CZ293943B6

CZ293943B6 - Způsob výroby buňkyŹ která exprimuje membránově vázaný bílkovinný chimerní receptorŹ příbuzné molekuly a materiály

Info

Publication number: CZ293943B6
Application number: CZ1997264A
Authority: CZ
Inventors: Seedábrian; Banapourábabak; Romeoácharles; Kolanusáwaldemar
Original assignee: Theágeneraláhospitalácorporation
Priority date: 1994-08-02
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2004-08-18
Also published as: CN1142941C; CA2195653A1; HK1002545A1; FI970428A; PL181085B1; NZ291017A; KR100384249B1; EP0781095A4; CZ26497A3; ES2191058T3; MX9700800A; IL114778A; AU697489B2; HUT77253A; NO325081B1; CN1158552A; EP0781095A1; CA2195653C; JPH10503932A; FI970428A0

Abstract

Způsob výroby buňkyŹ která exprimuje membránově vázaný bílkovinný chimérní receptorŹ spočívající v tomŹ že se zavede do uvedené buňky nukleová kyselina kódující chimérní receptorŹ jenž obsahuje extracelulární částŹ jež zahrnuje fragment CD@Ź který je schopný specificky rozpoznávat a vázat HIV@infikované buňkyŹ ale který nezprostředkovává infekci HIVŹ membránově vázaný bílkovinný chimérní receptorŹ jenž obsahuje extracelulární částŹ jež zahrnuje fragment CD@Ź který je schopný specificky rozpoznávat a vázat řečené HIV@infikované buňkyŹ ale který nezprostředkovává infekci HIVŹ DNA kódující membránově vázaný bílkovinný chimérní receptor a vektor obsahující DNA chimérního receptoruŕ

Description

Způsob výroby buňky, která exprimuje membránově vázaný bílkovinný chimerní receptor, příbuzné molekuly a materiály

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby buňky, která exprimuje membránově vázaný bílkovinný chimerní receptor, receptorů, jež obsahují fragmenty CD4, které vážou HIV, ale nedávají hostitelským buňkám schopnost podléhat infekci HIV, DNA kódující membránově vázaný bílkovinný chimerní receptor a vektoru obsahujícího DNA chimemího receptorů.

Dosavadní stav techniky

Rozeznání antigenu T buňkami prostřednictvím T-buňkového receptorů je základem řady imunologických fenoménů. T buňky řídí to, co se nazývá imunitou zprostředkovanou buňkami. Ta zahrnuje destrukci cizích tkání nebo infikovaných buněk buňkami imunitního systému. Existuje řada různých T buněk, včetně „pomocných“ [helper] a „potlačovacích“ [supressor], které modulují imunitní systém, a cytotoxických (neboli „zabíjecích“, [killer]), které mohou zabíjet abnormální buňky přímo.

T buňka, která rozezná a naváže unikátní antigen exponovaný na povrchu jiné buňky, se stává aktivovanou: Může se dělit, a pokud je cytotoxickou buňkou, může zabít navázanou buňku.

HIV a imunopatogeneze

V roce 1984 bylo pro HIV zjištěno, že je etiologickým agens AIDS. Od této doby byla definice AIDS mnohokrát revidována s ohledem na to, která kritéria se mají zahrnout do diagnózy. Přes toto kolísání v diagnostických parametrech je však jednoduchým společným jmenovatelem AIDS infekce virem HIV a následný vývoj přetrvávajících a konstitutivních symptomů a AIDS-definovaných onemocnění, jako jsou druhotné infekce, neoplazma a neurologická onemocnění. Harrisonů Principles of Interna! Medicine, 12. vyd., McGraw Hill (1991).

HIV je lidský retrovirus ze skupiny lentivirů. Čtyři uznávané lidské retroviry patří do dvou rozdílných skupin: lidské T lymfotropní (nebo leukemické) retroviry, HTLV-1 a HTLV-2, a lidské viry imunodeficience, HIV-1 a HIV-2. Viry prvně jmenované skupiny jsou transformující viry, zatímco druhé jsou cytopatické viry.

HIV-1 byl identifikován jako nejběžnější původce AIDS po celém světě. Sekvenční homologie mezi HIV-2 a HTV-1 je kolem 40 % s tím, že HIV-2 je blíže příbuzný k některým členům skupiny opičích virů imunodeficience (SIV). Viž Curran et al., Science 329:1357-1359 (1985); Weiss et al., Nátuře 324:572-575 (1986).

HIV má běžné retrovirové geny (env, gag a pol), jakož i šest dalších genů, jež jsou zapojeny do replikace a dalších biologických aktivit viru. Jak se již uvedlo výše, společným jmenovatelem AIDS je výrazná imunosuprese, převážně imunity zprostředkované buňkami. Toto potlačení imunity vede k řadě oportunistických onemocnění, zvláště určitých druhů infekcí a neoplazmy.

Jako hlavní příčina imunitního defektu při AIDS byla identifikována kvantitativní a kvalitativní nedostatečnost v T4 populaci, v jedné z podtříd lymfocytů odvozených z thymu, (T lymfocytů). Tato podtřída buněk je fenotypicky definována přítomností CD4 povrchové molekuly, pro niž bylo prokázáno, že je receptorem pro HIV. Dalgleish et al., Nátuře 312:763 (1984). I když T4 buňky jsou hlavním typem buněk infikovaných HIV, schopnost vázat HIV a být HIV infikována má v podstatě každá lidská buňka exprimující CD4 molekulu na svůj povrch.

-1 CZ 293943 B6

Tradičně je CD4⁺ T buňkám připisována role pomocných/induktorových buněk, což ukazuje na jejich funkci v zajištění a aktivování signálu B buňkám, nebo indukování T lymfocytů nesoucích reciproční CD8 markér ktomu, aby se staly cytotoxickými/potlačovacími buňkami. Reinherz a Schlossman, Cell 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68:5-42 (1982).

HIV se váže specificky a s vysokou afinitou, prostřednictvím úseku aminokyselin v bílkovině virového obalu (gpl20), k části VI oblasti CD4 molekuly, lokalizované v jejím N-konci. Po navázání virus fúzuje s membránou cílové buňky a je intemalizován. Jakmile je intemalizován, použije enzym reverzní transkriptázu k transkripci své genomové RNA na DNA, jež je zaintegrována do buněčné DNA, kde existuje po dobu života buňky jako „provirus“.

Provirus může zůstat latentní nebo být aktivován k transkripci mRNA a genomové RNA, vedoucí syntéze bílkovin, skládání, tvorbě nových virionů, a pučení viru z buněčného povrchu. I když přesný mechanismus, jímž virus indukuje smrt buňky, nebyl stanoven, má se za to, že hlavním mechanismem je masivní pučení viru z buněčného povrchu, jež vede k rozkladu plazmatické membrány a výsledné osmotické nerovnováze.

V průběhu infekce vyvíjí hostitelský organizmus protilátky proti virovým bílkovinám, včetně hlavních obalových glykoproteinů gpl20 a gp41. Navzdory této humorální imunitě nemoc pokračuje, s výslednou letální imunosupresí, charakterizovanou parazitémií, demencí a smrtí. Neschopnost hostitelských protivirových protilátek zadržet postup choroby představuje jeden z nejvíce znepokojivých a alarmujících aspektů infekce, a nevěstí nic dobrého pro snahy o vakcínaci, založené na konvenčních přístupech.

V účinnosti humorální imunity na viry imunodeficience mohou hrát roli dva faktory. A prvé: Podobně jako jiné RNA viry (a jeho retroviry obzvlášť) vykazují viry imunodeficience vysokou mutační rychlost v odpovědi na omezující působení hostitelské imunity. Za druhé: Obalové glykoproteiny samotné jsou silně glykosylované molekuly, jež prezentují málo epitopů pro vazbu protilátek s vysokou afinitou. Špatný antigenní cíl, jež virový obal představuje, poskytuje hostiteli málo příležitostí pro omezení virové infekce tvorbou specifických protilátek.

Buňky infikované virem HIV exprimují glykoprotein gpl20 na svůj povrch. Gpl20 zprostředkovává kroky fúze mezi CD4⁺ buňkami prostřednictvím reakce podobné té, v níž virus vstupuje do neinfikované buňky, což vede ke tvorbě krátce žijících multijademých obrovských buněk. Tvorba syncytií je závislá na přímé interakci obalového glykoproteinů gpl20 s bílkovinou CD4. Dalgleish et al., Science 231:382 (1986); Sodroski et al., Nátuře 322:470 (1986); Lifson et al., Nátuře 323:725 (1986); Sodroski et al., Nátuře 321:412 (1986).

Důkazy, že vazba CD4-gpl20 je zodpovědná za virovou infekci buněk nesoucích CD4 antigen, zahrnují nález, že mezi gpl20 a CD4 se vytváří specifický komplex (McDougal et al., výše). Jiní badatelé ukázali, že buněčné linie, které nebyly infikovatelné HIV, byly konvertovány na infikovatelné buňky po transfekci a expresi cDNA lidského CD4 genu. Maddon et al., Cell 46:333-348 (1986).

Terapeutické programy založené na rozpustném CD4 jako na pasivním činidlu pro interferenci s virovou adsorpcí a buněčným přenosem zprostředkovaným syncytiemi byly navrženy a úspěšně demonstrovány in vitro řadou skupin (Deen et al., Nátuře 331:82-84 1988); Fisher et al., Nátuře 331:76-78 (1988); Hussey et al., Nátuře 331:78-81 (1988); Smith et al., Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nátuře 331:84—86 (1988)); a následně byly vyvinuty fúzní CD4 imunoglobulinové bílkoviny s prodlouženým poločasem života a mírnou biologickou aktivitou (Capon et al., Nátuře 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nátuře 339:68-70 (19889); Bym et al., Nátuře 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)). I když CD4 imunotoxinové konjugáty nebo fúzní bílkoviny vykazují účinnou cytotoxicitu k infikovaným buňkám in vitro (Chaudhary et al., Nátuře 335:369-372 (1988); Till et al., Science 242:1166-1168 (1988)), latence syndromu imunodeficience činí nepravděpodobným, že by

-2CZ 293943 B6 jakákoli jednorázová terapie byla účinná v eliminaci virové zátěže, a antigenicita cizích fuzních bílkovin bude pravděpodobně omezovat jejich přijatelnost pro léčbu vyžadující opakované dávkování. Zkoušky s opicemi ovlivněnými SIV ukázaly, že rozpustný CD4 může, když je podáván zvířatům bez význačné CD4 cytopenie, snižovat titr SIV a zlepšovat in vitro ukazatele myeloidního potenciálu (Watanabe et al., Nátuře 337:267-270 (1989)). Pozorovalo se však promptní znovuobjevení viru po přerušení léčby, což napovídá, že pro zábranu postupného zeslabování imunitního systému by bylo potřebné podávání po celou délku života.

T buňky a Fc receptory

Exprese nejhojnější formy T-buňkového antigenového receptoru (TCR) na buněčný povrch vyžaduje koexpresi přinejmenším šesti distinktních polypeptidových řetězců (Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nátuře 316:606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)): α/β antigen vážících řetězců, tří polypeptidů CD3 komplexu a ζ. Když kterýkoli z těchto řetězců chybí, nenásleduje stabilní exprese zbývajících složek komplexu, ζ je limitující polypeptid exprese na povrch (Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)) a soudí se o něm, že zprostředkovává přinejmenším část buněčných aktivačních programů spuštěných rekognicí ligandu receptorem (Weissman et al., EMBO J. 8:3651-3656 (1989); Frank et al„ Science 249:174-177 (1990). 32 kDa integrální membránový homodimer typu I, ζ (zeta) má extracelulámí doménu o 9 zbytcích bez míst pro N-vazebnou adici glykanu, a intracelulámí doménu o 112 zbytcích (myší) nebo 113 zbytcích (lidský) (Weissman et al., Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). Isoforma ζ, nazývaná η (eta) (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989)), která vzniká z alternativní cesty sestřihu (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)) je přítomná v buňkách exprimujících antigenový receptor ve sníženém množství. O heterodimerech ζ-η se soudí, že zprostředkovávají tvorbu inositol fosfátů, jakož i receptorem iniciovanou programovou smrt buněk, zvanou apoptosa (Mercep et al., Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)).

Podobně jako ζ a η, je γ (gama) řetězec spojený s Fc receptorem exprimován v komplexech buněčného povrchu společně s dalšími polypeptidy, z nichž některé zprostředkovávají rekognici ligand a z nichž jiné nemají definovanou funkci, τ má homodimerickou strukturu a celkovou organizaci velice podobnou ζ, a je složkou jak vysoce afinitního IgE receptoru žímých buněk/basofilů, FceRI, jenž sestává z přinejmenším tří polypeptidových řetězců (Blank et al., Nátuře 337:187-189 (1989); Ra et al., Nátuře 241:752-754 (1989)), tak jednoho z nízkoafinitních receptorů pro IgG, reprezentovaného v myších expresí FcxRIIa (Ra et al., J. Biol. Chem. 264:15323-15327 (1989)), a u člověka expresí podtypu CD16 makrofágy a přirozenými zabíjecími buňkami, CD tm (transmembránového CD 16) (Lanier et al., Nátuře 342:803-805 (1989); Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)) a s polypeptidem o neidentifikované funkci (Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Nedávno bylo oznámeno, že γ je exprimován v jedné myší linii T-buněk, CTL, v níž tvoří jak homodimery, tak γ-ζ a γ-η heterodimery (Orloff et al., Nátuře 347:189-191 (1990)).

Fc receptory zprostředkovávají fagocytosu imunních komplexů a na protilátce závislou buněčnou cytotoxicitu (ADCC) (Ravetch a Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless et al., Annu Rev. Immunol. 6:251-281 (1988); a Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Nedávno se ukázalo, že jedna zisoforem myšího nízkoafmitního Fc receptoru, FcRxIIIBl, zprostředkovává intemalizaci Ig-pokrytých cílů do klatrinem pokrytých prohloubenin a že jiný nízkoafinitní receptor, FcRxIIIA, zprostředkovává ADCC svou asociací s jedním nebo více členy malé rodiny „spouštěcích molekul“ (Miettinem et al., Cell 58:317-327 (1989); a Hunziker a Mellman, J. Cell. Biol. 109:3291-3302 (1989)). Tyto spouštěcí molekuly, ζ řetězec T-buňkového receptoru (TCR), η řetězec TCR a γ řetězec Fc receptoru interagují s doménami rekognice ligandu receptorů různých imunitních systémů a mohou autonomně iniciovatprogramy

-3 CZ 293943 B6 buněčných efektorů, včetně cytolýzy následující po agregaci (Samelson et al., Cell 43:223-231 (1985); Weissman et al., Science 238:1018-1020 (1988); Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990); Lanier et al., Nátuře 342:803-805 (1989); Kurosaki a Ravetch, Nátuře 342, 805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); a Irving a Weiss, Cell 64:891-901 (1991)).

Při vytváření paralel mezi myšími a lidskými rodinami nízkoafinitních Fc receptorů vyšlo však najevo, že lidské izoformy FcRylIA a C nemají žádný myší protějšek. Zčásti proto musí být jejich funkce teprve definována.

Protože humorální činidla založená na CD4 mohou samotná mít jen omezené použití in vivo, předcházející práce zkoumaly možnost zesílení buněčné imunity kHIV. Byly identifikovány prvky transdukce signálu u preparátů bílkovinných chimér, v nichž je extracelulámí doména CD4 fúzovaná k transmembránovým nebo intracelulámím doménám T-buňkového receptorů, IgG Fc receptorů nebo B-buňkového receptorů (US patent 5 843 728, zahrnuto zde odkazem). Cytolytické T buňky exprimující chiméry, jež obsahují extracelulámí doménu CD4 vykazují potentní, na MHC nezávislou destrukci buněčných cílů exprimujících obalové bílkoviny HIV. Krajně důležitou a novou složkou tohoto přístupu byla identifikace jednoduchých řetězců T-buňkového receptorů, Fc receptorů nebo B-buňkového receptorů, jejichž agregace postačuje k iniciaci buněčné odezvy. Jednou ze zvláště užitečných aplikací tohoto přístupu je vynález chimér mezi CD4 ζ, η nebo γ, které směrují cytolytické T lymfocyty k rozeznání a zabití buněk exprimujících HTV gpl20 (US patent 5 843 728, zahrnuto zde odkazem).

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob výroby buňky, která exprimuje membránové vázaný bílkovinný chimerní receptor, vyznačující se tím, že zavede do uvedené buňky nukleová kyselina kódující chimemí receptor, jenž zahrnuje fragment CD4, který je schopný specificky rozpoznávat a vázat HlV-infikované buňky, ale který nezprostředkovává infekci HIV, a tento receptor působí jako lákadlo pro HIV k navázání cirkulujících HIV a tím redukuje titr viru.

Obecně vynález obsahuje způsob směrování buněčné imunitní odpovědi proti HlV-infikovaným buňkám v savci. Způsob zahrnuje podávání účinného množství terapeutických buněk savci, přičemž terapeutické buňky exprimují membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor, obsahující a) extracelulámí část, která obsahuje fragment CD4, jenž je schopen specificky rozeznat a vázat HlV-infikované buňky, ale jenž nezprostředkuje infekci HIV, a b) intracelulámí část, jež je schopna signalizovat terapeutickým buňkám ničení HlV-infikovaných buněk vázaných k tomuto receptorů.

V příbuzném ohledu obsahuje vynález buňky, jež exprimují bílkovinný, membránově vázaný chimemí receptor, obsahující a) extracelulámí část, která obsahuje fragment CD4, jenž je schopen specificky rozeznat a vázat HlV-infikované buňky, ale jenž nezprostředkuje infekci HIV, a b) intracelulámí část, jež je schopna signalizovat terapeutickým buňkám ničení HlV-infikovaných buněk vázaných ktomuto receptorů.

V druhém ohledu vynález obsahuje způsob léčby HIV v savci, zahrnující podávání účinného množství terapeutických buněk savci, přičemž terapeutické buňky exprimují membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor, obsahující extracelulámí část, která obsahuje fragment CD4, jenž je schopen specificky rozeznat a vázat HlV-infikované buňky, ale jenž nezprostředkuje infekci HIV.

V příbuzném ohledu obsahuje vynález buňky, jež exprimují membránově vázaný bílkovinný chimerní receptor, obsahující extracelulámí část, která obsahuje fragment CD4, jenž je schopen specificky rozeznat a vázat HlV-infikované buňky, ale jenž nezprostředkuje infekci HIV.

-4CZ 293943 B6

Ve výhodných provedeních je jak u prvního, tak u druhého aspektu CD4 fragmentem úsek aminokyselin 1 - 394 z CD4 nebo úsek aminokyselin 1 - 200 z CD4; fragment CD4 je separován od intracelulární části CD7 transmembránovou doménou, ukázanou v Obr. 26 nebo ohebnou spojkou [hinge], CH2 a CH3 doménami molekuly lidského IgGl, ukázanými v Obr. 25; a CD4 fragment je separován od terapeutické buňky alespoň 48 angstromy (a s výhodou alespoň 72 angstromy). Ve výhodném provedení je u prvního aspektu intracelulární částí signál-transdekující část T-buňkové receptorové bílkoviny (například ζ), B-buňkové receptorové bílkoviny nebo Fc receptorové bílkoviny; a terapeutické buňky jsou vybrány ze skupiny sestávající z: a) T lymfocytů, b) cytotoxických T lymfocytů, c) přirozených zabíjecích buněk, d) neutrofílů, e) granulocytů, f) makrofágů, g) žímých buněk, h) HeLa buněk, a i) embiyonálních kmenových buněk (ES).

V příbuzném ohledu obsahuje vynález DNA, kódující chimemí receptor podle vynálezu a vektor, jenž obsahuje tuto DNA chimemího receptoru.

I když konkrétním provedením tohoto vynálezu je chiméra mezi CD4 a zeta, lze pro účely zde zveřejněné použít jakýkoli receptorový řetězec, jenž má podobnou funkci, jako tyto molekuly, např. v granulocytech nebo vB lymfocytech. Charakteristické vlastnosti žádoucí spouštěcí molekuly imunitní buňky zahrnují schopnost být exprimovánaautonomně (tj. jako jeden řetězec), schopnost být fúzována k extracelulámí doméně CD4 tak, že výsledná chiméra bude přítomná na povrchu terapeutické buňky, a schopnost iniciovat buněčné efektorové programy po agregaci, druhotné vzhledem k setkání s cílovým ligandem.

V současnosti je pro dodání chimér do buněk imunitního systému nejvhodnějším způsobem určitá forma genové terapie. Přesto by měla vést i rekonstituce buněk imunitního systému schimemími receptory pomocí smíchání se vhodně solubilizovanou bílkovinou chimemího receptoru k tvorbě populace „inženýrovaných“ buněk, schopných odezvy k HTV-infikovaným cílům. Podobné přístupy se použily například pro zavedení CD4 molekuly do erythrocytů k terapeutickým účelům. V tomto případě nebude populace „inženýrovaných“ buněk schopna sama se obnovovat.

Tento vynález se týká funkčních a zjednodušených chimér mezi CD4 fragmenty a podjednotkami T-buňkového receptoru, Fc receptoru nebo B-buňkového receptoru, jež jsou schopné směrovat imunitní buňky k rozeznání a lyži HlV-infikovaných buněk. Způsob řízení buněčné odezvy v savci zahrnuje podávání účinného množství terapeutických buněk (například cytotoxických T lymfocytů) savci, přičemž terapeutické buňky jsou schopné rozeznávat a ničit HlV-infikované buňky.

Vynález rovněž zahrnuje chimemí receptorové bílkoviny, jež směrují cytotoxické T lymfocyty k rozeznání a lyži HlV-infikovaných buněk, hostitelské buňky transformované vektorem zahrnujícím chimemí receptory, a protilátky proti chimemím receptorům.

Tato a další neomezující provedení vynálezu budou pro zběhlé zřejmá z následujícího podrobného popisu vynálezu.

V následujícím podrobném popisu se bude odkazovat na různé metodiky známé těm, co jsou zběhlí v oboru molekulární biologie a imunologie. Publikace a jiné materiály udávané u takovýchto metod, na něž se odkazuje, jsou zde zahrnuty odkazem ve své úplnosti, jako kdyby byly udávány v úplné formě.

Standardní odkazy udávané k obecným principům technologie rekombinantní DNA zahrnují Watson et al., Molecular Biology of the Gene, svazky I a II, naki. Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, nakl. Scientific Američan Books, lne., New York, N.Y. (1986); Levin, Genes II, nakl. John Wiley

-5CZ 293943 B6 & Sons, New York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction toGenetic Engineering, 2. vydání, nakl. University of Califomia Press, Berkeley CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, nakl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

Definice „Klonováním“ je míněno použití in vitro rekombinantních technik k inzerci konkrétního genu nebo jiné DNA sekvence do vektorové molekuly.

„cDNA“ je míněna komplementární DNA nebo DNA kopie, vytvořená zRNA templátu působením RNA-dependentní DNA polymerázy (reverzní transkriptázy). „cDNA klonem“ je tedy míněna sekvence DNA duplexu, komplementární k RNA molekule, jež je předmětem zájmu, nesená v klonovacím vektoru.

„cDNA knihovnou“ je míněn soubor molekul rekombinantní DNA, obsahujících inzerty cDNA, jež zahrnují DNA kopie mRNA, jež je exprimována buňkami v čase, kdy se knihovna cDNA vytváří. Takovouto knihovnu cDNA lze připravovat způsoby, které jsou zběhlým známé a popsané například v Ausubel et al., výše a Maniatis et al., výše. Obecně se napřed izoluje RNA z buněk nebo z organizmu, z jehož genomu je žádoucí klonovat konkrétní gen. Výhodné pro účel tohoto vynálezu jsou linie savčích, obzvláště lidských, lymfocytových buněk. V současnosti je výhodným vektorem pro tento účel WR kmen viruvakcínie.

„Vektorem“ je míněna DNA molekula odvozená například zplazmidu, bakteriofága, nebo savčího nebo hmyzího viru, do níž mohou být vkládány, nebo v níž mohou být klonovány, DNA fragmenty. Vektor bude obsahovat jedno nebo více unikátních restrikčních míst a může být schopen autonomní replikace v definovaném hostitelském nebo hnacím organizmu tak, že klonovaná sekvence je reprodukovatelná. „DNA vektorem exprese“ je tedy míněn autonomní element schopný řízení syntézy rekombinantního peptidu. Takovéto DNA vektory exprese zahrnují bakteriální plazmidy a fágy a savčí a hmyzí plazmidy a viry.

„V podstatě čistou“ je míněna sloučenina, např. bílkovina, polypeptid nebo protilátka, jež je v podstatě prostá sloučenin, které ji přirozeně provázejí. Obecně je sloučenina v podstatě čistá, když přinejmenším 60 %, výhodněji přinejmenším 75 % a nejvýhodněji přinejmenším 90 % celkového materiálu vzorku je sloučenina, o niž je zájem. Čistota může být měřena patřičnými metodami, např. kolonovou chromatografií, elektroforézou v polyakrylamidovém gelu, nebo HPLC analýzou. V kontextu nukleové kyseliny znamená „v podstatě čistá“ to, že sekvence, segment nebo fragment nukleové kyseliny není přímo napojen (tj. kovalentně navázán) na sekvence, s nimiž se přímo pojí (tj. s jednou na 3' konci a s jednou na 5' konci) v přirozeně se vyskytujícím genomu organizmu, z něhož je DNA podle vynálezu odvozena.

„Fragment“ molekuly, jako je kterékoli z cDNA sekvencí podle vynálezu, je zamýšlen jako odkaz na jakýkoli podsoubor propojených nukleotidů molekuly. „Analog“ molekuly je zamýšlen jako odkaz na nepřirozenou molekulu podstatně podobnou buď k celé molekule, anebo k jejímu fragmentu. O molekule se říká, že je „podstatně podobná“ jiné molekule, když sekvence aminokyselin v obou molekulách je v podstatě stejná. Obzvláště je „podstatně podobná“ aminokyselinová sekvence taková, jež vykazuje alespoň 50 %, s výhodou 85 % a nejvýhodněji 95 % shody aminokyselinové sekvence s přirozenou nebo referenční sekvencí nebo taková, jež se liší od přirozené nebo referenční sekvence jen konzervativními záměnami aminokyselin. Podstatně podobné aminokyselinové molekuly budou mít podobnou biologickou aktivitu. Jak se zde používá, o molekule se říká, že je „chemickým derivátem“ jiné molekuly tehdy, když obsahuje chemické skupiny, jež nejsou normální součástí molekuly. Takovéto skupiny mohou zlepšovat rozpustnost molekuly, absorpci, biologický poločas, atd. Alternativně mohou tyto skupiny snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat jakékoli nežádoucí vedlejší účinky

-6CZ 293943 B6 molekuly, atd. Skupiny schopné zprostředkovávat takovéto efekty se zveřejňují například v Remingtonů PharmaceuticalSciences, 16. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA. (1980).

„Funkční derivát“ genu receptorové chiméry podle vynálezu je míněn tak, že zahrnuje „fragmenty“ a „analogy“ genu, jež jsou „podstatně podobné“ v nukleotidové sekvenci. „Podstatně podobné“ nukleové kyseliny kódují podstatně podobné aminokyselinové sekvence (jak jsou definovány shora) a mohou rovněž zahrnovat jakoukoli sekvenci nukleové kyseliny schopnou za patřičných hybridizačních podmínek hybridizace s přirozenou nebo referenční sekvencí nukleové kyseliny (k patřičným podmínkám hybridizační „stringence“ viz například Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989)).

„Podstatně podobný“ chimemí receptor má aktivitu podobnou aktivitě receptorové chiméry „divokého typu“ odvozené z T-buňkových, B-buňkových nebo Fc receptorů. Nejvýhodněji má derivát 90 %, výhodněji 70 % a výhodně 40 % aktivity receptorové chimeiy divokého typu. Aktivita funkčního derivátu chimerního receptorů zahrnuje specifickou vazbu (extracelulámí CD4 částí) k HlV-infikovaným buňkám a výslednou destrukci buněk; navíc chimemí receptor nečiní buňky nesoucí receptor susceptibilními k HIV infekci. Aktivitu chimerního receptorů lze testovat například s použitím kteréhokoli zde popsaného testu.

DNA sekvence kódující CD4 receptorovou chiméru podle vynálezu, nebo její funkční deriváty, může být rekombinována s vektorovou DNA podle konvenčních technik, včetně vytváření tupých nebo stupňovitých konců pro ligaci, štěpení restrikčními enzymy k poskytnutí patřičných konců, vyplnění lepivých konců pokud je to patřičné, zpracování alkalickou fosfatázou k zabránění nežádoucího spojování, a ligace patřičnými ligázami. Techniky takovýchto manipulací jsou zveřejněné Maniatisem et al., výše, a jsou v oboru dobře známé.

O molekule nukleové kyseliny, jako je DNA, se říká, že je „schopná exprimovat“ polypeptid tehdy, když obsahuje nukleotidové sekvence, které obsahují transkripční a translační regulační informace a když takovéto sekvence jsou „funkčně spojeny“ s nukleotidovou sekvencí, která kóduje polypeptid. Funkční spojení je spojení, v němž jsou regulační DNA sekvence a DNA sekvence zamýšlená pro expresi spojeny způsobem, jenž umožní genovou expresi. Přesný charakter regulačních oblastí potřebných pro genovou expresi se může lišit od organizmu k organizmu, ale obecně bude zahrnovat promotorovou oblast, která v prokaryotech obsahuje jak promotor (jenž řídí iniciaci RNA transkripce), tak i DNA sekvence, které budou, když jsou přepsány do RNA, signalizovat iniciaci proteosyntézy. Takovéto oblasti budou normálně obsahovat 5'-nekódující sekvence zapojené do iniciace transkripce a translace, jako je TATA box, sekvence „čepičky“, CAAT sekvence, a podobně.

Když je to žádoucí, může být shora popsanými způsoby získána nekódující oblast ve 3' směru od sekvence genu kódujícího bílkovinu. Tato oblast může být zachována pro své transkripčněterminační regulační sekvence, jako je terminace a polyadenylace. Zachováním 3' oblasti přirozeně navazující na DNA, jež kóduje bílkovinu, mohou být tedy poskytnuty signály transkripční terminace. Tam, kde transkripční terminační signály nejsou uspokojivě funkční, mohou pak být nahrazeny 3' oblastmi funkčními v hostitelských buňkách.

O dvou DNA sekvencích (jako je sekvence promotorové oblasti a sekvence kódující CD4-receptorovou chiméru) se říká, že jsou funkčně spojené tehdy, když charakter spojení mezi těmito dvěma DNA sekvencemi 1) nevede ke vnesení mutace posunem čtecího rámce, 2) neinterferuje se schopností sekvence promotorové oblasti řídit transkripci sekvence genu receptorové chiméry, a 3) neinterferuje se schopností sekvence genu receptorové chiméry být transkribována ze sekvence této promotorové oblasti. Promotorová oblast bude funkčně spojená s DNA sekvencí tehdy, když její promotor bude schopen určovat transkripci této DNA sekvence. Pro expresi bílkoviny jsou tudíž potřebné transkripční a translační signály rozeznávané patřičným hostitelem.

-7CZ 293943 B6

Tento vynález zahrnuje expresi bílkoviny CD4-receptorové chiméry (nebo jejího funkčního derivátu) jak v prokaryotických, tak v eukaryotických buňkách, i když výhodná je eukaryotická exprese (obzvlášť v lidských lymfocytech).

Protilátky podle tohoto vynálezu lze připravit kteroukoli z řady různých metod. Například: Buňky exprimující bílkovinu CD4-receptorové chiméry nebo jejího funkčního derivátu lze podávat zvířeti s účelem indukovat tvorbu séra, obsahujícího polyklonální protilátky, jež jsou schopné vázat se na tuto chiméru.

U výhodné metody jsou protilátkami podle vynálezu monoklonální protilátky. Takovéto monoklonální protilátky lze připravovat s použitím hybridomové technologie (Kohler et al., Nátuře 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., v Monoclonal Antibodies cm T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., str. 563-684 (1981)). Obecně takovýto postup zahrnuje imunizaci zvířete s CD4-receptorovou chimérou jako antigenem. Splenocyty takovéhoto zvířete se vyjmou a fúzují s buňkami vhodné myelomové linie. V souladu s tímto vynálezem lze použít jakoukoli vhodnou myelomovou buněčnou linii. Po fúzi se výsledné hybridomové buňky selektivně udržují na HAT médiu a pak klonují limitujícím ředěním, jak je popsáno Wandsem et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Hybridomové buňky získané takovouto selekcí se pak testují k identifikaci klonů, jež secrenují protilátky schopné vázat se na chiméru.

Protilátky podle vynálezu mohou být rovněž polyklonální, s výhodou polyklonální protilátky specifické k určité oblasti.

Protilátky proti CD4-receptorové chiméře podle tohoto vynálezu mohou být použity k monitorování množství chimemího receptoru (nebo buněk nesoucích chimemí receptor) v pacientovi. Takovéto protilátky jsou velmi vhodné pro použití ve standardních imunodiagnostických testech známých v oboru, včetně takových imunometrických nebo „sendvičových“ testů, jakými jsou přímé sendvičové, reverzní sendvičové a simultánní sendvičové testy.

Standardní odkazové práce, jež podávají obecné základy imunologie zahrnují: Roitt, Essential Immunology, 6. vydání, nakl. Blackewell Scientifíc Publications, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2. vydání, nakl. Macmillan Publishing Co., New York (1986); Roitt et al., Immunology, nakl. Gower Medical Publishing Ltd., London, (1985); Campbell, „Monoclonal Antibody Technology“ v Burdon et al., vyd., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, svazek 13, nakl. Elsevier, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, nakl. John Wiley & Sons, New York (1982); a Kennett et al., vyd., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New dimension in Biological Analyses, nakl. Plenům Press, New York (1980).

„Detekce“ je myšlena tak, že zahrnuje stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti látky, nebo kvantifikaci množství látky. Tento výraz tedy odkazuje na použití materiálů, prostředků a způsobů podle tohoto vynálezu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení.

Protilátky a v podstatě vyčištěný antigen podle vynálezu jsou ideálně vhodné pro přípravu soupravy. Takováto souprava může obsahovat nosičové prostředky, rozdělené pro umístění (v těsném omezení) jednoho nebo více nádobkových prostředků, jako jsou lahvičky, zkumavky a podobně, přičemž řečené nádobkové prostředky budou obsahovat oddělené součásti testu, jenž se má použít.

Typy testů, jež mohou být zabudovány do formy soupravy, jsou mnohé, a zahrnují například kompetitivní a nekompetitivní testy. Typické příklady testů, jež mohou využívat protilátky podle vynálezu, jsou radioimunotesty (RIA), enzymové imunotesty (EIA), s enzymy spojené imunoadsorbentové testy (ELISA) a imunometrické, nebo sendvičové, imunotesty.

-8CZ 293943 B6

U výrazu „imunometrický test“ nebo „sendvičový test“ se rozumí, že zahrnuje simultánní sendvičové, přímé sendvičové a reverzní sendvičové imunotesty. Ti, kdo jsou zběhlí v oboru, těmto výrazům dobře rozumí. Ti, kdo jsou zběhlí, rovněž uznají, že protilátky podle tohoto vynálezu budou užitečné i v jiných variacích a formách, než jsou v současnosti známé, a jež mohou být vyvinuty v budoucnosti. Ty jsou zamýšleny jako součást zahrnutá do rozsahu tohoto vynálezu.

„Specificky rozeznává a váže“ je míněno tak, že protilátka rozeznává a váže polypeptid chimemího receptoru, ale nebude podstatně rozeznávat a vázat jiné nepříbuzné molekuly ve vzorku, např. v biologickém vzorku.

„Terapeutickou buňkou“ je míněna buňka, jež je transformována CD4-receptorovou chimérou podle vynálezu tak, že je schopna rozeznat a rozložit HlV-infikovanou buňku; s výhodou jsou takovýmito terapeutickými buňkami buňky hematopoetického systému.

„Extracelulámím“ je míněno, že má alespoň část molekuly exponovanou na povrchu buňky. „Intracelulámím“ je míněno, že má alespoň část molekuly exponovanou k cytoplazmě terapeutické buňky. „Transmembránovým“je míněno, že má alespoň část molekuly procházející plazmatickou membránou. „Extracelulámí část“, „intracelulární část“ a „transmembránová část“, jak se zde používají, mohou zahrnovat obklopující aminokyselinové sekvence, jež zasahují do přilehlých buněčných kompartmentů.

„Oligomerizovat“ znamená vstupovat do komplexu sjinými bílkovinami za tvorby dimerů, trimerů, tetramerů a jiných oligomerů vyššího řádu. Takovéto oligomery mohou být homo-oligomery a hetero-oligomery. „Oligomerizační část“ jeta část molekuly, která řídí tvorbu komplexu (tj. oligomerů).

„Cytolytickým“ je míněno být schopným rozkládat buňku (např. HlV-infikovanou buňku) nebo být schopným rozkládat infekční agens (např. HIV virus).

„Virem imunodeficience“ je míněn retrovirus, který je ve formě divokého typu schopný infikovat T4 buňky primárního hostitele a má virovou morfogenezi a morfologii charakteristickou pro pod-rodinu lentivirů. Tento výraz zahrnuje, ale bez omezení, všechny varianty HIV a SIV, včetně HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand a SIVcpz.

„Na MHC nezávislý“ znamená, že buněčná cytolytická odpověď nevyžaduje přítomnost antigenu MHC, třídy II, na povrchu cílové buňky.

„Funkčním, cytolytický signál-transdukujícím derivátem“ je míněn funkční derivát (jak je definován shora), jenž je schopný řízení alespoň 40 %, výhodněji 70 %, nebo nejvýhodněji alespoň 90 % biologické aktivity molekuly divokého typu. Jak se zde používá, „funkční, cytolytický signál-transdukující derivát“ může působit tak, že přímo signalizuje terapeutické buňce rozložení receptorově vázaného agens nebo buňky (např. v případě intracelulární části chimemího receptoru), nebo může působit nepřímo prostřednictvím podpory oligomerizace s bílkovinami terapeutické buňky transdukujícími cytolytický signál (např. v případě transmembránové domény). Takovéto deriváty mohou být testovány na účinnost, např. s použitím zde popsaných in vitro testů.

„Funkčním derivátem vážícím obal HIV“ je míněn funkční derivát (jak je definován shora), jenž je schopný vázat kteroukoli bílkovinu obalu HIV. Funkční deriváty mohou být identifikovány např. s použitím zde popsaných in vitro testů.

-9CZ 293943 B6

Terapeutické podávání

Transformované buňky podle vynálezu se používají k terapii viru imunodefícience. Současné metody podávání takovýchto transformovaných buněk zahrnují adoptivní imunoterapii nebo terapii buněčným přenosem. Tyto metody umožňují navrácení transformovaných buněk imunitního systému do krevního řečiště. Rosenberg, Sci. Ám. 62 (květen 1990); Rosenberg et al., N. Eng. J Med. 323:570 (1990).

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou být podávány jakémukoli živočichovi, u něhož se projeví příznivé účinky látek podle vynálezu. Předními mezi takovýmito živočichy jsou lidé, i když u vynálezu není zamýšleno takovéto omezení.

Podrobný popis

Napřed se popisují obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A představuje aminokyselinové sekvence kolem místa fuze mezi CD4 (zbytky 1-369) a různými receptorovými řetězci (SEKV. ID. Č. 38 - 41). Podtržená sekvence ukazuje aminokyseliny kódované v rámci BamHI místa použitého pro konstrukci fuze. Začátek transmembránové domény je vyznačen svislou čárou. Sekvence n je identická se sekvencí ζ v amino-konci, ale odlišná v karboxy-konci (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). OBR. 1B představuje proudově cytometrickou analýzu povrchové exprese CD4, Οϋ4:ζ, CD4:y a CD4:r] v CV1 buňkách. Buňky byly infikovány virem exprimujícím CD4 chiméry nebo CD16pi, inkubovány po 9 hodin při 37 °C, a barveny anti-CD4 MAb Leu3A, konjugovanou s fykoerythrinem.

Obr. 2 ukazuje povrchovou expresi CD 16™ po koinfekci s CD 16™ samotným (husté tečkování), nebo koinfekci s virem exprimujícím CD4:t (čárkovaně) nebo Οϋ4:ζ (plná čára). Řídké tečkování: Buňky infikované CD4:C samotným, barvené 3G8 (Fleit et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:3275-3279 (1982)) (anti-CD16 MAb).

Obr. 3 ukazuje povrchovou expresi CD16™ po koinfekce viry exprimujícími CD16™ samotný a následující ζ chiméry: Οϋ4:ζ (silná čára), Οϋ4:ζ Cl 1G (plná čára), Οϋ4:ζ (přerušovaná čára), CD4^ Cl 1G/D15G (husté tečkování); bez koinfekce (CD 16™ samotný, řídké tečkování). Buňky byly inkubovány santi-CD16 MAb 3G8 a Fab'₂ kozími protilátkami k myším IgG konjugovanými s fykoerythrinem. Hladina exprese ζ chimér byla v podstatě identická pro různé analyzované mutanty, a koinfekce s různými viry exprimujícími CD 16™ samotný a ζ chiméry neměnila znatelně povrchovou expresi chimér.

Obr. 4 A-D ukazuje zvýšený intracelulámí volný vápníkový iont po provázání mutantních ζ chimér v T-buněčné linii. Jurkat E6 buňky (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) byly infikovány rekombinantními viry vakcínie a analyzovány proudovou cytometrií. Předvedené výsledky jsou pro vymezenou CD4⁺ populaci, takže jsou analyzovány pouze buňky exprimující relevantní chimemí bílkovinu. Střední poměr fialové k modré Indo-1 fluorescenci odráží intracelulámí koncentraci volného vápníku v populaci jako celku, a procento odpovídajících buněk odráží frakci buněk, které přesáhnou předem určený prahový poměr (nastavený tak, že 10 % nezpracovaných buněk je pozitivních). Obr. 4A a Obr. 4B ukazují Jurkat buňky exprimující Οϋ4:ζ (plná čára) a Ο016:ζ (přerušovaná čára), jež byly vystaveny anti-CD4 MAb Leu3A (konjugované s fykoerythrinem), s následným provázáním s kozí protilátkou k myším IgG. Tečkovaná čára ukazuje odpověď neinfikovaných buněk kanti-CD3 MAb OKT3. Obrázky 4C

-10CZ 293943 B6 a 4D ukazují Jurkat buňky exprimující CD4^ D15G (plná čára), Οϋ4:ζ Cl 1G/D15G (čárkovaně) a Οϋ4:ζ Cl 1G (tečkované), jež byly zpracovány a analyzovány jako vobrázcích 4A a 4B.

Obr. 5A-C ukazují, že Οϋ4:ζ, CD4^ a CD4:y receptory umožňují cytolytickým T lymfocytům zabíjet cíle exprimující HIV-1 gp 120/41. Obr. 5A: plné kroužky, CTL exprimující CD4^ inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné kroužky, CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami; plné čtverečky, neinfikované CTL inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gp 120/41; prázdné čtverečky, neinfikované CTL inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami. Obr. 5B: plné kroužky, CTL exprimující CD4.T] inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gp 120/41; prázdné kroužky, CTL exprimující CD4:y inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné čtverečky, CTL exprimující C11G/D15G dvojitý mutant Οϋ4:ζ chiméry inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41. Obr. 5C: Proudově cytometrická analýza CD4 exprese CTL buňkami použitými v Obr. 5B. Ke korekcím poměrů cíle kefektoru bylo odčítáním škálované negativní (neinfikované) populace pomocí superpozice histogramu stanoveno procento buněk exprimujících CD4 chiméru; pro porovnávací účely v tomto obrázku byl přiřazen neinfíkovaným buňkám arbitrámí práh, jenž pro jiné buněčné populace dává pozitivní frakci zhruba stejnou, jakou by dalo histogramové odčítání.

Obr. 6A-B ukazují specifitu CD4-řízené cytolýzy. Obr. 6A: plné kroužky, CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované sHeLa buňkami exprimujícími CD16_Pi; prázdné kroužky, CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20; plné čtverečky, CTL exprimující Οϋ16:ζ inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné čtverečky, CTL exprimující CDlópi inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41. Obr. 6B: plné kroužky, CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované s buňkami Ráji (MHC třídy if); prázdné kroužky, neinfikované CTL buňky inkubované s buňkami RJ2.2.5 (MHC třídy If Ráji mutant); plné čtverečky, neinfikované CTL buňky inkubované s buňkami Ráji (MHC třídy iT); prázdné čtverečky, CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované s buňkami RJ2.2.5 (MHC třídy If). Svislá osa je natažena.

Obr. 7A-B ukazují charakterizaci Οϋ16:ζ chimemího receptoru. Obr. 7A je schematický diagram fuzní bílkoviny Οϋ16:ζ. Extracelulámí část monomerického CD16, formy vázané s fosfatidylinositolem, byla spojena s dimemím ζ těsně mimo transmembránové domény. Bílkovinná sekvence fúzního spojení je ukázána dole (SEKV. ID. Č. 42, 43). Obr. 7B ukazuje proudovou cytometrickou analýzu mobilizace vápníku, následující po provázání Οϋ16:ζ chiméry buď v TCR pozitivní, anebo v TCR negativní buněčné linii. Ukázán je střední poměr fialové k modré fluorescenci (měřítko relativní koncentrace vápníkového iontu) u buněčných populací, na něž se v čase 0 působilo protilátkami. Plné čtverečky, odpověď Jurkat buněk na anti-CD3 MAb OKT3; plné trojúhelníky, odpověď na CD16^ provázání anti-CD16 MAb 3G8 v REX33A TCR⁺ mutantu; prázdné čtverečky, odpověď na CD16^ provázání v Jurkat TCR“ mutantní linii JRT3.T3.5; prázdné trojúhelníky, odpověď na CD16^ provázání v Jurkat buňkách; křížky, odpověď knechimemému CD 16 v Jurkat buňkách; a tečky, odpověď knechimemému CD 16 v REX33A TCR“ buněčné linii.

Obr. 8A-B ukazuje deleční analýzu cytolytického potenciálu. Obr. 8A ukazuje polohy koncových bodů ζ delece. Zde jakož i jinde jsou mutace v ζ reprezentovány konvencí původní zbytekpoloha-mutantní zbytek, takže např. D66* označuje náhradu Asp-66 termínačním kodonem. Obr. 8B ukazuje výsledky stanovení cytolýzy pro nedeletovaný Οϋ16:ζ a pro význačné ζ delece. Hybridomové buňky exprimující povrchovou protilátku kCD16 byly nabity ^5lCr a inkubovány s rostoucími počty lidských cytolytických lymfocytů (CTL) infikovaných rekombinantami vakcínie exprimujícími Οϋ16:ζ chiméry. Vyneslo je procento uvolnění ^5lCr jako funkce poměru efektorových (CTL) buněk k cílovým (hybridomovým) buňkám (e/t). Plné kroužky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími CD16^ (mfi 18.7); Plné kroužky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími CD16^ (mfi 18.7); plné čtverečky, cytolýza zprostředkovaná

- 11 CZ 293943 B6 buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ Asp66* (mfí 940.2); prázdné čtverečky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ Glu60* (mfí 16.0); prázdné kroužky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ Tyr51* (mfí 17.4); plné trojúhelníky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ Phe34* (mfí 17.8); prázdné trojúhelníky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími nechimemí CD16 (mfí 591). Ikdyž v tomto experimentu nebyla exprese CD16^ Asp66* dána do souladu s expresemi jiných fúzních bílkovin, cytolýza buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ v ekvivalentních hladinách ve stejném experimentu dávaly výsledky v podstatě totožné s výsledky ukázanými s buňkami exprimujícími ϋϋ16:ζ Asp66*.

Obr. 9A-D ukazují, že eliminování potenciálu pro transmembránové interakce odhaluje krátký ζ segment schopný zprostředkovat cytolýzu. Obr. 9A je schematický diagram monomemích bipartitních a tripartitních chimér. Nahoře je Οϋ16:ζ konstrukt zkrácený u zbytku 65 a zbavený transmembránových zbytků Cys a Asp. Pod ním jsou konstrukty CD16:CD5^ a CD16:CD7^ a vztažné kontroly. Dole jsou ukázány peptidové sekvence intracelulámích domén (SEKV. ID. Č. 45-47). Obr. 9B ukazuje cytolytické aktivity delečních mutant monomerických chimér. Cytolytická aktivita buněk exprimujících Οϋ16:ζ (plné kroužky, mfí 495) byla porovnávána s cytolytickou aktivitou buněk exprimujících Οϋ16:ζ Asp66* (plné čtverečky, mfí 527) nebo mutanty Οϋ16:ζ Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66* (prázdné čtverečky, mfí 338) a Οϋ16:ζ CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* (plné trojúhelníky, mfí 259). Obr. 9C ukazuje cytolytickou aktivitu zprostředkovanou tripartitními fúzními bílkovinami. Plné trojúhelníky, CD16^Asp66*; prázdné čtverečky, Οϋ16:5:ζ (48-65); plné čtverečky, ΟΟ16:7:ζ (48-65); prázdné trojúhelníky, Οϋ16:7:ζ (48-59); prázdné kroužky, CD16:5; plné kroužky, CD16:7. Obr. 9D ukazuje mobilizaci vápníku mutantními a tripartitními chimérami vTCR negativní Jurkat JRT3.T3.5 mutantní buněčné linii. Prázdné kroužky, odpověď buněk exprimujících dimemí Οϋ16:ζ Asp66*; plné čtverečky, odpověď buněk exprimujících Οϋ16:ζ CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*; prázdné čtverečky, odpověď buněk exprimujících Οϋ16:ζ CysllGly/Aspl5Gly/Glu60*; plné trojúhelníky, odpověď buněk exprimujících Οϋ16:7:ζ (48-65); prázdné trojúhelníky, odpověď buněk exprimujících Οϋ16:ζ (48-59).

Obr. 10A-F ukazuje příspěvek jednotlivých aminokyselin k aktivitě 18-zbytkového motivu transdukce cytolytického signálu. Obrázky 10A a 10B ukazují cytolytickou aktivitu a Obr. 10C ukazuje mobilizaci vápníkového iontu, zprostředkované chimérami nesoucími bodové mutace poblíž karboxy-koncového tyrosinu (Y62). Obrázky 10A resp. 10B představují data shromážděná s buňkami exprimujícími vysoká resp. nízká množství Οϋ16:ζ fúzních bílkovin. Pro stanovení mobilizace vápníku a cytolýzu se používají stejné symboly, ukázané v jednopísměnkovém kódu vpravo. Plné kroužky, buňky exprimující Οϋ16:ζ (mfí v A, 21; B, 376); plné čtverečky, buňky exprimující Οϋ16:7:ζ (48-65) (mfí A, 31; B, 82); prázdné čtverečky, Οϋ16:7:ζ (4865)Glu60Gln (mfí A, 33; B, 92); křížky, Οϋ16:7:ζ (48-65)Asp63Asn (mfí A, 30; B, 74); plné trojúhelníky, Οϋ16:7:ζ (48-65)Tyr62Phe (mfí A, 24; B, 88); prázdné kroužky, Οϋ16:7:ζ (4865)Glu61Gln (mfí A, 20; B, 62); a prázdné trojúhelníky, Οϋ16:7:ζ (48-65)Tyr62Ser (mfí B, 64). Obrázky 10D a 10E ukazují cytolytickou aktivitu a Obr. 10F ukazuje mobilizaci vápníkového iontu chimérami nesoucími bodové mutace poblíž amino-koncového tyrosinu (Y51). Pro stanovení mobilizace vápníku a cytolýzu se používají stejné symboly, ukázané vjednopísmenkovém kódu vpravo. Plné kroužky, buňky exprimující Οϋ16:ζ (mfí v D, 21.2; v E, 672); plné čtverečky, buňky exprimující Οϋ16:7:ζ (48-65) (mfí D, 31.3; E, 179); plné trojúhelníky, Οϋ16:7:ζ (48-65)Asn48Ser (mfí D, 22,4; E, 209); prázdné čtverečky, Οϋ16:7:ζ (4865)Leu50Ser (mfí D, 25,0; E, 142); a prázdné trojúhelníky, Οϋ16:7:ζ (48-65)Tyr51Phe (mfí D, 32,3; E, 294).

Obr. 11A-B ukazuje přiložení vnitřních opakování ζ a porovnání jejich schopnosti podporovat cytolýzu. Obr. 1 IA je schematický diagram chimér tvořených rozdělením ζ intracelulámí domény na třetiny a jejich připojováním za transmembránovou doménu CD 16:7 chiméry.

- 12CZ 293943 B6

Sekvence intracelulámích domén jsou ukázány dole (SEKV. ID. Č. 48-50), se společnými zbytky v rámečcích a s příbuznými zbytky označenými hvězdičkou. Obr. 11B ukazuje cytolytický potenciál tří ζ subdomén. Plné kroužky, buňky exprimující Οϋ16:ζ (mfi 476); plné čtverečky, Οϋ16:7:ζ (33-65) (mfi 68); prázdné čtverečky, Οϋ16:7:ζ (71-104) (mfi 114); a plné trojúhelníky, Οϋ16:7:ζ (104-138) (mfi 104).

Obr. 12 je schematický diagram chimér CD16:FcRtII.

Obr. 13 A-B ukazuje mobilizaci vápníku po provázání chimér CD4:FcRyII a CD16:FcRyII. Obr. 13 A ukazuje poměr fialové k modré fluorescenci buněk nabitých fluoroforem Indo-1, citlivým k vápníku, jako funkci času po provázání extracelulámích domén CD 16 protilátkami. Obr. 13B ukazuje podobnou analýzu zvýšení poměru fialové k modré fluorescenci buněk nesoucích CD4:FcRyII po provázání protilátkami.

Obr. 14 A-B ukazuje cytolytická u chimér CD4:FcRyII a CD16:FcRyII. Obr. 14 A ukazuje procento uvolnění ⁵*Cr anti-CD16 z hybridomových (cílových) buněk, když jsou tyto buňky vystaveny rostoucímu počtu cytotoxických T lymfocytů, exprimujících CD16: FcRylI chiméry (efektorovým buňkám). Obr. 14B ukazuje podobnou analýzu cytotoxicity zprostředkované CD4:FcRyII chimérami proti cílovým buňkám exprimujícím HIV obalové glykoproteiny.

Obr. 15A-E ukazují identifikaci zbytků v koncovém řetězci FcRylI A, jež jsou důležité pro cytolýzu. Obr. 15A je schematický diagram delečních konstruktů. Obrázky 15B a 15C ukazují mobilizaci vápníku a cytolýzu karboxy-terminálními delečními variantami CD16:FcRyII A. Obrázky 15D a 15E ukazují mobilizaci vápníku a cytolýzu tripartitními chimérami nesoucími postupně méně a méně amino-koncové sekvence intracelulámího koncového řetězce CD16:FcRyII A.

Obr. 16 (SEKV. ID. Č. 24) ukazuje aminokyselinovou sekvenci CD3 delta receptorové bílkoviny; zarámovaná sekvence představuje výhodnou oblast transdukujfcí cytolytický signál.

Obr. 17 (SEKV. ID. Č. 25) ukazuje aminokyselinovou sekvenci T3 gama receptorové bílkoviny; zarámovaná sekvence představuje výhodnou oblast transdukující cytolytický signál).

Obr. 18 (SEKV. ID. Č. 26) ukazuje aminokyselinovou sekvenci mbl receptorové bílkoviny; zarámovaná sekvence představuje výhodnou oblast transdukující cytolytický signál.

Obr. 19 (SEKV. ID. Č. 27) ukazuje aminokyselinovou sekvenci B29 receptorové bílkoviny; zarámovaná sekvence představuje výhodnou oblast transdukující cytolytický signál.

Obr. 20 ukazuje schematický diagram CD4 chimér. Molekula „A“ je CD4(Dl-D4):Ig:CD7; molekula „B“ je CD4(Dl,D2):Ig:CD7; molekula „C“ je CD4(Dl-D4):Ig:CD7^; molekula „D“ je CD4(Dl,D2):Ig:CD7^; a molekula „E“ je Οϋ4:ζ. Extracelulámí doména molekuly lidského CD4, odpovídající aminokyselina 1 - 394 prekurzoru, byla spojena pomocí BamHI místa s doménami ohebné spojky, CH1, a CH2 lidského IgGl jak bylo popsáno dříve (Zettlmeissl et al., DNA Cell. Biol. 9:347 (1990)) až na to, že se použila cDNA verze lidské Ig sekvence pro umožnění exprese v rekombinantech viru vakcínie. Dvoudoménová verze CD4 chimér byla vytvořena inzercí BamHI adaptoru do unikátního Nhel místa (odpovídajícíhoaminokyselině 200) v cDNA CD4 prekurzoru. Sekvence připojení k membráně sestávaly z 22 zbytků z prvního exonu lidského membránového vázaného IgGl, následovaných CD7 zbytky 146-203. Aminokyseliny 55 a 163 z ζ sloužily jako spouštěcí motiv tetrapartitních konstruktů (C a D). V tetrapartitních konstruktech obsahujících ζ řetězec byla intracelulární exprese ζ dokumentována s komerčně dostupnou protilátkou proti intracelulární doméně (Coulter).

-13 CZ 293943 B6

Obr. 21 ukazuje cytolýzu cílových buněk, exprimujících HIV-1 obalový glykoprotein, zprostředkovanou klonem cytotoxických T-buněk, WH3, exprimujících jako efektorové molekuly různé chiméry odvozené od CD4. Pro stanovení cytotoxicity byla linie lidských CD8⁺, CD4” HLA B44 restringovaných T buněk, WH3, udržována v IMDM doplněném 10 % lidského séra, jak zde bylo dříve popsáno. Tyto buňky byly stimulovány gama-ozářenými (3000 rad) B44 nesoucími mononukleámími buňkami a fytohemaglutininem (PHA) při 1 pg/ml. Po jednom dni stimulace byl PHA naředěn na 0,5 pg/ml přidáním čerstvého média; po třech dnech bylo médium vyměněno úplně. Před použitím ve stanoveních cytotoxicity byly buňky rozrůstány nejméně po lOdní. Buňky byly infikovány patřičnými rekombinantními viry vakcínie, jak se zde popisuje pro vPE16. Infekce byly ponechány probíhat po další 3 až 4 hodiny v úplném médiu, po čemž byly buňky sklizeny centrifugací a resuspendovány na hustotu 1 x 10⁷/ml. 100 μΐ se přidalo do každé jamky mikrotitrační destičky s U-tvarovanými dny, obsahující 100 μΐ úplného média na jamku, a ředilo s dvojnásobnými seriálními kroky. Dvě jamky pro každý vzorek neobsahovaly lymfocyty, aby bylo možno měřit spontánní uvolňování chrómu a celkové zachycení chrómu. Cílové buňky, HeLa podlínie S3 (HeLa-S3, ATCC) byly infikovány jako shora v 10 cm miskách svPEló. 10⁶ infikovaných buněk se uvolnilo sPBS a 1 mM EDTA, centrifugovalo a resuspendovalo v 100 μΐ ^5ICr chromanu sodného (1 mCi/ml v PBS) po 1 hodinu při 37 °C a pak třikrát promylo sPBS. Do každé jamky se přidalo 100 μΐ značených cílových buněk. Mikrotitrační destička se stočila při 750 x g po 1 minutu a inkubovala při 37 °C po 4 hodiny. Na konci inkubační periody byly buňky v každé jamce resuspendovány jemným pipetováním, byl odebrán vzorek ke stanovení celkových inkorporovaných impulzů, a mikrotitrační destička se stočila při 750 x g po 1 minutu. Odebíraly se alikvoty (100 μΐ) a měřily se na gama scintilačním počítači. Poměr efektor:cíl byl korigován na procento infikovaných buněk změřené proudovou cytometrií.

Obr. 22 ukazuje replikaci HIV-1 v buněčných liniích transfektantů. V podlinii linie 293 lidských embryonálních ledvinových buněk byly založeny buněčné linie stabilně exprimující CD4 divokého typu a různé rekombinantní chiméry. Zásobní preparát viru HIV-1, IIIB izolátu, byl připraven s titrem «10⁶ infekčních částic/ml podle měření pomocí analýzy s koncovým ředěním za použití lidské T-buňkové linie C8166 jako indikátoru. Infekce se prováděly při MOI hodnotě přibližně 1, po dobu 8 až 12 hodin při 37 °C. Další den byly buňky myty třikrát PBS, trypsinovány, znovu naneseny na nové misky a ze supematantů kultur byly brány vzorky na titr p24 (označováno jako den 0). Ve 3 až 4 denních intervalech byly potom sbírány supematanty kultur a uschovávány k analýze p24. Buňkám se znovu dodávalo čerstvé médium obsahující hygromycin B v koncentraci 100 μΐ/ml. Analýza supematantů kultur se prováděla s použitím komerční, na ELISA založené testovací soupravy HIV-1 p24 antigenu (Coulter) podle instrukcí dodávaných výrobcem. Výsledky jsou reprezentativní pro dva nezávislé pokusy s podobnou dobou trvání.

Obr. 23 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. Č. 28) a aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 29) D1-D4 domén CD4 (CD4 Bam).

Obr. 24 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. Č. 30) a aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 31) D1-D4 domén CD4 (CD4 Bam).

Obr. 25 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. Č. 32) a aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 33) domén ohebné spojky [hinge], CH2 a CH3 lidského IgGl (Igh23 Bam).

Obr. 26 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. Č. 34) a aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 35) transmembránové domény CD7 (TM7 Bam Mlu).

Obr. 27 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. C. 36) a aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 37) intracelulámí domény zeta (Zeta Mlu Not).

Obr. 28 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. Č. 51) a primární aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 52) syntetického alfa helixu.

-14CZ 293943 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce chimér lidský IgGl :receptor

Sekvence těžkého řetězce lidského IgGl byly připraveny spojením C_H3 doméně s cDNA fragmentem odvozeným od 3' konce mRNA transmembránové formy protilátky. 3' koncový fragment byl získán polymerázovou řetězovou reakcí s použitím cDNA knihovny tonsil jako substrátu a oligonukleotidů, majících sekvence

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEKV. ID. Č. 7) a

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEKV. ID. Č. 8), odpovídající 5' resp. 3' koncům žádaných DNA fragmentů. 5' oligonukleotid je komplementární k místu vC_Hl doméně lidského IgGl a 3' oligonukleotid je komplementární k místu těsně, v 5' směru, u sekvence kódující doménu procházející membránou. PCR produkt byl digerován s BstXI a BamHI a ligován mezi BstXI a BamHI místa semisyntetického genu pro IgGl protilátku, nesoucího variabilní a konstantní oblasti. Po inzerci fragmentu BstXI až BamHI byla amplifikovaná část konstruktu nahrazena až po Smál místo vC_H3 výměnou restrikčního fragmentu, takže jenom úsek mezi Smál a 3' oligonukleotidem pocházel z PCR reakce.

K vytvoření lidského IgGl^ chimemího receptoru byl gen těžkého řetězce končící v BamHI místě spojen s BamHI místem ζ chiméry popsané níže tak, že sekvence protilátky vytvářely extracelulámí část. Proudová cytometrie COS buněk transfekovaných plazmidem kódujícím tuto chiméru ukázala vysokou hladinu exprese determinant protilátky když byl kotransfekován plazmid kódující cDNA lehkého řetězce a skromnou expresi determinant protilátky když plazmid exprese lehkého řetězce nebyl přítomen.

Podobné chiméry zahrnující lidský IgGl fúzovaný k η nebo γ (viz níže), nebo jakoukoli signál transdukující část bílkovin T-buňkového receptoru nebo Fc receptoru, lze konstruovat obecně jak je popsáno shora, s použitím standardních metod molekulární biologie.

K vytvoření jediné transkripční jednotky, jež by umožňovala aby se jak těžký, tak lehký řetězec exprimovaly z jediného promotoru, byl z kódujících sekvencí pro těžký a lehký řetězec a z 5' nepřekládané oblasti mRNA kódující 78 kD bílkovinu regulace glukosy, jinak známou jako grp78 nebo BiP, vytvořen plazmid kódující dvoucistronovou mRNA. Sekvence grp78 byly získány PCR lidské genomové DNA s použitím primerů majících sekvence

CGC GGC CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEKV. ID. Č. 9) a

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEKV. ID. Č. 10) v 5' resp. 3' koncích. Polymerizační řetězová reakce s těmito oligonukleotidy se provedla v přítomnosti 10 % dimethylsulfoxidu. Fragment získaný PCR byl digerován sNotl a HincII

-15CZ 293943 B6 a vložen mezi Notl a HincII ležící směrem dolů od sekvence kódující lidský IgGl. Sekvence cDNA kódující lidský IgG kapa lehký řetězec byly pak vloženy pod zaváděcí sekvenci grp78 s použitím HincII místa a jiného místa ve vektoru. Plazmid exprese vzniklý těmito manipulacemi sestával ze semisyntetického genu těžkého řetězce, následovaného zaváděcí sekvencí grp78, následovanou sekvencí cDNA kapa lehkého řetězce lidského IgG, následovanou polyadenylačním signálem odvozeným z fragmentu SV40 DNA. Při transfekci COS buněk tímto plazmidem exprese se značně zlepšila exprese determinant těžkého řetězce v porovnání s transfekcí plazmidem, jenž kódoval jen determinanty těžkého řetězce samotné.

K vytvoření dvoucistronového genu obsahujícího chiméru těžký řetězec/receptor a lehký řetězec lze horní [upstream] sekvence těžkého řetězce nahradit jakýmkoli zde popsaným genem chiméry těžký řetězec/receptor.

Příklad 2

Konstrukce CD4 receptorových chimér cDNA lidského ζ (Weissman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988b)) ay(Kiister et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990)) byly izolovány polymerasovou řetězovou reakcí z knihoven připravených zHPB-ALL nádorové buněčné linie (Aruffo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b)) a z lidských přirozených zabíjecích buněk, zatímco n cDNA (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)) byla izolována z knihovny myších thymocytů. cDNA ζ, η a γ byly napojeny k extracelulámí doméně „inženárované“ formy CD4, mající BamHI místo těsně nad doménou procházející membránou (Aruffo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), jež bylo spojeno s BamHI místem přirozeně se nacházejícím v ζ a η cDNA v podobné lokalizaci několika zbytků nad doménou procházející membránou (SEKV. ID. C. 1,3, 4 a 6). K vytvoření fuzní bílkoviny s γ bylo do této sekvence „inženýrováno“ BamHI místo v přibližně stejné lokalizaci (Obr. 1; SEKV. ID. C. 2 a 5). Genové fuze byly zavedeny do plazmidu exprese viru vakcínie, jež nesl E. coli gtp gen jako selekční markér a vneseny do genomu vakcínie kmene WR homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolové kyselině (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene 65:123-128 (1988)). Proudová cytometrická analýza ukázala, že rekombinanty vakcínie řídí hojnou produkci fúzních bílkovin Οϋ4:ζ a CD4:y na buněčném povrchu, zatímco exprese CD4:q je podstatně slabší (Obr. 1B). Posledně jmenovaný nález je v souladu s nedávnou zprávou, že transfekce η cDNA exprimujícího plazmidu do myší hybridomové buněčné linie dala podstatně méně exprese než transfekce srovnatelného ζ exprimujícího plazmidu (Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990)). Imunoprecipitace buněk transfekovaných vakcíniovými rekombinanty ukázala, že fúzní bílkoviny tvoří, na rozdíl od přirozeně se vyskytujícího CD4 antigenu, kovalentní dimery. Molekulové hmotnosti fúzních bílkovin Οϋ4:ζ a CD4:y resp. nativního CD4 byly nalezeny jako 63, 55 resp. 53 kD. Vyšší hmotnosti fúzních bílkovin jsou přibližně v souladu s větší délkou intracelulámí části, jež převyšuje délku pro nativní CD4 o 75 zbytků (CD4: ζ) nebo 5 zbytků (CD4:y).

Příklad 3

CD4 chiméry se mohou sdružovat sjinými receptorovými řetězci

Buněčně-povrchová exprese lidského FctRIII makrofágové formy/formy přirozených zabíjecích buněk (CD16tm) na transfektantech je ulehčena kotransfekcí s myším (Kurosaki et al., Nátuře 342, 805-807 (1989)) nebo lidským (Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989)) y, jakož i lidským ζ (Lanier et al., Nátuře 342:803-805 (1989)).

-16CZ 293943 B6

V souladu s těmito zprávami také exprese chimér dovolovala expresi CD16™ na povrch, když byly dodány k cílovým buňkám buď kotransfekcí, nebo koinfekcí s rekombinantními viry vakcínie (Obr. 2). Podpora povrchové exprese CD16™ pomocí ζ byla ve zkoušených buněčných liniích výraznější než podpora pomocí γ (Obr. 2), zatímco CD4 povrchovou expresi CD16™ nezvyšoval.

Příklad 4

Asp ζ mutanty se nepřidružují k Fc receptorů

K vytvoření chimér, jež by se nesdružovaly s existujícími antigenovými nebo Fc receptory, byly připraveny mutantní ζ fúzní bílkoviny, jež neměly vnitromembránový Asp zbytek, nebo nitromembránový Cys zbytek, nebo ani jeden z těchto dvou zbytků. Proudová cytometrie ukázala, že intenzita exprese na buněčný povrch různými mutantními chimérami nebyla znatelně rozdílná od nemutovaného prekurzoru, a imunoprecipitační experimenty ukázaly, že celková exprese chimér byla podobná. Jak se očekávalo, u mutantních chimér, jež neměly transmembránový cysteinový zbytek bylo nalezeno, že nevytvářejí disulfidicky propojené dimery. Dvojitě mutantní chiméry bez Asp byly neschopné podporovat povrchovou expresi CD 16™, zatímco monomemí chiméry bez Cys ale nesoucí Asp umožňovaly koexpresi CD 16™, avšak s menší účinností než rodičovský dimer (Obr. 3).

Příklad 5

Mutantní receptory si zachovávají schopnost iniciovat vápníkovou odpověď

Pro stanovení, zda provázání fůzních bílkovin umožní akumulaci volného intracelulámího vápníku způsobem podobným tomu, o němž je známo, že probíhá s antigenovým receptorem T buněk, byly buňky lidské leukemické T-buňkové linie, Jurkat E6 (ATCC přístupové číslo TIB 152, Američan Type Culture Collection, Rockville, MD) infikovány rekombinanty vakcínie a byla měřena relativní koncentrace cytoplazmatického vápníku po provázání extracelulární domény protilátkami. Proudově cytometrická měření byla prováděna s buňkami nabitými barvivém Indo1, citlivým k vápníku (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137-952-961 (1986)). Obrázek 4A-D ukazuje výsledky pokusů s tokem vápníku s buňkami infikovanými Οϋ4:ζ a Asp a Cys“ mutanty /. Provázání chimér reprodukovatelně zvyšovalo intracelulámí vápník. Οϋ4:η a CD4:y podobně umožňovaly akumulaci intracelulámího vápníku v infikovaných buňkách. Jurkat buňky exprimují nízké hladiny CD4 na buněčný povrch, ale provázání nativního CD4 v přítomnosti nebo nepřítomnosti Οϋ16:ζ neměnilo hladiny intracelulámího vápníku (Obr. 4A-B).

Příklad 6

CD4: ζ, η a γ chiméry zprostředkovávají cytolýzu cílů exprimujících HIV gp 120/41

Pro stanovení, zda chimerní receptory spouštějí cytolytické efektorové programy byl vytvořen model systému cíkefektor založený na CD4 rozeznávání HIV obalového komplexu gpl20/41. HeLa buňky byly infikovány rekombinantními viry vakcínie exprimujícími gpl20/41 (Chakrabarti et al., Nátuře 320:535-537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) a označeny ^5lCr. Značené buňky byly inkubovány s buňkami z lidské alospecifické (CD8⁺, CD4“) linie cytotoxických T lymfocytů, jež byly infikovány rekombinanty vakcínie exprimujícími CD4^, CD4:r| nebo CD4:y chiméry, nebo CD16:/ Cysl lGly/Asp!5Gly dvojitě mutantní

-17CZ 293943 B6 chiméru. Obr. 5A-C ukazuje, že HeLa buňky exprimující gp 120/41 byly specificky lyžovány cytotoxickými T lymfocyty (CTL) exprimujícími CD4 chiméry. Pro porovnání účinnosti různých chimér byly poměry efektorů k cíli korigovány na frakci CTL exprimující gpl20/41, jak byla změřena proudovou cytometrií. Obr. 5C ukazuje cytometrickou analýzu CD4 exprese CTL buňkami použitými v pokusech s cytolýzou, jež jsou ukázány v Obrázcích 5A a 5B. I když střední hustota povrchového CD4^ vysoce přesahovala střední hustotu CD4:iq, byly cytolytické aktivity buněk exprimujících obě formy podobné. Po korekci na frakci cílů exprimujících gpl20 jsou účinnosti cytolýzy zprostředkované bílkovinami Οϋ4:ζ a CD4:r| srovnatelné s nejlepšími účinnostmi udávanými u T-buňkových receptorů pro specifické páry cíhefektor (střední poměr efektorů k cílům pro 50% uvolnění T buňkami exprimujícími Οϋ4:ζ byl 1,9 ± 0,99, n = 10). Fúze CD4:y byla méně aktivní, stejně jako fúze ΟΏ4:ζ, v níž chyběly transmembránové Asp a Cys zbytky. V obou případech však byla pozorována významná cytolýza (Obr. 5B-C).

Pro kontrolu možnosti, že by infekce vakcínií mohla podporovat arteficiální rozeznávání CTL buňka, byly provedeny podobné pokusy s cytolýzou u cílových buněk infikovaných rekombinanty vakcínie, exprimujícími na fosfatidylinositol vázanou formu CD 16 (CD16pi), a značených ⁵¹Cr, a u CTL infikovaných kontrolními rekombinanty, exprimujícími buď CDlópi nebo Οϋ16:ζ. Obr. 6A ukazuje, že buňky exprimující non-CD4 chiméry nerozeznávají nativní HeLa buňky nebo HeLa buňky, exprimující gpl20/41, a podobně že T buňky exprimující CD4 chiméry nerozeznávají HeLa buňky, exprimující jiné, vakcínií kódované, povrchové bílkoviny. Navíc: CTL exprimující nechimemí CD4 významně nelyžují HeLa buňky exprimující gpl20/41 (Obr. 6A).

Příklad 7

Buňky nesoucí MHC třídy II nejsou cíly chimér

O CD4 se soudí, že interaguje s nepolymorfickými sekvencemi exprimovanými MHC antigenem třídy II (Gay et al., Nátuře 328: 626-629 (1987); Sleckman et al. Nátuře 328:351-353 (1987)). I když specifická interakce mezi CD4 a antigenem třídy II nebyla nikdy dokumentována u vyčištěných bílkovin, lze za jistých podmínek dokumentovat adhezi mezi buňkami exprimujícími CD4 a buňkami exprimujícími molekuly třídy II (Doyle et al. Nátuře 330:256-259 (1987); Clayton et al, J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990); Lamrre et al. Science 245:743-746 (1989)). Dále se zkoušelo, zda může být zaznamenáno zabíjení proti buňkám nesoucím třídu II. Obr. 6B ukazuje, že neexistuje specifická cytolýza řízená Οϋ4:ζ proti Ráji B buněčné linii, která exprimuje hojný antigen třídy II. I když se pozoruje mírná (« 5 %) cytolýza, Ráji mutant negativní co do třídy II, RJ2.2.5 (Accolla, J. Exp. Med. 157:1053-1058 (1983)) vykazuje stejnou susceptibilitu jako Ráji buňky inkubované s neinfikovanými T buňkami.

Příklad 8

Sekvenční předpoklady pro indukci cytolýzy zeta řetězcem T buňkového antigenového/Fc receptorů

I když chiméry mezi CD4 a ζ mohou vyzbrojit cytotoxické lymfocyty (CTL) k zabíjení cílových buněk exprimujících HIV gpl20, hledala se alternativa k CD4, aby bylo možno jednoznačně porovnat vlastnosti zeta chimér zavedených do linií lidských T buněk. Takovéto linie mohou exprimovat CD4 a činit tak obtížnějším konkrétní definování vztahů mezi typy nebo stupni mobilizace vápníku a cytotoxickým potenciálem různých chimér. Aby se toto obešlo, byly vytvořeny chiméry mezi ζ a CD16, v nichž je extracelulámí doména CD16 připojena k transmembránovým a intracelulárním sekvencím ζ (Obr. 7A). Genové fúze byly zavedeny do plazmidu exprese viru vakcínie, jež nesl E. coli gtp gen jako selekční markér a vneseny do genomu

-18CZ 293943 B6 vakcínie kmene WR homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolové kyselině (Falkner a Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle a Coupar, Gene 65:123 (1988)).

Linie T buněk byly infikovány vakcíniovými rekombinanty a byla měřena relativní koncentrace cytoplazmatických iontů vápníku po provázání extracelulámích domén protilátkami. Jak spektrofluorimetrická měření (v celkové populaci), tak proudově cytometrická měření (s jednotlivými buňkami) byla prováděna s buňkami nabitými barvivém Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952 (1986)). Obrázek 7 ukazuje analýzu dat shromážděných z buněk lidské leukemické T-buňkové linie Jurkat infikovaných rekombinanty vakcínie, exprimujícími fuzní bílkovinu Οϋ16:ζ. Provázání těchto chimér reprodukovatelně zvyšovalo intracelulámí vápník, zatímco podobné působení na buňky exprimující nechimemí CD 16 mělo malý nebo nemělo žádný účinek. Když byly chiméry exprimovány v mutantních buněčných liniích, jimž chyběl antigenový receptor, buď v REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 164:20760 (1989)), nebo v Jurkat mutantu JRT3.T3.5 (Weiss et al., J. Immunol. 133:123 (1984)), byla pozorována silná odpověď na provázání CD 16 protilátkou. Podobná data byla shromážděna na mutantní buněčné linii REX20A (Breitmeyer et al., výše, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) a na CD3/TÍ negativní mutantě Jurkat buněčné linie, založené v této laboratoři. Infekce s rekombinanty exprimujícími CD16^ nezpůsobila návrat k odpovědi na anti-CD3 protilátku, což ukazuje, že fúzní bílkoviny nepůsobí prostřednictvím záchytu intracelulámích řetězců CD3 komplexu.

Pro hodnocení schopnosti chimér přesměrovat buněčnou imunitu byly CTL infikovány s vakcíniovými rekombinanty exprimujícími Cl6 chiméry a použity k specifickému lyžování hybridomových buněk exprimujících membránově vázané anti-CD16 protilátky. Tento test je rozšířením testu hybridomové cytotoxicity, původně vyvinutého k analýze efektorových mechanizmů buněk nesoucích Fc receptory (Graziano a Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987; Graziano a Fanger, J. Immunol. 139:35-36, 1987; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959, 1989; Fanger et al., Immunol. Today 10: 92, 1989). Obr. 8B ukazuje, že exprese Οϋ16:ζ v cytotoxických T lymfocytech umožňuje vyzbrojeným CTL zabíjet hybridomové buňky 3G8 (anti-CD3; Fleit et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 3275, 1982), zatímco CTL exprimující na fosfatidylinositol vázanou formu CD16 jsou neaktivní. CTL vyzbrojené Οϋ16:ζ rovněž nezabíjejí hybridomové buňky exprimující irelevantní protilátku.

K identifikaci minimálních ζ sekvencí potřebných pro cytolýzu byla připravena série delečních mutantů, v nichž bylo z karboxylového konce odstraňováno postupně více a více ζ intracelulámí domény (SEKV. ID. Č. 44) (Obr. 8A). Většina intracelulámí domény zeta může být odstraněna sjen malými důsledky pro cytolytický potenciál; chiméra plné délky, Οϋ16:ζ, byla v podstatě stejně účinná jako chiméra deletovaná u zbytku 65, Οϋ16:ζ Asp66* (Obr. 8B). Podstatný pokles cytotoxicity byl pozorován při deleci u zbytku 59 (chiméra Οϋ16:ζ Glu60*), a další delece u zbytku 50 měla za následek o trochu nižší aktivitu. Úplná ztráta aktivity však nebyla pozorována ani když intracelulámí doména byla redukována na trojzbytkovou transmembránovou kotvu (Obr. 8B).

Protože ζ je disulfidicky vázaný dimer, jedním vysvětlením udržení cytolytické aktivity bylo, že endogenní ζ vytvářel heterodimery s chimemími ζ delecemi, a takto rekonstituoval aktivitu. K testování této idey byly ζ zbytky 11 a 15 zaměněny zAsp resp. Cys na Gly (CysllGly/Aspl5Gly) a provedla se následujícím způsobem imunoprecipitace. Přibližně 2 x 10⁶ buněk CV1 bylo po jednu hodinu infikováno v bezsérovém DME médiu rekombinantní vakcínií při multiplicitě infekce (moi) přinejmenším deset. Šest až osm hodin po infekci byly buňky uvolněny z misek sPBS/lmM EDTA a povrchově značeny s 0,2 mCi ^l25I na 2 x 10⁶ buněk za použití Iaktoperoxidázy a H₂O₂ metodou Clarka a Einfelda (Leukocyte Typing II, str. 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Značené buňky byly sebrány centrifugací a lyžovány v 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl₂, 0,2 M jódacetamid a 1 mM PMSF. Jádra byla odstraněna centrifugací a CD 16 bílkoviny byly precipitovány protilátkou 3G8

-19CZ 293943 B6 (Fleit et al., výše, 1982; Medarex) a agarózou s protilátkou proti myšímu IgG (Capple, Durham, NC). Vzorky byly podrobeny elektroforéze v 8% polyakrylamidovém/SDS gelu za neredukujících podmínek nebo v 10% gelu za redukujících podmínek. Tyto imunoprecipitace potvrdily, že chiméra CD16: / Cysl lGly/Aspl5Gly neasociuje v disulfícidy vázaných dimerních strukturách.

Cytolytická aktivita těchto mutantních receptorů byla rovněž testována. Mutovaná chiméra deletovaná u zbytku 65 (Οϋ16:ζ Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66*) byla v cytolytickém testu, v závislosti na podmínkách testu, dva- až osmkrát méně aktivní než srovnatelná nemutovaná chiméra (Οϋ16:ζ Asp66*), která byla co do aktivity obvykle v rámci faktoru dvě od Οϋ16:ζ, nebo od ní nerozeznatelná (Obr. 9B). Snížení aktivity je u těchto mutantní chimér srovnatelné se snížením pozorovaným u CD4 chimér s podobnou strukturou (viz shora), a lze je nejpravděpodobněji připsat nižší účinnosti ζ monomerů ve srovnání sdimery. Naproti tomu nemá Asp, Cys mutovaná chiméra, deletovaná u zbytku 59, žádnou cytolytickou aktivitu, což podporuje hypotézu, že asociace s jinými řetězci, zprostředkovaná transmembránovými Cys nebo Asp zbytky, je zodpovědná za slabé zachování cytolytické aktivity při deleci více než zbytku 65 k aminokonci.

Proudově cytometrické studie ukázaly, že deleční mutanty, jež nemají transmembránové Asp a Cys zbytky, mohou ještě stále podporovat zvýšení intracelulárního vápníkového iontu v odpovědi na protilátkové provázání v TCR mutantní linii Jurkat buněk (Obr. 9D). Podobné výsledky byly získány pro chiméry exprimované rodičovskou Jurkat linií. V případě Οϋ16:ζ Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66* tato data ukazují, že schopnost zprostředkovat vápníkovou reaktivitu může být oddělena od schopnosti podporovat cytolýzu.

Pro konečnou eliminaci možného příspěvku ζ transmembránových zbytků byly transmembránové zbytky ζ a prvních 17 intracelulámích zbytků ζ nahrazeny sekvencemi kódujícími zbytky procházející membránou a prvních 14 resp. 17 cytoplazmatických zbytků CD5 resp. CD7 antigenů (Obr. 9A). Výsledné tripartitní fúzní bílkoviny CD16:5:/ (48-65) a CD16:7: ζ (48-65) nevytvářejí disulfidicky vázané dimery (jak to dělají jednodušší Οϋ16:ζ chiméry), protože jim chybí cysteinové zbytky v ζ transmembránové doméně. Obě tripartitní chiméry jsou schopné mobilizovat vápník v Jurkat a TCR negativních buněčných liniích (Obr. 9D) a navodit cytolytickou odpověď v CTL (Obr. 9C a nepředvedené údaje). Useknutí ζ části u zbytků 59 v chiméře Οϋ16:7:ζ (48-59) však anuluje schopnost tripartitní fuze řídit vápníkovou reaktivitu v TCR pozitivních nebo negativních Jurkat buňkách nebo cytolýzu v maturních CTL (Obr. 9C a nepředvedené údaje).

Ke zkoumání příspěvků jednotlivých zbytků v rámci 18-zbytkového motivu jsme připravili řízenou mutagenezou řadu mutantních variant a hodnotili jejich schopnost zprostředkovávat receptorem řízené zabíjení za podmínek nízké (Obrázky 10A a 10D) a vysoké (Obrázky 10B a 10E) exprese chimemího receptorů. Obr. 10A-E ukazuje, že zatímco řada poměrně konzervativních substitucí (tj. nahrazení kyselých zbytků jejich příslušnými amidy, nebo tyrosinu fenylalaninem), jež zasahovaly oblast zbytků 59 až 63, poskytla mírný ústup cytolytické účinnosti, obecně si tyto varianty zachovávaly schopnost mobilizovat vápník. Kolektivně však tyto zbytky vytvářejí důležitý podmotiv, protože jejich delece eliminuje cytolytickou aktivitu. Konverze Tyr 62 na buď Phe, anebo Ser eliminuje jak cytolytické, tak vápníkové odpovědi. Na aminokonci tohoto 18-zbytkového úseku odstraní náhrada Tyr 51 fenylalaninem jak mobilizaci vápníku, tak cytolytickou aktivitu, zatímco substituce leucinu serinem v pozici 50 odstraní vápníkovou odpověď, ale jen zčásti poškodí cytolýzu. Bez lnutí ke konkrétní hypotéze vzniká podezření, že neschopnost Leu50Ser mutantu mobilizovat vápník v krátkodobém proudově cytometrickém testu neodráží plně jeho schopnost zprostředkovat podstatné zvýšení volného intracelulárního iontu vápníku v průběhu delšího časového úseku cytolytického testu. Cytolytická aktivita necitlivá k vápníku byla však u některých cytolytických T-buňkových linií ohlášena, a možnost že podobný jev je základem zde popsaných výsledků se nevylučuje. Náhrada Asn48

-20CZ 293943 B6 serinem zčásti narušoval cytotoxicitu v některých pokusech, zatímco v jiných měla malý nebo žádný efekt.

K probádání potenciální role redundantních sekvenčních prvků byla intracelulámí doména ζ rozdělena na tři úseky, zahrnující zbytky 35 až 65, 71 až 104 a 194 až 138. Každý z těchto úseků byl připojen k CD16:CD7 chiméře pomocí Mlul místa zavedeného těsně distálně od bazických, na membráně kotvicích sekvencí intracelulámí domény CD7 (viz níže; Obr. 11 A). Pozorování cytolytické účinnosti těchto tří úseků ukázalo, že jsou v podstatě stejně potentní. Porovnání sekvencí (Obr. 11A) ukazuje, že druhý motiv nese mezi tyrosiny jedenáct zbytků, zatímco první a třetí motivy nesou deset.

I když přesný rozbor procesu aktivace T buněk nebyl proveden, je zřejmé, že agregace antigenových receptorů nebo receptorových chimér, jež nesou ζ intracelulámí sekvence, spouští mobilizaci vápníku, uvolnění cytokinů a granulí, a objevení se buněčně-povrchových markérů aktivace. Aktivní místo ζ, krátká lineární sekvence, asi příliš malá na to, aby měla inherentní enzymovou aktivitu, interaguje ke zprostředkování buněčné aktivace pravděpodobně s jednou nebo přinejmenším s několika málo bílkovinami. Je také zřejmé, že mobilizace volného vápníku není sama o sobě postačující pro buněčnou aktivaci, když lze schopnost zprostředkovat cytolýzu mutačně oddělit od schopnosti zprostředkovat akumulaci vápníku.

Jak je zde ukázáno, přidání 18 zbytků z intracelulámí domény ζ k transmembránové a intracelulámí doméně dvou nepříbuzných bílkovin umožní výsledným chimérám přesměrovat cytolytickou aktivitu proti cílovým buňkám, jež vážou extracelulámíčást fúzních bílkovin. I když chiméry nesoucí 18-zbytkový motiv jsou přibližně osmkrát méně aktivní než chiméry založené na ζ plné délky, sníženou aktivitu lze připsat ztrátě transmembránových interakcí, které normálně umožňují ζ divokého typu vytvářet disulfidicky vázané dimery. Tedy: ζ deleční konstrukty, jež mají stejný karboxylový konec jako tyto motivy, a jimž schází transmembránové Cys a Asp zbytky, typicky vykazují poněkud nižší aktivitu než chiméry, jež nesou pouze 18-zbytkový motiv.

Prvek cytolytické kompetence, na nějž jsme se soustředili, má dva tyrosiny a žádné šeřiny nebo treoniny, což omezuje možné příspěvky fosfoiylace k aktivitě. Mutace kteréhokoli tyrosinu ničí aktivitu, ale i když předběžné výsledky neukazují na podstatnou fosforylaci tyrosinů po provázání chimemích povrchových antigenů nesoucích 18-zbytkový motiv, nelze vyloučit možnost účasti takovéto fosforylace v nízké hladině. Navíc k účinkům zaznamenaným u těchto dvou tyrosinů, řada aminokyselinových záměn v amino- a karboxylovém konci tohoto motivu zeslabuje aktivitu za podmínek nízké receptorové hustoty.

Sekvence podobné aktivnímu motivu ζ lze nalézt v cytoplazmatických doménách několika dalších transmembránových bílkovin, včetně CD3 δ a γ molekul, s povrchem asociovaných IgM bílkovin mbl a B29, a β a γ řetězců vysokoafínitního IgE receptorů, FceRI (Reth, Nátuře 338:383, 1989). I když funkce těchto sekvencí je nejistá, každá z nich je schopna autonomní aktivace T buněk, pokud je účinně exprimována, a takováto aktivity může vysvětlovat reziduální TCR reaktivitu pozorovanou v zeta-negativní mutantní buněčné linii (Sussman et al., Cell 52:85, 1988).

ζ samotný nese tři takovéto sekvence, a rozdělení intracelulámí domény zhruba na tři díly ukazuje, že každá z nich je schopna iniciovat cytolytickou odpověď, n, sestřihová isoforma / (Jin et al., výše, 1990; Clayton et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:5202, 1991) postrádá karboxylovou polovinu třetího motivu. Protože odstranění karboxylové poloviny prvního motivu ničí aktivitu, zdá se pravděpodobné, že většina biologické účinnosti n může být připisována prvním dvěma motivům. I když podle různých měřítek je n stejně tak aktivní, jako je ζ v podpoře antigenem zprostředkovaného uvolnění cytokinů (Bauer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3842, 1991) nebo v přesměrování cytolýzy (viz shora), η není fosforylován v odpovědi na receptorovou stimulaci (Bauer et al., výše, 1991). Buď tedy je pro fosforylaci vyžadována

-21 CZ 293943 B6 přítomnost všech tří motivů, anebo třetí motiv představuje přednostní substrát neidentifikované tyrosinkinázy.

Příklad 9

Transdukce cytolytického signálu lidským Fc receptorem

Pro hodnocení účinků různých podtypů lidských Fc receptorů byly vytvořeny chimemí molekuly, v nichž byla extracelulámí doména lidských CD4, CD5 nebo CD16 antigenů spojována stransmembránovými a intracelulámími doménami FcRIIyA, Bl, B2 a C subtypů (nomenklatura Ravetche a Kineta, Annu. Rev. Immunol. 9:457, 1991). Konkrétně: cDNA sekvence odpovídající transmembránový a intracelulámím doménám dříve popsaných FcRIIA, Bl a B2 izoforem byly amplifikovány z dříve existujícího klonu PC23 nebo z cDNA knihovny lidských tonsil (konstruované standardními technikami) za použití následujících syntetických oligonukleotidových primerů:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEKV. ID. Č. 18; FcRII A přímý [forward],

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEKV. ID. Č. 19; FcRII A zpětný [reverze]),

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEKV. ID. Č. 20; FcRII Bl a FcRII B2 přímý), a

GCG GGG CGC GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEKV. ID. Č. 21; FcRII Bl a FcRII B2 zpětný).

Tyto primety obsahovaly štěpící místa pro enzymy BamHI resp. Notl, zamýšlená 6 zbytků od 5' konce. Notl místo bylo bezprostředně následováno „antisense stop kodonem, buď CTA, anebo TTA. Všechny primery obsahovaly 18 nebo více nukleotidů komplementárních k 5' a 3' koncům žádaných fragmentů. cDNA fragment odpovídající cytoplazmatické doméně FcRIIxC, jež se liší od ΠΑ izoformy pouze v jednom aminokyselinovém zbytku (L za P ve zbytku 268), byl generován řízenou mutagenezou pomocí překryvové PCR s primery sekvencí:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEKV. ID. Č. 22) a

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEKV. ID. Č. 23).

PCR fragmenty byly vloženy do vektorů exprese vakcíniového viru, které obsahovaly extracelulámí domény CD 16 resp. CD4, a následně zavedeny do vakcínie divokého typu rekombinací v lokusu thymidinkinázy, s použitím selekce na kointegraci E. coli gtp pro ulehčení identifikace žádaných rekombinantů. Identity všech izoforem (ukázaných v Obr. 12) byly potvrzeny dideoxy sekvenováním.

Produkce bílkovin chimemích receptorů byla dále potvrzena imunoprecipitačními studiemi. Přibližně 10' JRT3.T3.5 buněk bylo po jednu hodinu infikováno vbezsérovém IMDM médiu rekombinantní vakcínií při multiplicitě infekce přinejmenším deset. Dvanáct hodin po infekci byly buňky sklizeny a povrchově značeny s 0,5 mCi ¹²⁵I na 10⁷ buněk za použití laktoperoxidázové / glukoso oxidázové metody (Clark a Einfeld, výše). Značené buňky byly sebrány centrifugací a lyžovány 1 % NP-40, 1 mM MgCl₂, 5 mM KC1, 0,2 M jódacetamidem a 1 mM PMSF. Jádra byla odstraněna centrifugací a CD16 fúzní bílkoviny byly imunoprecipitovány protilátkou 4G8 a agarózou s protilátkou proti myším IgG. Vzorky byly podrobeny elektroforéze

-22CZ 293943 B6 za redukujících podmínek. Všechny molekuly imunoprecipitovaných chimemích receptorů měly očekávané molekulové hmotnosti.

Pro testování schopnosti chimemích receptorů zprostředkovávat zvýšení cytoplazmatického volného vápníkového iontu byly rekombinantní viry použity k infekci TCR mutantní linie Jurkat buněk, JRT3.T3.5 (jak je zde popsáno), a v buňkách byl měřen volný cytoplazmatický vápník (jak je zde popsáno) po provázání receptorových extracelulámích domén protilátkou 3G8 nebo Leu-3A (jak je zde popsáno). Tyto pokusy ukázaly, že intracelulární domény FcRIIx B1 a B2 byly za srovnatelných podmínek neaktivní (Obr. 13A a 13B). CD4, CD5 a CD16 hybridy FcRIIx A sdílely v podstatě stejnou schopnost podporovat vápníkovou odpověď (Obr. 13A-B). Jiné buněčné linie, jak monocytového, tak lymfocytového původu, byly schopné odpovídat na signály iniciované provázáním extracelulámích domén.

K prozkoumání zapojení různých intracelulámích domén FcRxII do cytolýzy byly lidské cytotoxické T lymfocyty (CTL) infikovány vakcíniovými rekombinanty exprimujícími CD16:FcRxII A, Bl, B2 a C chiméry. Infikované buňky pak byly kokultivovány s ⁵¹Cr-nabitými hybridomovými buňkami (tj. 3G8 10-2 buňkami), jež exprimovaly buněčně-povrchovou protilátku kCD16. V tomto testu CTL nesoucí CD 16 chiméry zabíjely cílové hybridomové buňky (přičemž umožňovaly uvolnění volného ⁵¹Cr) tehdy, když CD16 extracelulární doména chiméry byla spojena s intracelulámím úsekem schopným aktivace lymfocytového efektorového programu; tento test je podrobně popsán níže. Obr. 14A ukazuje, že CTL vyzbrojené s CD16:FcRxIIA a C, ale ne sCD16:FcRxII Bl a B2, jsou schopné lyžovat cílové buňky exprimující buněčně-povrchovou anti-CD16 protilátku.

K eliminaci možnosti, že specifickou cytolýzu lze nějakým způsobem připsat interakci s CD16 částí byly provedeny pokusy s cytolýzou, u nichž byla FcRII intracelulární doména připojena kCD4 extracelulární doméně. V tomto případě byly cílovými buňkami HeLa buňky exprimující HIV obalové gp 120/41 bílkoviny (konkrétně HeLa buňky infikované vakcíniovým vektorem vPE16, dostupným zNational Institute of Allergy and Infections Desease AIDS Depository, Bethesda, MD). Stejně jako vCD16 systému, cílové buňky exprimující HIV obal byly susceptibilní k lyži T buňkami exprimujícími CD4:FcRyII A chiméru, ale ne FcRylI Bl nebo B2.

Intracelulární domény FcRylI A a C nesdílejí žádnou zřetelnou sekvenční homologii s žádnou jinou bílkovinou, včetně členů rozšířené rodiny FcRx/TC^. K definování prvků sekvence, odpovědných za indukci cytolýzy, byly provedeny 5' a 3' delece sekvencí kódujících intracelulární doménu (popsané níže a ukázané v Obr. 15A) a zhodnoceny co do účinnosti v testech mobilizace vápníku a testech cytolýzy (jak jsou zde popsány). V pokusech, kde byla odstraněna amino-koncová část intracelulární domény, byla transmembránová doména FcRxII nahrazena transmembránovou doménou nepříbuzného CD7 antigenu, aby se odstranil možný příspěvek interakcí zprostředkovaných doménou procházející membránou.

Obrázky 15B a 15C ukazují, že odstranění 14 karboxy-terminálních zbytků, včetně tyrosinu 298, mělo za následek úplnou ztrátu cytolytické schopnosti a podstatné snížení potenciálu pro mobilizaci vápníku. Další delece těsně před tyrosinem 282 poskytla stejný fenotyp (Obrázky 15B a 15C). Delece intracelulární domény od N-konce ke zbytku 268 neměla žádný podstatný vliv ani na vápníkový profil, ani na cytolytickou schopnost, zatímco delece ke zbytku 275 značně narušila uvolňování vápníku, ale měla malý vliv na cytolýzu (Obrázky 15D a 15E). Další delece, ke zbytku 282, daly FcRxII řetězce, jimž scházela schopnost jak mobilizovat vápník, tak spouštět cytolýzu (Obrázky 15D a 15E). „Aktivní prvek“ definovaný v tomto hrubém měřítku je poměrně velký (36 aminokyselin) a obsahuje dva tyrosiny oddělené 16 zbytky.

-23 CZ 293943 B6

Příklad 10

Cílená cytolýza lymfocyty nesoucími chimerní CD4 receptory, jež nepodporují infekci

Jak se rozebírá shora, mohou být konstruovány efektorové molekuly, jež přesměrují cytolytickou aktivitu CTL v MHC-nezávislém módu. Například: Chiméra sestávající z extracelulámí domény CD4, fúzované k ζ řetězci v lidském CTL klonu, WH3, specificky zabíjí cílové buňky nesoucí povrchový obalový glykoprotein HTV-1, gpl20. Protože však extracelulámí doména CD4 molekuly poskytuje susceptibilitu k HTV infekci, mohou se tyto vyzbrojené CTL stát cílem pro virus, což by mělo za následek pokles jejich síly (Dalgleish et al., Nátuře 312:763 (1984); Klatzman et al., Nátuře 312:763 (1984). Aby se předešlo takovýmto důsledkem, byly navrženy chimémí efektorové molekuly založené na CD4, jež jsou účinné při specifickém cílení k HTV-infikovaným buňkám pro buněčné zprostředkované zabíjení, ale jež neposkytují susceptibilitu k infekci HIV.

Jedna bílkovina fúzovaná ze tří částí byla vytvořena genetickým sestavením extracelulámí domény CD4 (Obr. 23) ke spojce, druhé a třetí konstantní domény těžkého řetězce lidského IgGl (Zettlmeissl et al., DNA Cell. Biol. 934Ί (1990) (Obr. 25), jež byly v tomto případě napojeny k části prvního transmembránového exonu lidského, membránově vázaného IgGl, následované částí lidského CD7 antigenu, sestávající ze sekvence mezi jedinou Ig-podobnou doménou a stop transfer sekvencí, jež následuje za transmembránovou doménou (Aruffo a Seed, EMBOJ. 6:3313 (1987)) (Obr. 26). Primární aminokyselinová sekvence extracelulámí skupiny CD7 segmentu sestávala z oblasti bohaté na prolin, což napovídá strukturu podobnou stonku, jenž vystrkuje Ig-podobnou doménu směrem od buněčného povrchu (Aruffo a Seed, EMBOJ. 6:3313 (1987)) (Obr. 26). K expresi této a podobných chimér byly připraveny rekombinantní viry vakcínie jak je zde popsáno. Konkrétně byly rekombinantní viry vakcínie připraveny homologní rekombinací c CV-1 buňkách. S každým preparátem byla provedena přinejmenším dvě kola vizualizace plaků sOKT4 nebo Leu3a s následnou purifíkací plaků dříve, než se v buňkách CV-1 připravil preparát o vysokém titru.

Trojčlenná chiméra (CD4(Dl-D4):Ig:CD7) (Obr. 20, molekula „A“) vykazovala účinnou expresi na buněčný povrch a byla testována na schopnost působit jako HIV receptor v testu na tvorbu syncytií založeném na vakcínii (Lifson et al., Nátuře 323:725 (1986); Ashom et al., J. Virol. 64.2149 (1990)). HeLa buňky infikované rekombinantním virem vakcínie (vPE16) kódujícím obalový glykoprotein HIV-1 (Earl et al., J. Virol. 64:2448 (1990)) byly kokultivovány s HeLa buňkami infikovanými buď s CD4, nebo Οϋ4:ζ, nebo CD4(Dl-D4):Ig:CD7. Misky o průměru šest cm s HeLa buňkami (ATCC, Rockvílle, MD) o 50% konfluenci byly infikovány v bezsérovém médiu po 1 hodinu při přibližně multiplicitě infekce (MOI) 10. Buňky byly inkubovány po dalších 5 až 6 hodin v úplném médiu a pak uvolněny pomocí fosfátem pufiovaného solného roztoku (PBS), obsahujícího 1 mM EDTA. Buňky exprimující virový obal a CD4 chiméru byly smíchány v poměru 1:1a znovu naneseny na 6 cm misky s úplným médiem. Syncytie byly spočítány a fotografovány při 6 - 8 hodinách kokultivace.

Kokultivace CD4 a vPE16 vedla ke tvorbě snadno detekovatelných mnohojademých obřích buněk. Také chiméra sestávající z extracelulámí domény CD4 fúzované k ζ řetězci TCR (Obr. 27) (Οϋ4:ζ) byla schopna zprostředkovat tvorbu syncytií, zatímco buňky exprimují CD4(Dl-D4):Ig:CD7 nedaly žádné projevy buněčné fuze. Testovali jsme rovněž konstrukt exprimující jen první a druhou doménu CD4 (Obr. 24), CD4(Dl,D2):Ig:CD7 (Obr. 20, molekula „B“), protože v jiných souvislostech bylo ukázáno, že tyto dvě domény CD4 jsou potřebné pro infektivitu HIV (Landau et al., Nátuře 334:159 (1988)). Také tato molekula se projevila jako nesusceptibilní k HTV-indukované tvorbě syncytií. Vazebné studie s rozpustným ^f25I-značeným gpl20 určily, že jak CD4(Dl-D4):Ig:CD7, tak CD4(Dl,D2):Ig:CD7 mají nesníženou afinitu k gpl20.

-24CZ 293943 B6

Dále jsme stanovili, zda by chimemí molekuly, jež odolávaly tvorbě syncytií, mohly být schopné přesměrovat zabíjení buněk při dodání spouštěcí skupiny, jak je zde popsána. Fúzovali jsme intracelulární doménu ζ (Obr. 27) k 3' konci CD4(Dl-D4):Ig:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7 a připravili odpovídající rekombinantní víry vakcínie. Tyto konstrukty, CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ aCD4(Dl,D2):Ig:CD7^ (Obr. 20, molekuly „C“ a „D“) byly exprimovány v klonu WH3 lidských CTL a testovány na schopnost zaměřovat a zabíjet HeLa buňky exprimující obalový glykoprotein HIV (s použitím zde popsaných metod). Obr. 21 ukazuje, že intracelulární doména ζ fúzovaná jak k CD4(Dl-D4):Ig:CD7, tak k CD4(Dl,D2):Ig:CD7 může poskytovat zabíjecí schopnost; konstrukty bez ζ řetězce nebyly schopné zprostředkovat tuto aktivitu. Οϋ4:ζ, pozitivní kontrola, zprostředkovala trochu účinnější cytotoxicitu, a CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ poněkud méně účinnou cytotoxicitu než CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ (Obr. 21), Je však jasné že jak CD4(Dl-D4):Ig:CD7^, tak CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ mají schopnost zprostředkovat specifické zabíjení buněk exprimujících HIV obalové bílkoviny na svůj povrch. Tyto čtyřčlenné chiméry byly konzistentně neschopné zprostředkovávat tvorbu syncytií ve stanovení založeném na vakcínii. Demonstrovali jsme rovněž, že jediný ζ motiv typu ukázaného v obr. 1 IA je postačující k poskytnutí cytolytické aktivity CD4(D1-D4) chiméře.

Radioimunoprecipitační experimenty ukázaly, že fuzní molekuly jsou převážně, pokud ne úplně dimery. V těchto pokusech se použila zrnka protein-A agarózy k imunoprecipitování solubilizovaných extraktů metabolicky značených HeLa buněk infikovaných rekombinantními vakcíniemi exprimujícími chiméry CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ a CD4(Dl,D2):Ig:CD7^. Imunoprecipitovaný materiál byl frakcionován elektroforézou v polyakrylamidovém gelu za redukujících a neredukujících podmínek. Konkrétně bylo přibližně 5 x 10⁶ HeLa-S3 buněk infikováno patřičným preparátem viru vakcínie jak je popsáno výše pro vPE16. Buňky byly metabolicky značeny s 200 pCi/ml Tran³⁵S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) po 6 až 8 hodin v médiu deficientním na cystein a methionin, a uvolněny PBS obsahujícím 1 mM EDTA. Buňky byly následně peletovány a lyžovány 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5 % NP40, 0,1 % SDS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF. Po odstranění jader centrifugací byla jedna pětina každého extraktu adsorbována na promytá zrnka protein A-konjugované agarózy po 2 hodiny při 4 °C. Zrnka byla následně myta PBS obsahujícím 1 % NP-40 a eluována vzorkovým pufrem obsahujícím a neobsahujícím merkaptoethanol. Výsledky těchto pokusů ukázaly, že většina imunoprecipitovaných chimér CD4(Dl-D4):Ig:CD7:/ a CD4(Dl,Dl):Ig: CD7^ migrovala za neredukujících podmínek jako dimery o očekávané molekulové hmotnosti.

Pro přímé zhodnocení schopnosti buněk, exprimujících CD4 fúzované molekuly, podporovat HIV infekci jsme provedli dlouhodobé studie infektivity s transfektanty exprimujícími CD4(Dl-D4):Ig:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7. Stabilní transfektanty CD4(Dl-D4):Ig:CD7, CD4(Dl,D2):Ig:CD7 a CD4 byly připraveny vpodlinii buněk 293, snadno transfekovatelné buněčné linii, pocházející z lidských embryonálních ledvinových buněk. Chimemí molekuly byly subklonovány v obousměrném vektoru, v němž měl hygromycin B gen předřazen promotor thymidin kinázy viru herpes simplex. Z 60 až 70 % konfluentní 10 cm miska buněk byla transfekována s 10 pg DNA tohoto plazmidu koprecipitací s kalcium fosfátem. Před transfekcí byly plazmidy linearizovány v unikátním Sfi I místě a konce zaplněny T4 DNA polymerázou. 24 hodin po transfekci byly buňky rozděleny se čtyřnásobným ředěním a 48 hodin po transfekci byly buňky dány pod selekci hygromycinem B (Sigma, St. Louis, Mo) při 400 pg/ml. Po 3 až 4 dnech bylo buňkám dáno čerstvé médium obsahující hygromycin.

Byly vzaty a expandovány rezistentní kolonie, a jejich exprese byla určena nepřímou imunofluorescencí s použitím fluorescein-konjugované protilátky proti lidským IgG Fc (Organon Teknika, West Chester, PA) nebo Q4120, protilátky reaktivní s lidským CD4 (Sigma), s následnou proudovou cytometrií (Coulter, Hialeah, FL). K analýze byly vybrány dva nezávislé klony z každého konstruktu, s hladinami buněčně-povrchového CD4 srovnatelnými s hladinami vykazovanými jinými buněčnými liniemi. Obr. 22 ukazuje, že po vystavení HIV byl p24 detekován v kulturách CD4 stabilních transfektantů už tak časně, jako je 3 dny po infekci.

-25CZ 293943 B6

V těchto kulturách byla jasná přítomnost mnohojademých obřích buněk a charakteristického „nafouknutí“ už tak časně, jako je 5 dnů po infekci. Žádné významné hladiny p24 ani důkazy mnohojademých obřích buněk nebyly po 32 dnech v kultuře detekovatelné v liniích netransfekovaných rodičovských buněk nebo kteréhokoli ze dvou nezávisle odvozených izolátů CD4(Dl-D4):Ig:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7 transfektantů (Obr. 22).

Po dokončení studií infektivity byly buňky analyzovány na expresi CD4 na buněčném povrchu. Povrchová hustota CD4 epitopu byla významně snížena v infikovaných kulturách exprimujících CD4, v souladu s virovou modulací směrem dolů, ale zůstala nezměněna v kulturách exprimujících CD4(Dl-D4):Ig:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7. Tyto experimenty stanovily, že je možné vytvořit molekuly nesoucí dvě apické domény CD4, jež mají, když jsou fúzované s T-buňkovým receptorovým ζ řetězcem, schopnost zaměřovat a zabíjet HIV-infíkované buňky, ale jež nepodporují CD4-zprostředkovanou HIV infekci.

Další pokusy napovídají, že je to fyzikální odstup mezi extracelulámí doménou CD4 a lipidovou dvojvrstvou, jenž uděluje schopnost odolávat HIV infekci. V prvním pokusu jsme konstruovali chimemí molekulu nesoucí deleci CD7 stonku a transmembránové domény; tato delece odstranila zCD7 transmembránové části oblast bohatou na prolin. Když byla tato doména fúzována k extracelulámí doméně CD4, udržela si schopnost účinně zakotvovat extracelulámí doménu CD4 molekuly, jak bylo měřeno expresí CD4 molekuly na buněčném povrchu (zde popsaným způsobem). Potenciál odolávat tvorbě syncytií, indukované HIV obalovým glykoproteinem, se však ztratil. Tedy: Delece na prolin bohaté oblasti CD7 molekuly, oblasti pravděpodobně tvořící α-helikální šroubovicovou strukturu, účinně snížila vzdálenost mezi extracelulámí doménou CD4 a lipidovou dvojvrstvou a anulovala schopnost chiméry odolávat tvorbě syncytií.

Ve druhém pokusujeme prokázali, že schopnost odolávat HTV-indukované tvorbě syncytií může být udělena CD4/CD5 chiméře, o níž bylo dříve doloženo, že slouží jako transmembránová kotva extracelulámí domény CD4 a že je ale neschopná odolávat HTV-indukované tvorbě syncytií.

V tomto pokusu byly vloženy do CD4/CD5 molekuly spojka [hinge], CH2 a CH3 domény těžkého řetězce lidského IgGl; výsledná chiméra odolávala tvorbě syncytií, což znovu napovídá, že odstup poskytovaný imunoglobulinovými doménami je dostatečný k udělení odolnosti k HTV-indukované tvorbě syncytií.

Ve třetím pokusu byla CD4 doména prodloužena s variacemi odstupu od buněčné membrány, pomocí syntetických alfa helixů různé délky. Konkrétně byly navrženy syntetické oligonukleotidy reprezentující opakované alfa helixové motivy zbytků lysinu a glutamové kyseliny, obklopených dvěma alaninovými zbytky (viz Obr. 28 k primárním nukleotidovým a aminokyselinovým sekvencím). V předcházejících studiích se pro takovéto aminokyselinové sekvence nalezlo, že se z vysokou frekvencí vyskytují v alfa helixech, což napovídá že takovéto opakované motivy by mohly přijímat alfa helikální konformaci a že umístění takovýchto alfa helixů mezi transmembránovou doménu a extracelulámí domény CD4 by mělo vystrkovat CD4 směrem dál od buněčné membrány. U variací délky tohoto alfa helikálního úseku byla, na základě známých hodnot pro alfa helikální zdvih a otočku, výpočtem stanovena velikost odstupu potřebná pro rezistenci ke vstupu HIV. Tyto výsledky jsou převedeny v Tabulce 1.

-26CZ 293943 B6

	Tvorba syncytií	Exprese Thy-1
A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk	-	-
B. CD4(Dl,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk	-	-
C. CD4+CD7tm+stk	₊/-^(a)	+
D. CD4+CD7tm (dlouhá verze)	+	+
E. CD4+CD7tm (krátká verze)	+	+
F. CD4+CD5tm	+	+
G. CD4+CH2+CH3+CD5tm	-	-
H. CD4+CH3+CD5tm	-	nestanoveno
I. CD4+CD34tm	+	+
J. CD4+syntetický alfa helix (24 angstromů) +CD34tm	nestanoveno	+
K. CD4+syntetický alfa helix (48 angstromů) +CD34tm	nestanoveno	_+/_(a)
L. CD4+syntetický alfa helix (72 angstromů) +CD34tm	nestanoveno	-

^a Podstatné snížení v počtu syncytií nebo buněk exprimujících thy—1.

V této tabulce „CD4“ představuje CD4(D1-D4) pokud se nepoznamenává jinak; „H“, „CH2“ resp. „CH3“ představují oblasti spojky [hinge], CH2 resp. CH3 těžkého řetězce lidského IgGl; „CD7tm a stk“ představuje transmembránovou oblast a oblast stonku; „CD7tm (dlouhá verze)“ resp. „CD7tm (krátká verze)“ představují transmembránovou oblast CD7 resp. Transmembránovou oblast CD7 deletovanou v prolin-bohaté doméně (jak se rozebírá výše); „CD5tm“ představuje transmembránovou oblast CD5; a „CD34tm“ představuje transmembránovou oblast CD34. Ve vstupech J - L je délka alfa helikální oblasti vyznačena v angstromech; tyto hodnoty jsou založeny na skutečnosti, že v obrátce alfa helixu je 3,6 zbytku, což odpovídá 5,4 A (nebo 1,5 A na zbytek). V souladu stím by měl 16-zbytkový alfa helix vystrkovat extracelulámí doménu CD4 o asi 24 angstromů. 48 a 72 angstromové alfa helixy byly konstruovány postupnou konkatemerizací BstYl fragmentů do unikátního BamHI místa fragmentu (viz Obr. 28), následovanou selekcí klonů se správnou orientací.

Tvorba syncytií byla určována v kokultivačních testech s HeLa buňkami exprimujícími HIV-1 obalový glykoprotein z vPE-16 konstruktu viru vakcínie (viz shora).

Exprese thy-1 byla měřena jak následuje: Konstrukce živého retrovirového vektoru byla založena na hxb.2 klonu HIV-1. V tomto vektoru byl neesenciální nef gen nahrazen kódující sekvencí potkaního thy-1, účinně exprimované buněčné-povrchové molekuly, jež je zakotvena k membráně fosfatidyl-inositolovou vazbou. Virus odvozený z tohoto molekulárního klonu, označovaný hxb/thy-1, byl infekční, jak prokazují jeho cytopatologické účinky a produkce p24 v kultivačních supernatantech infikovaných C8166 buněk (lidská CD4⁺ leukemická T-buňková linie). Navíc: Po expozici k hxb/thy-1, buňky HeLa transientně transfekované CD4 vykazovaly známky thy-1 exprese tak časně, jako je 18 hodin po infekci, jak by se očekávalo u informace regulované způsobem podobným regulaci nef. Informace (zpráva) kódovaná nef genem normálně

-27CZ 293943 B6 spadá do třídy virových regulačních bílkovin, jež podléhají alternativnímu sestřihu a jimž chybí prvek odezvy na rev. Tyto zprávy se mohou konstitutivně akumulovat v cytoplazmě jako ranné produkty virových genů. U thy-1 zpráv se očekává podobná regulace, tj. že se vyskytnou v ranné fázi životního cyklu viru. V krátkosti: Tento systém umožňoval test vstupu HIV, s thy-1 expresí používanou jako náhražkou pro vstup viru. Do HeLa buněk byly s použitím standardních DEAE-dextranových metod transientně transfekovány různé chiméry založené na CD4. Transfekované buňky byly exponovány k hxb/thy-1 viru 48 hodin po transfekci a hodnoceny na thy-1 expresi 24 až 48 hodin po infekci. U výsledků ukázaných v Tabulce 1 byla thy-1 exprese měřena 24 hodin po infekci s použitím komerčně dostupné Thy-1 monoklonální protilátky (Accurate).

Z dat předvedených v Tabulce 1 byl vyvozen závěr, že pro resistenci k HIV-1 infekci mají extracelulámí domény CD4 optimálně vyčnívat od buněčné membrány o alespoň 48 angstromů, s výhodou o alespoň 72 angstromů.

S použitím strategie podobné celkové strategii zde popsané, mohou být konstruovány chiméry, jež jsou založené na protilátkách proti HIV obalům a jež se zaměřují na HlV-infikované buňky. Příklady takovýchto protilátek jsou popsány v Gomy et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:1642 (1989) a Marasco et al., J. Clin. Invest. 90:1467 (1992).

Příklad 11

Použití vyčnívajících CD4 molekul jako vnadidel na HIV

Jak je zde předvedeno, buňky nesoucí CD4 domény vyčnívající z buněčného povrchu odolávají HIV infektivitě. V souladu s tím jsou takovéto CD4 nesoucí buňky užitečné jako vnadidlo pro vazbu cirkulujícího HIV a snížení virálních titrů v HlV-infikovaných jednotlivcích. S výhodou je CD4 doména prezentována na buňkách, jež přirozeně procházejí lymfatickými uzlinami; užitečné hostitelské buňky zahrnují kterékoli buňky, jež hrají roli v uvolňování buněk imunitního systému jakož i kterékoli jiné buňky přirozeně přítomné ve váčcích lymfatických uzlin. Konkrétní příklady zahrnují, bez omezení, makrofágy, neutrofíly, dendritické buňky a folikulámí dendritické buňky.

V tomto způsobu podle vynálezu může být využita kterákoli doména CD4 schopná vazby HIV, včetně D1-D4 a D1,D2 domén zde popsaných. Přinejmenším pro některá provedení (například pro ta, co jsou popsána shora) mohou být části intracelulámích a transmembránových domén chiméry vybrány z kterékoli bílkovinné nebo aminokyselinové sekvence.

Příklad 12

Další bílkoviny T-buňkových receptorů a spouštěcí bílkoviny B-buňkových receptorů

Jiné intracelulámí a transmembránové signál-transdukující domény podle vynálezu mohou být odvozeny od bílkovin T-buňkového receptoru, CD3 delta a T3 gama, a od bílkovin B-buňkového receptoru, mbl a B29. Aminokyselinové sekvence těchto bílkovin jsou ukázány v Obr. 16 (CD3 delta, SEKV. ID. Č. 24), Obr. 17 (T3 gama, SEKV. ID. Č. 25), Obr. 18 (mbl, SEKV. ID. Č. 26), Obr. 19 (B29, SEKV. ID. Č. 27). Části sekvencí postačující pro transdukci cytolytického signálu (a tedy s výhodou zahrnuté v chimemím receptoru podle vynálezu) jsou ukázány v závorkách. Chimemí receptory, které zahrnují tyto bílkovinné domény se konstruují a používají v léčebných metodách podle vynálezu obecně tak, jak je popsáno shora.

-28CZ 293943 B6

Příklad 13

Infekce vakcínií a radioimunoprecipitace

Přibližně 5 x 10⁶ CV1 buněk bylo infikováno po jednu hodinu v bezsérovém DME médiu rekombinantní vakcínií při multiplicitě infekce (moi) přinejmenším deset (titr měřen na CV1 buňkách). Buňky byly dány po infekci do čerstvého média a značeny s 200 pCi/ml ³⁵S-methioninu plis cysteinu (Tran³⁵S-label, ICN, Costo Mesa, CA) po šest hodin vDMEM médiu prostém methioninu a cysteinu (Gibco, Grand Island, NY). Značené buňky byly uvolněny PBS obsahujícím 1 mM EDTA, sebrány centrifugací a lyžovány v 1 % NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, a 1 mM PMSF. Jádra byla odstraněna centrifugám a CD4 bílkoviny byly precipitovány s OKT4 protilátkou a s agarózou s protilátkou proti myšímu IgG (Cappel, Durham, NC). Vzorky byly podrobeny elektroforéze v 8 % polyakrylamidovém/SDS gelu za neredukujících (NR) nebo redukujících (R) podmínek. Gely obsahující ³⁵S-značené vzorky byly před autoradiografií impregnovány En³Hance (New England Nuclear, Boston, MA). Usnadněná exprese transmembránové formy CD16, CD 16™, se měřila srovnáním její exprese vCVl buňkách infikovaných pouze sCD16™ a exprese v buňkách koinfikovaných s viry kódujícími CD 16™ a I nebo τ chiméry. Po infekci a inkubaci po šest hodin nebo více byly buňky uvolněny z misek sPBS, 1 mM EDTA a exprese CD 16™ nebo chimér byla měřena nepřímou imunofluorescencí nebo průtokovou cytometrií.

Stanovení toku vápníku

Buňky Jurkat podlínie E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) byly infikovány rekombinantními viry vakcínie po jednu hodinu v bezsérovém IMDM médiu při moi hodnotě 10 a inkubovány po tři až devět hodin v IMDM, 10 % FBS. Buňky byly sebrány centrifugám' a resuspendovány na 3 x 10⁶ buněk/ml v úplném médiu obsahujícím 1 mM Indo-1 acetomethoxyester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340—3450 (1985)) (Molecular Probes) a inkubovány při 37 °C po 45 minut. Buňky nabité Indo-1 byly peletovány a resuspendovány na 1 x 10⁶ buněk/ml v bezsérovém IMDM a skladovány za pokojové teploty v temnu. Buňky byly analyzovány na volný vápníkový iont simultánním měřením fialové a modré fluorescence průtokovou cytometrií (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137-952-961 (1986)). K iniciaci toku vápníku byla k suspenzi buněk přidána buď anti-CD4 Leu-3A konjugovaná s fykoerythrinem (PE) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) při 1 pg/ml s následnými 10 pg/ml nekonjugovaného ovčího anti-myšího IgG v čase 0, anebo byla k suspenzi buněk přidána nekonjugovaná 3G8 (anti-CD16) monoklonální protilátka při 1 pg/ml s následnými 10 pg/ml PE-konjugováného Fab₂' ovčího anti-myšího IgG v čase 0. Histogramy emisního poměru fialová/modrá byly vzaty z PE-pozitivní (infikované) buněčné populace, která typicky představovala 40 až 80 % všech buněk. Odezva T-buňkového receptorového antigenu v neinfikovaných buňkách se spouštěla protilátkou OKT3, bez provázání [crosslinking]. U pokusů sCD16 chimemími receptory byly z analýz vyloučeny vzorky vykazující drift základní čáry směrem k nižšímu intracelulámímu vápníku (bez protilátky). Histogramová data byla následně analyzována konverzí binárních dat na ASCII s použitím software Write Hand Man (Cooper City, FL), s následnou analýzou se sbírkou programů FORTRAN. K určení normalizovaného počátečního poměru se použil emisní poměr fialová/modrá před přidáním reagencií s druhou protilátkou, jenž byl položen rovný jednotce, a klidový prahový poměr, jenž byl nastaven tak, aby 10 % klidové populace přesahovalo práh.

Cytolytická stanovení

WH3 linie lidských T buněk (CD8⁺ CD4“ HLA B44 restringovaná cytolytická linie) byla udržována v IMDM, 10 % lidského séra, se 100 j./ml IL2, a byla periodicky stimulována buď nespecificky, ozářenými (3000 rad) HLA-nepřizpůsobenými lymfocyty periferální krve a 1 pg/ml fytohemaglutininu, nebo specificky, ozářenými mononukleárními buňkami nesoucími B44. Po jednom dni nespecifické stimulace se PHA naředil na 0,5 pg/ml přidáním čerstvého

-29CZ 293943 B6 média a po třech dnech bylo médium vyměněno. Buňky byly před použitím vtestech cytotoxicity rozrůstány přinejmenším 10 dní. Buňky byly infikovány rekombinantní vakcínií při multiplicitě infekce alespoň 10 po jednu hodinu v bezsérovém médiu s následnou inkubací v úplném médiu po tři hodiny. Buňky byly sebrány centrifugací a resuspendovány na hustotu 1 x 10⁷ buněk/ml. Po 100 μΐ se přidalo do každé jamky mikrotitrační destičky s U-tvarovanými dny, obsahující 100 μΐ/jamku úplného média. Buňky se ředily seriálními kroky s faktorem dva. Dvě jamky pro každý vzorek neobsahovaly lymfocyty, aby bylo možno měřit spontánní uvolňování chrómu a celkový záchyt chrómu. Cílové buňky, z HeLa podlínie S3, byly infikovány v 6,0 nebo 10,0 cm miskách při moi hodnotě přibližně 10 po jednu hodinu v bezsérovém médiu s následnou inkubací v úplném médiu po tři hodiny. Buňky byly pak uvolněny z misek s PBS, 1 mM EDTA a spočítány. Alikvot o 10⁶ cílových buňkách (HeLa, Ráji nebo RJ2.2.5 buňky pro pokusy s CD4 chimemím receptorem a 3G8 10—2 buňky; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959 (1989) pro pokusy sCD16 chimemím receptorem) byl zcentrifugován a resuspendován v 50 μΐ ⁵¹ Cr chromanu sodného (1 mCi/ml, Dupont, Wilmington, DE) po jednu hodinu při 37 °C s přerušovaným mícháním a pak třikrát promyt PBS. Do každé jamky se přidalo 100 μΐ značených cílových buněk resuspendovaných v médiu na 10⁵ buněk/ml. Mikrotitrační destička se stočila při 750 x g po 1 minutu a inkubovala při 37 °C po 4 hodiny. Na konci inkubační periody byly buňky v každé jamce resuspendovány jemným pipetováním, byl odebrán vzorek ke stanovení celkových inkorporovaných impulzů, a mikrotitrační destička se stočila při 750 x g po 1 minutu. Odebíraly se 100 μΐ alikvoty supematantů a měřily na gama scintilačním počítači. Procento zabíjení bylo korigováno na procento infikovaných cílových buněk (obyčejně 50 až 90 %) změřené proudovou cytometrií. Pro infikované efektorové buňky byly poměr efektor:cíl korigován na procento infikovaných buněk (obyčejně 20 až 50 % u pokusů s CD4 chimemím receptorem a >70 % u pokusů s CD 16 chimemím receptorem).

In vitro mutageneza ζ sekvencí

K vytvoření bodových mutací v aminokyselinových zbytcích 11 nebo 15 ζ sekvence byly připraveny syntetické oligonukleotidové primery v rozsahu od BamHI místa nad ζ transmembránovou doménou a měnící přirození ζ zbytek 11 zCys na Gly (C11G), nebo zbytek 15 z Asp na Gly (D15G), nebo oba. Syntetické oligonukleotidové primery byly použity vPCR reakcích pro generování mutovaných fragmentů, které byly vkládány zpět do CD4^ konstruktů divokého typu.

K vytvoření ζ delecí byly ζ cDNA sekvence amplifikovány PCR s použitím syntetických oligonukleotidových primerů navržených tak, aby vytvářely stop kodon (UAG) za zbytky 50, 59 resp. 65. Primery obsahovaly štěpící místo pro enzym Notl, zamýšlené pět nebo šest zbytků od 5' konce, obvykle v sekvenci typu CGC GGG CGG CCG CTA (SEKV. ID. Č. 11), kde poslední tři zbytky odpovídají stop antikodonu. Sekvence Notl a stop antikodonu byly následovány 18 nebo více zbytky komplementárními k žádanému 3' konci fragmentu. Výsledné chiméry byly označovány jako CD16:£> Y51*, €ΰ16:ζ E60* resp. ΟΌ16:ζ D66*. U generování fragmentů, jež byly vkládány zpět do 0016:ζ konstruktů divokého typu, se používalo BamHI místo nad transmembránovou doménou a Notl místo. Monomemí ζ chiméry byly vytvářeny uvolněním ζ transmembránových a membráně proximálních intracelulámích sekvencí pomocí BamHI a Sací digesce Asp' a Cys” CD4^ konstruktů popsaných shora a inzercí těchto fragmentů do Οϋ16:ζ E60* resp. CD16^ D66* konstruktů.

Konstrukce tripartitních chimér CD16:7^ (48-65) a CD16:7^ (48-59)

Pro přípravu konstruktu ϋϋ16:ζ D66* byla ζ cDNA sekvence odpovídající transmembránové doméně a následujícím 17 zbytkům cytoplazmatické domény nahrazena odpovídající transmembránovou a cytoplazmatickou doménou získanou zCD5 a CD7 cDNA. Fragmenty CD5 aCD7 byly generovány PCR reakcí s použitím přímých [forward] oligonukleotidů zahrnujících BamHI místo restrikčního štěpení a odpovídajících oblastí těsně nad transmembránovou oblastí

-30CZ 293943 B6

CD5 resp. CD7 a následujících reverzních oligonukleotidů překrývajících sekvence CD5 resp. CD7 a ζ sekvenci, jež obsahoval Sací místo restrikčního štěpení.

CD5:C: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEKV. ID. Č. 12)

CD7^: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAC CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEKV. ID. Č. 13).

CD5 a CD7 PCR produkty byly digerovány BamHI a Sací a ligovány do BamHI a Sací digerovaného CD16^ E60* za náhrady ζ sekvence od BamHI po Sací CD7 fragmentem. U přípravy konstruktů CD16:CD5 a CD16:CD7 byly získány fragmenty CD5 a CD7 s použitím PCR a oligonukleotidů obsahujících Notl restrikční štěpící místo a kódujících stop kodon (UAA) za zbytkem Gln416 resp. Alal93 sekvence CD5 resp. CD7. Tyto PCR fragmenty CD5 a CD7 byly digerovány BamHI aNotl a vloženy do konstruktu CD16ζ Aspóó*.

In vitro mutageneza N-koncových zbytků v rámci ζ motivu transdukce cytolytického signálu

Byly připraveny syntetické oligonukleotidové primery zasahující oblast od Sací místa uvnitř ζ motivu a konvertující nativní zbytek 48 z Asn na Ser (N48S), zbytek 50 z Leu na Ser (L50S), a zbytek 51 z Tyr na Phe (Y51F); použily se v PCR reakci ke generování fragmentů, které byly zavedeny zpět do konstruktu CD16:7^ (48-65) divokého typu.

In vitro mutageneza C-koncových zbytků v rámci ζ motivu transdukce cytolytického signálu

Byly připraveny syntetické oligonukleotidové primery zasahující oblast od Notl místa 3' ke stop kodonu a konvertující nativní zbytek 60 z Glu na Gin (E60Q), zbytek 61 z Glu na Gin (E61Q), zbytek 62 z Tyr na Phe nebo Ser (Y62F nebo Y62S), a zbytek 63 z Asp na Asn (D63N); použily se v PCR reakci ke generování fragmentů, které byly subklonovány do konstruktu CD16: D66* divokého typu od BamHI místa po Notl místo.

Konstrukce chimér CD16:7:C (33-65), CD16:7^ (71-104) a CD16:7^ (104-137

CD7 transmembránový fragment nesoucí Mlul a Notl místa u spojení mezi transmembránovou a intracelulámí doménou se získal PCR s použitím oligonukleotidů následující sekvence: CGC GGG GCG GCC ACG CGY CCT CGC CAG CAC ACA (SEKV. ID. Č. 14). Výsledný PCR fragment byl digerován BamHI a Notl a znovu zaveden do konstruktu ΰϋ16:7:ζ (48-65). Fragmenty ζ kódující zbytky 35 až 65, 71 až 104, a 104 až 137 byly získány PCR reakcí s použitím párů primerů obsahujících Mlul místa na 5' konci přímých primerů a stop kodony následované Notl místy na 5' koncích reverzních primerů. Ve všech případech byla restrikční místa zamýšlena šest zbytků od 5' konce primerů aby bylo zajištěno štěpení restrikčním enzymem.

ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACAb (SEKV. ID. Č. 15), ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAC ATG GGG GGA AAG (SEKV. ID. Č. 16), ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEKV. ID. Č. 17).

Konstrukce delečních mutant PcrylIA

Karboxyterminální FcRIIA deleční mutanty se konstruovaly PCR stejným způsobem jako konstrukty plné délky za konverze sekvencí kódujících tyrosiny v pozicích 282 a 298 na stop kodony (TAA). N-terminální delece byly generovány amplifíkací fragmentů kódujících postupně

-31 CZ 293943 B6 méně a méně intracelulární domény pomocí PCR s použitím oligonukleotidů, jež dovolovaly inzercí výsledných fragmentů mezi Mlul a Notl restrikční místa předem konstruovaného plazmidu exprese, kódujícího CD 16 extracelulámí doménu fúzovanou k CD7 transmembránové doméně, přičemž posledně jmenovaná končí v Mlul místě a ve spojení mezi transmembránovou a intracelulární doménou.

Jiná provedení

Příklady uvedené shora prokazují, že agregace ζ, η nebo y chimér postačuje v T-buňkách k iniciaci odpovědi cytolytických efektorových buněk. Známý rozsah exprese ζ, η nebo γ, jenž zahrnuje T lymfocyty, makrofágy, přirozené zabíjecí buňky, basofily, granulocyty a žímé buňky, napovídá, že konzervované sekvenční motivy mohou interagovat se senzorickým aparátem běžným u buněk hematopoetického původu a že důležitá složka hostitelské obrany v imunitním systému může být zprostředkovaná událostmi agregace receptorů.

Síla cytolytické odezvy a absence odezvy k cílovým buňkám nesoucím receptory MHC třídy II prokazují, že chiméry založené na ζ, η nebo γ vytvářejí základ pro genetickou intervenci proti AIDS prostřednictvím adoptivní imunoterapie. Široká distribuce endogenního ζ, a γ a důkazy, že Fc receptory asociované s γ zprostředkovávají cytotoxicitu v různých buněčných typech (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99 (1989)) umožňují úvahy o využití řady různých buněk pro tento účel. Například: Neutrofilní granulocyty, jež mají v oběhu velmi krátkou životnost (« 4 h), jsou přitažlivým cílem pro expresi těchto chimér. Není pravděpodobné, že by infekce neutrofílů HIV vedla k uvolňování viru, a hojnost těchto buněk (daleko převládající mezi leukocyty) by měla usnadňovat hostitelskou obranu. Jinou lákavou možností pro hostitelské buňky jsou matumí T buňky, populace v současnosti dostupná pro retrovirové manipulace (Rosenberg, Sci. Am. 262:62-69 (1990)). S pomocí rekombinantního IL-2 může být populace T buněk expandována poměrně snadno, a tyto expandované populace mají typicky omezenou životnost při reinfusi (Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 323:570-578 (1990).

Za patřičných podmínek by mělo rozeznání HIV buňkami exprimujícími CD4 chiméry poskytovat také mitogenní stimuly, což by dávalo možnost, že vyzbrojená buněčná populace bude dynamicky odpovídat na virovou zátěž. I když jsme se zde soustředili na chování fúzních bílkovin v cytolytických T lymfocytech, exprese těchto chimér v pomocných leukocytech by mohla poskytovat HTV-mobilizovaný zdroj cytokinů, jež by mohly působit proti kolapsu podtřídy pomocných buněk při AIDS. Nedávný popis několika schémat pro konstrukci rezistence k infekci při krocích jiných než je penetrace viru (Friedman et al., Nátuře 335:452-454 (1988); Green et al., Cell 58:215-223 (1989); Malim et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al., Cell 59:113-120 (1989); Buonocore et al., Nátuře 345:625-628 (1990)) napovídá, že by mohly být navrženy buňky nesoucí CD4 chiméry pro zamezení produkce viru pomocí exprese patřičných agens majících intracelulární místo působení.

Schopnost transmise signálů kT lymfocytům prostřednictvím autonomních chimér také poskytuje schopnost regulace retrovirové manipulovaných lymfocytů in vitro. Provazovací [crosslinking] stimuly, zprostředkované například specifickými IgM protilátkami, konstruovanými k odstranění domén vážících komplement, mohou zajistit zvyšování počtu takovýchto lymfocytů in šitu, zatímco působení s podobně specifickými IgG protilátkami (rozeznávajícími například variace aminokyselin „inženýrované“ do chimemího řetězce) by mohlo selektivně depletovat manipulovanou populaci. Navíc: Anti-CD4 IgM protilátky nepotřebují dodatečné provázání k mobilizaci vápníku vJurkat buňkách exprimuj ících CD4^ chiméry. Možnost regulace buněčné populace bez návratů k opakované mimotělní amplifikaci může podstatně rozšířit rozsah a účinnost běžných použití navrhovaných pro geneticky manipulované Tbuňky.

I když tento vynález byl popsán v souvislosti s konkrétními provedeními, bude se rozumět, že je schopen dalších modifikací, a tato přihláška je zamýšlena tak, aby pokrývala variace, využití

-32CZ 293943 B6 a adaptace vynálezu, včetně odchylek od současného popisu, jak k nim dojde v rámci oboru, do nějž vynález patří, a jak mohou být aplikovány na podstatné rysy poskytnuté zde dříve, což plyne z rozsahu připojených nároků.

Seznam sekvencí

SEKV. ID. Č. 1:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT	9S0
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG	1050
gtctcgaagc gggagaagcc ggtgtgggtg ctgaaccctg aggcggggat	1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC	1200
TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC	1250
CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC	1300
TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGAGAG	1350
GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG	1400
CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC	1450
AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG	1500
AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA	1550
AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA	1600

-33 CZ 293943 B6

GGACCCTTGG	GTTAAGAGCC	CGCCCCAAAG	GTGAAAGCAC	CCAGCAGAGT	1650
AGCCAATCCT	GTGCCAGCGT	CTTCAGCATC	CCCACTCTGT	GGAGTCCATG	1700
GCCACCCAGT	AGCAGCTCCC	AGCTCTAA			1728

SEKV. ID. Č. 2:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT	1100

-34CZ 293943 B6

GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA

GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TGCACGCGGA	TCCGCAGCTC	1200
TATGGTATTG	TCCTTACCCT	1250
AAAGGCAGAC	ATAGCCAGCC	1300
TGAACACCCG	GAACCAGGAG	1350
CCCCAATAG		1389

SEKV. ID. Č. 3:

ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT	aagctccaga	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950

-35CZ 293943 B6

GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA

CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
CTGAACCCTG	aggcggggat	1100
GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TGCACGCGGA	TCCCAAACTC	1200
TATGGTGTCA	TTCTCACTGC	1250
CGGAGAGCCC	CCCGCGTACC	1300
TCAATCTAGG	ACGAAGAGAG	1350
CGGGACCCTG	AGATGGGGGG	1400
CCTGTACAAT	GAACTGCAGA	1450
TTGGGATGAA	AGGCGAGCGC	1500
CAGGGTCTCA	GTACAGCCAC	1550
GGCCCTGCCC	CCTCGCTAA	1599

SEKV. ID. Č. 4:

Het 1

Asn Arg Gly Val 5

Pro

Phe Arg His

Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Aen

Ser

Aen

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Aep

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

-36CZ 293943 B6

Val Glu Phe 195

Lys Ile

Asp Ile Val Val Leu 200

Ala

Phe Gin 205

Lys

Ala

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Aep

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

LvB

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lye

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Aep

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Tyr

Leu

Arg

Ala

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Thr

Ala

420

425

430

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Arg

Ala

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Lys

Gin

Arg Arg

Arg

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Val

Tyr

465

470

475

480

Asn

Ala

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Pro

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

485

490

495

Thr

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

Híb

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

500

505

510

Asp

Ser

His

Phe

Gin

Ala

Val

Gin

Phe

Gly

Asn

Arg

Glu

Arg

Glu

515

520

525

Gly

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ala

Arg

Pro

Lys

Gly

530

535

540

Glu

Ser

Thr

Gin

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Ser

Val

Phe

Ser

Ile

555

550

565

560

Pí o

Thr

Leu

Trp

Ser

Pro

Trp

Pro

Ser

Gin

Leu

565

570

575

-37CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 5:

Met 1

Asn

Arg

Gly

Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gin

Leu

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lye

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

Thr

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

S£ i?

Ser

Lye

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

24S

250

255

Lye

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lye

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lvs

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Gin

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Ile

Leu

Asp

Ala

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ile

Val

Leu

Thr

405

410

415

Leu

Tyr

Cys

Arg

Leu

Lys

Ile

Gin

Val

Arg

Lys

Ala

Asp

Ile

Ala

420

425

430

Ser

Arg

Glu

Lys

Ser

Asp

Ala

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Arg

Asn

435

440

445

Gin

Glu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Lys

His

Glu

Lys

Pro

Gin

450

455

460

462

-38CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 6:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

Val

Leu

Gin

Leu

1

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

LyB

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly

LyB

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215.

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

Eis

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

3S5

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Asp

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

420

425

430

-39CZ 293943 B6

Tyr

Gin

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Asp

Lys

Arg

Gly

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

465

470

475

480

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Met

485

490

495

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

500

505

510

Leu

Ser

Thr

Ala

Thr

Lys

Asp

Thr

Tyr Asp

Ala

Leu

His

Met

Gin

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Arg

530

SEKV. ID. Č. 7:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC

SEKV. ID. Č. 8:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG

AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA

SEKV. ID. Č. 9:

CGCGGCCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC

SEKV. ID. Č. 10:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG

SEKV. ID. Č. 11:
CGCGGGCGGC CGCTA	15

-40CZ 293943 B6

SEKV. ID. <

CGCGGGCTCG

SEKV. ID. <

CGCGGGGAGC

SEKV. ID. *

CGCGGGGCGG

SEKV. ID. <

CGCGGGACGC

SEKV. ID. < CGCGGGACGC

SEKV. ID. l

CGCGGGACGC

SEKV. ID. 1

CCCGGATCCC

TTATAGAGCT

TCGTTATAGA

14:

CCACGCGYCC

15:

GTTTCAGCCG

GTGACCCTGA

17:

GTATTGGGAT

AGCATGGGCA

GGTTCTGGCG

CCTGGTTTGC

TCGCCAGCAC

TCCTCGCCAG

CTGCTTCTTC TG

CGCCGAATTC TTATCCCG

ACA

CACACA

CATGGGGGGA AAG

GAAAGGCGAG CGC

GCTCTT

-41 CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 19:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT

SEKV. ID. Č. 20:

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG CTCTTCACCG

SEKV. ID. Č. 21:

GCGGGGCGCG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC

SEKV. ID. Č. 23:

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A

SEKV. ID. Č. 24:

Met

Glu

His

Ser

Thr

Phe

Leu

Ser

Gly

Leu

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

5

10

15

Ser

Gin

Val

Ser

Pro

Phe

Lys

Ile

Pro

Ile

Glu

Leu

Glu

Asp

Arg

20

25

30

val

Phe

Val

Asn

Cys

Asn

Thr

Ser

Ile

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Thr

Val

35

40

45

Cly

Thr

Leu

Ser

Asp

Ile

Thr

Arg

Leu

Asp

Leu

Gly

tys

Arg

Ile

50

55

60

Leu

Asp

Pro

Arg

Gly

Ile

Tyr

Arg

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ile

Tyr

Lys

65

70

75

80

Asp

Lys

Glu

ser

Thr

Val

Gin

Val

His

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Ser

Cys

85

90

95

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Gly

ile

Ile

Val

Thr

Asp

Val

100

105

110

Ala

Ile

Thr

Leu

Ala

Leu

Gly

Val

Phe

Cys

Phe

Ala

Gly

His

115

120

125

-42CZ 293943 B6

Glu

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser

Gly

Ala

Ala Asp

Thr

Gin Ala

Leu

Arg

130

135

140

Asn

Asp

Gin

Val

Tyr

Gin

Pro

Leu

Arg Aep

Arg

Asp Asp

Ala

Gin

Tyr

145

150

155

160

Ser

His

Leu

Gly

Asn

Trp

Ala

Arg Asn

Lys

165

170

SEKV. ID. Č. 25:

Met

Glu Gin

Gly

LyB 5

Gly Leu Ala Val Leu 10

Ile

Leu

Ala Ile

Ile 15

Leu

Gin

Gly

Thr

Leu

Ala

Gin

Ser

Ile

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Val

Lys

20

25

30

Val

Tyr

Asp

Tyr

Gin

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Cys

Asp

Ala

35

40

45

Glu

Ala

Lys

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Lys

Asp Gly

Lys

Met

Ile

Gly

Phe

50

55

60

Leu

Thr

Glu

Asp

Lys

Trp

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Ala

Lys

Asp

65

70

7S

80

Pro

Arg

Gly

Met

Tyr

Gin

Cys

Lys

Gly

Ser

Gin

Asn

Lys

ser

Lys

Pro

85

90

95

Leu

Gin

Val

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Asn

Cys

Ile

Glu

Leu

Asn

Ala

100

105

110

Ala

Thr

Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe

Ala

Glu

Ile

Val

Ser

Ile

Phe

Val

115

120

125

Leu

Ala

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

Ile

Ala

Gly

Gin

Asp

Gly

Val

Arg

Gin

130

135

140

Ser

Arg

Ala

Ser

Asp

Lys

Gin

Thr

Leu

Pro

Asn

Asp

Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro

Leu

Lys

Asp

Arg

Glu

Asp

Gin

Tyr

Ser

His

Leu

Gin

Gly

165

170

175

Asn

Gin

Leu

Arg

Asn

180

-43CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 26:

Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe

5

10

15

Leu

Ser

Tyr

Ala

Cye

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Arg

Val

Glu

20

25

30

Gly

Pro

Ser

Leu

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Glu

Ala

Arg

Leu

35

40

45

Thr

Cye

Glu

Aěn

Asn

Gly

Arg

Asn

Pro

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Ser

Asn

Ile

Thr

Trp

Pro

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

Gly

Gin

65

70

75

80

Gly

Thr

Gly

Gin

Leu

Phe

Pro

Glu

Val

Asn

Lys

Asn

Thr

Gly

85

90

95

Ala

Cye

Thr

Gly

Cys

Gin

Val

Ile

Glu

Asn

Ile

Leu

Lys

Arg

Ser

100

105

110

Cye

Gly

Thr

Tyr

Leu

Arg

Val

Arg

Aen

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Phe

Leu

115

120

125

Asp

Met

Gly

Glu

Gly

Thr

Lys

Asn

Arg

Ile

Thr

Ala

Glu

Gly

Ile

130

135

140

Ile

Leu

Phe

Cys

Ala

Val

Pro

Gly

Thr

Leu

Phe

Arg

145

150

155

160

Lys

Arg

Trp

Gin

Asn

Glu

Lys

Phe

Gly

Val

Asp

Met

Pro

Asp

Tyr

165

170

175

Glu

Asp

Glu

Asn

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Leu

Asp

Cys

Ser

Met

180

185

190

Tyr

Glu

ASp

Ile

Ser

Arg

Gly

Leu

Gin

G2y

Thr

Tyr

Gin

Asp

Val

Gly

195

200

205

Asn

Leu

His

Ile

Gly

Asp

Ala

Gin

Leu

Glu

Lys

Pro

210

215

220

SEKV. ID. Č. 27:

Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro

Cys

His Trp Leu Leu 15

Phe

5

10

Leu

Phe

Ser

Gly

Glu

Pro

Val

Pro

Ala

Met

Thr

Ser

20

25

30

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gin

Gly

Ser

Pro

Cye

Ser

Gin

Ile

Trp

Gin

35

40

45

His

Pro

Arg

Phe

Ala

Lys

Arg

Ser

Met

Val

Lys

Phe

His

50

55

60

Cys

Tyr

Thr

Asn

His

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg Gly

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Gin

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Arg

Ile

Val

Gin

85

90

95

Thr

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Gin

Asn

Ile

Gin

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Asn

Gly

Ile

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gin

Lys

Cys

Asp

Ser

Ala

Asn

115

120

125

His

Asn

Val

Thr

Asp

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

130

135

140

Ser

Thr

Leu

Aep

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

Asp

Gly

Ile

145

150

155

160

Ile

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Ile

Leu

Phe

Ile

Val

Pro

Ile

165

170

175

-44CZ 293943 B6

Phe Leu His Thr Ile Val

210

Pro Gly

225

Leu Leu

180 Tyr Glu 195 Thr Leu

Gin Glu

Asp Lys

Gly Leu

Arg Thr

Asp Asp

Asn Ile

200 Gly Glu 215

Gly Lys

185

Asp Gin

Val Lys

Ala Gly

Thr Ala

Trp Ser

220

Met Glu

190 Thr Tyr 205

Val Gly

Glu Asp

Glu His

SEKV. ID. Č. 28:

GCCTGTTTGA	GAAGCAGCGG	GCAAGAAAGA	CGCAAGCCCA	GAGGCCCTGC	50
CATTTCTGTG	GGCTCAGGTC	CCTACTGGCT	CAGGCCCCTG	CCTCCCTCGG	100
CAAGGCCACA	ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	150
TGCAACTGGC	GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	200
GGCAAAAAAG	GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	250
GAGCATACAA	TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	300
ATCAGGGCTC	CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	350
GACTCAAGAA	GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCGGC	TGATCATCAA	400
GAATCTTAAG	ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	450
AGAAGGAGGA	GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	500
ACCCACCTGC	TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	550
TGGTAGTAGC	CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAČ	600
AGGGGGGGAA	GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	650
ACCTGGACAT	GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	700
AGACATCGTG	GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	750
AAGAGGGGGA	ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	800
AAGCTGACGG	GCAGTGGCGA	gctgtggtgg	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	850
CTCCAAGTCT	TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	900
AACGGGTTAC	CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	950
CACCTCACCC	TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	1000
CACCCTGGCC	CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	1050

-45CZ 293943 B6

TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG1100

TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA1150

GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG1200

AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG1250

GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA1300

TCCC1304

SEKV. ID. Č. 29:

Met

Asn Arg Gly

Val 5

Pro Phe Arg Híb Leu Leu 10

Leu Val

Leu

Gin 15

Leu

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Zle

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Tle

Zle

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Zle

Giu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

fhe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Zle

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

11 e

Asp

Zle

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Zle

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Zle

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

2S5

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

-46CZ 293943 B6

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lye

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

LyB

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Zle

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

385

390

395

SEKV. ID. Č. 30:

GCCTGTTTGA	GAAGCAGCGG	gcaagaaaga	CGCAAGCCCA	GAGGCCCTGC	50
CATTTCTGTG	GGCTCAGGTC	CCTACTGGCT	CAGGCCCCTG	CCTCCCTCGG	100
CAAGGCCACA	ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	150
TGCAACTGGC	GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	200
GGCAAAAAAG	GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	250
GAGCATACAA	TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	300
ATCAGGGCTC	CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	350
GACTCAAGAA	GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	400
GAATCTTAAG	ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	450
AGAAGGAGGA	GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	500
ACCCACCTGC	TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	550
TGGTAGTAGC	CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	600
AGGGGGGGAA	GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	650
ACCTGGACAT	GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	700
AGACATCGTG	GTGCTAGCT				719

-47CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 31:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

Val

Leu

Gin

Leu

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lye

Asn

Ile

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

195

200

SEKV. ID. Č. 32:

GCTAGCAGAG CCCAAATCTT CAGCACCTGA ACTCCTGGGG CCCAAGGACA CCCTCATGAT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT AACAGCACGT ACCGGGTGGT GCTGAATGGC AAGGAGTACA CCCCCATCGA GAAAACCATC

GTGACAAAAC TCACACATGC GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC GCCAAGACAA AGCCGCGGGA CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC AGTGCAAGGT CTCCAACAAA TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC

CCACCGTGCC50

CCCCCCAAAA100

CATGCGTGGT150

TGGTACGTGG200

GGAGCAGTAC250

ACCAGGACTG300

GCCCTCCCAG350

CCGAGAACCA400

-48CZ 293943 B6

CAGGTGTACA	CCCTGCCCCC	ATCCCGGGAT	GAGCTGACCA	AGAACCAGGT	450
CAGCCTGACC	TGCCTGGTCA	AAGGCTTCTA	TCCCAGCGAC	ATCGCCGTGG	500
AGTGGGAGAG	CAATGGGCAG	CCGGAGAACA	ACTACAAGAC	CACGCCTCCC	550
GTGCTGGACT	CCGACGGCTC	CTTCTTCCTC	TACAGCAAGC	TCACCGTGGA	600
CAAGAGCAGG	TGGCAGCAGG	GGAACGTCTT	CTCATGCTCC	GTGATGCATG	650
AGGCTCTGCA	CAACCACTAC	ACGCAGAAGA	GCCTCTCCCT	GTCTCCGGGG	700
CTGCAACTGG	ACGAGACCTG	TGCTGAGGCC	CAGGACGGGG	AGCTGGACGG	750
GCTCTGGACG	ACGGATCC				768

SEKV. ID. Č. 33:

Glu

Pro

Lye

Ser

Cys

Asp

Lye

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

1

5

10

15

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

50

55

60

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lye

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Αβπ

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lye

Cys

Lys

Val

Ser

ABn

Lye

Ala

100

105

110

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

115

120

125

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

130

135

140

Lye

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

LyB

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Val.

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Aap

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Leu

Gin

Leu

Asp

Glu

Thr

Cys

Ala

Glu

225

230

235

240

Ala

Gin

Asp

Gly

Glu

Leu

Asp

Gly

Leu

Trp

Thr

Asp

Pro

245

250

-49CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 34:

CCAAGGGCCT CTGCCCTCCC TGCCCCACCG

CCCGCAGACA GCCTCTGCCC TCCCTGACCC

CTGCGGCCCT GGCGGTGATC TCCTTCCTCC

ACAGGCTCCG	CCCTCCCTGA	50
GCCAGCAGCC	TCTGCCCTCC	100
TCGGGCTGGG	CCTGGGGGTG	150

174

GCGTGTGTGC TGGCGAGGAC GCGT

SEKV. ID. Č. 35:

Pro Arg 1

Asp Pro

Leu Pro

Gly Val

SO

Ala Ser

Gin Thr

Ala Ala 35 Ala Cys

Ala Leu 5

Ala ser

Leu Ala

Val Leu pro Ala Ala Leu Val Ile

Ala Arg

Pro Pro

Pro Aep

Ser Phe

Thr Arg

Thr Gly

Pro Pro

Leu Leu

Ser Ala

Ala Ala

Gly Leu

Leu Pro

Ser Ala

Gly Leu

SEKV. ID. Č. 36:

ACGCGTTTCA GCAGGAGCGC

CCAGCTCTAT AACGAGCTCA

TGGACAAGAG ACGTGGCCGG

AAGAACCCTC AGGAAGGCCT

GGAGGCCTAC AGTGAGATTG

GGCACGATGG CCTTTACCAG

GACGCCCTTC ACATGCAGGC

AGAGCCCCCC GCGTACCAGC ATCTAGGACG AAGAGAGGAG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GTACAATGAA CTGCAGAAAG GGATGAAAGG CGAGCGCCGG GGTCTCAGTA CAGCCACCAA CCTGCCCCCT CGCTAAAGCG

AGGGCCAGAA50

TACGATGTTT100

GCCGAGAAGG150

ATAAGATGGC200

AGGGGCAAGG250

GGACACCTAC300

GCCGC34S

-50CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 37:

Thr

Arg

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

Tyr

Gin

Gly

Gin

1

5

10

15

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

Asp

20

25

30

Val

Leu

Asp

Lys

Arg

Gly

Arg

Aep

Pro

Glu

Met

Gly

Lys

Pro

35

40

45

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu Leu

Gin

Lys

Asp

50

55

60

Lys

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Met

Lys

Gly

Glu

Arg

65

70

75

80

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Ser

Thr

Ala

Thr

85

90

95

Lys

Aep

Thr

Tyr

Asp

Ala

Leu

His

Het

Gin

Ala

Leu

Pro

Arg

100

105

110

SEKV. ID. Č. 38:

SEKV. ID. Č. 39:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu Cys 1510

Tyr Leu

Leu Asp Gly

SEKV. ID. Č. 40:

Leu Gly Glu Pro Glr. Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala 1510

SEKV. ID. Č. 41:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gin Leu cys Tyr Ile 1 5 1015

Leu Asp Ala

-51 CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 42:

Gin Ser Phe Gly Leu

5

Leu Asp Pro Lys

Leu Cys 'Tyr Leu Leu

Asp Gly

SEKV. ID. Č. 43:

Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu 1 S 10

Asp Gly

SEKV. ID. Č. 44:

Gin Ser 1

Phe

Gly

Leu S

Leu Asp

Pro

Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp

Gly

10

15

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

Ala

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

20

25

30

LyB

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

Tyr

Gin

Gly

Gin

Asn

35

40

45

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

50

55

60

Leu

Asp

Lys

Arg

Gly

Arg

Asp

Pro

Glu

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

65

70

75

80

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

65

90

95

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Met

Lys

Gly

Glu

Arg

100

105

110

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Ser

Thr

Ala

Thr

Lys

115

120

125

Aep

Thr

Tyr

Asp

Ala

Leu

His

Met

Gin

Ala

Leu

pro

Pro

Arg

130

135

140

SEKV. ID. Č. 45:

Arg val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gin Gin Gly 15 1

Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 ^{25 30}

Asp Val Leu

-52CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 46:

Lys Lys Leu Val 1

Leu Tyr Asn Glu

Lys Lye Phe Arg

Leu Asn Leu Gly

Gin Lys Lys Gin 10

Arg Arg Glu Glu

Arg Gin Aen Gin

Tyr Asp Val Leu 30

SEKV. ID. Č. 47:

Arg Thr Gin Ile Lys Lys Leu Cys

5

Ser Tro Arg Asp Lys Asn 10'

Ser Ala

Ala Asn Gin Leu

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

Gly Arg Arg Glu

Glu Tyr

Asp val Leu

SEKV

Arg 1

Thr

Arg

Phe

Ser e

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro 10

Pro

Ala

Tyr

Gin

Gin 15

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu 20

.yr

Asn

Glu

Leu

Asn 25

Leu

Gly

Arg

Glu 30

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

SEKV. ID. Č. 49:

Arg

Thr

Arg

Asp

Pro

Glu

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

1

5

10

15

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Ala

Glu

Ala

20

25

30

Tyr Ser Glu Ile

-53CZ 293943 B6

SEKV. ID. Č. 50:

Arg Thr Arg Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 15 10 15

Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 20 25 30

Ala Leu His Met Gin Ala

SEKV. ID. Č. 51:

GGATCCCAAG GCGAGGCTAA AGCCGAAGCC GCGAAGGCCG AGGCTAAGGC CGAAGCAGAT

CTG

SEKV. ID. Č. 52:

Asp Pro Lys Ala Glu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ala 15 10 15

Glu Ala Asp Leu

-54CZ 293943 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby buňky, která exprimuje membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor, vyznačující se tím, že se zavede do uvedené buňky nukleová kyselina kódující chimerní receptor, jenž zahrnuje fragment CD4, který je schopný specificky rozpoznávat a vázat HIVinfikované buňky, ale který nezprostředkovává infekci HIV, a tento receptor působí jako lákadlo pro HIV k navázání cirkulujících HTV, a tím je schopen redukovat titr viru.
2. Způsob výroby buňky podle nároku 1,vyznačující se tím, že fragment CD4 se skládá z aminokyselin 1 až 394 nebo 1 až 200.
3. Způsob výroby buňky podle nároku 1,vyznačující se tím, že fragment CD4 se separuje od intracelulární části transmembránovou doménou CD7, ukázanou v Obr. 26, nebo pantem, doménami CH2 a CH3 molekuly lidského IgGl, ukázanými v Obr. 25.
4. Způsob výroby buňky podle nároku 1,vyznačující se tím, že fragment CD4 se separuje od membrány řečené terapeutické buňky alespoň 48.10^-10 m nebo alespoň 72.10^-10 m.
5. Způsob výroby buňky podle nároku 1,vyznačující se tím, že receptor obsahuje transmembránovou část CD7, transmembránovou část CD5, nebo transmembránovou část CD34.
6. Způsob výroby buňky podle nároku 1,vyznačující se tím, že fragment CD4 se separuje od membrány terapeutické buňky jedním nebo více bílkovinnými a-helixy.
7. Způsob výroby buňky podle nároku 1,vyznačující se tím, že terapeutické buňky jsou vybrány ze skupiny sestávající z T buněk, B buněk, neutrofilů, dendritických buněk nebo folikulárních dendritických buněk.
8. Membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor, jenž zahrnuje fragment CD4, který je schopný specificky rozpoznávat a vázat HlV-infíkované buňky, ale který nezprostředkovává infekci HIV, a tento receptor působí jako lákadlo pro HIV k navázání cirkulujících HTV, a tím je schopen redukovat titr viru.
9. Membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor podle nároku 8, kde CD4 fragment je složen z aminokyselin 1 až 394 nebo 1 až 200.
10. Membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor podle nároku 8, přičemž CD4 fragment je separován od intracelulární části transmembránovou doménou CD7, ukázanou v Obr. 26, nebo pantem, doménami CH2 a CH3 molekuly lidského IgGl, ukázanými v Obr. 25.
11. Membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor podle nároku 8, přičemž CD4 fragment je separován od membrány řečené terapeutické buňky alespoň 48 angstromy nebo alespoň 72 angstromy.
12. Membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor podle nároku 8, přičemž receptor obsahuje transmembránovou část CD7, transmembránovou část CD5, nebo transmembránovou část CD34.
13. Membránově vázaný bílkovinný chimemí receptor podle nároku 8, kde CD4 fragment je separován od membrány řečené terapeutické buňky jedním nebo více bílkovinnými a-helixy.

-55CZ 293943 B6
14. DNA kódující membránově vázaný bílkovinný chimerní receptor, jenž obsahuje extracelulární část, která zahrnuje fragment CD4, který je schopný specificky rozpoznávat a vázat HlV-infikované buňky, ale kteiý nezprostředkovává infekci HIV, a tento receptor působí jako

5 lákadlo pro HIV k navázání cirkulujících HTV, a tím je schopen redukovat titr viru.
15. Vektor obsahující DNA chimemího receptoru podle nároku 14.