을 입증하였다.
실시예 2. EF1α 프로모터와 CD8α 막횡단 도메인은 CAR 발현을 향상시키고 HIV-1을 조절한다.
EF1α CD8TM 구조체는 가장 낮은 E:T 비율에서도 HIV-1 복제를 조절하는 것으로 나타났다. EF1α 프로모터 (도 3a 및 3b, 중간 컬럼)로 CD4TM의 발현을 단순히 증가시키는 것은 HIV-1 복제에 대한 제어를 개선시켰지만, EF1α 프로모터 및 CD8α 막 횡단 치환으로 증가된 발현의 조합은 HIV-1에 대한 최선의 제어를 만들었다. 더욱이, CD8αTM은 특히 EF1α 구조체에 대한 1:50의 비율 및 PGK 구조체에 대한 1:25의 비율에서 CD4 막-결합 키메라 수용체 CD8 세포 (도 3a 및 3b 컬럼의 오른쪽 세트)의 감염을 감소시키는 것으로 나타났다.
CD8αTM 도메인의 치환은 1:25 및 1:50 E:T 비율에서 사용된 프로모터에 관계없이 CAR+ CD8 T 세포의 감염을 감소시켰다 (도 3b). 그러나, 도 2a 내지 2g의 경우와 같이, CAR+ CD8 T 세포는 더이상 HIV 감염을 통제할 수 없고 감염에 직접적으로 굴복할 수 있는 지점까지 희석될 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터, 프로모터 및 막 횡단 도메인의 변경은 임상 시험 레트로바이러스에 비해 50배의 효력 증가를 가져와 시험관 내에서 1:50 E:T 비율로 HIV 복제를 완전히 제어하였다 (도 3c 및 3d).
따라서, CD8α 막 횡단 변화는 HIV-1 복제의 조절을 개선하는 중요한 변형이었다.
실시예 3. 광범위 중화 항체 기반 CAR은 HIV-1을 조절할 수 있다
도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 광범위 중화 항체 (bnAb)-기반 CAR 및 CD4 막-결합 키메라 수용체 모두 HIV-1 감염을 조절할 수 있다. 그들의 HIV-1 결합 폭 및 중화 효능 범위의 scFv 패널 (도 4a 참조)을 CD4 막-결합 키메라 수용체와 동일한 EF1α-CD8αTM-제타 구조체 골격 내로 클로닝하고 HIV-1 복제를 제어하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 4시간 공-배양으로부터의 Cr51 방출 살해 분석은 scFv CAR 또는 CD4 막-결합된 키메라 수용체를 발현하는 CD8 T 세포가 비-형질 도입되지 않은 (NTD) T 세포는 아니지만 Env-발현 표적 세포를 용해시킴을 보여주었다. 이는 scFv CAR이 적절한 접힘/구조로 표현되어 Env에 결합할 수 있음을 나타낸다 (도 4b). 많은 scFv CAR은 Env-발현 표적에 반응하여 높은 수준의 세포내 사이토카인을 일관되게 생산하였다. CD4 막-결합된 키메라 수용체 및 scFv CAR 모두는 NTD 대조군에 비해 Env 표적 세포의 1:50 내지 1:200의 E:T 비율까지의 용해를 나타내었으며 (도 4c), 이는 도 1에서 1:25 E:T 비율까지의 효능을 나타낸 KF11 TCR의 활성보다 우수하였다.
이론에 얽매이지 않기를 바라며, HIV를 표적으로 하는 CAR의 사용은 항-IGF scFv를 포함하는 CAR이 HIV-감염 세포의 비축 집단을 갖는 대상의 치료에 유익할 것이라는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 하나의 양태에서 이러한 사용을 위한 CAR을 포함한다.
실시예 4. CD4 CAR은 시험관 내에서 HIV 특이적 엘리트 제어기 TCR보다 100배 이상 강력하다.
엘리트 컨트롤러 (Elite controller; EC)는 ART가 없는 상태에서 HIV 복제를 통제할 수 있는 드문 개인(individual)이다. HLA-B57과 같은 특정 HLA 대립 유전자는 엘리트 컨트롤러 집단에서 과다 표현되어 (overrepresented) T 세포 반응이 이들 개체에서 HIV 복제를 조절하는 데 핵심적인 역할을 한다는 것을 시사한다 (Walker et al., Nature reviews. Immunology 13, 487-498 (2013)). EC로부터 분리된 HIV 특이적 T 세포는 HIV 진행 인자로부터 분리된 HIV 특이적 T 세포보다 더 높은 세포 용해 잠재력을 갖는다 (Migueles et al., PNAS 97, 2709-2714 (2000); Saez-Cirion et al., PNAS 104, 6776-6781 (2007)). 따라서 CD4 CAR을 발현하는 T 세포가 환자의 HIV 복제에 대한 더 나은 제어와 관련된 엘리트 컨트롤러로부터 분리된 HLA-B57 제한 TCR을 발현하는 T 세포보다 HIV 복제를 더 잘 제어할 수 있는지를 결정하기 위해, HLA-인간 CD8 T 세포를 EF1α 프로모터 하에서 또한 발현된 KF11 (HIV p24Gag 에피토프, 서열번호 42)에 특이적인 TCR로 형질 도입시키고, HIV도 퍼짐을 제한하는 능력을 동일한 공여자로부터의 CD4 T 세포를 사용하여 측정하였다. KF11 TCR은 당업계에서 환자의 HIV-1 복제에 대한 더욱 우수한 제어와 관련이 있으며, HIV-1에 대한 가장 유력한 환자 유래 TCR 중 하나이다. KF11 TCR-형질 감염된 CD8 T 세포가 1:25 E:T 비율로 HIV 복제를 감소 시켰지만, HIV 복제에 대한 완전한 제어는 결코 달성되지 않았다 (도 1a 및 1b 및 3a 내지 3d). 대조적으로, 본 발명의 CD4 CAR은 거의 완전하게 1:100 E:T 비율로 HIV를 제어하였다. 이러한 결과는 CD4 제타 CAR이 HLA-B*57 제한된 KF11 엘리트 컨트롤러 TCR보다 NL4-3 HIV-1 복제를 잘 제어함을 보여주었다.
이러한 데이터는 본 발명의 CD4 CAR이 내인성 HIV T 세포 반응보다 훨씬 더 큰 효능을 가지며, 최적화된 CD4 CAR을 발현하는 T 세포가 입양 T 세포 요법에 의해 달성될 수 있는 이펙터 대 표적 비율에서 ART 제거 후 HIV 복제를 제어할 수 있음을 시사한다.
또한, 도 5a 및 5b는 CD28 보조 자극이 HIV-1 Bal보다 제어를 촉진한다는 것을 보여준다. CD-4 제타 구조체보다 HIV-1을 일관되게 제어하는 또 다른 막-결합 키메라 수용체 구조체는 CD4 CD28 제타 구조체였다.
실시예 5. CD28 및 4-1BB 보조 자극은 시험관 내에서 HIV-1 복제의 제어에 반대 효과를 갖는다.
T 세포는 증식, 이펙터 기능 및 장기 생존을 위해 보조 자극 신호를 필요로 한다. CD28 및 4-1BB와 같은 추가의 보조 자극 도메인은 생체 내에서 내구력있는 CAR T 세포 반응을 유도하는데 필요한 것으로 입증된 보다 최근의 CAR 디자인에 포함되었다 (Van der Stegen 등, Nature reviews.Drug discovery 14, 499 -509 (2015)). CD28, 4-1BB, CD28+ 4-1BB, OX40, ICOS 또는 CD27을 포함하는 CD3-제타 도메인과 함께 다양한 보조 자극 도메인을 포함하는 CD4 CAR 패널이 생성되었으며 시험관 내 시험을 실시하였다. 4-1BB, CD27 또는 ICOS 보조 자극 도메인을 함유하는 CAR을 발현하는 CD8 T 세포는 CD3-제타 신호 도메인만을 함유하는 CAR을 발현하는 T 세포만큼 HIV를 효과적으로 제어하지 못하여 이러한 보조 자극 경로가 HIV 복제의 T 세포 조절을 방해함을 시사한다 (도 5a 및 5b). OX40 또는 CD28과 4-1BB의 조합을 함유하는 CAR은 CD3-제타만을 함유하는 CAR과 유사한 수준으로 HIV를 조절하였다. 대조적으로, CD28은 시험관 내에서 대조군을 개선하여 CD28 보조 자극이 HIV 특이적 CAR에서 유익할 수 있음을 나타내었다.
실시예 5. CD4 CAR은 MHC 클래스 II+ 세포가 아닌 Env+ 세포에 특이적으로 반응한다.
전임상 데이터는 임상 시험 CD4 CAR을 발현하는 T 세포가 CD4의 낮은 친화성 리간드인 MHC 클래스 II를 높은 수준으로 발현하는 Raji 세포를 죽이지 않는다는 것을 증명했다 (Romeo 등, Cell 64, 1037-1046 (1991)). 그러나, 환자에서 CD4 CAR T 세포의 긴 반감기는 MHC 클래스 II와의 낮은 친화성 상호 작용 또는 바이러스 뇌졸중시 Env 방출 가능성으로 추측되었다 (Scholler et al., Science Translational Medicine 4, 132ra153 2012)). 이전에 기술된 벡터 변형이 MHC 클래스 II에 대한 표적에서의 반응성을 촉진시키는지를 결정하기 위해, 고수준의 HLA-DR*0401 대립 유전자를 안정하게 발현하는 K562 세포주에 대해 CD4 CAR+ CD8 T 세포 반응을 측정하였다 (도 14 참조). CD8 T세포는 CD3-제타, 4-1BB-CD3-제타 또는 CD28-CD3-제타 자극 도메인을 포함하는 최적화된 CD4 CAR로 형질 도입 되었고, 무변성 K562 표적 세포 HLA-DR*0401+ K562 세포 또는 HIV YU2 Env + K562 세포와 배양하였다. CAR로 형질 도입된 CD8 T 세포는 HIV Env+ 표적에 반응하여 IL-2, CD107a, IFN-γ 및 MIP-1β를 생산하였으나 HLA-DR+ 또는 부모 K562에 반응하지 못하고 CD28 포함 CAR T 세포에서 가장 강력한 생산을 보였다 (도 11a). 소량의 MIP-1β 신호가 CAR을 발현하는 T 세포에서 관찰된 일부 구성적이고 비-항원 특이적 시그널링에 기인한 비-형질 도입 대조군에서 관찰되지 않은 부모 또는 HLA-DR 발현 표적과 혼합될 때 모든 CAR에서 관찰되었다. 그러나, 단독으로 또는 부모 K562와 함께 배양된 CAR T 세포와 비교하여, MHC II 발현 세포에 대한 반응으로 추가의 사이토카인 또는 CD107a 생산이 검출되지 않았다.
사이토카인 생산의 결핍에도 불구하고 CAR+ CD8 T 세포가 MHC 클래스 II 표적을 죽일 수 있는지를 결정하기 위해 공-배양 분석을 수행하였다. HLA-A*02+/GFP+ K562s 및 HLA-DR*0401+/mCherry+ K562s의 1:1 혼합물에 CD28-CD3-제타 보조 자극 도메인을 포함하는 CD4 CAR을 첨가하고 두 개의 K562 세포 유형의 비율을 시간이 지남에 따라 측정하였다. 72시간 이상의 연장된 배양은 HLA-DR*0401+ K562s의 비율을 감소시키지 않았다 (도 11b 및 11c). 이러한 결과는 재조직된 CD4 CAR의 사용은 원래의 CD4 CAR 벡터와 같이 사람에서 사용하기에 안전할 것이라고 시사한다.
실시예 6. 최적화된 CD4 CAR을 발현하는 T 세포는 HIV-1 복제를 제어하고 1세대 CD4 CAR보다 생체 내에서 훨씬 더 큰 수준으로 확장한다.
CD28 및 CD3-제타 시그널링 영역을 포함하는 CD19-특이적 CAR은 4-1BB 및 CD3-제타 시그널링 영역을 포함한 것보다 우수한 시험관 내 활성을 나타내지만, CAR을 함유하는 4-1BB는 인간화된 마우스 모델에서 우수성을 나타내었고 B 세포 백혈병에서 궁극적인 효과를 보여주었다 ((Porter et al., Science translational medicine 7, 303ra139 (2015); Milone et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1453-1464 (2009); Brentjens et al., Blood 118, 4817-4828 (2011)). HIV-표적화 CAR에 대해 동일한 것인지 및 본 발명의 최적화된 CD4 CAR이 이전에 클리닉에서 테스트한 기존의 CD4 CAR 구조체보다 생체 내에서 HIV를 더 잘 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 8백만개의 CD4 T 세포와 2백만개의 CD8 T 세포로 구성된 1천만 개의 인간 T 세포가 쥐의 집단에 주입되었다. 4 그룹의 마우스를 다른 CD8 이펙터 세포 집단과 비교하였다: 비-형질 도입 (NTD), CD28 (28z) 또는 4-1BB 보조 자극 도메인 (BBz)을 포함하는 최적화된 렌티바이러스 벡터로 형질 도입됨, 또는 임상 시험 MMLV 기반 벡터 (CD4z)로 형질 도입됨.
감염 전 초기의 CD4 T 세포 수는 NTD, BBz 또는 28z 군에서 현저한 차이가 없었으며, CD4z 처리 마우스에서 유의하게 더 높았다 (도 12a). 그 후, 마우스에게 CCR5-트로픽 HIV 균주 Bal을 감염시켰으며 감염 22일 후에 말단 말초 CD4 T 세포 수를 계수하였다. BBz 또는 28z 구조체를 발현하는 T 세포가 주입된 마우스는 각각 인간 CD4 T 세포의 수의 17배 및 177배의 확장을 보였다 (도 12b). 반대로, 말초 CD4 수는 비-형질 도입 CD8 T 세포 또는 CD4z T 세포로 처리된 마우스에서는 아마도 HIV-매개 고갈로 인해 매우 낮게 유지되었다 (도 12b). 상이한 마우스 집단에서 CD4 CAR+ CD8 T 세포의 수를 조사하여 BBz, 28z 및 CD4z T 세포에서 각각 389배, 587배 및 2배의 확장이 확인되었다 (도 12c 및 12d). 바이러스 부하를 조절하는 CD4 CAR T 세포의 능력 또한 이 모델에서 조사되었다. HIV 감염 7일 후, NTD, 28z 및 CD4z 처리 동물로부터의 혈장은 ㎕당 약 1 복제본의 HIV RNA를 함유하는 반면, 거의 검출되지 않는 바이러스 부하와 함께 BBz CAR T 세포는 바이러스 복제에 대한 가장 큰 조절을 나타냈다 (도 12e). 감염 18일 후에, HIV RNA의 중간 복사 수는 NTD T 세포로 처리된 마우스와 비교하여 BBz 및 28z 처리 동물에서 10배 이상 감소하였다 (도 12f). 그러나, CD4z 처리 마우스는 NTD 처리 마우스와 비교하여 HIV RNA를 통계적으로 감소시키지 않았다. 최적의 CD4 CAR 제어되는 동안
HIV가 임상 실험 CAR보다 더 좋게 나타났고, 이 결과는 다른 보조 자극 도메인이 CD4 T 세포를 최대한 보호하는 CD28 및 HIV 복제에 대한 조기 제어를 촉진하는 4-1BB와 함께 HIV 감염에 있어 서로 다른 보호 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: CCR5-ZFN 변형된 CD4 CAR CD8 T 세포가 생체 내에서 농축된다.
시험관 내 및 생체 내에서의 HIV 복제에 대한 증가된 제어에도 불구하고, 시험관 내 자료에 따르면 HIV 특이적 CAR로 CD8 T 세포를 형질 도입하면 감염에 취약해질 수 있다고 시사한다. 이들 CAR T 세포가 생체 내에서 감염되는지 여부를 결정하기 위해, 풍부한 감염에 강한 CAR T 세포를 생체 내에서 HIV의 존재 하에 시험하였다. 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nucleases; ZFN)를 사용하여 CCR5 HIV 보조 수용체를 유전자 편집함으로써 생존 이점을 얻는 것은 1차 인간 CD4 T 세포에서 이미 입증되었다 (Perez et al., Nat Biotechnol 26, 808-816 (2008); Tebas et al., Nature reviews. Immunology 13, 693-701 (2013)). 그러나, HIV 감염의 존재하에 CD4 CAR+ CD8 T 세포에 대한 유사한 농축 분석은 연구되지 않았다. 보조 수용체 편집이 CD4 CAR CD8 T 세포의 생체내 감염에 대한 감수성을 결정하는 수단으로서 CAR+ CD8 T 세포의 더욱 풍부한 농축을 촉진 하는지를 결정하기 위해, CD8 T 세포를 CCR5 ZFN으로 처리한 후 각각의 CD4 CAR 구조체로 형질 도입한 4개의 추가 그룹이 도 12a 내지 12f에 기재된 실험에 포함되었다.
CD4 CAR T 세포로 처리하고 비-형질 도입 CD8 T 세포와 관련하여 HIV로 감염된 마우스에서 CCR5 붕괴된 대립 유전자가 풍부해졌다 (도 13a). 비-형질 도입 CD8 T 세포로 이식된 HIV 감염 마우스는 0.4%의 중간 파괴 빈도를 보였다. 이 CD8 T 세포는 CD4 CAR이 형질 전환되지 않았기 때문에 HIV의 존재하에서 풍부해질 것으로 기대되지 않았다. BBz, 28z 또는 CD4z T 세포로 처리한 마우스의 평균 붕괴 빈도는 각각 14.4%, 29.6% 및 9.5%였으며, HIV에 감염된 CD4 T 세포가 HIV 감염의 존재 하에서 풍부해 졌음을 나타낸다. CCR5 붕괴 농축은 CAR의 존재하에 확장하는 CAR+ CD8 T 세포의 능력에 의해 영향을 받는다. 도 13b 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 따라서, 28z CAR T 세포의 더 큰 항원-특이적 확장은 도 8a에서 볼 수 있는 더 큰 CCR5 풍부화의 원인이 될 수 있다. 이 데이터는 또한 BBz로 조작된 T 세포가 종양 특이적 CAR을 사용하여 발견한 결과와 일치하는 항원이 없는 상태에서 28z 조작된 T 세포보다 더 잘 유지될 수 있음을 보여준다 (Milone et al., Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1453-1464 (2009); Carpenito et al., PNAS 106, 3360-3365 (2009)). 종합하면, 이 데이터는 HIV 특이적 CAR T 세포의 HIV 감염이 발생하고 HIV 감염으로부터 이들 세포를 보호하는 전략이 HIV 감염의 내구성있는 조절을 보장하는 것에 필요할 것임을 시사한다.
또한 HIV 감염에 저항성인 CD4 CAR CD8 T 세포가 HIV-1 감염을 조절하는 능력을 향상시키는지 여부를 조사하였다. 감염 22일 후, 비 ZFN으로 처리한 것 (도 16a 및 16b)과 비교하여 ZFN으로 처리한 28z 쥐에서 더 낮은 말단 CD4 T 세포 수를 제외하고는, 일반적으로 ZFN 처리된 세포 또는 비 ZFN 처리된 세포에서 말초 혈액 CD4 T 세포 수 또는 CAR+ CD8 T 세포의 확장은 감염된 마우스에서 유의한 차이가 없었다. 그러나, ZFN-처리된 CD4z 마우스 (도 16a 및 16b)에서 CD4 및 CAR+ CD8 T 세포 확장이 더 커지는 경향이 있었다. ZFN 처리의 부재하에 낮은 바이러스 부하를 갖는 28z 또는 BBz 마우스에서, 바이러스 RNA의 추가 감소는 ZFN 처리로 인한 것이 아니었다 (도 13c). 한편, ZFN 처리된 CD4z T 세포를 투여한 마우스에서 혈장 바이러스 RNA의 유의한 감소가 관찰되었는데, 여기서 혈장 바이러스가 BBz 또는 28z CAR을 투여한 마우스보다 더 이상 유의적으로 높지 않았다. ZFN이 없는 BBz 또는 28z 처리된 마우스에 비해 CD4z 레트로바이러스로 처리된 마우스에서 ZFN이 없는 경우 바이러스 부하가 대략 지수 배 (log-fold)로 높았으므로 ZFN 치료로 인해 바이러스 복제가 제대로 제어되지 않는 상황에서 바이러스 부하의 유의한 감소를 탐지하는 것이 더 쉽다. 게다가, 짧은 실험 기간으로 인해 특히 CD4z 치료 마우스에서 가장 많은 항 바이러스 효과를 나타내는 CD8 T 세포의 검출 가능한 풍부함을 포함하여 CAR T 세포에서 ZFN 치료의 모든 이점을 볼 수 없었다. 요약하면, ZFN 치료가 없는 경우, 최적화된 CAR은 생체 내에서 임상 시험 CD4z보다 우수하다. 그러나, 기존의 CAR 구조를 발현하는 T 세포가 CCR5 파괴에 의해 보호될 수 있다면, HIV 복제에 대한 제어는 이 비교적 짧은 생체 내 분석법 내에서 달성될 수 있다.
전체적으로, 본 명세서에 개시된 HIV 복제의 개선된 제어는 인상적이다 (도 17a 내지 17c). 본 발명은 HIV-1 감염 세포를 살상하는 능력을 50배 증가시키는 이전에 개시된 CD4 막 결합 키메라 수용체에 대한 몇 가지 개선점을 포함한다. 1세대 CD4 막-결합 키메라 수용체와는 달리, 시험관 내 분석에서 생리학적으로 관련이 있는 이펙터:표적 (E:T) 비율에 대한 적정은 이러한 향상된 CD4 막-결합 키메라 수용체 구조체가 환자의 바이러스 부하를 줄이는 것에 효과적임을 시사한다.
HIV 감염의 장기적인 통제를 위한 주요 문제점 중 하나는 일부 바이러스 변이의 면역 탈출이다. 본 발명의 scFv 기반 CARs (scFv-CARs)는 이러한 문제점을 해결하고 HIV-감염 세포의 비축 집단을 갖는 대상자의 치료에 유익한 것으로 나타났다. scFv 기반 CARs를 발현하는 T 세포의 추가는 ART가 없는 상태에서 HIV 복제의 내구성있는 조절을 제공하도록 조작된 T 세포의 능력을 추가로 증가시킬 수 있다. 도 9a 및 10a에 도시된 바와 같이, VRC01, VRC01c 및 3BNC60-CARs는 HIV-1 엔벨로프 gp120/41 (YU-2 분리물)을 발현하는 K562 세포의 특이적 용해를 나타내지만, CD19를 발현하는 K562 세포의 특이적 용해를 나타내지 않아 scFv-CARs 세포 독성이 강력하고 특이적임을 확인하였다. 또한, scFv-CAR T 세포에 의해 방출된 인터페론 감마 (IFNg)는 세포의 살상 효능과 밀접하게 상관되었다 (도 9c 및 10c). 또한, 살해 세포 면역글로블린-유사 수용체 (KIR) 세포질 도메인을 사용함으로써 scFv-CARs 세포 독성이 추가로 증가되었다.
본 발명은 개선된 HIV 요법에 대한 엄청난 잠재력을 제공한다. HIV 환자로부터 분리된 T 세포는 scFv-CAR 및/또는 CD4 막-결합 키메라 수용체로 형질 도입될 수 있으며, 생체 외에서 확장되고 대상으로 재주입될 수 있다. 형질 도입된 T 세포는 gp120 발현 세포를 인식하고 활성화되어 HIV 바이러스를 죽이는 결과를 낳는다. 이 접근법은 표적 항원이 이동하거나 표류할 수 있고 따라서 정상 항체 (예를 들어, 인플루엔자 A의 혈구 응집소)에 의한 면역 감시를 피할 수 있는 바이러스 매개 질환에 적용될 수 있다. 이 요법은 다른 알려진 항체 요법인 HAART와 병용하거나 CAR 요법 중 또는 치료 전에 바이러스 유도제와 병용할 수 있다.
본 발명의 예방적 적용은 T 세포가 HIV 레파토리의 확립을 방해하는 감염된 CD4 세포를 사멸시켜야하므로 고위험 집단에서도 가능하다.
다른 실시 양태
여기에 변수의 정의에서 요소 목록을 설명하면 나열된 요소의 단일 요소 또는 조합 (또는 하위 조합)으로서 해당 변수의 정의가 포함된다. 본 명세서의 실시 양태의 설명은 임의의 단일 실시 양태로서 또는 임의의 다른 실시 양태 또는 이들의 일부와 결합된 실시 양태를 포함한다.
본 명세서에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 공개 문헌의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용되어있다. 본 발명은 특정 실시 양태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 실시 양태 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있다는 것은 자명하다. 첨부된 청구범위는 그러한 모든 실시 양태 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> Method of Redirecting T cells to Treat HIV Infection <130> IPA180336-CN <150> US 62/222,132 <151> 2015-09-22 <150> US 62/253,790 <151> 2015-11-11 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 1 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga 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ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca 1140 gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg 1200 gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc 1260 gc 1262 <210> 74 <211> 1355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 74 gacttcgtgc tgacccagag ccctcacagc ctgagcgtga cacctggcga gagcgccagc 60 atcagctgca agagcagcca ctccctgatc cacggcgacc ggaacaacta cctggcttgg 120 tacgtgcaga agcccggcag atccccccag ctgctgatct acctggccag cagcagagcc 180 agcggcgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggcagcgaca aggacttcac cctgaagatc 240 agccgggtgg aaaccgagga cgtgggcacc tactactgta tgcagggcag agagagcccc 300 tggacctttg gccagggcac caaggtggac atcaagggcg gcagctccag aagcagctct 360 agcggaggcg gaggatctgg cggcggagga caggctcagc tggtgcagtc tggacccgaa 420 gtgcggaagc ctggcaccag cgtgaaggtg tcctgtaaag cccctggcaa caccctgaaa 480 acctacgacc tgcactgggt gcgcagcgtg ccaggacagg gactgcagtg gatgggctgg 540 atcagccacg agggcgacaa gaaagtgatc gtggaacggt tcaaggccaa 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<400> 75 cagagactgg tggaaagcgg tggaggcgtg gtgcagcctg gcagcagcct gagactgagc 60 tgcgccgctt ccggcttcga cttcagccgg cagggcatgc attgggtgcg ccaggctcca 120 ggacagggac tggaatgggt ggccttcatc aagtacgacg gcagcgagaa gtaccacgcc 180 gacagcgtgt ggggtagact gtctatcagc cgggacaaca gcaaggacac cctgtacctg 240 cagatgaaca gcctgcgggt ggaggacacc gccacatact tttgcgtgcg ggaggctggt 300 ggacctgact accggaacgg ctacaactac tacgacttct acgacggcta ctacaactac 360 cactacatgg atgtgtgggg caagggcacc accgtgaccg tgtctagcgg aggcggagga 420 tctggcggcg gaggaagtgg aggcggcgga agccagtctg ccctgaccca gcctgcctct 480 gtgtctggca gccctggcca gagcatcacc atcagctgca acggcaccag caacgacgtg 540 ggcggctacg agagcgtgtc ctggtatcag cagcaccccg gcaaggcccc caaggtggtg 600 atctacgacg tgtccaagag gcccagcggc gtgagcaacc ggttcagcgg cagcaagagc 660 ggcaataccg ccagcctgac catctctggg ctgcaggccg aggacgaggg cgactactac 720 tgcaagagcc tgaccagcac caggcggaga gtgttcggca ccggcaccaa gctgaccgtg 780 ctg 783 <210> 76 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 76 ggatcccaga gcgccctgac acagcctcct agcgcctctg gatctcccgg ccagagcatc 60 accatcagct gtaccggcac cagcaacaac ttcgtgtcct ggtatcagca gcacgccggc 120 aaggccccca agctcgtgat ctacgacgtg aacaagcggc ccagcggcgt gcccgataga 180 ttcagcggca gcaagagcgg caacaccgcc agcctgacag tgtctggcct gcagaccgat 240 gacgaggccg tgtactactg cggcagcctc gtgggcaact gggacgtgat ctttggcgga 300 ggcaccaagc tgaccgtgct gggcggaagc agcagaagct ctagttctgg cggcggagga 360 agcggaggcg gaggacagcc tcagctgcag gaatctggcc ccacactggt ggaagccagc 420 gagacactga gcctgacctg tgccgtgtcc ggcgattcta ccgccgcctg caatagcttc 480 tggggctggg tgcgccagcc tcctggaaag ggactggaat gggtgggaag cctgagccac 540 tgcgccagct attggaaccg gggctggacc taccacaacc ccagcctgaa gtccagactg 600 accctggccc tggacacccc caagaacctg gtgttcctga agctgaacag cgtgacagcc 660 gccgacaccg ccacctacta ctgtgccaga tttggcggcg aggtgctgcg gtacaccgac 720 tggcctaaac ctgcctgggt ggacctgtgg ggcagaggaa cactcgtgac cgtgtctagc 780 tccgga 786 <210> 77 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 77 ggatccgaga tcgtgctgac acagagccct ggcaccctga gcctgtctcc aggcgagaca 60 gccatcatca gctgccggac aagccagtac ggcagcctgg cctggtatca gcagaggcct 120 ggacaggccc ccagactcgt gatctacagc ggcagcacaa gagccgccgg aatccccgat 180 agattcagcg gctctagatg gggccctgac tacaacctga ccatcagcaa cctggaaagc 240 ggcgacttcg gcgtgtacta ctgccagcag tacgagttct tcggccaggg caccaaggtg 300 caggtggaca tcaagagagg cggcagctcc agaagctcca gctctggcgg cggaggatct 360 ggcggaggcg gacaggtgca gctggtgcag tctggcggcc agatgaagaa acccggcgag 420 agcatgcgga tcagctgcag agcctccggc tacgagttca tcgactgcac cctgaactgg 480 attcggctgg cccctggcaa aagacccgag tggatgggct ggctgaagcc cagaggcgga 540 gccgtgaatt acgccagacc tctgcagggc agagtgacca tgacccggga cgtgtacagc 600 gataccgcct tcctggaact gcggagcctg accgtggatg ataccgccgt gtacttctgc 660 acccggggca agaactgcga ctacaactgg gacttcgagc actggggcag aggcacccct 720 gtgatcgtgt ctagctccgg a 741 <210> 78 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 78 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gagtgggcga caccgtgacc 60 atcacctgtc aggccaacgg ctacctgaac tggtatcagc agcggagagg caaggccccc 120 aagctgctga tctacgacgg cagcaagctg gaaagaggcg tgcccgccag attcagcggc 180 agaagatggg gccaggagta caacctgacc atcaacaacc tgcagcccga ggacgtggcc 240 acatactttt gccaggtgta cgagttcatc gtgcccggca cccggctgga tctgaagggc 300 ggaagcagca gaagcagctc tagcggcgga ggcggatctg gcggaggggg acaggtgcac 360 ctgagtcagt ctggcgccgc tgtgacaaag ccaggcgctt ctgtgcgggt gtcctgtgaa 420 gccagcggct acaagatcag cgaccacttc atccactggt ggcggcaggc tccaggacag 480 ggactgcagt gggtgggatg gatcaacccc aagaccggcc agcccaacaa ccccagacag 540 ttccagggca gagtgtccct gaccagacag gccagctggg acttcgacac ctacagcttc 600 tacatggacc tgaaggccgt gcggagcgac gacaccgcca tctacttttg cgccagacag 660 agaagcgact tctgggattt cgacgtgtgg ggcagcggca cccaagtgac cgtgtcatct 720 <210> 79 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 79 gacttcgtgc tgacccagag ccctcacagc ctgagcgtga cacctggcga gagcgccagc 60 atcagctgca agagcagcca ctccctgatc cacggcgacc ggaacaacta cctggcttgg 120 tacgtgcaga agcccggcag atccccccag ctgctgatct acctggccag cagcagagcc 180 agcggcgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggcagcgaca aggacttcac cctgaagatc 240 agccgggtgg aaaccgagga cgtgggcacc tactactgta tgcagggcag agagagcccc 300 tggacctttg gccagggcac caaggtggac atcaagggcg gcagctccag aagcagctct 360 agcggaggcg gaggatctgg cggcggagga caggctcagc tggtgcagtc tggacccgaa 420 gtgcggaagc ctggcaccag cgtgaaggtg tcctgtaaag cccctggcaa caccctgaaa 480 acctacgacc tgcactgggt gcgcagcgtg ccaggacagg gactgcagtg gatgggctgg 540 atcagccacg agggcgacaa gaaagtgatc gtggaacggt tcaaggccaa agtgaccatc 600 gactgggaca gaagcaccaa caccgcctac ctgcagctga gcggcctgac ctctggcgat 660 accgccgtgt actactgcgc caagggcagc aagcaccggc tgagagacta cgccctgtac 720 gacgatgacg gcgccctgaa ctgggccgtg gatgtggact acctgagcaa cctggaattc 780 tggggccagg gaaccgccgt gaccgtgtca tct 813 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 80 ctgtgcttca aggtccttgt ctgc 24 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 81 ctctgtctcc ttctacagcc aagc 24 <210> 82 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 acacgacgct cttccgatct nnnnngccag gttgagcagg tagatg 46 <210> 83 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized <400> 83 gacgtgtgct cttccgatct gctctactca ctggtgttca tcttt 45

Claims (43)

  1. CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 코딩하며, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있는 것인, 분리된 핵산 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD4 세포외 도메인은 서열번호 3 또는 64를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 분리된 핵산 서열.
  3. 제1항에 있어서, 상기 막 횡단 도메인은 핵산 서열 서열번호 4 또는 65에 의해 암호화되는 CD8알파 힌지 및 서열번호 5 및 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 막 횡단 도메인을 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시그널링 도메인은 서열번호 6 또는 68을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 CD3제타 시그널링 도메인을 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  5. 제1항에 있어서, 보조 자극 (costimulatory) 시그널링 영역을 추가로 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  6. 제5항에 있어서, 상기 보조 자극 시그널링 영역은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), DAP12, OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 유래 보조 자극 시그널링 영역, 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 보조 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  7. 제6항에 있어서, 상기 보조 자극 시그널링 영역은 CD28이고 서열번호 9 또는 67을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 분리된 핵산 서열.
  8. 제1항에 있어서, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 엔벨로프 (envelope; Env) 당단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  9. 제1항의 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1, 7, 62 및 63으로 구성되는 군으로부터 적어도 하나를 포함하는 것인, 벡터.
  11. CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 코딩하며, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식하고 결합할 수 있는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CD4 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 46을 포함하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  13. 제11항에 있어서, 상기 막 횡단 도메인은 서열번호 47의 CD8알파 힌지 및 서열번호 48 및 49로 구성되는 군으로부터 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 막 횡단 도메인을 포함하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  14. 제11항에 있어서, 상기 시그널링 도메인은 서열번호 51을 포함하는 CD3제타 시그널링 도메인을 포함하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  15. 제11항에 있어서, 보조 자극 시그널링 영역을 추가로 포함하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  16. 제15항에 있어서, 상기 보조 자극 시그널링 영역은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), DAP12, OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 유래 보조 자극 시그널링 영역, 및 이들의 어떠한 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 보조 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  17. 제16항에 있어서, 상기 보조 자극 시그널링 영역은 CD28이고 서열번호 49를 포함하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  18. 제11항에 있어서, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 엔벨로프 (Env) 당단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 분리된 아미노산 서열.
  19. CD4 세포외 도메인, 막 횡단 도메인 및 시그널링 도메인을 포함하는 막-결합 키메라 수용체를 포함하는 벡터로서, 상기 CD4 세포외 도메인은 HIV 감염 세포를 인식 및 결합할 수 있고, 상기 벡터는 아미노산 서열번호 44 및 45로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 EFα 프로모터를 포함하는 것인, 벡터.
  21. HIV-특이적 결합 도메인, 막 횡단 도메인, 보조 자극 시그널링 영역 및 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하며, 상기 HIV 결합 도메인은 항-HIV 항체 또는 이의 단편인 것인, 분리된 핵산 서열.
  22. 제21항에 있어서, 상기 HIV-특이적 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  23. 제21항에 있어서, 상기 HIV-특이적 결합 도메인은 인간 항체, 인간화 항체 및 이의 단편인 것인, 분리된 핵산 서열.
  24. 제21항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 및 단일 사슬 Fv (scFv)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 분리된 핵산 서열.
  25. 제24항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 13, 17, 21, 25, 29, 57 내지 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  26. 제24항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 12, 16, 20, 24, 28, 75 내지 78 및 79로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 분리된 핵산 서열.
  27. 제21항에 있어서, 상기 HIV-특이적 결합 도메인은 HIV 감염 세포의 표면 또는 HIV 비리온에 특이적으로 결합하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  28. 제21항에 있어서, 상기 보조 자극 시그널링 영역은 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 통상적인 FcR 감마, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체 (TCR), CD8, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, KIR 패밀리 단백질, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 이들의 어떠한 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 보조 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  29. 제21항에 있어서, 상기 시그널링 도메인은 핵산 서열 서열번호 6 또는 68에 의해 암호화되는 CD3제타 시그널링 도메인을 포함하는 것인, 분리된 핵산 서열.
  30. 제21항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호 10, 14, 18, 22, 26, 34, 70 내지 73 및 74로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 분리된 핵산 서열.
  31. 제21항에 있어서, 상기 CAR은 서열번호 11, 15, 19, 23, 27, 35, 52 내지 55 및 56으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인, 분리된 핵산 서열.
  32. 제1항 또는 제21항의 분리된 핵산 서열을 포함하는 변형된 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 세포 독성 T 림프구 (CTL) 및 조절 T 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 변형된 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 핵산 서열은 DNA 및 mRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 변형된 세포.
  35. 제33항에 있어서, 상기 핵산 서열은 전기천공법 (electroporation), 렌티바이러스 (lentivirus)의 사용, 레트로 바이러스의 사용 및 화학적 기반의 형질 감염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 상기 세포 내로 도입되는 것인, 변형된 세포.
  36. 제33항의 변형된 세포를 포함하는 조성물.
  37. 제33항의 세포를 필요로 하는 대상체에서 HIV 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에서, 제33항의 세포의 용도.
  38. 제33항의 변형된 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  39. HIV 감염된 포유 동물에서 세포 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제33항의 변형된 세포의 유효량을 상기 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  40. 제33항의 변형된 세포를 HIV 감염된 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, HIV 감염된 포유 동물을 치료하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 포유 동물에게 자가 유래인 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 포유 동물에게 항레트로바이러스 요법 (HAART)을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 변형된 세포 및 HAART는 상기 포유류에 동시에 투여되는 것인, 방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201890782A1 (ru) * 2015-09-22 2018-09-28 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Способ перенацеливания t-клеток для лечения инфекции hiv
EA201891028A1 (ru) 2015-10-25 2019-02-28 Санофи Триспецифические и/или тривалентные связывающие белки для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой hiv
RS64771B1 (sr) 2016-04-13 2023-11-30 Sanofi Sa Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini
IL262241B2 (en) 2016-04-13 2024-05-01 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins with an arm that has a cross-linking dual variable domain and a traditional FAB antibody arm, the pharmaceutical composition that includes said binding proteins and their uses in the prevention and/or treatment of cancer or inflammatory diseases
US20200061117A1 (en) * 2017-05-08 2020-02-27 The Regents Of The University Of California Protective Chimeric Antigen Receptor Stem Cell Gene Therapy for Viral Infection
WO2019084018A1 (en) * 2017-10-23 2019-05-02 City Of Hope CAR FOR THE TREATMENT OF HIV INFECTION
CN108059675B (zh) * 2017-12-12 2021-09-10 武汉波睿达生物科技有限公司 重组pg9-car分子的构建及其在清除hiv-1感染细胞中的应用
US20210275589A1 (en) * 2018-07-13 2021-09-09 Nanjing Legend Biotech Co. Ltd. Co-receptor systems for treating infectious diseases
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
CN110358793A (zh) * 2019-05-30 2019-10-22 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种用于car-t制备的慢病毒载体制备方法
CN110343175B (zh) * 2019-06-26 2021-02-26 深圳市再生之城生物医药技术有限公司 抑制HIV-1病毒感染的scFv序列及其应用
AU2021232603A1 (en) * 2020-03-03 2022-10-20 American Gene Technologies International Inc. On demand expression of exogenous factors in lymphocytes to treat HIV
CN116917313A (zh) * 2021-12-31 2023-10-20 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 靶向hiv感染细胞的嵌合抗原受体t细胞

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
WO1993006216A1 (en) * 1991-09-26 1993-04-01 Oklahoma Medical Research Foundation Fusion proteins targeted to lysosomes, for the treatment of aids
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
CZ293943B6 (cs) * 1994-08-02 2004-08-18 Theágeneraláhospitalácorporation Způsob výroby buňkyŹ která exprimuje membránově vázaný bílkovinný chimerní receptorŹ příbuzné molekuly a materiály
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
CN107699585A (zh) 2010-12-09 2018-02-16 宾夕法尼亚大学董事会 嵌合抗原受体‑修饰的t细胞治疗癌症的用途
WO2013044225A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A universal immune receptor expressed by t cells for the targeting of diverse and multiple antigens
US9447194B2 (en) 2012-02-13 2016-09-20 Seattle Children's Hospital Bispecific chimeric antigen receptors and encoding polynucleotides thereof
KR102332322B1 (ko) * 2012-07-13 2021-12-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 형질도입된 ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
EP3027755B1 (en) 2013-08-02 2019-10-09 The Regents of The University of California Engineering antiviral t cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors
US10144770B2 (en) * 2013-10-17 2018-12-04 National University Of Singapore Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
AU2014352638B2 (en) * 2013-11-25 2018-08-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors to control HIV infection
EP3104866A4 (en) 2014-02-14 2017-08-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide
CN107074929B (zh) * 2014-05-02 2021-09-03 宾夕法尼亚大学董事会 嵌合自身抗体受体t细胞的组合物和方法
EA201890782A1 (ru) * 2015-09-22 2018-09-28 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Способ перенацеливания t-клеток для лечения инфекции hiv

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