PL181085B1

PL181085B1 - Środek do leczenia, komórka, białkopodobny chimeryczny receptor błonowy

Info

Publication number: PL181085B1
Application number: PL95318443A
Authority: PL
Inventors: Brian Seed; Babak Banapour; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1994-08-02
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2001-05-31
Also published as: NO970440L; NZ291017A; HK1002545A1; CZ26497A3; MX9700800A; HU221603B; CA2195653A1; PL318443A1; FI970428A; NO970440D0; CN1158552A; HUT77253A; PT781095E; FI119868B; DK0781095T3; DE69529910D1; ES2191058T3; CZ293943B6; IL114778A0; CA2195653C

Abstract

1. Srodek do leczenia HIV u ssaka, zawierajacy rekombinowane komórki terapeutycz- ne oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze komórki terapeutyczne wykazuja ekspresje zwiazanego z blona bialkopodobnego receptora chimerycznego zawie- rajacego czesc zewnatrzkomórkowa obejmujaca fragment CD4 zawierajacy aminokwasy 1-94 lub aminokwasy 1-200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od czesci wewnatrz- komórkowej domena zawierajaca sekwencje aminokwasowa wybrana z grupy obejmujacej: fragment CD7 posiadajacy sekwencje SEQ ID NO: 35, region zawiasowy domen CH2 i CH3 z czasteczki ludzkiej IgG posiadajacy sekwencje SEQ ID NO: 33, czesc przezblonowa CD7, czesc przezblonowa CD5 lub czesc przezblonowa CD34 lub bialkowa alfa helise. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek do leczenia HIV u ssaka, zawierający rekombinowane komórki terapeutyczne oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że komórki terapeutyczne wykazują, ekspresję związanego z błoną białkopodobnego receptora chimerycznego zawierającego część zewnątrzkomórkową obejmującą fragment CD4 zawierający aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od części wewnątrzkomórkowej domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadający sekwencję SEQ iD NO: 35, region zawiasowy domen CH2 i CH3 cząsteczki ludzkiej IgG posiadający sekwencję SEQ ID NO: 33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5 lub część przezbłonową CD34, lub białkową alfa helisę.

Korzystnie środek według wynalazku charakteryzuje się tym, ze fragment CD4 jest oddalony od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 4,8 nm lub o co najmniej 7,2 nm. Równie korzystnie środek według wynalazku charakteryzuje się tym, ze komórkę terapeutyczną wybiera się spośród komórek T, komórek B, neutrofili, komórek dendrytycznych lub pęcherzykowych komórek dendrytycznych.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka charakteryzująca się tym, że wykazuje ekspresję związanego z błoną białkopodobnego receptora chimerycznego zawierającego część zewnątrzkomórkową obejmującą fragment CD4 zawierający aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od części wewnątrzkomórkowej domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadający sekwencję SEQ ID NO: 35, region zawiasowy domen CH2 i CH3 cząsteczki ludzkiej IgG posiadający sekwencję SEQ ID NO: 33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5 lub część przezbłonową CD34 lub białkową alfa helisę.

Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment CD4 jest oddalony od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 4,8 nm lub o co najmniej 7,2 nm. Równie korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, ze pochodzi od komórki wybranej spośród komórek T, komórek B, neutrofili, komórek dendrytycznych lub pęcherzykowych komórek dendrytycznych.

Przedmiotem wynalazku jest także białkopodobny chimeryczny receptor błonowy zawierający część zewnątrzkomórkową obejmującą fragment CD4 zawierający aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od części wewnątrzkomórkowej domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadający sekwencję SEQ ID NO: 35, region zawiasowy domen cH2 i CH3 z cząsteczki ludzkiej IgG posiadający sekwencję SEQ ID NO: 33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5 lub część przezbłonową CD34, lub białkową alfa helisę.

Korzystnie receptor według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment CD4 jest oddalony od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 4,8 nm lub o co najmniej 7,2 nm.

Streszczenie wynalazku

Generalnie wynalazek dotyczy sposobu kierowania komórkowej odpowiedzi immunologicznej przeciw komórce zakażonej HIV u ssaka. Sposób związany jest z podawaniem ssakowi skutecznych ilości komórek terapeutycznych, przy czym komórki terapeutyczne, wykazujące ekspresję związanego z błoną, białkopodobnego, chimerycznego receptora składają się z (a) części zewnątrzkomórkowej, która obejmuje fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznania i związania komórki zakażonej HIV, lecz nie pośredniczy w zakażeniu HIV

181 085 i (b) części wewnątrzkomórkowej, zdolnej do przekazania komórce terapeutycznej sygnału do zniszczenia komórki zakażonej HTV, związanej z receptorem.

W odpowiednim aspekcie wynalazek ujawnia komórkę, która wykazuje ekspresję białkopodobnego, chimerycznego, związanego z błoną receptora, który składa się z (a) części zewnątrzkomórkowej, która obejmuje fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznania i związania komórki zakażonej HIV, lecz nie pośredniczy w zakażeniu HTV i (b) części wewnątrzkomórkowej, zdolnej do przekazania komórce terapeutycznej sygnału do zniszczenia komórki zakażonej HIV, związanej z receptorem.

Wynalazek ujawnia także sposób traktowania HIV u ssaka, związanego z podawaniem ssakowi skutecznych ilości komórek terapeutycznych, przy czym komórki terapeutyczne, wykazujące ekspresję związanego z błoną białkopodobnego, chimerycznego receptora składają się z części zewnątrzkomórkowej, która obejmuje fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznania i związania komórki zakażonej HIV, lecz nie pośredniczy w zakażeniu HIV.

W odpowiednim aspekcie, wynalazek ujawnia komórkę, wykazującą ekspresję związanego z błona, białkopodobnego, chimerycznego receptora składającą się z części zewnątrzkomórkowej, która obejmuje fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznania i związania komórki zakażonej HIV, lecz nie pośredniczy w zakażeniu HIV.

W zalecanych postaciach realizacji, fragmentem CD4 są aminokwasy CD4 1-394 wyodrębnione z wewnątrzkomórkowej części przy domenie transbłonowej CD7 pokazanej na fig. 26 lub przy zawiasie, domenach CH2 i CH3 cząsteczki ludzkiej IgG1 pokazanej na fig. 25; i wyodrębnia się z komórki terapeutycznej fragment CD4 o co najmniej 4,8 nanometrach (a korzystnie co najmniej 7,2 nm). W zalecanych postaciach realizacji, częścią wewnątrzkomórkową jest część przekazująca sygnał białka receptora komórki T (np. ζ), białka receptora komórki B lub białka receptora Fc; i komórki terapeutyczne wybiera się z grupy składającej się z: (a) limfocytów T; (b) cytotoksycznych limfocytów T; (c) naturalnych zabójców komórek; (d) neutrofili; (e) granulocytów; (f) makrofagów; (g) komórek tucznych; (h) komórek HeLa; oraz (i) embrionalnych komórek macierzystych (ES).

W innych odpowiednich aspektach, wynalazek dotyczy DNA kodującego chimeryczne receptory według wynalazku; oraz wektor zawierający DNA tego receptora chimerycznego.

Mimo, iż szczególną postacią realizacji niniejszego wynalazku jest chimera między CD4 i zeta, każdy łańcuch receptora, pełniący funkcje podobne do tych cząsteczek, np. w granulocytach lub limfocytach B, mógłby być użyty do opisanych tu celów. Wyróżniające cechy cząsteczki wyzwalającej pożądaną odporność komórki obejmują zdolność do wykazywania ekspresji w sposób autonomiczny (to jest jako pojedynczy łańcuch), zdolność do fuzji z zewnątrzkomórkową domeną CD4 tak, że otrzymana chimera obecna jest na powierzchni komórki terapeutycznej i zdolność do inicjowania komórkowych programów efektorowych, po wtórnej agregacji odpowiednika z docelowym ligandem.

Obecnie najbardziej dogodnym sposobem dostarczenia chimer do komórek systemu immunologicznego prowadzi przez pewne postacie terapii genetycznej. Jednakże odtworzenie komórek systemu immunologicznego z chimerycznymi receptorami, przez mieszanie komórek z odpowiednimi, rozpuszczonymi, oczyszczonymi białkami chimerycznymi, dałoby także efekt w postaci wytworzenia populacji zbudowanych komórek zdolnych do odpowiedzi na obiekty zakażone HIV. Podobnych sposobów użyto np. do wprowadzenia cząsteczki CD4 do erytrocytów, w celach leczniczych. W tym wypadku populacja zbudowanych komórek nie byłaby zdolna do odnawiania się.

Niniejszy wynalazek odnosi się do funkcjonalnych i uproszczonych chimer między fragmentami CD4 i receptorem komórki T, receptorem komórki B i podjednostkami receptora Fc, które są zdolne do kierowania komórek odporności do rozpoznawania i lizy komórek zakażonych HIV. Sposób kierowania odpowiedzi komórkowej u ssaka obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości komórek terapeutycznych (np. cytotoksycznych limfocytów T), przy czym komórki są zdolne do rozpoznawania i niszczenia komórki zakażonej HIV.

Wynalazek ujawnia także chimeryczne białka receptora, które kierują cytotoksyczne limfocyty T do rozpoznania i lizy komórek zakażonych HIV, przy czym komórki gospodarza

181 085 transformowane wektorem, zawierają chimeryczne receptory i przeciwciała skierowane przeciw chimerycznym receptorom.

Te i inne nie ograniczające postacie realizacji niniejszego wynalazku staną się jasne dla fachowców przez następujący szczegółowy opis wynalazku.

Następujący szczegółowy opis będzie odnosić się do różnych, znanych fachowcom, metodologii biologii i immunologii molekularnej. Publikacje i inne materiały przedstawiające takie znane metodologie, do których czyni się odniesienie, załącza się tu w całości jako odnośniki, aby przedstawić je w pełni.

Standardowe publikacje informacyjne, przedstawiające generalne zasady technologii rekombinantów DNA obejmują: Watson i in., Molecular Biology of the Gene, tomy I i II, wydawca the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell i in., Molecular Cell Biology, wydawca Scientific American Books, Inc., New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, wydawcy John Willey & Sons, New York, N.Y. (1985); Old i in., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, wyd. 2, wydawca University of California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, wydawca Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); i Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

Definicje

Przez „kloning” rozumie się stosowanie in vitro technik rekombinacyjnych, aby wprowadzić poszczególny gen lub inną sekwencję DNA do cząsteczki wektora.

Przez „cDNA” rozumie się komplementarny DNA lub kopię DNA wytworzoną na matrycy RNA przez działanie polimerazy DNA zależnej od RNA (odwrotnej transkryptazy). W ten sposób „klon cDNA” oznacza podwójną sekwencję DNA komplementarną do interesującej cząsteczki RNA, przenoszoną w wektorze kloningowym.

Przez „bibliotekę cDNA” rozumie się zbiór rekombinowanych cząsteczek DNA, zawierających wtręty cDNA, które obejmują kopie DNA z mRNA, podlegające ekspresji przez komórkę w czasie tworzenia biblioteki cDNA. Taką bibliotekę cDNA można sporządzić sposobami znanymi fachowcom i opisano je np. u Ausubela i in., jak wyżej i Maniatisa i in., jak wyżej. Generalnie najpierw izoluje się RNA z komórek organizmu, z genomu którego pragnie się klonować poszczególny gen. Zaleca się dla celów niniejszego wynalazku linie komórek limfocytów ssaków, zwłaszcza ludzi. Obecnie zalecanym do tego celu wektorem jest szczep wirusa ospy krowiej WR.

Przez „wektor” rozumie się cząsteczkę DNA pochodzącą np. z plazmidu, bakteriofaga lub wirusa ssaka lub owada, do którego wtrącono lub klonowano fragmenty DNA. Wektor będzie zawierał jedno lub więcej unikatowych miejsc restrykcji i może być zdolny do autonomicznej replikacji w określonym gospodarzu lub organizmie nośnikowym, takim, że klonowana sekwencja zdolna jest do reprodukcji. Tak więc przez „wektor ekspresji DNA” rozumie się każdy autonomiczny element zdolny do sterowania syntezą rekombinowanego peptydu. Takie wektory ekspresji DNA obejmują plazmidy bakteryjne i fagi oraz plazmidy ssaków i owadów oraz wirusy.

Przez „zasadniczo czysty” rozumie się związek, np. białko, polipeptyd lub przeciwciało, które jest zasadniczo wolne od składników naturalnie mu towarzyszących. Generalnie związek jest zasadniczo czysty, gdy co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 75%, a najkorzystniej co najmniej 90% całości materiału w próbce jest interesującym związkiem. Czystość można mierzyć jakąkolwiek odpowiednią metodą, np. chromatografią na kolumnie, elektroforezą w żelu poliakrylamidowym lub analizie HPLC. W przypadku kwasu nukleinowego „zasadniczo czysty” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, segment lub fragment, który nie sąsiaduje bezpośrednio (to jest nie wiąże się kowalencyjnie) z obiema kodującymi sekwencjami, z którymi bezpośrednio sąsiaduje (to jest z jedną przy końcu 5' i z jedną przy końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego pochodzi DNA według wynalazku.

„Fragment” cząsteczki, takiej jak każda sekwencja cDNA według mniejszego wynalazku jest rozumiany jako każdy sąsiadujący podzbiór nukleotydów cząsteczki. „Analog” cząsteczki oznacza nienaturalną cząsteczkę zasadniczo podobną zarówno do całej cząsteczki jak

181 085 do jej fragmentu. O cząsteczce mówi się, że jest „zasadniczo podobna” do innej cząsteczki jeśli sekwencja aminokwasów w obu cząsteczkach jest zasadniczo taka sama. W szczególności „zasadniczo podobną” sekwencją aminokwasu jest ta, która wykazuje co najmniej 50%, korzystnie 85%, a najkorzystniej 95% identyczności sekwencji aminokwasu, jak w sekwencji naturalnej lub porównawczej i/lub ta, która różni się od naturalnej lub porównawczej sekwencji aminokwasowej tylko konserwatywnymi substytucjami aminokwasu. Zasadniczo podobne cząsteczki aminokwasów będą posiadały podobną aktywność biologiczną. Jak mówi się tutaj, cząsteczka jest „pochodną chemiczną” innej cząsteczki, gdy zawiera cząstki chemiczne nie będące normalnie składnikiem cząsteczki. Takie cząstki mogą poprawiać rozpuszczalność cząsteczki, absorpcję, okres biologicznego półtrwania, itd. Z drugiej strony cząstki te mogą zmniejszać toksyczność cząsteczki, eliminować lub osłabiać jej niepożądane efekty uboczne, itd. Cząstki zdolne do pośredniczenia w takich efektach opisano np. w Remington’s Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

Na „funkcjonalną pochodną” genu chimery receptora według wynalazku składają się „fragmenty” lub „analogi” genu, które są „zasadniczo podobne” w sekwencji nukleotydów. „Zasadniczo podobne” kwasy nukleinowe kodują zasadniczo podobne sekwencje aminokwasów (jak określono powyżej), a także mogą obejmować każdą sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do hybrydyzowania naturalnej lub porównawczej sekwencji kwasu nukleinowego w odpowiednich warunkach hybrydyzacji (patrz np. Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) dla odpowiednich ścisłych warunków hybrydyzacji).

„Zasadniczo podobny” chimeryczny receptor posiada podobną aktywność do komórek T „dzikiego typu”, komórek B lub chimery receptora Fc. Najkorzystniej, pochodna posiada 90%, mniej korzystnie 70% i najmniej korzystnie 40% aktywności chimery receptora dzikiego typu. Aktywność funkcjonalnej pochodnej chimerycznego receptora obejmuje specyficzne wiązanie (z jego zewnątrzkomórkową częścią CD4) komórki zakażonej HIV i w efekcie zniszczenie tej komórki; dodatkowo, receptor chimeryczny nie sprawia, że komórka posiadająca receptor jest wrażliwa na infekcję HIV. Aktywność receptora chimerycznego można testować przy użyciu np. każdego oznaczenia tu opisanego.

Sekwencję DNA kodującą chimerę receptora CD4 według niniejszego wynalazku lub jej pochodne funkcjonalne można rekombinować wektorem DNA przy użyciu konwencjonalnych technik, obejmujących końce tępe lub leżące naprzeciw siebie przeznaczone do łączenia, trawienie enzymem restrykcyjnym, aby otrzymać odpowiednie końce, uzupełnienie lepkich końców, aby były odpowiednie, traktowanie fosfatazą alkaliczną w celu uniknięcia niepożądanego połączenia i łączenie przy użyciu odpowiednich ligaz. Techniki stosowane przy tych zabiegach opisano przez Maniatisa i in., jak wyżej i są dobrze znane w obecnym stanie wiedzy.

Mówi się, że cząsteczka kwasu nukleinowego, takiego jak DNA jest „zdolna do ekspresji” polipeptydu jeśli obejmuje sekwencję nukleotydów, które zawierają informację regulującą transkrypcję i translację i takie sekwencje są „operacyjnie związane” z sekwencjami nukleotydów, kodującymi polipeptyd. Wiązanie operacyjne jest wiązaniem, w którym sekwencje DNA regulującej sekwencje DNA przeznaczone do ekspresji łączą się tak, aby pozwolić na ekspresję genu. Ściśle określony charakter regionów regulatorowych wymagany dla ekspresji genu może ulegać zmianom zależnie od organizmu, ale generalnie, będzie obejmować region promotora, który u organizmów prokariotycznych zawiera promotor (sterujący inicjacją transkrypcji RNA) jak również sekwencje DNA, które transkrybowane na RNA, dadzą sygnał inicjacji syntezy białka. Takie regiony zwykle będą obejmować sekwencje 5' nie kodujące, związane z inicjacją transkrypcji i translacji, takie jak TATA box, sekwencja kapturkowa, sekwencja CAAT i podobne.

Jeśli potrzeba, nie kodujący region 3' sekwencji genu, kodującego białko można otrzymać wyżej opisanymi metodami. Region ten można utrzymywać, dla jego regulatorowych sekwencji terminacji transkrypcji, takich jak terminacja i poliadenylacja. Tak więc, przez utrzymanie regionu 3' naturalnie sąsiadującego z sekwencją DNA, kodującą białko, można dostarczyć sygnałów terminacji transkrypcji. Tam, gdzie sygnały terminacji transkrypcji nie

181 085 są wystarczająco funkcjonalne w ekspresji w komórce gospodarza, region 3' funkcjonalny w komórce gospodarza można zastąpić.

Uważa się, ze dwie sekwencje DNA (takie jak sekwencja regionu promotora i sekwencja kodująca chimerę receptora CD4) są operacyjnie związane jeśli charakter wiązania między dwiema sekwencjami DNA (1) nie daje w efekcie wprowadzenia mutacji zmiany fazy odczytu (2) nie zakłóca zdolności sekwencji regionu promotora do sterowania transkrypcją sekwencji genu chimery receptora lub (3) nie zakłóca zdolności do transkrypcji sekwencji genu chimery receptora przez sekwencję regionu promotora. Region promotora będzie operacyjnie związany z sekwencją DNA, jeśli promotor będzie zdolny do wykonania transkrypcji tej sekwencji DNA. Tak więc, w celu ekspresji białka konieczne są sygnały transkrypcji i translacji rozpoznawane przez odpowiedniego gospodarza.

Niniejszy wynalazek obejmuje ekspresję białka chimery receptora CD4 (lub jego funkcjonalną pochodną) zarówno w komórkach organizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych, jednakże zaleca się ekspresję komórek eukariotycznych (a zwłaszcza ludzkiego limfocytu).

Przeciwciała można wytworzyć różnymi sposobami. Można np. podać zwierzęciu komórki wykazujące ekspresję białka chimery receptora CD4 lub jego funkcjonalną pochodną, w celu wytworzenia surowicy odpornościowej, zawierającej poliklonalne przeciwciała, zdolne do wiązania chimery.

W zalecanym sposobie, przeciwciałami według wynalazku są przeciwciała monoklonalne. Takie przeciwciała monoklonalne można wytworzyć przy użyciu technologii hybrydomy (Kohler i in., Nature, 256: 495 (1975); Kohler i in., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler i in., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling i in., w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier, N.Y., str. 563-684 (1981)). Zazwyczaj, takie procedury związane są z immunizacją zwierzęcia antygenem chimery receptora CD4. Ekstrahuje się limfocyty śledziony takich zwierząt i łączy z odpowiednią linią komórek szpiczaka. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, można użyć każdej odpowiedniej linii komórkowej szpiczaka. Po fuzji, powstałe w efekcie komórki hybrydomy utrzymuje się wybiórczo w pożywce HAT i następnie klonuje przez rozcieńczanie ograniczające jak opisano u Wandsa i in., (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)). Komórki hybrydomy otrzymane w wyniku takiej selekcji analizuje się następnie, w celu identyfikacji klonów, które wydzielają przeciwciała zdolne do wiązania chimery.

Przeciwciała mogą być także poliklonalne lub, korzystnie, mogą być specyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi regionu.

Przeciwciała wobec chimery receptora CD4 według niniejszego wynalazku można stosować do monitorowania ilości receptorów chimerycznych (lub komórek posiadających receptor chimeryczny) u pacjenta. Takie przeciwciała są bardzo wygodne do użytku w standardowych analizach immunodiagnostycznych znanych w tej dziedzinie, obejmujących takie oznaczenia immunometryczne lub „typu sandwicz” jak oznaczenie typu sandwicz współbieżne, odwrotne oraz jednoczesne. Przeciwciała mogą być używane w każdej ilości kombinacji określonej przez fachowca, bez niepotrzebnego eksperymentowania, aby uzyskać oznaczenia immunologiczne o możliwej do przyjęcia specyficzności, czułości i dokładności.

Standardowe publikacje informacyjne, przedstawiające generalne zasady immunologii obejmują Roitt, Essential Immunology, wyd. 6, wydawca Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, wyd. 2, wydawca Macmillan Publishing Co., New York (1986); Roitt i in., Immunology, wydawca Gower Medical Publishing Ltd., London (1985); Campbell, „Monoclonal Antibody Technology” u Burdona i in., wyd. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 13, wydawca Elsevier, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science od Self-Nonself Discrimination, wydawca John Wiley & Sons, New York (1982); oraz Kennett i in., wyd. Monoclonal Antibodies. Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, wydawca Plenum Press, New York (1980).

Przez „wykrywanie” rozumie się określanie obecności lub nieobecności substancji albo oznaczenie ilości substancji. W ten sposób termin wiąże się z użyciem materiałów, kompozycji i sposobów niniejszego wynalazku do określeń jakościowych i ilościowych.

181 085

Przeciwciała i zasadniczo oczyszczony antygen idealnie nadają się do wytworzenia zestawu. Przyjmuje się, że taki zestaw może zawierać nośnik, poprzedzielany, aby otrzymać ściśle odgrodzony jeden lub więcej pojemników, rozumianych jako fiolki, rurki i temu podobne, przy czym przyjmuje się, że każdy z wymienionych pojemników zawiera oddzielne elementy do użycia w oznaczeniu.

Jest wiele typów oznaczeń, które można włączyć w formie zestawu i obejmują one np. oznaczenia współzawodniczące i nie współzawodniczące. Typowymi przykładami oznaczeń, które mogą wykorzystać przeciwciała według wynalazku są oznaczenia radioimmunologiczne (RIA), immunoenzymatyczne (EIA), enzymatyczne oznaczenia immunosorpcyjne (ELISA) i oznaczenia immunometryczne lub typu sandwicz.

Przez termin „oznaczenie immunometryczne” lub „oznaczenie immunologiczne sandwiczowe” rozumie się oznaczenie typu sandwicz jednoczesne, współbieżne i odwrotne. Terminy te są dobrze rozumiane przez fachowców. Fachowcy docenią również, że przeciwciała według niniejszego wynalazku będą użyteczne w innych odmianach i postaciach oznaczeń znanych obecnie lub mogących rozwinąć się w przyszłości. Zamierza się włączyć je w zakres niniejszego wynalazku.

Przez „specyficznie rozpoznaje i wiąże” rozumie się to, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże polipeptyd chimerycznego receptora, ale nie rozpoznaje w sposób istotny innych nieodpowiednich cząsteczek w próbce, np. próbce biologicznej.

Przez „komórkę terapeutyczną” rozumie się komórkę transformowaną przez chimerę receptora CD4 według wynalazku tak, że jest ona zdolna do rozpoznania i zniszczenia komórki zakażonej HIV; korzystnie takimi komórkami terapeutycznymi są komórki układu hematopoetycznego.

Przez „zewnątrzkomórkowy” rozumie się posiadający co najmniej część cząsteczki wystawionej na powierzchni komórki. Przez „wewnątrzkomórkowy” rozumie się posiadający co najmniej część cząsteczki, wystawionej do cytoplazmy komórki terapeutycznej. Przez „transbłonowy” rozumie się posiadający co najmniej część cząsteczki przechodzącej przez błonę plazmatyczną. Użyte tu terminy „część zewnątrzkomórkowa”, „część wewnątrzkomórkowa” i „część transbłonowa” mogą obejmować leżące po obu stronach sekwencje aminokwasowe, które rozciągają się do sąsiadujących przedziałów komórkowych.

„Oligomeryzować” oznacza tworzyć kompleks z innymi białkami do postaci dimerów, trimerów, tetramerów lub innych oligomerów wyższego rzędu. Takimi oligomerami mogą być homooligomery lub heterooligomery. „Częścią oligomeryzującą” jest taki region cząsteczki, który steruje tworzeniem kompleksu (to jest oligomeru).

Przez „cytolityczny” rozumie się zdolny do niszczenia komórki (np. komórki zakażonej HIV) lub zdolny do niszczenia czynnika zakażającego (np. wirusa HIV).

Przez „wirusa niedoboru odporności” rozumie się retrowirusa, który w formie dzikiej, zdolny jest do zakażenia komórek T4 gospodarza, należącego do naczelnych i posiada morfogenezę i morfologię charakterystyczną dla podrodziny lentiwirusów. Termin ten obejmuje, bez ograniczeń, wszystkie odmiany HIV i SIV, włączając HIV-1, HIV-2, SlVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand i SIVcpz.

Przez „zależny od MHC” rozumie się to, że cytolityczna odpowiedź komórkowa nie wymaga obecności antygenu MHC klasy II na powierzchni komórki docelowej.

Przez „funkcjonalną pochodną przekazującą sygnał cytolityczny” rozumie się funkcjonalną pochodną (jak określono powyżej), zdolną do sterowania co najmniej 40%, korzystniej 70% lub najkorzystniej, co najmniej 90% biologicznej aktywności cząsteczki typu dzikiego. Jak określa się tutaj, „funkcjonalna pochodna przekazująca sygnał cytolityczny” może działać bezpośrednio przez podanie komórce terapeutycznej sygnału do zniszczenia czynnika lub komórki związanej z receptorem (np. w przypadku wewnątrzkomórkowej części receptora chimerycznego) albo może działać nie bezpośrednio przez pobudzenie oligomeryzacji z białkami przekazującymi sygnał cytolityczny komórki terapeutycznej (np. w przypadku domeny transbłonowej). Skuteczność takich pochodnych można testować np. stosując oznaczenia in vitro tu opisane.

181 085

Przez „funkcjonalną pochodną wiążącą otoczkę HIV” rozumie się funkcjonalną pochodną (jak określono powyżej) zdolną do wiązania każdego białka otoczkowego HIV. Pochodne funkcjonalne można identyfikować stosując np. opisane tu oznaczenia in vitro.

Stosowanie terapeutyczne

Transformowanych komórek według niniejszego wynalazku używa się w terapii schorzeń powodowanych przez wirusa niedoboru odporności. Aktualne sposoby stosowania takich transformowanych komórek związane są z immunoterapią adoptywną i terapią polegającą na przenoszeniu komórek. Metody te pozwalają na przywrócenie transformowanych komórek układu odpornościowego do krwioobiegu, Rosenberg, Sci. Am. 62 (maj 1990); Rosenberg i in.. N. Engl. J. Med. 323: 570 (1990).

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać każdemu zwierzęciu, które może doświadczyć korzystnych efektów działania związków według wynalazku. Pośród takich zwierząt są przede wszystkim ludzie, chociaż nie zamierza się tak ograniczać wynalazku.

Szczegółowy opis

W pierwszej kolejności zostaną opisane rysunki.

Krótki opis rysunków

Figura 1A przedstawia sekwencję aminokwasową wokół miejsca fuzji między CD4 (reszty 1-369) i innymi łańcuchami receptora (SEQ ID Nr: 38-41). Sekwencja podkreślona ukazuje pozycję aminokwasów kodowanych w miejscu BamHI, użytego do zmontowania połączenia. Początek domeny transbłonowej zaznaczono pionową kreską. Sekwencja η jest identyczna jak sekwencja ζ przy zakończeniu aminowym, lecz różna przy zakończeniu karboksylowym (Jin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990)).

Figura 1B przedstawia cytometryczną analizę przepływową ekspresji powierzchniowej CD4 CD4:Z, CD4:y i CD4:n w komórkach CV1. Komórki zakażono wirusem, wykazującym ekspresję chimer CD4 lub CD16pi, inkubowano przez 9 godzin w temperaturze 37°C i zaprawiono anty-CD4 MAb Leu3 A sprzężonym z fikoerytryną.

Figura 2 ukazuje ekspresję powierzchniową CD16™, następującą po koinfekcji, CD16 samego (gęste kropki) lub koinfekowanego wirusem, wykazującym ekspresję CD4:y (kreska przerywana) albo CD4:Z (linia ciągła). Rzadkie kropki, komórki zakażone CD4 samym, zaprawione 3G8, (anty-CD16 MAb) (Fleit i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275-3279 (1982)).

Figura 3 ukazuje ekspresję powierzchniową CD16™ następującą po koinfekcji wirusami, wykazującymi ekspresję CD16tm i następujących chimer ζ:0ϋ4:ζ (gruba linia); CD4:Z C11G (linia ciągła); CD4:Z (linia przerywana); CD4:Z C11G/D15G (gęste kropki); bez koinfekcji (sam CD16tm, rzadkie kropki). Komórki inkubowano z anty-CD16 Mab 3G8 i kozimi przeciwciałami wobec mysich IgG, Fab'2 sprzężonymi z fikoerytryną. Poziom ekspresji chimer ζ był zasadniczo identyczny dla różnych analizowanych mutantów i koinfekcja komórek wirusami, wykazującymi ekspresję CD16 i chimer ζ nie zmieniała w sposób dostrzegalny ekspresji powierzchniowej chimer.

Figura 4A-D ukazuje przyrost wewnątrz komórki wolnych jonów wapniowych następujący po usieciowaniu zmutowanych chimer ζ w linii komórek T. Komórki Jurkat E6 (Weiss i in., J. Immunol. 133: 123-128 (1984) zakażano rekombinowanymi wirusami ospy krowiej i analizowano, stosując cytometrię przepływową. Ukazane wyniki dotyczą zamkniętej populacji CD4+, tak, że analizuje się tylko komórki, wykazujące ekspresję odpowiednich białek chimerycznych. Średni stosunek fioletu do błękitu fluorescencji Indo-1 odzwierciedla wewnątrzkomórkowe stężenie wolnego wapnia w populacji jako całości, a udział procentowy odpowiednich komórek jest odbiciem frakcji komórek, które przekraczają z góry określony współczynnik progowy (ustalony tak, że 10% komórek nietraktowanych jest pozytywnych). Figura 4A i 4b ukazuje komórki Jurkat, wykazujące ekspresję CD4:Z (linia ciągła) lub CD16:Z (linia przerywana), wystawione na anty-CD4 MAb Leu3a (sprzężenie z fikoerytryną), po którym następuje sieciowanie koziego przeciwciała z mysim IgG. Linia kropkowana ukazuje odpowiedź komórek nie zakażonych na anty-CD3 MAb OKT3. Figura 4C i 4D ukazuje komórki Jurkat, wykazujące ekspresję CD4:Z D15G (linia ciągła); CD4:Z C11G/D15G (linia

181 085 przerywana) lub CD4:( C11G (linia kropkowana), które traktowano i analizowano jak na fig. 4A i 4B.

Figura 5A-C ukazuje, że receptory CD4:(, CD4:r| i CD4:y pozwalają cytolitycznym limfocytom T (CTL) na zabicie obiektów, wykazujących ekspresję gp120/41 HIV-1. Figura 5A: wypełnione kółka, CTL, wykazujące ekspresję CD4:(, inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gp120/41; puste kółka, CTL, wykazujące ekspresję CD4:Z, inkubowane z nie zakażonymi komórkami HeLa; wypełnione kwadraty, nie zakażone CTL inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gp120/41; puste kwadraty, nie zakażone CTL inkubowane z nie zakażonymi komórkami HeLa. Figura 5B: wypełnione kółka, CTL, wykazujące ekspresję CD4:p, inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gp120/41; puste kółka, CTL, wykazujące ekspresję CD4:y, inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gpl20/41; puste kwadraty, CTL, wykazujące ekspresję chimery CD4:( podwójnie zmutowanej C11G/D15G, inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gpl20/41. Figura 5C: cytometryczna analiza przepływowa ekspresji CD4 przez CTL użytych w fig. 5B. Aby skorygować obiekt w stosunku do współczynników efektorowych określano procent komórek wykazujących ekspresję chimery CD4 przez odjęcie naniesionej na skali populacji negatywnej (nie zakażonej) przez superpozycję na histogramie; dla celów porównawczych na tej figurze komórkom nie zakażonym wyznaczono dowolny próg, który w przybliżeniu daje taką samą frakcję pozytywną dla innej populacji komórek, jak po odjęciu na histogramie.

Figura 6A-B ukazuje specyficzność cytolizy sterowanej przez CD4. Figura 6A: kółka wypełnione, CTL, wykazujące ekspresję CD4:(, inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję CD16pi; kółka puste, CTL, wykazujące ekspresję CD4 inkubowane z komórkami HeLa; wykazującymi ekspresję gp120; kwadraty wypełnione, CTL, wykazujące ekspresję CD16T. inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gp120/41; kwadraty puste, CTL, wykazujące ekspresję CD16pi inkubowane z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję gp120/41. Figura 6B: kółka wypełnione, CTL, wykazujące ekspresję CD4:(, inkubowane z komórkami Raji (MHC klasy Ir); kółka puste, nie zakażone komórki CTL inkubowane z komórkami RJ2.2.5 (mutant Raji MHC klasy II); kwadraty wypełnione, nie zakażone CTL inkubowane z komórkami Raji (MHC klasy II'); kwadraty _puste, CTL, wykazujące ekspresję CD4:( inkubowane z komórkami RJ2.2.5 (MHc klasy Ii). Skala rzędnej jest powiększona.

Figura 7A-B ukazuje swoiste cechy chimerycznego receptora CD16:Z. Figura 7A jest schematycznym wykresem białka połączonego CD16:Z. Zewnątrzkomórkową część postaci związanej fosfatydyloinozytolem monomerycznego CD16 dołączono do dimerycznego ζ również zewnętrznego wobec domeny transbłonowej. Sekwencję białka w miejscu łączenia ukazano na dole (SEQ ID Nr: 42, 43). Figura 7B ukazuje cytometryczną analizę przepływową mobilizacji wapniowej następującej po sieciowaniu chimery (ΤΗ6:ζ zarówno w pozytywnej, jak i negatywnej pod względem TCR linii komórkowej. Ukazuje się średni stosunek fioletu do błękitu fluorescencji (miara odpowiedniego stężenia jonów wapnia) między populacjami komórek traktowanych przeciwciałami, w czasie 0 Kwadraty wypełnione, odpowiedź komórek Jurkat na anty-CD3 MAb OKT3; trójkąty wypełnione, odpowiedź CD16:Z na antyCD16 MAb 3G8 sieciujący, w mutancie REX33A TCR; puste kwadraty, odpowiedź na CD16:Z sieciujący w zmutowanej linii Jurkat JRT3.T3.5 TCR ; puste trójkąty, odpowiedź na CD16:Z sieciujący w komórkach Jurkat; krzyżyki, odpowiedź na nie chimeryczny CD16 w linii komórkowej REX33A TCR.

Figura 6A-B ukazuje analizę delecji potencjału cytolitycznego. Figura 6A ukazuje umiejscowienie punktów zakończenia delecji ζ. Tutaj i gdziekolwiek indziej mutacje w łańcuchu ζ wyraża się przez zestawienie reszta oryginalna-umiejscowienie-reszta zmutowana, tak, ze np. D66 oznacza zamianę Asp-66 na kodon terminacyjny. Figura 6B ukazuje wyniki oznaczenia cytolizy CD16:Z bez delecji i uwypuklonych delecji ζ. Komórki hybrydomy, wyrażające ekspresję przeciwciała powierzchniowego CD16 zaopatrzono ⁵Cr l inkubowano ze wzrastającymi ilościami ludzkich limfocytów cytolitycznych (CTL) zakażonych rekombinatami ospy krowiej, wykazujących ekspresję chimer cD16:Z. Procent uwolnionego 51Cr jest

181 085 wykreślony jako funkcja stosunku efektora (CTL) do komórki docelowej (hybrydoma), (e/t). Kółka wypełnione, cytoliza, w której pośredniczą komórki wykazujące ekspresję CD16:Z (mfi 18,7); kwadraty wypełnione, cytoliza, w której pośredniczą komórki, wykazujące ekspresję CD16:ZAsp66* (mfi 940,2); puste kwadraty, cytoliza, w której pośredniczą komórki, wykazujące ekspresję CD16:ZGlu60* (mfi 16,0); puste kółka, cytoliza, w której pośredniczą komórki, wykazujące ekspresję CDłó^Tyróf (mfi 17,4); wypełnione trójkąty, cytoliza, w której pośredniczą komórki, wykazujące ekspresję CD16:CPhe34 (mfi 17,8); i puste trójkąty, cytoliza, w której pośredniczą komórki, wykazujące ekspresję nie* chimerycznego CD16:Z (mfi 591). Mimo, że w tym doświadczeniu ekspresja CD16:ZAsp66* nie była równa ekspresji innych białek połączonych, cytoliza przez komórki, wykazujące ekspresję CD16:Z na równoważnym poziomie, w tym samym doświadczeniu dała wyniki zasadniczo takie same, jak wykazane przez komórki o ekspresji CD16:ZAsp66.

Figura 9A-D ukazuje, że eliminacja potencjału dla interakcji transbłonowych ujawnia krótkie segmenty ζ zdolne do pośredniczenia w cytolizie. Figura 9A jest schematycznym wykresem monomerycznych chimer dwudzielnych i trójdzielnych. Na szczycie znajduje się konstrukcja CD16:Z ucięta przy reszcie 65 i nie posiadająca transbłonowych reszt Cys i Asp. Niżej znajdują się konstrukcje CD16:CD5:Z i CD16:Cd7:Z i odpowiednie elementy kontrolne. Sekwencje peptydu domen wewnątrzkomórkowych pokazano poniżej (SEQ ID Nr: 45-47). Figura 9b ukazuje aktywność cytolityczną monomerycznych chimer mutantów z delecją. Aktywność cytolityczną komórek, wykazujących ekspresję CD16:Z (kółka wypełnione, mfi 495) porównano z aktywnością komórek o ekspresji CD16:ZAsp66 (wypełnione kwadraty, mfi 527) lub mutantów CD16:ZCys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (puste kwadraty; mfi 338) i CD16:ZCys11Gly/Asp15Gly/Glu60 (wypełnione trójkąty; mfi 259). Figura 9c ukazuje aktywność cytolityczną, w której pośredniczą trójdzielne białka połączone. Wypełnione trójkąty, CD16:ZAsp66*; puste kwadraty, CD16:5:Z (48-65); wypełnione kwadraty, CD16:7:Z (48-65); trójkąty, CD16:7:Z (48-59); puste kółka, CD16:5; wypełnione kółka, cD16:7. Figura 9D ukazuje mobilizację wapniową przez zmutowane i trójdzielne chimery w zmutowanej linii komórkowej Jurkat JRT3.T3.5 negatywnej pod względem TCR. Puste kółka, odpowiedź komórek o ekspresji dimerycznego CD16: ZAsp66*; wypełnione kwadraty, odpowiedź komórek o ekspresji CD16:Z Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66 ; puste kwadraty, odpowiedź komórek o ekspresji 6Ο16:ζ Cys11Gly/Asp15Gly/Glu60 ; wypełnione trójkąty, odpowiedź komórek o ekspresji CD16:7:Z (48-65); i puste trójkąty, odpowiedź komórek o ekspresji CD16:Z (48-59).

Figura 10A-F ukazuje udział indywidualnych aminokwasów w aktywności motywu 18-resztowego, przekazującego sygnał cytolizy. Figury 10A i 10B ukazują aktywność cytolityczną a figura 10C ukazuje mobilizację jonu wapniowego, w której pośredniczą chimery posiadające punkt mutacji obok karboksylo-terminalnej tyrozyny (Y62). Figury 10A i 1θΒ przedstawiają zebrane dane o komórkach, wykazujących ekspresję małych i wysokich ilości, odpowiednio, białek połączonych CD16:Z- Identycznych symboli użyto dla oznaiczeń mobilizacji wapnia i cytolizy, pokazano je w jednym kodzie literowym po prawej stronie. Kółka wypełnione, komórki, wykazujące ekspresję CDród (mfi w A - 21; B - 376), kwadraty wypełnione, komórki, wykazujące ekspresję CD16:7ą (48-65) (mfi A - 31; B - 82); kwadraty puste, CD16:7:Z (48-65) Glu60Gln (mfi A - 33; B - 92); krzyżyki, CD16:7:Z (48-65) Asp63Asn (mfi A - 30; B - 74); trójkąty wypełnione, CD16:7:Z (48-65) Tyr62Phe (mfi A - 24; B - 88); kółka puste, CD16:7:Z (48-65) Glu61Gln (mfi A - 20; B - 62); i trójkąty puste, CD16:7:Z (48-65) Tyr62Ser (mfi B - 64). Figury 10D i 10E ukazują aktywność cytolityczną i figura 10F ukazuje mobilizację jonu wapniowego przez chimery, posiadające punkt mutacji przy tyrozynie aminoterminalnej (Y51). Identycznych symboli użyto dla oznaczeń mobilizacji wapnia i cytolizy i ukazano je po prawej stronie. Kółka wypełnione, komórki, wykazujące ekspresję CD16:Z (mfi wD-21,2; w E - 672), kwadraty wypełnione, komórki, wykazujące ekspresję CD16:7:Z (48-65) (mfi D - 31,3; E - 179); trójkąty wypełnione, CD16:7:Z (48-65) Asn48Ser (mfi D - 22,4; E - 209); kwadraty puste, Cd16:7:Z (48-65) Leu50Ser (mfi D - 25,0; E - 142); i trójkąty puste, CD16:7:Z (48-65) Tyr51Phe (mfi D - 32,3; E - 294).

Figura 11A-B ukazuje wyrównanie wewnętrznych powtórzeń ζ i porównanie ich zdolności do podtrzymywania cytolizy. Figura 11A jest schematycznym wykresem chimer two181 085 rzonych przez podzielenie domeny wewnątrzkomórkowej ζ na trzy i dołączenia ich do domeny transbłonowej chimery CD16:7. Sekwencje domen wewnątrzkomórkowych ukazano poniżej (SEQ ID Nr: 48-50) z wydzielonymi, odosobnionymi resztami i odpowiednie reszty zaznaczono gwiazdkami. Figura 11B ukazuje siłę cytolityczną trzech subdomen ζ. Kółka wypełnione, komórki, wykazujące ekspresję Ο016:ζ (mfi 476); kwadraty wypełnione, CD16:7:Z (33-65) (mfi 68); kwadraty puste, CD16:7:Z (71-104) (mfi 114); i trójkąty wypełnione, CD16:7:Z (104-138) (mfi 104).

Figura 12 jest schematycznym wykresem chimer CD16: FcRyII.

Figura 13A-B ukazuje mobilizację wapniową, następującą po sieciowaniu chimer CD4: FcRyII i CD16: FcRyII. Figura 13A ukazuje stosunek fioletu do błękitu fluorescencji emitowanej przez komórki znaczone wrażliwym na wapń fluoroforem Indo-1, ukazanym jako fuhkcja postępującego w czasie sieciowania domeny wewnątrzkomórkowej CD16 z przeciwciałami. Figura 13B ukazuje podobną analizę przyrostu współczynnika fioletu do błękitu fluorescencji komórek, posiadających chimery CD4: FcRyII, następującego po sieciowaniu z przeciwciałami.

Figura 14A-B ukazuje oznaczenia cytolizy chimer CD4: FcRyII i CD16: FcRyII. Figura 14A ukazuje procent ⁵¹Cr uwolnionego z komórek hybrydomy (docelowych) anty-CD16, gdy komórki są wystawione na zwiększającą się liczbę cytotoksycznych limfocytów T, wykazujących ekspresję chimer CD16: FcRyII (komórki efektorowe). Figura 14B ukazuje podobną analizę cytotoksyczności, w której pośredniczą chimery CD4: FcRyII, przeciw komórkom docelowym, wykazującym ekspresję glikoprotein otoczkowych HIV.

Figura 15A-E ukazuje identyfikację reszt w ogonku FcRyII A, które są ważne w cytolizie. Figura 15A jest schematycznym wykresem konstrukcji z delecją. Figury 15B i 15C ukazują mobilizację wapniową i cytolizę przez warianty z delecją karboksyterminalną CD16: FcRyII A. Figury 15D i 15E ukazują mobilizację wapniową i cytolizę przez trójdzielne chimery, posiadające stopniowo coraz mniej końców aminowych wewnątrzkomórkowego ogonka CD16: FcRyII A.

Figura 16 (SEQ ID Nr: 24) ukazuje sekwencję aminokwasową białka receptora delta CD3; zamknięta sekwencja przedstawia zalecaną część, przekazującą sygnał cytolityczny.

Figura 17 (SEQ ID Nr: 25) ukazuje sekwencję aminokwasową białka receptora gamma T3; zamknięta sekwencja przedstawia zalecaną część, przekazującą sygnał cytolityczny.

Figura 18 (SEQ ID Nr: 26) ukazuje sekwencję aminokwasową białka receptora mbl; zamknięta sekwencja przedstawia zalecaną część, przekazującą sygnał cytolityczny.

Figura 19 (SEQ ID Nr: 27) ukazuje sekwencję aminokwasową białka receptora B29; zamknięta sekwencja przedstawia zalecaną część, przekazującą sygnał cytolityczny.

Figura 20 ukazuje schematyczny wykres chimer CD4. Cząsteczką „A” jest CD4 (D1-D4): Ig: CD7; cząsteczką„B” jest CD4 (D1, D2): Ig: CD7; cząsteczką „C” jest CD4 (D1-D4): Ig: CD7:Z; cząsteczką „D” jest CD4 (D1, D2): Ig: CD7:Z; i cząstec:zcą„E” jest CD4:Z. Zewnątrzkomórkową domenę ludzkiej cząsteczki CD4, odpowiadającej aminokwasom 1-394 prekursora, łączono przy miejscu BamHI z zawiasem, domenami CH1 i CH2 ludzkiej IgG1 jak opisano poprzednio (Zettlmeisl i in., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)) z wyjątkiem tego, ze wersji cDNA sekwencji ludzkiej Ig użyto do umożliwienia ekspresji w rekombinantach wirusa ospy krowiej. Utworzono dwudomenowe wersje chimer CD4 przez insercję adaptora BamHI w unikatowym miejscu NheI (odpowiadające aminokwasowi 200) w cDNA prekursora CD4. Sekwencje wiązania z błoną składające się z 22 reszt od pierwszego eksonu, ludzkiej IgG1 wiążącej się z błoną, przy czym za nimi następują reszty 146-203 CD7. Aminokwasy 55 aż do 163 ζ służące jako motyw wyzwalający konstrukcji czterodzielnych (C i D). W konstrukcjach czterodzielnych, zawierających łańcuch ζ, ekspresję wewnątrzkomórkową ζ poparto dostępnymi w handlu przeciwciałami wobec domeny wewnątrzkomórkowej (Coulter).

Figura 21 ukazuje cytolizę komórek docelowych, wykazujących ekspresję glikoprotein otoczkowych HIV-1, w której pośredniczy klon cytotoksycznych komórek T, WH3, wykazujący ekspresję różnych chimer pochodnych CD4, jako cząsteczek efektorowych. Dla oznaczeń cytotoksyczności utrzymywano ludzką ograniczoną linię komórek T cD8+ CD4 HLA B44, WH3, w IMDM wzbogaconej 10% ludzką surowicą, jak opisano tutaj poprzednio. Ko16

181 085 mórki stymulowano napromieniowanymi promieniami gamma (3000 Rad) jednojądrowymi komórkami, posiadającymi B44 i 1 pg/ml fitohemaglutyniny (PHA). Po jednym dniu stymulacji PHA rozcieńczono do 0,5 pg/ml przez dodanie świeżej pożywki; po 3 dniach pożywkę całkowicie wymieniono. Komórki hodowano przez co najmniej 10 dni przed użyciem do oznaczeń cytotoksyczności. Komórki zakażono odpowiednimi rekombinantami wirusów ospy krowiej jak opisano tu dla vPE16. Pozwolono, aby zakażenia rozwijały się w kompletnej pożywce przez dodatkowe 3-4 godziny, po których komórki odebrano przez wirowanie i powtórnie sporządzono zawiesinę o gęstości 1 x 10⁷/ml. Dodano 100 pl do każdej studzienki płytki do mikromianowania o dnie w kształcie U, zawierającej 100 pl na studzienkę kompletnej pożywki i rozcieńczono 2-krotnie w kolejnych etapach. Dwie studzienki na każdą próbkę nie zawierały limfocytów, aby umożliwić samorzutne uwolnienie chromu i zorientować się w całości chromu do zmierzenia. Komórki docelowe, sublinia S3 HeLa (HeLa-S3 ATCC) zakażono jak powyżej, wirusem vPE16, w naczynkach o 10 cm. 10⁶ zakażonych komórek oddzielono przez wirowanie z PBS i mM EDTA i powtórnie zawieszono w 100 pl chromianu sodowego ⁵'Cr (1 mCi/ml w PBS) na jedną godzinę w temperaturze 37°C i następnie przemyto trzy razy PBS. 100 pl znakowanych komórek docelowych dodano do każdej studzienki. Płytkę do mikromianowania wirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Na koniec okresu inkubacyjnego komórki w każdej studzience powtórnie zawieszono przez delikatne pipetowanie, próbki usunięto w celu wykonania całości obliczeń i wirowano płytkę do mikromianowania przy 750 x g przez 1 minutę. Równe ilości (100 pl) supematantu usunięto i liczono w liczniku scyntylacyjnym z promieniowaniem gamma. Skorygowano współczynnik efektor : cel w stosunku do procentu zakażonych komórek jaki zmierzono przez cytometrię przepływową.

Figura 22 ukazuje replikację HTV-1 w transfekowanych liniach komórkowych. Linie komórkowe, wykazujące stałą ekspresję CD4 dzikiego typu i różnych rekombinowanych chimer, ustalono w sublinii ludzkich linii zarodkowych komórek nerek 293. Wyizolowano ród wirusów HIV-1 IIIB o mianie «106 cząsteczek zakażających/ml, jak zmierzono przez analizę punktu zakończenia rozcieńczania, używając linii ludzkich komórek T C8166 jako wskaźnika. Infekcję przeprowadzano przy MOI około 1 przez okres 8-12 godzin w temperaturze 37°C. Następnego dnia komórki przemyto trzy razy PBS, dodano trypsyny, umieszczono w nowych naczynkach i kulturę supematantową podzielono na próbki o mianie p24 (oznaczono dzień 0). Po 3-4-dniowej przerwie, supernatanty z hodowlą komórek zebrano i utrzymywano, w celu przeprowadzenia analizy p24. Komórki ponownie zaopatrzono w świeżą pożywkę, zawierającą higromycynę B w stężeniu 100 pg/ml. Analizę supernatantów z kulturami przeprowadzono, stosując handlowy zestaw do oznaczania antygenu p24 HIV-1 oparty o test ELISA (Coulter) według instrukcji dostarczonej przez producenta. Wyniki przedstawiają dwa niezależne doświadczenia o podobnym czasie trwania.

Figura 23 ukazuje sekwencję kwasów nukleinowych (SEQ ID Nr: 28) i aminokwasów (SEQ ID Nr: 29) domen D1-D4 CD4 (CD4 Bam).

Figura 24 ukazuje sekwencję kwasów nukleinowych (SEQ ID Nr: 30) i aminokwasów (SEQ ID Nr: 31) domen D1-D2 CD4 (CD4 Nhe).

Figura 25 ukazuje sekwencję kwasów nukleinowych (SEQ ID Nr: 32) i aminokwasów (SEQ ID Nr: 33) zawiasu, domen CH2 i CH3 ludzkiej IgG1 (Igh23 Bam).

Figura 26 ukazuje sekwencję kwasów nukleinowych (SEQ ID Nr: 34) i aminokwasów (SEQ ID Nr: 35) domeny transbłonowej CD7 (TM7 Bam Mlu).

Figura 27 ukazuje sekwencję kwasów nukleinowych (SEQ ID Nr: 36) i aminokwasów (SEQ ID Nr: 37) wewnątrzkomórkowej domeny zeta (Zeta Mlu Not).

Figura 28 ukazuje sekwencję DNA (SEQ ID Nr: 51) i pierwotną sekwencję aminokwasową (SEQ ID Nr: 52) syntetycznego alfa heliksu.

Przykład I. Konstruowanie chimer receptora ludzkiego IgG1.

Wytworzono sekwencję ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG1 przez łączenie sekwencji w domenie Ch3 do fragmentu cDNA pochodzącego z końca 3' transbłonowej postaci mRNA przeciwciała. Fragment końca 3' otrzymano dzięki łańcuchowej reakcji polimerazy, przy uży181 085 ciu biblioteki cDNA migdałkowego jako substratu i oligonukleotydów posiadających sekwencje:

CGC GGC GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID Nr: 7) i

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID Nr: 8), odpowiadających odpowiednio końcom 5' i 3' pożądanych fragmentów DNA. Oligonukleotyd końca 5' jest komplementarny do miejsca w domenie Ch1 ludzkiej IgG1, a oligonukleotyd końca 3' jest komplementarny do miejsca przy końcu 5' sekwencji, kodującej domenę przekraczającą błonę. Produkt PCR trawiono BstXI i BamHI i łączono między miejscami BstXI i BamHI półsyntetycznego genu przeciwciała IgG1, posiadającego regiony stałe i zmienne. Po insercji BstXI do fragmentu BamHI, powielone części konstrukcji wstawiono do miejsca SmaI w Ch3 przez wymianę fragmentu restrykcyjnego tak, że tylko część między miejscem SmaI i oligonukleotydem 3' uzyskano w wyniku reakcji PCR.

Aby stworzyć chimeryczny receptor ludzkiej IgG1: ζ dołączono gen łańcucha ciężkiego, kończący się w miejscu BamHI, z miejscem BamHI chimery ζ, opisanej poniżej, tak, ze sekwencje przeciwciała tworzyły część zewnątrzkomórkową. Cytometria przepływowa komórek COS, transfekowanych plazmidem, kodującym chimerę, wykazała wysoki poziom ekspresji determinantów przeciwciała, gdy plazmid ekspresji, kodujący cDNA łańcucha lekkiego był kotransfekowany i niewielką ekspresję determinantów przeciwciała, gdy nie było plazmidu ekspresji łańcucha lekkiego.

Podobne chimery, obejmujące ludzką IgG1 połączone z częścią η lub γ (patrz poniżej), albo każdą częścią przekazującą sygnał białka receptora komórki T lub receptora Fc, można zbudować, generalnie, jak opisano powyżej, przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.

Aby stworzyć pojedyncząjednostkę transkrypcyjną, która pozwoliłaby na ekspresję obu łańcuchów - ciężkiego i lekkiego od jednego promotora, stworzono plazmid, kodujący bicistronowy mRNA z sekwencji, kodujących łańcuch ciężki i lekki i nie podległej translacji części 5' mRNA, kodującej białko glukozowo regulowane, o 78 kD, znane z drugiej strony jako grp78 lub BiP. Sekwencje grp78 otrzymano przez PCR ludzkiego DNA genomowego, przy użyciu starterów, posiadających sekwencje:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID Nr: 9) i

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID Nr: 10) odpowiednio przy końcach 5' i 3'. Wykonano łańcuchowe reakcje polimerazy z tymi oligonukleotydami w obecności 10% sulfotlenku dimetylu. Fragment otrzymany przez PCR trawiono NotI oraz HincII i wtrącono miejsca NotI i HpaI w dół od sekwencji, kodujących ludzką IgG1. Następnie sekwencje, kodujące cDNA ludzkiego łańcucha kappa ludzkiej IgG, wtrącono w dół od lidera grp78, przy użyciu miejsca HincII i innego miejsca w wektorze. Plazmid ekspresji otrzymany w wyniku tych manipulacji, składa się z półsyntetycznego genu łańcucha ciężkiego, po którym następują sekwencje lidera grp78, po których następują sekwencje cDNA lekkiego łańcucha kappa, po których następują sygnały poliadenylacji, pochodzące od fragmentu DNA SV40. Transfekcja komórek COS plazmidem ekspresji dała nieznacznie polepszoną ekspresję determinantów łańcucha ciężkiego, w porównaniu z transfekcją samym plazmidem, kodującym determinanty łańcucha ciężkiego.

Aby stworzyć biscistronowy gen, zawierający chimerę łańcuch ciężki/receptor i łańcuch lekki, sekwencje w górę łańcucha ciężkiego można wymienić na każdy inny opisany tu gen chimeryczny łańcuch ciężki/receptor.

Przykład II. Konstruowanie chimer receptora CD4.

Ludzkie cDNA ζ (Weissman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988b)) i y (Kuster i in., J. Biol. Chem. 265: 6448-6452 (1990)) izolowano przez łańcuchową reakcję polimerazy z bibliotek sporządzonych z linii komórkowej nowotworu HPB-ALL (Aruffo i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b)) i z ludzkich naturalnych zabójców komórek, podczas gdy cDNA η (Jin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990)) izolowano z biblioteki tymocytów mysich. cDNA ζ, ζ i γ dołączono do domeny zewnątrzkomórkowej postaci zbudowanej CD4, posiadającej miejsce BamHI dokładnie w górę od domeny,

181 085 przekraczającej błonę (Aruffo i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b); Zettlmeissl i in., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990)), dołączonej do miejsca BamHI naturalnie występującego w cDNA ζ i η w podobnym położeniu, kilka reszt w górę od domeny przekraczającej błonę (SEQ ED Nr: 1, 3, 4 i 6). Aby utworzyć białko połączone z γ, wbudowano miejsce BamHI do sekwencji w tym samym zbliżonym położeniu (fig. 1; SEQ ID Nr: 2 i 5). Wprowadzono fuzje genowe do plazmidu ekspresji wirusa ospy krowiej, posiadającego gen gpt E. coli jako możliwy do wyselekcjonowania marker i wtrącono je do genomu szczepu WR ospy krowiej przez rekombinację homologiczną i selekcję pod względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (mycophenolic acid) (Falkner i in., L Virol. 62: 1849-1854 (1988); Boyle i in., Gene 65: 123-128 (1988)). Cytometryczna analiza przepływowa wykazała, ze rekombinanty ospy krowiej sterują produkcją wielu białek połączonych ί'Ό4:ζ i CD4:y na powierzchni komórki, natomiast ekspresja CD4:n jest zasadniczo słabsza (fig. 1B). Ostatnie odkrycie pokrywa się z wcześniejszym doniesieniem, że transfekcja plazmidu ekspresji cDNA η do linii komórkowej hybrydomy mysiej dała zasadniczo mniejszą ekspresję niz transfekcja porównywalnego plazmidu ekspresji ζ (Clayton i in, J. Exp. Med. 172: 1243-1253 (1990)). Immunopercypitacja komórek zakażonych rekombinantami ospy krowiej dowiodła, ze białka połączone tworzą kowalentne dimery, odmienne od naturalnie występującego antygenu CD4. Masy cząsteczkowe monomerycznych białek połączonych CD4:Z i CD4:y i natywnego CD4: określono odpowiednio jako 63,55 i 53 kD. Większe masy białek połączonych pokrywają się w przybliżeniu z większymi długościami części wewnątrzkomórkowych, które przekraczają te z natywnych CD4 o 75 (CD4:Z) lub 5 (CD4:y) reszt.

Przykład IlI. Chimery CD4 mogą łączyć się z innymi łańcuchami receptorowymi.

Ekspresja powierzchniowo-komórkowa ludzkiego FcRyRIII (CD16tm) w postaci makrofaga/naturalnego zabójcy komórek, u transfektantów ułatwiona jest przez kotransfekcję łańcuchem y mysim (Kurosaki i in., Nature 342: 805-807 (1989)) lub ludzkim (Hibbs i in., Science 246: 1608-1611 (1989)), jak również ludzkim ζ (Lanier i in., Nature 342: 803-805 (1989)).

Zgodnie z tymi doniesieniami, ekspresja chimer pozwala także na ekspresję powierzchniową CD16tm, po dostarczeniu do komórki docelowej zarówno przez kotransfekcję jak i przez konfekcję rekombinowanymi wirusami ospy krowiej (fig. 2). Pobudzenie ekspresji powierzchniowej CD16tm przez ζ było bardziej wyraźne niż pobudzenie przez y (fig. 2) w badanych liniach komórkowych, natomiast natywny CD4 nie wzmocnił ekspresji powierzchniowej CD16tm.

Przykład IV. Mutanty Asp ζ nie koasocjująz receptorem Fc.

Aby stworzyć chimery, które nie asocjowałyby z istniejącymi receptorami antygenowymi lub receptorami Fc, utworzono mutanta białek połączonych ζ, który utracił albo wewnątrzbłpnpwą resztę Asp, albo wewnątrzbłonową resztę Cys lub obie. Cytometria przepływowa wykazała, że intensywność ekspresji powierzchniowo-komórkowej różnych zmutowanych chimer nie była widoczna inna niż niezmutowanego prekursora, a doświadczenia immunoprecypitacyjne wykazały, że całkowita ekspresja chimer była podobna. Jak oczekiwano, okazało się, że zmutowane chimery, które utraciły transbłonową resztę cysteiny nie tworzą dimerów związanych mostkiem dwusiarczkowym. Dwie zmutowane chimery, które utraciły Asp były niezdolne do podtrzymywania ekspresji powierzchniowej CD16tm, natomiast monomeryczne chimery, które utraciły Cys lecz posiadają Asp pozwalały na koekspresję CD16™· ale z niższą skutecznością ruż dimer rodzicielski (fig. 3).

Przykła d V. Zmutowane rcepptoyy wykzzują oPorpość Oo nmcjacj i odomidedzi wapniowej.

Aby określić, czy usieciowanie białek połączonych pozwoli na nagromadzenie wolnego wapnia wewnątrdypmórypwrgo w sposób podobny do tego, o którym wiadomo, że występuje z receptorem antygenu komórek T, komórki ludzkiej linii komórkowej białaczki limfocytarnej T, Jurkat E6 (ATCC numer dostępu TIB 152, Zbiór Amerykańskich Typów Hodowli, Rockville, MD), zakażono rekombinantami ospy krowiej i odpowiednim stężeniem wapnia aytppladmatγadnego, następującym po pomiarze sieciowania domeny zewnątrdkomórkpwęj z przeciwciałami. Przeprowadzono pomiary cytometrii przepływowej z komórkami zaopa181 085 trzonymi we wrażliwy na wapń barwnik Indo-1 (Grynkiewicz i in., J. Biol. Chem. 260: 33403450 (1985); Rabinovitca i in., J. Immunol. 137: 952-961 (1986)). Fig. 4A-D ukazują wyniki doświadczeń przepływu wapnia w komórkach zakażonych CD4:Z i mutantami Asp i Cys łańcucha ζ. Sieciowanie chimer powtarzalnie zwiększyło wapń wewnątrzkomórkowy. CD4:i CD4:y podobnie pozwalały na akumulację wapnia wewnątrzkomórkowego w zakażonych komórkach. Komórki Jurkat wyrażają niskie poziomy CD4 na powierzchni komórkowej, jednak sieciowanie natywnego CD4 w obecności lub nieobecności CD16:Z nie zmienia poziomów wapnia wewnątrzkomórkowego (fig. 4A-B).

Przykład VI. Chimery 1Ι24:ζ, - i γ pośredniczą w cytolizie obiektów, wykazujących ekspresję gp120/41 HIV.

Aby określić, czy receptory chimeryczne wyzwalałyby cytolityczne programy efektorowe, stworzono modelowy układ obiekt : efektor oparty na rozpoznaniu przez CD4 kompleksu gp120/gp41 otoczki HIV. Komórki HeLa zakażono rekombinowanymi wirusami ospy krowiej, wykazującej ekspresję gpl20/gp41 (Chakrabarti i in, Nature 320: 535-537 (1986); Earl i in., J. Virol. 64: 2448-2451 (1990)) i znakowano ^MCr. Znakowane komórki inkubowano z komórkami ludzkiej allospecnOicznej (CD8+, CD4) linii cytotoksycznych limfocytów T, zakażonej rekombinantami ospy krowiej, wykazującymi ekspresję chimer CD4:Z, CD4:- lub CD4: γ albo chimer podwójnego mutanta CD4:ζCys11Gln:Aspl5Gly. Fig. 5A-C ukazuje, ze komórki HeLa, wykazujące ekspresję gp120/41 uległy specyficznej lizie przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL), wykazujące ekspresję chimer CD4. Nie zakażone komórki HeLa nie były celami dla CTL uzbrojonych w chimery CD4:Z, a komórki HeLa, wykazujące ekspresję gp120/41 nie były rozpoznawane przez nie zakażone CTL.. Aby porównać skuteczność różnych chimer korygowano stosunki efektora do celu wobec frakcji CTL, wykazujących ekspresję chimer CD4 i wobec frakcji komórek HeLa, wykazujących ekspresję gpl20/41, jak zmierzono przy użyciu cytometrii przepływowej. Fig. 5C ukazuje analizę cytometryczną ekspresji CD4 u CTL zastosowanych w doświadczeniu cytolitycznym pokazanym na fig. 5A i 5B. Mimo, że średnia gęstość powierzchniowego CD4:Z bardzo przewyższa średnią gęstość CD4: -, skuteczności cytolityczne komórek wykazujących ekspresję obu postaci były podobne. Korygowanie w stosunku do frakcji obiektów, wykazujących ekspresję gpl20, skuteczności cntolizy, w której pośredniczą białka CD4ą i CD4:- są porównywalne z najlepszymi skutecznościami zanotowanymi dla par obiekt : efektor specyficznego receptora komórki T (średni stosunek efektom do obiektu dla 50% uwolnienia przez komórki T, wykazujące ekspresję CD4:z, wynosił 1,9 ± 0,99, n = 10). Połączony ϋ)4:ζ był mniej aktywny, tak jak połączony CD4:Z, który utracił transbłonowe reszty Asp i Cys. Jednak w obu przypadkach obserwowano znaczącą cytolizę (fig. 5B-C).

Aby skontrolować możliwość, ze infekcja wirusami ospy krowiej mogłaby pobudzać faktyczne rozpoznanie przez CTL, wykonano podobne doświadczenia dotyczące cytolizy z komórkami docelowymi zakażonymi rekombinantami ospy krowiej, wykazującymi ekspresję związanych fosfatndnloinozytolem postaci CD16 (CD16pi) i znaczonych ⁵ Cr, i z CTL zakażonymi rekombinantami kontrolnymi, wykazującymi ekspresję zarówno CD16pi jak CD16:Z . Fig. 6A ukazuje, ze komórki T, wykazujące ekspresję chimer bez CD4 nie rozpoznają natywnych komórek HeLa lub komórek HeLa, wykazujących ekspresję gpl20/41, i podobnie, ze komórki T, wykazujące ekspresję chimer CD4 nie rozpoznają komórek HeLa, wykazujących ekspresję innych białek powierzchniowych kodowanych przez wirusa ospy krowiej. Ponadto, CTL, wykazujące ekspresję nie chimerycznego CD4, nie rozkłada znacząco komórek HeLa, wykazujących ekspresję gp120/41 (fig. 6A).

Przykład VII. Komórki, posiadające mHc klasy II nie są celem dla chimer.

Uważa się, że CD4 współdziałają z nie polimorficzną sekwencją, której ekspresję wykazuje antygen MHC klasy II (Gay i in., Nature 328: 626-629 (1987); Sleckman i in., Nature 328: 351-353 (1987)). Mimo, że nigdy nie udokumentowano specyficznego współdziałania między CD4 i antygenem klasy II z oczyszczonymi białkami, w pewnych warunkach można demonstrować adhezję między komórkami, wykazującymi ekspresję CD4 i komórkami, wykazującymi cząsteczki klasy iI (Doyle i in., Nature 330: 256-259 (1987); Clayton i in., J. Exp. Med 172: 1243-1253 (1990); Lamarre i in., Science 245: 743-746 (1989)). Następnie badano,

181 085 czy możliwe będzie wykrycie zabójców przeciw komórkom, niosącym klasę II. Fig. 6B ukazuje, że nie ma specyficznej cytolizy, zarządzanej przez CD4:Z przeciw linii komórkowej Raji B, wykazującej ekspresję licznych antygenów klasy II. Mimo, ze obserwuje się niewielką cytolizę (~ 5%), zmutowane komórki Raji negatywne pod względem klasy II, RJ2.2.5 (Accolla, J. Exp. Med. 157: 1053-1058 (1983)) wykazują podobną wrażliwość jak komórki Raji inkubowane z nie 'zakażonymi komórkami T.

Przykład VIII. Wymagania sekwencyjne dla indukcji cytolizy przez łańcuch zeta antygenu/receptora Fc komórek T.

Mimo, że chimery między CD4 i ζ mogą uzbrajać cytotoksyczne limfocyty T (CTL), aby zabić komórki docelowe, wykazujące ekspresję gp120 HIV, poszukiwano alternatywny do CD4, w celu jasnego porównania właściwości chimer zeta wprowadzonych do ludzkich linii komórek T. Takie linie mogą wykazywać ekspresję CD4, powodując, że trudne jest określenie związku między typem lub stopniem mobilizacji wapniowej a siłą cytotoksyczną różnych chimer. Aby tego uniknąć, stworzono chimery między ζ i CD16, w których zewnątrzkomórkowa domena CD16 przymocowana jest do sekwencji transbłonowych i wewnątrzkomórkowych ζ (fig. 7A). Fuzje genowe wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa ospy krowiej, posiadającego gen gpt E. coli jako możliwy do wyselekcjonowania marker i wtrącono do genomu szczepu WR ospy krowiej przez rekombinację homologiczną i selekcję pod względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (Falkner i Moss, J. Virol. 62: 1849-1854 (1988); Boyle i Coupar, Gene 65: 123 (1988)).

Linie komórkowe T zakażono rekombinantami ospy krowiej i po sieciowaniu domen zewnątrzkomórkowych z przeciwciałami, mierzono odpowiednie stężenie wolnych jonów wapnia cytoplazmatycznego. Oba pomiary, spektrofluorometryczny (cała populacja) i cytometrii przepływowej (pojedyncze komórki) wykonano z komórkami zaopatrzonymi w barwnik Indo-1 (Grynkiewicz i in., J. Biol. Chem. 260: 3430 (1985); Rabinovitch i in., J. Immunol. 137: 952 (1986)). Fig. 7B ukazuje analizę danych zebranych z ludzkiej linii komórkowej Jurkat białaczki limfocytarnej typu T zakażonej rekombinantami ospy krowiej, wykazującej ekspresję białek połączonych CD16:Z. Sieciowanie chimer wzmaga wytwarzanie wapnia wewnątrzkomórkowego, podczas gdy podobne traktowanie komórek, wykazujących ekspresję nie chimerycznego CD16 nie dało efektu lub był on niewielki: Gdy ekspresja chimery zachodziła w zmutowanych liniach komórkowych, które utraciły receptor antygenu albo REX33A (Breitmeyer i in., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho i in., J. Biol. Chem. 264: 20760 (1989)) albo zmutowanych Jurkat JRT3.T3.5 (Weiss i in., J. Immunol. 135: 123 (1984)); lub stwierdzano silną odpowiedź na sieciowanie przeciwciała CD 16. Podobne dane zgromadzono o zmutowanej linii komórkowej REX20A (Breitmeyer i in., jak wyżej, 1987; Blumberg i in., J. Biol. Chem. 265: 14036 (1990), zmutowanej linii komórkowej Jurkat negatywnej pod względem CD3/T1 ustalonej w tym laboratorium. Zakażenie rekombinantami, wykazującymi ekspresję CD16:Z nie przywróciło odpowiedzi na przeciwciało anty-CD3, pokazując, ze białko połączone nie działało przez uwolnienie wewnątrzkomórkowego kompleksu łańcuchów CD3.

Aby ocenić zdolność chimer do ponownego sterowania odpornością, w której pośredniczą komórki, zakażono CTL rekombinantami ospy krowiej, wykazującymi ekspresję chimer CD16 i użyto do specyficznej lizy komórek hybrydomy, wykazujących ekspresję związanych z błoną przeciwciał anty-CD16. Ocena ta jest rozwinięciem oceny cytotoksyczności hybrydomy pierwotnie prowadzonej, w celu analizowania mechanizmów efektorowych komórek, posiadających receptory Fc (Graziano i Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987); Graziano i Fanger, J. Immunol. 139: 35-36, 1987; Shen i in., Mol. Immunol. 26: 959, 1989; Fanger i in., Immunol. Today 10: 92, 1989). Fig. 8B ukazuje, ze ekspresja CD16:Z w cytotoksycznych limfocytach T pozwala uzbrojonym CTL na zabijanie komórek hybrydomy 3G8 (anty-CD16; Fleit i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275, 1982), natomiast CTL, wykazujące ekspresję postaci CD16 związanych fosfatydyloinozytolem, są nieaktywne. CTL uzbrojone CD16:Z także nie zabijają komórek hybrydomy, wykazujących ekspresję nieodpowiedniego przeciwciała.

Aby zidentyfikować minimalną ilość sekwencji ζ koniecznych do cytolizy, wytworzono szereg mutantów z delecją, w których usuwano coraz więcej wewnątrzkomórkowych domen ζ (SEQ ID Nr: 44) z końca karboksylowego (fig. 8A). Możnaby usunąć większość wewnątrz181 085 komórkowych domen ζ z małymi konsekwencjami dla siły cytolitycznej; chimera CD16:i pełnej długości miała zasadniczo skuteczność równą chimerze z delec^ądo reszty 65 CD16: iAsp66* (fig. 8B). Istotne zmniejszenie cytotoksyczności obserwowano przy delecji do reszty 95 łańcucha ζ (chimera CD16:iGlu60*) i dalszej delecji do reszty 50, w wyniku której aktywność nieznacznie się zmniejszyła. Jednakże całkowitej utraty aktywności nie obserwowano, nawet gdy domenę wewnątrzkomórkową zredukowano do trzy-resztowego miejsca przyczepienia (fig. 8B).

Ponieważ ζ jest dimerem połączonym mostkiem dwusiarczkowym, jedynym wytłumaczeniem utrzymania aktywności cytolitycznej było to, że endogeniczny ζ tworzył heterodimery z chimerycznym ζ z delecją, przez co przywracał swą aktywność. Aby sprawdzić len pomysł, reszty 11 i 15 łańcucha ζ zamieniano z Asp i Cys odpowiednio na Gly (Cys11Gly/Asp15Gly) i przeprowadzano immunopercypitację jak następuje. Około 2 x 10⁶ komórek CV1 zakażano rekombinantami ospy krowiej, przy wielokrotności zakażenia (moi) co najmniej dziesięć, na jedną godzinę, w pożywce DME pozbawionej surowicy. Sześć do ośmiu godzin po zakażeniu komórki odebrano z płytek przy użyciu PBS/1 mM EDTA i znakowano powierzchniowo 0,2 mCi ¹²⁵I na 2 x 10⁶ komórek, stosując laktoperoksydazę i H2O2 metodą Clarka i Einfelda (Leukocyte Typing II, str. 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Znakowane komórki zbierano przez wirowanie i poddawano lizie w 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0,2 M jodoacetamidu i 1 mM PMSF. Jądra usuwano przez wirowanie i białka CD16 poddawano immunoprecypitacji agarozowej z przeciwciałem 3G8 (Fleit i in., jak wyżej, 1982; Medarex) i IgG przeciw-mysiej (Capel, Durham, NC). Próbki poddano elektroforezie w 8% żelu poliakrylamid/SDS w warunkach nieredukujących lub w 10% żelu w warunkach redukujących. Te immunoprecypitacje potwierdziły, że chimera CD16:( Cys11Gly/Asp15Gly nie łączyła się w struktury dimeru połączonego mostkiem dwusiarczkowym.

Badano też aktywność cytolityczną receptorów mutantów. Zmutowana chimera poddana delecji do reszty 65 (CDl6:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*) była, w zależności od warunków oznaczenia, dwa do ośmiu razy mniej aktywna w oznaczeniu cytolizy niż porównywalna niezmutowana chimera (CD16:ŁAsp66 ), która zwykle nie przekraczała współczynnika 2 lub posiadała aktywność niedostrzegalną w stosunku do CD16:Z (fig. 9B). Zmniejszenie aktywności zmutowanych chimer jest porównywalne do zmniejszenia zauważonego u chimer CD4 o podobnej strukturze (patrz powyżej) i najprawdopodobniej przypisywane mniejszej skuteczności monomerów ζ w porównaniu z dimerami. Przeciwnie, zmutowane chimery Aspi Cys poddane delecji do reszty 59 nie posiadały aktywności cytolitycznej (fig. 9B), podtrzymując hipotezę, że asocjacja z innymi łańcuchami, w której uczestniczą reszty transbłonowe Cys i/lub Asp, odpowiadała za trwałość aktywności cytolitycznej w delecjach aminoterminalnych większych niż do reszty 65.

Badania z cytometrią przepływową wykazały, że mutanty z delecją, które utraciły transbłonowe reszty Asp i Cys mogłyby wciąż pobudzać wzrost poziomu wewnątrzkomórkowych wolnych jonów wapniowych w odpowiedzi na sieciowanie przeciwciała w zmutowanej linii komórkowej Jurkat TCR- (fig. 9D). Podobne wyniki otrzymywano dla chimer, wykazujących ekspresję w rodzicielskiej linii Jurkat. W przypadku CD16^Cys1 lGly/Asp15Gly/Glu60 , dane te wykazują, że zdolność pośredniczenia w reakcji wapnia może być oddzielona przy pomocy mutacji od zdolności podtrzymywania cytolizy.

Aby definitywnie wyeliminować współdziałanie transbłonowych reszt łańcucha ζ reszty transbłonowe i pierwszych 17 reszt cytoplazmatycznych ζ zamieniono na sekwencje, które kodują reszty, przekraczające błonę i pierwszych 14 lub pierwszych 17 reszt cytoplazmatycznych, antygenów, odpowiednio, CD5 albo CD7 (fig. 9A). Powstałe trójdzielne białka połączone CD16:5:Ł (48-65) i CD16:7:Ł (48-65) nie tworzyły dimerów połączonych mostkiem dwusiarczkowym, tak jak prostsze chimery CD16: ζ, ponieważ utraciły resztę cysteinową w domenie transbłonowej ζ. Obie trójdzielne chimery były zdolne do mobilizowania wapnia w liniach komórkowych Jurkat i negatywnych pod względem TCR (fig. 9D) oraz podnoszenia odpowiedzi cytolitycznej u CTL (fig. 9C i dane nie pokazane). Jednakże wycięcie części ζ do reszty 59 w chimerze CD16:7:Z (48-65) znosi zdolności trójdzielnej fuzji do sterowania

181 085 reakcją wapniową w komórkach Jurkat pozytywnych lub negatywnych pod względem TCR i dojrzałych CTL (fig. 9C i dane nie pokazane).

Aby zbadać współdziałanie indywidualnych reszt w 18-resztowym motywie, stworzyliśmy wiele zmutowanych odmian, przez miejscowo skierowaną mutagenezę i ocenialiśmy ich zdolność do pośredniczenia w receptorowo skierowanym zabijaniu w warunkach niskiej (fig. 10A i 10D) lub wysokiej (fig. 10B i 10E) ekspresji receptora chimerycznego. Fig. 10A-F ukazują ze mimo, iż wiele odpowiednio konserwatywnych substytucji (to jest wymiany reszt kwasowych z ich pokrewnymi amidami lub tyrozyny z fenyloalaniną), które przekraczają reszty 59 do 63, przynosiło umiarkowany kompromis skuteczności cytolitycznej, zwykle odmiany utrzymują zdolność do mobilizowania wapnia. Jednakże razem, reszty te tworzą istotny submotyw, jako że ich delecja eliminuje aktywność cytolityczną. Zamiana Tyr 6 na albo Phe albo Ser eliminowała obie odpowiedzi, cytotoksyczną i wapniową. Przy końcu aminowym 18-resztowego segmentu, zamiana Tyr 6 na Phe znosi obie, mobilizację wapniową i aktywność cytolityczną podczas gdy substytucja Leu na Ser w pozycji 50 eliminowała odpowiedź wapniową, tylko częściowo upośledzając cytolizę. Nie wiążąc się z określoną hipotezą, podejrzewa się, że niezdolność mutanta Leu50Ser do mobilizacji wapniowej w krótko trwających oznaczeniach cytometrii przepływowej, nie odzwierciedla w pełni jego zdolności do pośredniczenia w znacznym wzroście zawartości wolnych jonów wapnia wewnątrzkomórkowego przez dłuższy czas, przekraczający oznaczenie cytolizy. Jednakże opisano intensyfikującą wapń aktywność cytolityczną dla niektórych linii cytolitycznych komórek T i nie wykluczono możliwości, że podobne zjawisko stanowi podstawę wyników tutaj opisanych. Zastąpienie Asn48 przez Ser częściowo upośledzało cytotoksyczność w niektórych doświadczeniach, natomiast dawało niewielkie efekty w innych.

Aby prześledzić potencjalną rolę zbytecznych elementów sekwencji, dzielono wewnątrzkomórkową domenę ζ na trzy segmenty, obejmujące reszty 33 do 65, 71 do 104 i 104 do 138. Każdy z tych segmentów dołączono do chimery CD16:CD7 za pośrednictwem miejsca Mlul wprowadzonego przeciwlegle do głównych sekwencji kotwiczących do błony domeny wewnątrzkomórkowej CD7 (patrz poniżej; fig. 11 A). Porównanie skuteczności cytolitycznej trzech elementów pokazało, że były one zasadniczo wyrównane (fig. 11 B). Porównanie sekwencji (fig. 11 A) ukazuje, że drugi motyw posiada jedenaście reszt między tyrozynami, natomiast pierwszy i trzeci motyw posiada ich dziesięć.

Mimo, ze nie wykonywano precyzyjnych obliczeń dotyczących procesu aktywacji komórki T jasne jest, że agregacja receptora antygenu lub chimer receptora, który posiada sekwencje wewnątrzkomórkowe ζ, wyzwala mobilizację wapniową, uwalnianie cytokin i ziaren i pojawienie się komórkowo-powierzchniowych markerów aktywacji. Aktywne miejsce ζ, krótka liniowa sekwencja peptydowa, prawdopodobnie za krótka, aby posiadać dziedziczną aktywność enzymatyczną, prawdopodobnie współdziała z jednym lub najwyżej kilkoma białkami, w pośredniczeniu w aktywności komórkowej. Jest także jasne, że sama mobilizacja wolnego wapnia nie wystarcza do aktywacji komórki, tak jak zdolność do pośredniczenia w cytolizie może być przez mutacje oddzielona od zdolności pośredniczenia w gromadzeniu się wapnia.

Jak tutaj wykazano, dodanie 18 reszt z wewnątrzkomórkowej domeny ζ do transbłonowej i wewnątrzkomórkowej domeny dwóch nie pokrewnych białek pozwala otrzymanym chimerom na ponowne sterowanie aktywnością cytolityczną przeciw komórkom docelowym, które wiążą się z zewnątrzkomórkową częścią białek połączonych. Mimo, że chimery, posiadające 18-resztowy motyw są w przybliżeniu 6-krotnie mniej aktywne niż chimery oparte na ζ o pełnej długości, aktywność można przypisać utracie współdziałania transbłonowego, które normalnie pozwala uformować dimery ζ dzikiego typu, połączone mostkiem dwusiarczkowym. To jest, konstrukcje ζ z delecją, które mają taki sam koniec karboksylowy jako motyw i brak transbłonowych reszt Cys i Asp, typowo wykazują nieco mniejszą aktywność niż chimery, posiadające tylko motyw 18-resztowy.

Element dostatecznie cytolityczny, na którym się skupiliśmy, ma dwie tyrozyny i nie ma seryn ani treonin, ograniczając możliwy udział fosforylacji w aktywności. Jednakże mutacja którejkolwiek tyrozyny niszczy aktywność i mimo, że poprzedzające doświadczenia nie

181 085 dowodzą istotnej fosforylacji tyrozyny, następującej po sieciowaniu chimerycznych antygenów powierzchniowych, posiadających motyw 18-resztowy, możliwego udziału takiej fosforylacji na niskim poziomie nie można wykluczyć. Poza efektami zauważonymi przy dwóch resztach tyrozyny, wiele wymian aminokwasowych przy końcach aminowym i karboksylowym motywu, osłabiło aktywność w warunkach niskiej gęstości receptora.

Sekwencje podobne do aktywnego motywu ζ można znaleźć w domenach cytoplazmatycznych kilku innych białek transbłonowych, włączając cząsteczki CD3 δ i γ, białka mb1 i B29 związane powierzchniowo z IgM i łańcuchy β i γ receptora wysokiego powinowactwa IgE, FceRI (Reth, Naturę 338: 383, 1989). Mimo, że funkcja tych sekwencji nie jest oczywista, jeśli podlegają skutecznej ekspresji, każda może być zdolna do autonomicznej aktywacji komórek T i taka aktywność może tłumaczyć resztkową zdolność do odpowiedzi TCR obserwowaną w zmutowanej linii komórkowej negatywnej pod względem zeta (Sussman i in., Cell 52: 85, 1988).

Sam łańcuch ζ posiada trzy takie sekwencje, w przybliżeniu jednakowo rozprzestrzenione i pobieżny podział na trzy sekcje domeny wewnątrzkomórkowej pokazuje, ze każda jest zdolna do inicjacji odpowiedzi cytolitycznej. η, izotyp składania ζ (Jin i in., jak wyżej, 1990; Clayton i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5202, 1991), nie posiada karboksylowej połowy trzeciego motywu. Ponieważ usunięcie karboksylowej połowy pierwszego motywu upośledza aktywność, jest prawdopodobne, że większość biologicznej skuteczności η, można przypisać pierwszym dwóm motywom. Mimo, że w różnych pomiarach η jest jednakowo aktywny jak ζ w pobudzaniu uwalniania cytokiny, w którym pośredniczy antygen (Bauer i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842, 1991) lub przywróconej cytolizie (patrz powyżej), η nie jest fosforylowany w odpowiedzi na stymulację receptora (Bauer i in., jak wyżej, 1991). W ten sposób albo obecność wszystkich trzech motywów wymagana dla fosforylacji, albo trzeci motyw przedstawia pożądany substrat dla niezidentyfikowanej kinazy tyrozyny.

Przykład IX. Przenoszenie sygnału cytolitycznego przez ludzki receptor Fc.

Aby ocenić działania różnych podtypów ludzkich receptorów Fc, utworzono chimeryczne cząsteczki, w których zewnątrzkomórkową domenę ludzkich antygenów CD4, CD5 lub CD16 łączono z domenami transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi podtypów’ B1, B2 i C, FcRIfyA (nazewnictwo Raveth i Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991). W szczególności sekwencje cDNA, odpowiadające domenom transbłonowym i cytoplazmatycznym wcześniej opisanych izotypów B1 i B2, FcRIIA, namnożono z wcześniej istniejącego klonu PC23 lub z biblioteki cDNa ludzkiego migdałka (zbudowanej standardowymi technikami), stosując następujące syntetyczne oligonukleotydy starterowe:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID Nr: 18); FcRII A współbieżny);

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID Nr: 19); FcRII A odwrotny);

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID Nr: 20); FcRII B1 i FcRII B2 współbieżne); i

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID Nr: 21); FcRII B1 i FcRII B2 odwrotne).

Te startery zawierały miejsca rozszczepienia dla enzymów odpowiednio BamHI i NotI i wycięły 6 reszt z końca 5'. Zaraz po miejscu NotI następował kodon antysensowny, albo CTA, albo TTA. Wszystkie startery zawierały 18 lub więcej reszt komplementarnych do końców 5' i 3' pożądanych fragmentów. Utworzono fragment cDNA odpowiadający domenie cytoplazmatycznej FcRIfyC, który różni się od izotypu IIA tylko jedną resztą aminokwasową. (L na P przy reszcie 268) przez miejscowo skierowaną mutagenezę dzięki zachodzeniu PCR, stosując startery o sekwencji:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID Nr: 22) i

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID Nr: 23).

Fragmenty PCR włączono do wektorów ekspresji wirusa ospy krowiej, które zawierały zewnątrzkomórkowe domeny odpowiednio CD16 lub CD4 i następnie włączono do dzikiego typu ospy krowiej przez rekombinację w lokusie kinazy tymidynowej, stosując selekcję dla

181 085 kointegracji gpt E. coli, aby ułatwić identyfikację pożądanych rekombinantów. Identyczności wszystkich izotypów (pokazanych na fig. 12) potwierdzono przez sekwencjonowanie dideoksy.

Wytwarzanie białek chimerycznych receptorów potwierdzano dalej przez badania immunoprecypitacji. W przybliżeniu 10⁷ komórek JRT3.T3.5 zakażano na jedną godzinę, w pożywce IMDM, wolnej od surowicy, rekombinantami ospy krowiej przy wielokrotności zakażenia co najmniej dziesięć. Dwanaście godzin po zakażeniu komórki odebrano i znakowano powierzchniowo 0,5 mCi na 107 komórek, stosując metodę laktoperoksydazy/oksydazy glukozowej (Clark i Einfeld, jak wyżej). Znakowane komórki zgromadzono przez wirowanie i poddano lizie 1% NP-40, 0,1 mM MgCL, 5 mM KCl, 0,2 M jodoacetamidu i 1 mM PMSF. Jądra usunięto przez wirowanie i białka połączone CD16 poddano immunoprecypitacji agarozowej z przeciwciałem 4G8 i IgG przeciw-mysią. Próbki poddano elektroforezie w warunkach redukujących. Wszystkie cząsteczki chimerycznych receptorów poddane immunoprecypitacji, posiadały oczekiwane masy cząsteczkowe.

Aby przetestować zdolność receptorów chimerycznych do pośredniczenia we wzroście wolnego wapnia cytoplazmatycznego, użyto rekombinowanych wirusów, aby zakazić zmutowaną linię komórek TCR“ Jurkat JRT3.T3.5 (jak tu opisano) i mierzono w komórkach wolny wapń cytoplazmatyczny po sieciowaniu zewnątrzkomórkowej domeny receptora z przeciwciałem monoklonalnym 3G8 lub Leu-3A (jak tu opisano). Doświadczenia te dowiodły, że wewnątrzkomórkowe domeny FcRyII A i C były zdolne do pośredniczenia we wzroście wolnych jonów wapnia w cytoplazmie po sieciowaniu zewnątrzkomórkowych domen, natomiast domeny wewnątrzkomórkowe FcRyII B1 i B2 były nie aktywne w porównywalnych warunkach (fig. 13A i 13B). Hybrydy CD4, CD5 i CD16 FcRyII A przyczyniały się zasadniczo w równym stopniu do pobudzania odpowiedzi wapniowej (fig. 13A-B). Inne linie komórkowe, z obu rodów, monocytów i limfocytów, były zdolne do odpowiedzi na sygnał, inicjowany przez sieciowanie domen zewnątrzkomórkowych.

W celu zbadania związku różnych domen wewnątrzkomórkowych FcRyII z cytolizą, zakażono ludzkie cytotoksyczne limfocyty T rekombinantami ospy krowiej, wykazującymi ekspresję chimer CD16:FcRyII A, B1, B2 i C. Zakażone komórki hodowano następnie wspólnie z zaopatrzonymi w ’^lCr komórkami hybrydomy (to jest komórkami 3G8 10-2), które wykazywały ekspresję przeciwciała powierzchniowo-komórkowego do CD16: W tym oznaczeniu CTL, posiadające chimerę CD16 zabijały docelowe komórki hybrydomy (pozwalając na uwolnienie wolnego ^Cr), jeśli zewnątrzkomórkowa domena CD16 chimery została dołączona do segmentu wewnątrzkomórkowego, zdolnego do aktywacji limfocytarnego programu efektorowego; to oznaczenie cytolizy szczegółowo opisano poniżej. Fig. 14A ukazuje, że CTL uzbrojone w CD16: FcRyII A i C, lecz nie w FcRy B1 lub B2, są zdolne do lizy komórek docelowych, wykazujących ekspresję przeciwciała powierzchniowo-komórkowego anty-CD16.

Aby wyeliminować możliwość, że specyficzną cytolizę w pewien sposób przypisuje się interakcji z cząstką CD16, przeprowadzono doświadczenia, w których domeny wewnątrzkomórkowe FcRII dołączono do zewnątrzkomórkowej domeny CD4. W tym przypadku komórkami docelowymi były komórki HeLa, wykazujące ekspresję białek otoczkowych gpl20/41 HIV (zwłaszcza komórki HeLa zakażone wektorem ospy krowiej vPE16 (dostępnym w National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda MD). Podobnie jak w układzie CD16, komórki docelowe, wykazujące ekspresję otoczki HIV były podatne na lizę, wywołaną przez komórki T, wykazujące ekspresję chimer CD4: FcRyII A, lecz nie chimery FcRyII B1 lub B2 (fig. 14B).

Domeny wewnątrzkomórkowe FcRyII A i C nie wykazują dostrzegalnej homologii sekwencyjnej z żadnym innym białkiem, włączając członków rozszerzonej rodziny FcRy/TCRZ . Aby określić elementy sekwencji odpowiedzialne za indukcję cytolizy, wytwarzano delecje 5' i 3' sekwencji, kodujących domenę wewnątrzkomórkową (opisaną poniżej i pokazaną na fig. 15A) i oceniano pod względem skuteczności w oznaczeniach mobilizacji wapniowej i cytolizy (jak tu opisano). W doświadczeniach, w których usunięto aminoterminalną część domeny wewnątrzkomórkowej, zmieniono domenę transbłonową FcRyII na domenę

181 085 transbłonowąniezwiązanego antygenu CD7, w celu eliminacji możliwej przyczyny interakcji, w której pośredniczy domena, przekraczająca błonę.

Figury 15B i 15C pokazują, że usunięcie 14 reszt karboksy-terminalnych, obejmujące tyrozynę 298, dało w efekcie całkowitą utratę zdolności cytolitycznej i zasadniczą redukcję zdolności mobilizacji wapniowej. Dalsza delecja tuż przed tyrozyną 282 dała taki sam fenotyp (fig. 15B i 15C). Delecja do końca N domeny wewnątrzkomórkowej do reszty 268 nie dała zasadniczych efektów ani w profilu wapniowym, ani w sile cytolitycznej, natomiast delecja do reszty 275 znacznie osłabiła uwalnianie wolnego wapnia, lecz trochę poprawiła cytolizę (fig. 15D i 15E). Dalsza delecja, do reszty 282, dała ogonki FcRyII, które utraciły zdolność albo do mobilizowania wapnia, albo wyzwalania cytolizy (fig. 15D i 15E). „Aktywny element”, określony przez te pobieżne pomiary jest odpowiednio wielki (36 aminokwasów) i zawiera dwie tyrozyny przedzielone 16 resztami.

Przykład X. Ukierunkowana cytoliza przez limfocyty, posiadające chimeryczne receptory CD4, która nie podtrzymuje infekcji.

Jak rozważano powyżej, można zbudować cząsteczki efektorowe, które ponownie będą sterować aktywnością cytolityczną CTL w sposób niezależny od MHC. Np. chimera składająca się z zewnątrzkomórkowej domeny CD4 dołączona do łańcucha ζ klonu ludzkich CTL, WH3, specyficznie zabija komórki docelowe, prezentujące powierzchniowe glikoproteiny otoczkowe gpl20 HIV-1. Chociaż domena zewnątrzkomórkowa nadaje wrażliwość na infekcję HIV, jednak uzbrojone CTL mogą stawać się celami dla wirusa, dając w efekcie zmniejszenie ich siły (Dalgleish i in., Nature 312: 767 (1984); Klatzmann i in., Nature 312: 767 (1984)). Aby zabezpieczyć się przed takim rezultatem, zaprojektowano chimeryczne cząsteczki efektorowe, oparte na CD, które są skuteczne przy specyficznie określonych celach jakimi są komórki zakażone HIV, w zabijaniu, w którym pośredniczy komórka, ale które nie nadaj ją wrażliwości na zakażenie HTV.

Stworzono trójdzielne białko połączone przez przyłożenie domeny zewnątrzkomórkowej CD4 (fig. 23) do zawiasu, stałych domen, drugiej i trzeciej, łańcucha ciężkiego ludzkiego IgG1 (Zettlmeissl i in., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)) (fig. 25), które łączono w tym przypadku z częścią pierwszego eksonu transbłonowego ludzkiej IgG1 związanej z błoną, po której następuje część ludzkiego antygenu CD7, składającego się z sekwencji między pojedynczą domeną Ig-podobną i sekwencji zatrzymującej przenoszenie, następującej po domenie transbłonowej (Aruffo i Seed, EMBO J. 6: 3313 (1987)) (fig. 26). Pierwotna sekwencja aminokwasowa części zewnątrzkomórkowej segmentu CD7, składającego się z regionu bogatego w prolinę, przypominającego strukturę szypułopodobną, która wyrzuca domenę Ig-podobną poza powierzchnię komórki (Aruffo i Seed, EmBo J. 6: 3313 (1987)) (fig. 27)). Wytworzono rekombinowane wirusy ospy krowiej, w celu ekspresji tej i związanych z nią chimer tak, jak tu opisano. W szczególności, rekombinowane wirusy ospy krowiej stworzono przez homologiczną rekombinację w komórkach CV-1. Dla każdego rodu, przed wytworzeniem rodów o wysokim mianie w komórkach CV-1, przeprowadzono co najmniej dwie rundy wizualizacji płytkowej z OKT4 lub Leu3a, po których nastąpiło oczyszczanie płytkowe.

Trójdzielna chimera (CD4(D1-D4):Ig:CD7) (fig. 20, cząsteczka „A”) wykazała skuteczną ekspresję powierzchniowo-komórkową i była testowana na zdolność do zachowywania się jako receptor HIV w oznaczeniu tworzenia syncytiów, opartych na wirusie ospy krowiej (Lifson i in., Nature 323: 725 (1986); Ashorn i in., J. Virol. 64: 2149 (1990)). Komórki HeLa zakażone rekombinantami wirusa ospy krowiej (vPE16) kodujące glikoproteiny otoczkowe HIV-1 (Earl i in., J. Virol. 64: 2448 (1990)) hodowano wspólnie z komórkami HeLa zakażonymi albo CD4, Ο)4:ζ, albo CD4(D1-D4):Ig:CD7. Sześciocentymetrowe płytki z komórkami HeLa (ATCC Rockville, MD) przy 50% połączenia zakażono w pożywce wolnej od surowicy na 1 godzinę przy wielokrotności zakażenia (MOI), wynoszącej w przybliżeniu 10. Komórki inkubowano przez dodatkowe 5-6 godzin w pełnej pożywce i następnie odebrano przy użyciu roztworu soli buforowanej fosforanem (PBS), zawierającym 1 mM EDTA. Komórki o ekspresji otoczki i chimery CD4 mieszano w stosunku 1:1 i ponownie umieszczono na płytkach o średnicy 6 cm z pełną pożywką. Po 6-8 godzinach wspólnej hodowli syncytia oddzielono od płytki i sfotografowano.

181 085

Wspólne hodowle CD4 i vPE16 doprowadziły do utworzenia łatwo wykrywalnych wirlpjądrpwγch komórek olbrzymich. Także chimera, składająca się z domeny zewnątrzkomórkowej CD4 dołączonej do łańcucha ζ TCR (CD4:Z) (fig. 27) była zdolna do pośredniczenia w tworzeniu syncytiów, natomiast komórki o ekspresji CD4(D1-D4):Ig:CD7 nie dawały oznak fuzji komórkowej. Testowaliśmy także konstrukcję o ekspresji tylko pierwszej i drugiej domeny (fig. 24), CD4(Dl,D2):Ig:CD7 (fig. 20, cząsteczka „B”), jako, ze w innym kontekście dwie domeny aminotermalne CD4 wydawały się być konieczne do zakażenia przez HIV (Landau i in., Nature 334 159 (1988)). Ta cząsteczka także okazała się niewrażliwa na indukowane przez HIV tworzenie się syncytiów. Przez związane z tym badania, z rozpuszczalnym znakowanym ¹²⁵I gp120 ustalono, że obie CD4(Dl-D4):Ig:CD7 i CD4(D1, D2):Ig:CD7 posiadały bezkompromisowe powinowactwo do gp120.

Określiliśmy następnie, czy chimeryczne cząsteczki, oporne tworzenie syncytiów, powinny być zdolne do ponownego sterowania zabijaniem komórkowym, jeśli są obdarzone cząstką wyzwalającą, tak jak tu opisano. Połączyliśmy wewnątrzkomórkową domenę ζ (fig. 27) z końcem 3' CD4(D1-D4):Ig:CD7 i CD4(D1, D2): Ig:CD7^ i wytworzyliśmy odppwieOnie rekombinanty wirusów ospy krowiej. Konstrukcje te, CD4(D1-D4):lg: CD7:Z i CD4(D1, D2):Ig:CD7:<Ź (fig. 20, cząsteczki „C” i „ID”), podlegały ekspresji w klonie ludzkich CTL, WH3 i testowano je pod względem zdolności do określenia jako celu i zabicia komórek HeLa, o ekspresji powierzchniowych glikoprotein otoczkowych HIV (przy użyciu metod tu opisanych). Fig. 21 pokazuje, że wewnątrzkomórkowa domena ζ dołączona albo do CD4(Dl-D4):Ig:CD7, albo do CD4(D1, D2):Ig:CD7 może nadawać zdolność do zabijania; konstrukcje pozbawione łańcucha ζ nie były zdolne do pośredniczenia w tej aktywności. CD4:Z, pozytywna grupa kontrolna, pośredniczyła w nieco skuteczniejszej cytotoksyczności, a CD4(D1, D2): Ig: CD7:Z nieco mniej skutecznej cytotoksyczności niż CD4(D1-D4):Ig: CD7:Z (fig. 21). Jednak jest jasne, że obie chimery, CD4(D1-D4): Ig: CD7:Z i CD4(D1, D2): Ig:CD7d posiadają zdolność pośredniczenia w specyficznym zbijaniu komórek, wykazujących ekspresję białek otoczkowych na ich powierzchni. Chimery azterodzielnn były konsekwentnie niezdolne do pośredniczenia w tworzeniu syncytiów w oznaczeniu opartym na wirusach ospy krowiej. Wykazaliśmy także, że pojedynczy motyw ζ rodzaju pokazanego na fig. 11A jest wystarczający do nadawania aktywności cytolitycznej chimerze CD4(D1-D4).

Doświadczenia radipimmunoprecypitaayjne ustaliły, że cząsteczki połączone były przeważnie, jeśli nie wszystkie, dimerami. W tych doświadczeniach użyto perełek agarozy z białkiem-A do immunoprecypitacji rozpuszczonego ekstraktu metabolicznie znakowanych komórek HeLa, zakażonych rekombinantami ospy krowiej o ekspresji chimer CD4(D1-D4): Ig:CD7^ i CD4(D1, D2):Ig:CD7^. Materiał poddany immunpprecyditaaji frakcjonowano przez elektroforezę w żelu agarozowym w redukujących i nie redukujących warunkach. W szczególności, w przybliżeniu 5 x 10⁶ komórek HeLa-S3 zakażono, według powyższego opisu dla vPE16, odpowiednim szczepem wirusa ospy krowiej. Komórki metabolicznie znakowano 200 pCi/ml Tran^S-Label (ICN Ra0ioahemiaals, Irvine, CA) na 6-8 godzin w pożywce ubogiej w cysteinę i metioninę i odebrano, stosując PBS, zawierający 1 mM EDTa. Następnie komórki w postaci grudek poddano lizie w 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF. Po usunięciu jąder przez wirowanie, jedną piątą każdego ekstraktu komórkowego adsorbowano na przemytych perełkach agarozowych, sprzężonych z białkiem A przez 2 godziny w temperaturze 4°C. Perełki następnie przemyto PBS, zawierającym 1% NP-40 i eluowano w buforze do próbek, zawierającym SDS w obecności lub nieobecności mrrkaptoetanplu. Wyniki tych doświadczeń wykazały, że większość poddanych immunodrecyditacji chimer CD4(D1-D^kjiJggC^IÓY :ζ iCD4(D1, D2):Ig:CD7:ζ migrowało jako dimery o oczekiwanej masie cząsteczkowej w warunkach nie redukujących.

Aby bezpośrednio ocenić zdolność komórek, wykazujących ekspresję połączonych cząsteczek CD4 do podtrzymywania infekcji HIV, przeprowadziliśmy długoterminowe badania zakażalności na transfektantach, wykazujących ekspresję CD4(D1-D4):Ig: CD7ą i CD4(D1, D2):Ig:CD7:ζ. Wytworzono stabilne transfektanty CD4(D1-D4):Ig:CD7:ζ i CD4(D1, D2):Ig: CD7:Z i CD4 w sublinii 293 komórek, wyraźnie zdolnych do infekcji linii komórkowej po181 085 chodzących z ludzkich embrionalnych komórek nerek. Cząsteczki chimeryczne subklonowano w dwukierunkowych wektorach, do których wprowadzono gen higromycyny B przez promotor kinazy tymidynowej wirusa opryszczki. 10 cm płytkę z komórkami, w 60-70% konfluentną, transfekowano 10 pg DNA tego plazmidu przez koprecypitację z fosforanem wapnia. Przed transfekcją plazmid przekształcono w strukturę liniową w unikatowym miejscu Sfl i końce przepłukano polimerazą DNA T4. 24 godziny po transfekcji, komórki dzielono czterokrotnie i 48 godzin po transfekcji komórki poddano selekcji z higromycyną B (Sigma, St. Louis, MO) o 400 pg/ml. Co 3-4 dni komórkom dostarczano świeżą pożywkę, zawierającą higromycynę.

Kolonie oporne wybrano, rozszerzono i oznaczono ich ekspresję przez pośrednią immunofluorescencję, przy użyciu Fc anty-ludzkiej IgG sprzężonego z fluoresceiną (Organon Teknika, West Chester, PA) lub Q4120, przeciwciała reaktywnego z ludzkim CD4 (Sigma), po której nastąpiła cytometria przepływowa (Coulter, Hialeah, FL). Do analiz wyselekcjonowano dwa niezależne klony z każdej konstrukcji, o poziomach powierzchniowo-komórkowych CD4 porównywalnych z wykazanymi przez inne linie komórkowe. Fig. 22 pokazuje, ze po wystawieniu na HIV, wykryto p24 w stabilnych hodowlach transfektantów CD4, juz 3 dni po infekcji. Obecność w tych hodowlach wielojądrowych komórek olbrzymich i charakterystyczne wydęcie było oczywiste już 5 dni po infekcji. Nie wykryto znaczących poziomów p25 ani obecności wielojądrowych komórek olbrzymich w niezakażonych, rodzicielskich liniach komórkowych ani w obu z dwóch niezależnie wyizolowanych transfektantów CD4(D1-D4):Ig:CD7 i CD4(D1, D2):Ig:CD7 po 32 dniach hodowli (fig. 22).

W kompletnych badaniach infekcyjności, komórki analizowano pod względem ekspresji powierzchniowej CD4. Gęstość powierzchniowych epitopów CD4 była znacznie obniżona w zakażonych kulturach, wykazujących ekspresję CD4, zgodnie z wirusową modulacją obniżającą ale była nie zmieniona w hodowlach, wykazujących ekspresję CD4(D1-D4):Ig:CD7 iCD4(D1, D2):Ig:CD7. Doświadczenia te ustalają że możliwe jest stworzenie chimerycznych cząsteczek, posiadających dwie wierzchołkowe domeny CD4, które, gdy są dołączone do łańcucha ζ receptora komórki T, posiadają zdolność do określenia jako celu i zabicia komórek zakażonych HIV, ale które nie podtrzymują infekcji HIV, w której pośredniczy CD4.

Dodatkowe doświadczenia sugerują, ze istnieje fizyczna odległość między domeną zewnątrzkomórkową cząsteczki CD4 i dwuwarstwową lipidową, która nadaje zdolność oporności na infekcję HlV. W pierwszym doświadczeniu zbudowaliśmy chimeryczną cząsteczkę, posiadającą delecję szypuły CD7 i domeny transbłonowej; delecja ta usunęła region bogaty w prolinę części transbłonowej CD7. Gdy domenę tę dołączono do zewnątrzkomórkowej domeny CD4, utrzymało to jej zdolność do skutecznego przyczepiania się do domeny z.ewnątrzkomórkowej cząsteczki CD4, co zmierzono przez ekspresję powierzchniowo-komórkową cząsteczki CD4 (jak tu opisano). Jednak utracono zdolność powstrzymywania tworzenia się syncytium indukowanego przez glikoproteinę otoczkową. Tak więc, delecja regionu bogatego w prolinę cząsteczki CD4, regionu prawdopodobnie tworzącego strukturę spirali α-helisy, efektywnie zmniejszyła odległość między zewnątrzkomórkową domeną CD4 i dwuwarstwową lipidową i zniosła zdolność chimery do powstrzymywania tworzenia się syncytium.

W drugim doświadczeniu wykazaliśmy, że zdolność do powstrzymywania indukowanego przez HIV tworzenia się syncytium może uzyskać chimera CD4/CD5, którą poprzednio udokumentowano, jako służącą za transbłonowy łącznik dla domeny zewnątrzkomórkowej CD4, lecz była ona niezdolna do powstrzymywania indukowanego przez HlV tworzenia się syncytium. W tym doświadczeniu zawias, domeny CH2 i CH3 ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG1 wtrącono do cząsteczki CD4/CD5; powstała w efekcie chimera powstrzymywała tworzenie się syncytium, sugerując znowu, że odległość wytworzona przez domeny immunoglobuliny jest wystarczająca do nadania oporności przeciw indukowanemu przez HlV tworzeniu się syncytium.

W trzecim doświadczeniu, domenę CD4 przedłużano zmieniając odległości od błony komórkowej, stosując syntetyczne alfa helisy różnej długości. W szczególności, zaplanowano syntetyczne oligonukleotydy, przedstawiające powtarzane motywy alfa helisy, reszt lizyny i kwasu glutaminowego, na których końcach znajdują się reszty alaniny (patrz fig. 28 dla ro28

181 085 dzicielskich sekwencji kwasów nukleinowych i aminokwasowych). We wcześniejszych badaniach okazało się, że takie sekwencje aminokwasowe zdarzają się z wysoką częstotliwością w alfa helisach, sugerując, że takie powtarzane motywy przyjmują konformację alfa helisy i że umiejscowienie takich alfa helis między domeną transbłonowa i domenami zewnątrzkomórkowymi CD4 wyrzuca CD4 poza błonę komórkową. Przez zróżnicowanie długości segmentu alfa helisy, wykonano obliczenie odległości, koniecznej do przeciwstawienia się wniknięciu HIV, oparte na znanych wartościach skoku i skrętu alfa helisy. Wyniki te przedstawia się w tabeli 1.

Tabela 1

	Tworzenie syncytium	Ekspresja Thy-1
A. CD4 + H + CH2 + CH3 + CD7tm + stk	-	-
B. CD4(D1, D2) + H + CH2 + CH3 + CD7tm + stk	-	-
C. CD4 + CD7tm + stk	± (a)	+
D. CD4 + CD7tm (wersja długa)	+	+
E. CD4 + CD7tm (wersja krótka)	+	+
F. CD4 + CD5tm	+	+
G CD4 + CH2 + CH3 + CD5tm	-	-
H CD4 + CH3 + CD5tm	-	ND
I CD4 + CD34tm	+	+
J. CD4 + syntetyczna alfa helisa (2,4 nm) + CD34tm	ND	+
K. CD4 + syntetyczna alfa helisa (4,8 nm) + CD34tm	ND	±(a)
L CD4 + syntetyczna alfa helisa (7,2 nm) + CD34tm	ND	-

^(a) Znaczna redukcja w liczbie syncytiów lub komórek o ekspresji thy-1

W tabeli tej, „CD4” przedstawia CD4(D1-D4) chyba, że oznaczono inaczej; „H” i „CH3” przedstawia odpowiednio zawias, regiony CH2 i CH3 ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG1; „CD7tm i stk” przedstawia regiony transbłonowe i szypułowe CD7; „CD7tm (wersja długa)” i „CD7tm (wersja krótka)” przedstawia odpowiednio region transbłonowy CD7 i region transbłonowy CD7 z delecją domeny bogatej w prolinę (jak rozważano powyżej); „CD5tm” przedstawia region transbłonowy CD5; i „CD34tm” przedstawia region transbłonowy CD34. W pozycjach J-L, długość regionu alfa helisy jest określany w nanometrach; wartości te oparto na fakcie, ze na skręt alfa helisy przypada 3,6 reszty, co odpowiada 0,54 nm (lub 0,15 nm na resztę). Zgodnie z tym, 16-resztowa alfa helisa wyrzuciłaby domenę zewnątrzkomórkową CD4 o około 2,4 nanometry. Alfa helisy o 4,8 i 7,2 nanometry zbudowano dzięki sekwencyjnej polimeryzacji przez składanie fragmentu BstYI do unikatowego miejsca fragmentu BamHI (patrz fig. 28), następującej po selekcji klonów z właściwej orientacji.

Utworzone syncytia odebrano, w oznaczeniach przez wspólną hodowlę z komórkami HeLa, wykazującymi ekspresję glikoproteiny otoczkowej HIV-1 od konstrukcji wirusa ospy krowiej vPE16 (patrz powyżej).

Ekspresję thy-1 mierzono jak następuje. Zbudowano żywe wektory retrowirusowe oparte na klonie hxb.2 HIV-1. W tym wektorze, nieistotny gen nef zamieniono z sekwencją kodującą szczurzą thy-1 cząsteczką, podlegającą skutecznej ekspresji powierzchniowokomórkowej, która jest doczepiona do błony przez wiązanie fosfatydyloinozytolowe. Wirus, otrzymany z tego klonu cząsteczkowego, oznaczony hxb/thy-1, był zakaźny jak wykazano przez jego skutki cytopatologiczne i przez produkcję p24 w hodowli w supernatantach zakażonych komórek C8166 (ludzka linia CD, białaczki limfocytarnej T). Dodatkowo, wobec wystawienia na hxb/thy-1, komórki HeLa transfekowane krótkotrwale CD4 wykazywały oznaki ekspresji thy-1 już 18 godzin po zakażeniu, jak oczekiwano u regulowanych informacyjnie na sposób z nef. Informacje kodowane przez gen nef zwykle zalicza się do klasy wiru181 085 sowych białek regulatorowych, które są wielokrotnie składane i tracą element odpowiedzi rev. Informacje te mogą akumulować się w sposób istotny w cytoplazmie jako wczesny produkt genu wirusowego. Spodziewano się, że informacje thy-1 są podobnie regulowane, co powinno mieć miejsce wcześnie w cyklu życiowym wirusa. Pokrótce, system ten ułatwiał oznaczenie miejsca wejścia HIV, z ekspresją thy-1 użytą jako namiastką miejsca wejścia wirusa. Różne chimery oparte na CD4 transfekowano krótkotrwale do komórek HeLa, stosując standardowe metody dekstranu DEAE. Transfekowane komórki wystawiano na wirusa hxb/thy-1 przez 48 godzin po transfekcji i obliczano pod względem ekspresji thy-1 24-48 godzin po transfekcji. W wynikach pokazanych w tabeli 1, ekspresję thy-1 mierzono 24 godziny po transfekcji, stosując dostępne w handlu monoklonalne przeciwciało Thy-1 (Accurate).

Z danych prezentowanych w tabeli 1 wnioskowaliśmy, że domeny zewnątrzkomórkowe CD4 powinny być optymalnie wyrzucone poza błonę komórkową o co najmniej 4,8 nanometry, a korzystnie o co najmniej 7,2 nanometry, w celu powstrzymania infekcji HlV-1.

Stosując strategię podobną do generalnej strategii tu opisanej, można budować chimery oparte na przeciwciałach otoczkowych anly-Hw, dla których celem będą komórki zakażone HIV. Przykłady takich przeciwciał opisali Gorny i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1624 (1989) i Marasco i in., J. Clin. Invest. 90: 1467 (1992). '

Przykład XI. Zastosowanie wyrzuconych cząsteczek CD4 jako wabików HIV.

Jak tu wykazano, komórki, posiadające domeny CD4 wyrzucone poza powierzchnię komórki, hamują infekcyjność HIV. Zgodnie z tym, takie komórki, posiadające CD4 są użyteczne jako wabiki do wiązania krążącego HIV i obniżania mian wirusowych u osób zakażonych HIV. Korzystnie, domena CD4 jest prezentowana na komórce tak, że naturalnie przechodzi przez węzły limfatyczne; użyteczne komórki gospodarza obejmują każdą komórkę, która odgrywa rolę w równowadze odpornościowej komórki równie dobrze jak każda inna komórka naturalnie obecna w pęcherzykach węzła limfatycznego. Szczegółowe przykłady obejmują, bez ograniczenia, makrofagi komórki T (np. pomocnicze komórki T), komórki B, neutrofile, komórki dendrytyczne i pęcherzykowe komórki dendrytyczne.

Każda domena CD4 zdolna do wiązania HIV, włączając domeny D1-D4 i D1, D2, opisane tutaj, może być wykorzystana w tej postaci realizacji wynalazku. Dla co najmniej kilku postaci realizacji (np. tych opisanych powyżej), części wewnątrzkomórkowych i/lub zewnątrzkomórkownca domen chimer można wybrać z każdej sekwencji białka lub aminokwasu.

Przykład XII. Dodatkowe białka komórki T i receptora komórki B.

Inne wewnątrzkomórkowe i transbłonowe domeny, przewodzące sygnał według wynalazku mogą pochodzić z białek receptora komórki T, białek CD3 delta i T3 gamma oraz białek receptora komórki B, mbl i b29. Sekwencje aminokwasowe tych białek pokazano na fig. 16 (CD3 delta; SEQ ID Nr: 24), fig. 17 (T3 gamma;, SEQ ID Nr: 25), fig. 18 (mbl; SEQ ID Nr: 26) i fig. 19 (B29; SEQ ID Nr: 27). Części sekwencji, wystarczające do przekazania sygnału cytolitycznego (i przez to korzystnie włączone do chimerycznego receptora według wynalazku) pokazano w nawiasach. Chimeryczne receptory, które obejmują te białkowe domeny, są zbudowane i użyte w sposobach terapeutycznych według wynalazku, generalnie, jak opisano powyżej.

Przykład XIII. Infekcja wirusem ospy krowiej i immunoprecypitacja.

W przybliżeniu 5 x 10⁶ komórek CV1 zakażono na jedną godzinę, w pożywce DME wolnej od surowicy, rekombinowanymi wirusami ospy krowiej przy wielokrotności zakażenia (moi) co najmniej dziesięć (miano zmierzone dla komórek CV1). Komórki po zakażeniu umieszczono w świeżej pożywce i oznakowano metabolicznie 200 pCi/ml ³⁵S-metioniną plus cysteiną (Tran³⁵S-label, ICN; Costo Mesa, CA) w pożywce DMEM wolnej od metioniny i cysteiny (Gibco; Grand Island, NY), na sześć godzin. Znakowane komórki odebrano przy użyciu PBS, zawierającym 1 M EDTA, zgromadzono przez wirowanie i poddano lizie w 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,5 M Tris pH 8,0, 5 mM EDTA i 1 mM PMSF. Jądra usunięto przez wirowanie i białka CD4 poddano immunoprecypitacji w żelu, z przeciwciałem OKT4 i przeciw-mysią IgG (Cappel, Durham NC). Próbki poddano elektroforezie w 8% żelach poliakrnlamid/SDS w warunkach nie redukujących (NR) i redukujących (R). Żele, zawierające próbki znakowane ^S, przed autoradiografią impregnowano En Hance (New En30

181 085 gland Nuclear, Boston, MA). Ułatwioną ekspresję transbłonowych postaci CD16, CD 16™ mierzono przez porównanie ich ekspresji w komórkach CV1, pojedynczo zakażonych CD16tm, z ekspresją w komórkach, koinfekowanych wirusami, kodującymi chimery CD16tm i ζ lub γ. Po infekcji i inkubacji przez szeeć ggddin lub więcej, komórki odebrann z płytek, przy użyciu PBS, 1 mM EDTA i mierzono ekspresję CD16TM lub chimer przez pośrednią lmmbkoflborzsczkcję i cytometrię przepływową.

Ozknczzkiz strumienia wapnia

Komórki Jurkat sublinii E6 (Weiss i in., J. Immunol. 133: 123-128 (1984) zakażono rzUombinowckymi wirusami ospy krowiej na jedną godzinę w IMDM wolnej od surowicy przy moi - 10 i ikCbbdwand przez trzy do dziewięciu godzin w IMDM, 10% FBS. Komórki zgromadzono przez wirowanie i ponownie zawieszono w 3 x 10⁶ komórek/ml w pełnej pożywce, zawierającej 1 mM ncztyldmetoksyzstrb Indo© (Grykkiewicz i in., J. Biol. Chem. 260: 33403350 (1985)) (Μ^ζ^Ι^ Probes) i ikUbbownno w temperaturze 37°C przez 45 minut. Komórki zaopatrzone w Indo-d zebrano w grudki i ponownie zawieszono przy mianiz 1 x 10⁶/ml w IMDM wolnej od surowicy i przechowywano w temperaturze pokojowej w ciemności. Komórki cnnlizowckd pod względem wolnych jonów wapnia przez jednoczesny pomiar emisji fioletu i błękitu fluorescencyjnego na drodze cytomztrii przepływowej (Rnbinovitch i in.,

J. Immunol. 137: 952-961 (1986)). Aby znikicjować przepływ wapnia, do zawiesiny komórek dodano albo sprzężone z fiOobrytryną (PE) Lzu-3A (nkty-CD4) (Bzcton DicUiksok, Lincoln Park, NJ) o miarne 1 pg/ml, po którym do zawiesiny komórek dodano 10 pg/ml koziego przeciwciała kibsprzcżokbgo z IgG przeciw-mysią w czasie 0 lub kiesprzcżdnego 3G8 (antyCD16) mdkoklokalkegd przeciwciała, o mianie 1 pg/ml, po którym dodano 10 pg/ml koziego przeciwciała Faba', sprzężonego z PE i IgG przeciw-mysią w czasie 0. Z populacji komórek pozytywnych pod względem PE (zakażonych), które typowo przedstawiały 40-80% wszystkich komórek, zebrano histogramy stosunku emisji Γiolzt^/ałcUit. Odpowiedź receptom antygenu komórki T w komórkach niz zakażonych była wyzwolona przzz przeciwciało OKT3, kibusiecldwnke. Dla doświadczeń, związanych z chimerycznymi receptorami CD16, próbki wykazujące przesuwanie się linii podstawowej ku niższemu poziomowi wapnia wewnątrzkomórkowego (bzz przeciwciała) wyłączono z analizy. Dane histogramowe następnie analieowαko poprzez konwersję danych binarnych na ASCII, stosując program Writz Hand Man (Cooper City, FL), po którym analizowano stosując zbiór programów w języku FORTRAN. W celu ustalema znormalizowanego współczynnika początkowego, przed dodaniem następnych reagentów z przeciwciałem, użyto współczynnika emisji fiolet/błękit, ustalono go jako jedność, a pozostały współczynnik progowy ustawiono tak, żz 10% pozostałej populacji przekraczała próg.

Oznaczenie cytolizy

Ludzką linię komórek T WH3, ograniczoną cytolityczną linię CD8+ CD4~ HLA B44, utrzymywano w IMDM, 10% ludzkiej surowicy z 100 U/ml IL-2 i okresowo stymulowanej albo niespecyficznie z użyciem kapromizkidwαkych (3000 radów), nie związanych z HLA limfocytów krwi obwodowej i 1 pg/ml fltohzmaglbtykiky, albo specyficznie, z użyciem naprdmlzkidwanych jbekdjądrdwych komórek, posiadających B44. Po jednym dniu stymulacji niespecyficznej, rozcieńczono PHA do 0,5 pg/ml, przzz dodanie świeżej pożywki, a po trzech dniach pożywkę wymieniono. Komórki hodowano przzz co najmniej 10 dni po stymulacji, zanim użyto ich do oznaczenia cytdtdUsyczkdści. Komórki zaUażcko rzUomaikowakymi wirusami ospy krowiej przy wielokrotności eaUażzkia co najmniej 10 przzz co najmniej jedną godzinę w pożywce wolnej od surowicy, po czym nastąpiła inkubacja w kompletnej pożywce przez 3 godziny. Komórki zebrano przzz wirowanie i ponownie utworzono zawiesinę o gęstości 1 x 107 komórek/ml. 100 pl dodano do każdej studzienki płytki do mikromianowania o dnie w kształcie U, zawierającej 100 pl kompletnej pożywki na studzienkę. Komórki rozcieńczono dwukrotnie w kolejnych etapach. Dwie studzienki na każdą próbkę nie zawierały limfocytów, aby umożliwić spontaniczne uwalnianie chromu i odebranie do zmierzenia całkowitej ilości chromu. Komórki docelowe, z suWmu S3 HeLa, zakażono na 6,0 lub 10,0 cm płytkach, przy moi wynoszącym w przybliżeniu 10, na jedną godzinę, w pożywce wolnej od surowicy, po czym ikUubowakd w kompletnej pożywce przzz trzy godziny. Następnie ode181 085 brano je z płytek, przy użyciu PBS, 1 mM EDTA i policzono. Równowartość 106 komórek docelowych (komórki HeLa, Raji lub RJ2.2.5 do doświadczeń z chimerycznymi receptorami CD4 i komórki 3G8 10-2; Shen i in., Mol. Immunol. 26: 959 (1989) do doświadczeń z chimerycznymi receptorami CD16) wirowano i ponownie zawieszono w 50 pl sterylnego chromianu sodowego z ⁵¹Cr (1 mCi/ml, Dupont, Wilmington, DE) na jedną godzinę w temperaturze 37°C sporadycznie mieszając, następnie przemyto trzy razy PBS. 100 pl znakowanych komórek ponownie zawieszonych w pożywce przy 1θ5 komórek/ml, dodano do każdej studzienki. Komórki docelowe Raji i RJ2.2.5 oznakowano w ten sam sposób jak komórki HeLa. Płytkę do mikromianowania wirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Przy końcu okresu inkubacji, komórki w każdej studzience ponownie zawieszono przez delikatne pipetowanie, próbkę usunięto, w celu ustalenia całości odnośnych obliczeń i płytkę do mikromianowania wirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Równe ilości po 100 pl supernatantu usunięto i liczono w liczniku scyntylacyjnym promieni gamma. Procent zabicia korygowano w stosunku do frakcji zakażonych komórek docelowych (zwykle 50-90%), zmierzonej przez cytometrię przepływową. Dla zakażonych komórek efektorowych współczynnik efektor : cel korygowano w stosunku do procentu zakażonych komórek (zwykle 20-50% dla doświadczeń z chimerycznym receptorem CD4 i > 70% dla doświadczeń z chimerycznym receptorem CD16).

Mutageneza in vitro sekwencji łańcucha ζ

Aby utworzyć punkt mutacji w resztach aminokwasowych 11 i/lub 15 sekwencji ζ, wytworzono syntetyczne startery oligonukleotydowe przebiegające od miejsca BamHI w górę domeny transbłonowej ζ i przekształcającego natywną resztę 11 ζ z Cys w Gly (C11G) lub resztę 15 z Asp w Gly (D15G) lub obie (C11G/D15G) oraz użyto w reakcjach PCR, w celu wytworzenia mutowanych fragmentów, które ponownie wtrącono do konstrukcji Ο')4:ζ dzikiego typu.

Aby utworzyć delecję ζ, sekwencje cDNA ζ namnożono drogą PCR, przy użyciu syntetycznych starterów oligonukleotydowych przeznaczonych do tworzenia kodonu przestankowego (UAG) po resztach 50, 59 lub 65. Startery zawierały miejsce rozszczepienia dla enzymu NotI wcięte pięć lub sześć reszt od końca 5', zwykle w sekwencji o postaci CGC GGG CGG CTA (SEQ ID Nr: 11), gdzie trzy ostatnie reszty odpowiadają antykodonowi przestankowemu. Po sekwencjach NotI i kodonu przestankowego następowało 18 lub więcej reszt komplementarnych do pożądanego końca 3' fragmentu. Otrzymane w efekcie chimery oznaczono odpowiednio CD16:ZY51 , CD16:ZEó0* i CD16:ZD66 . Miejsce BamHI w górę domeny transbłonowej i miejsce NotI użyto do utworzenia fragmentów, które ponownie wprowadzono do konstrukcji CD16:Z dzikiego typu. Utworzono monomeryczne chimery ζ, drogą uwalniania transbłonowych i błonowych proksymalnych sekwencji wewnątrzkomórkowych przez trawienie BamHI i SacI konstrukcji CD4:Z Asp” i Cys^-, opisanych powyżej i wtrącenie fragmentu do konstrukcji odpowiednio CD16:ZE60* i CD16:ZD66*.

Konstruowanie trójdzielnej chimery €ρ16:7:ζ (48-65) i €ϋ16:7:ζ (48-65)

Aby wytworzyć konstrukcję CD16:ZD66 , sekwencję cDNA ζ, odpowiadającą domenie transbłonowej i 17 następujących reszt domeny cytoplazmatycznej zamieniono na odpowiadającą domenę transbłonową i cytoplazmatyczną, otrzymaną z cDNA CD5 i CD7. Utworzono fragmenty CD5 i CD7, na drodze reakcji PCR, stosując współbieżne oligonukleotydy obejmujące miejsce rozszczepienia restrykcyjnego BamHI i odpowiadające regionowi ściśle w górę, odpowiednio, domeny CD5 i CD7 i następujące odwrotne oligonukleotydy, zachodzące odpowiednio na sekwencje CD5 i CD7 oraz sekwencję ζ, która zawierała miejsce restrykcyjnego rozszczepienia SacI.

CD5:Z : CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID Nr: 12)

CD7:Z: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID Nr: 13). *

Produkty CD5 i CD7 PCR trawiono przy użyciu BamHI i SacI i łączono do CD16:Z E60* trawionego przy użyciu BamHI i SacI i zmieniając sekwencję ζ od BamHI do SacI na fragment CD7. Aby zrobić konstrukcję CD16:CD5 i CD16:CD7, otrzymano na drodze PCR

181 085 fragmenty CD5 i CD7, przy użyciu oligonukleotydu, zawierającego miejsce restrykcyjnego rozszczepienia NotI i kodującego kodon przestankowy (UAA) po reszcie Gln416 i Ala193, odpowiednio, CD5 i CD7. Fragmenty PCR CD5 i CD7 trawiono przy użyciu BamHI NotI i wtrącono do konstrukcji CD16:Z Asp66 .

Mutageneza in vitro reszt N-terminalnych w motywie przekazującym sygnał cytolityczny łańcucha ζ

Syntetyzowano i użyto w reakcji PCR syntetyczne oligonukleotydowe startery położone od miejsca SacI wewnątrz motywu ζ i przekształcające natywną resztę 48 z Asn na Ser (N48S), resztę 50 z Leu na Ser (L50S) i resztę 51 z Tyr na Phe (Y51F), w celu utworzenia fragmentów, które ponownie wprowadzono do konstrukcji CD16:7d (48-65) dzikiego typu.

Mutageneza in vitro reszt C-terminalnych w motywie, przekazującym sygnał cytolityczny łańcucha ζ

Syntetyzowano i użyto w reakcji PCR syntetyczne oligonukleotydowe startery położone od miejsca NotI 3' do kodonu przestankowego i przekształcające natywną resztę 60 z Glu na Gin (E60Q), resztę 61 z Glu na Gin (E16Q), resztę 62 z Tyr na Phe lub Ser (Y62F lub Y62S) i resztę 63 z Asp na Asn (D63N), w celu utworzenia fragmentów, które sklonowano do konstrukcji CD16:Z D66* dzikiego typu z miejsca BamHI do miejsca NotI.

Konstruowanie chimer CD16:7:Z (33-65), CD16 7:ζ (71-104), CD16:7:Z (104-137)

Otrzymano transbłonowy fragment CD7, posiadający miejsca MluI i NotI w miejscu połączenia domen transbłonowej i wewnątrzkomórkowej, na drodze PCR, przy użyciu oligonukleotydu o następującej sekwencji: cGc GGG GCG GCC ACG CGT cCt CGC CAG CAC ACA (SEQ ID Nr: 14). Otrzymany w wyniku PCR fragment trawiono przy użyciu BamHI i NotI i ponownie wtrącono do konstrukcji CD16:7:Z (48-65). Otrzymano fragmenty ζ, kodujące reszty 33 do 65, 71 do 104 i 104 do 137, na drodze reakcji PCR, przy użyciu par starterów, zawierających miejsca MluI na końcu 5' starterów współbieżnych i kodonów przestankowych, po których następują, miejsca NotI przy końcu 5' starterów odwrotnych. W każdym przypadku miejsca restrykcyjne są wcięte sześć reszt od końca 5' startera, aby zapewnić rozszczepienie enzymem restrykcyjnym.

ζ33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID Nr: 15) ζ71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT CAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID Nr: 16) oraz ζ104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID Nr: 17). Konstruowanie mutantów z delecją FcRyllA

Mutanty z karboksyloterminalną delecją FcRylLA skonstruowano na drodze PCR, w taki sam sposób jak dla konstrukcji o pełnej długości, przekształcając sekwencje, kodujące tyrozynę w pozycji 282 i 298, na kodon przestankowy (TAA). Utworzono delecje N-terminalne, przez namnożenie fragmentów kodujących coraz mniej domen wewnątrzkomórkowych, na drodze PCR, przy użyciu oligonukleotydów, które umożliwiały wtrącenie otrzymanych fragmentów między miejsca restrykcyjne MluI i NotI we wcześniej utworzonym plazmidzie ekspresji, kodującym domenę zewnątrzkomórkową CD16, dołączoną do domeny transbłonowej CD7, przy czym ta ostatnia kończy się w miejscu MluI i skrzyżowaniu między domeną transbłonową i wewnątrzkomórkową.

INNE POSTACIE REALIZACJI

Przykłady opisane powyżej pokazują, że agregacja chimer ζ, η lub γ wystarcza do zainicjowania cytolitycznej odpowiedzi komórki efektorowej w komórkach T. Znany zakres ekspresji ζ, η i γ, obejmujący limfocyty T, naturalnych zabójców komórek, granulocyty zasadochłonne, makrofagi i komórki tuczne sugeruje, że zachowane motywy sekwencji mogą współdziałać z aparatem czuciowym, powszechnym u komórek pochodzenia hematopoetycznego i że w ważnym składniku obrony gospodarza w układzie odpornościowym mogą pośredniczyć agregacje receptorowe.

Siła odpowiedzi cytolitycznej i brak odpowiedzi na komórki docelowe, posiadające receptory MHC klasy II pokazuje, że chimery oparte na ζ, η lub γ tworzą podstawę do genetycznej interwencji przy AIDS, poprzez adoptywną immunoterapię. Szeroki rozkład endogenicznego ζ i γ i fakt, że receptory Fc połączone z γ pośredniczą w cytotoksyczności w różnych typach komórek (Fanger i in., Immunol. Today 10: 92-99 (1989)) pozwala wziąć pod uwagę

181 085 różnorodność komórek do tego celu. Np. granulocyty neutrofilowe, które posiadają bardzo krótki okres życia («4 h) w krwiobiegu i są silnie cytolityczne, są atrakcyjnymi komórkami docelowymi dla ekspresji chimer. Infekcja neutrofilów HIV prawdopodobnie nie da w efekcie uwolnienia wirusa, a obfitość tych komórek (przeważająca ilość leukocytów) powinna ułatwiać obronę gospodarza. Inną atrakcyjną możliwością dla komórek gospodarza są dojrzałe komórki T, populacja obecnie dostępna dla inżynierii retrowirusowej (Rosenberg, Sci. Am. 262: 62-69 (1990)). Z pomocą rekombinantów IL-2, populacje komórek T mogą rosnąć w hodowli z odpowiednią łatwością, a powiększone populacje zwykle posiadają ograniczony okres życia po ponownym dodaniu (Rosenberg i in., N. Engl. J. Med. 323: 570-578 (1990)).

W odpowiednich warunkach, rozpoznanie HIV przez komórki, wykazujące ekspresję chimer CD4 powinno także stanowić mitogeniczny bodziec, dający możliwość dynamicznej odpowiedzi przez populację uzbrojonych komórek na obciążenie wirusem. Chociaż skupiliśmy się tu na zachowaniu białek połączonych w cytolitycznych limfocytach T, ekspresja chimer w limfocytach pomocniczych mogłaby dostarczyć mobilizowanego przez HIV źródła cytokin, które mogłoby przeciwdziałać zanikowi podzbioru komórek pomocniczych w AIDS. Poprzedni opis kilku schematów dotyczących budowania odporności na infekcję na etapach innych niż penetracja wirusa (Friedman i in., Nature 335: 452-454 (1988); Green i in., Cell 58: 215-223 (1989); Malim i in., Cell 58: 205-214 (1989); Trono in., Cell 59: 113-120 (1989); Bnonocore i in., Nature 345: 625-628 (1990)) sugeruje, że komórki, posiadające chimery CD4 możnaby przeznaczyć do udaremniania produkcji wirusa przez ekspresję odpowiednich czynników, mających wewnątrzkomórkowe miejsce działania.

Zdolność przenoszenia sygnałów do limfocytów T przez autonomiczne chimery nadaje także zdolność do regulacji limfocytów zbudowanych przy użyciu retrowirusów in vivo. Bodziec sieciowania, w którym pośredniczą np. specyficzne przeciwciała IgM, zbudowane aby usuwać domeny związane z dopełniaczem, może pozwolić na zwiększenie ilości takich limfocytów in situ, podczas gdy traktowanie podobnymi specyficznymi przeciwciałami IgG (np. rozpoznającymi różne aminokwasy wbudowane w chimeryczny łańcuch) mogłoby zmniejszyć zbudowaną populację. Ponadto, przeciwciała IgM anty-CD4 nie wymagają dodatkowego sieciowania, w celu mobilizacji wapnia w komórkach Jurkat, wykazujących ekspresję chimer Ο')4:ζ. Zdolność regulowania populacji komórek bez uciekania się do powtarzanego dpzaustrojpwrgo namnażania, może zasadniczo poszerzyć zakres i skuteczność aktualnych zastosowań proponowanych dla genetycznie konstruowanych komórek T.

Chociaż opisywano wynalazek łącznie z jego specyficznymi postaciami realizacji, zrozumiałe jest, że możliwe są dalsze modyfikacje i zamierza się odnieść w tym zgłoszeniu do odmian, zastosowań lub adaptacji wynalazku i włączenia takich odejść od niniejszego opisu, jak to się przyjmuje w tej dziedzinie, do której wynalazek należy i jakie można dołączyć do podstawowych cech przedstawionych tu wcześniej, co następuje w zakresie załączonych zastrzeżeń.

181 085

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Seed, Brian i in.

(ii) TYTOŁ WYNLAAKKY : KOMÓKKI ZAKAŻONE HIV BĘDĄCE OBIEKTEM CYTOLIZY PRZEZ KOMÓRKI, POSIADAJĄCE CHIMERYCZNY RECEPTOR CD4 (iii) LICZBA SEKWENCJI: 52 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Fish & Richardson P.C.

(B) ULICA: Franklin Street (C) MIASTO: Boston (D) STAN: MA (E) KRAJ: USA (F) KOD: 02110-2804 (v) POSTAĆ ODCZCTCWALNA DLA KOMPUTERA:

(A) TCP NOŚNIKA: Dyskietka 3.5”, 1,44 Mb (B) KOMPUTER: IBM PS/2 Model 50Z lub 55SX (C) SYSTEM OPERACYJNY: IBM P.C. DOS (Wesja 3.30) (D) PROGRAM: Wordperfect (Wersja 5.0) (vi) DANE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/394,388 (B) DATA ZŁOŻENIA: 24 luty 1995 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/284,391 (B) DATA ZŁOŻENIA: 2 sierpnia, 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/195,395 (B) DATA ZŁOŻENIA: 14 luty, 1994 (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 07/847,566 (B) DATA ZŁOŻENIA: 6 marca, 1992 (viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/POŚREDNIKU (A) NAZWISKO: Karen F. Lech, Ph.D (B) NUMER REJESTRACYJNY: 35,238 (C) NUMER ŚWIADECTWA/POZWOLENIA: 00786/27001 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (617) 542-5070 (B) TELEFAKS: (617) 542-8906 (C) TELEX: 200154 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 1:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1728 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomcwe) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 1:

181 085

GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCCAGCTGAGT	1650
AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GAAGCCATGG	1700
GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA	1128
(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 2:
(i) CECHY SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1389 par zasad
(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: podwójna
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe)
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 2:
ATGAACCGGG GAGGCCCGGT TAOGCACTTG TCGCAACTTCC	50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGT<T3TGCTG TCCCAAAAAG	107
CGGATACAGT GGAACTGACC GGGACAGCTG CCCAGAGGJGA GAGCCATACCAA	150
TTCCACTCGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG A‘ICΓ¢GKGGAA ATOAGGGCTC	200
CTTCTTA-ACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCG GACTCiAGGA	250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCG£TCGGC GlCCΓGCGGCAί	300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CAGCGGGGAA GKTJACAJACC AGJAAGJACKJA	330
GGTGCAATTG CTAGTCTTCG GATTGACTGC CJUACTCTrGAC ACCCGCC:GGΪC	400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CGGACCGGGG AGAGCCCCCC TTCTAGTAGC	450
CCCTCAGTOC AATCTAOGAG GCCAAGGGGG AWAAtCATAC A«XXXXGiA^	507
GACCCGCGCC GGGGCGCAGC GGGAGCGCCA GGATAGTCGC ACCTGGACAT	0 07
GCACTCTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGGGG AGCACGGAACΓ ACACGCGGGG	607
aTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATATAA AAtC^GtCGKKK^Gt	650
ACAGGTGGAG GGCGCCTGCC CACGCGCCGG TAGAGCAGGA	717
GCAGTGGCGA GCGGGGGGGG CAGGCGGAGA	710
GGGAGCACCG GTGACCGGAA GAACAAGGAA GTAGAGGGAG AACGGGGTAC	887
CCAGGACCCT ARGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCAGGCGCAC GGCGGGGCCC	880
GGGCCCAGGG CTTGGGGCAG GAGGCGGGGT CTCTAGACAC	907
CTTGAGCCGA ACACCAACAA GGGAGCGGCG GAACAATGCC GGAAGAAGAC	950
ACACGGCCCG CAACGGGAAC ACCCGGGACG CGGGGTGCAG AGAAGACCCG	1077
GGGCCCGGCA ACGACGGGGA AACGGAACCG TGGAACACCG CAACGAGAAC	1070
AGGGGAACAC AAAAGCAAGC AAGAGAAGGG CGGTACCGGG AAAGGAAAAC	1107

181 085

GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150

TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC 1200

TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250

GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300

GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG 1350

ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 3:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1599 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii) TYP	CZĄSTECZKI:	DNA (genomowe)
(xi) OPIS	; SEKWENCJI:	SEQ ID Nr:	3:
ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	9150

181 085

GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	TTTGGAGTGG	GGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGACAAA	GGAGGCAAAG	1050
gtctcgaagc	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	TAGGCCCTGG	AGCAAAAGTG	1100
GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG	ACTCGGGACA	GGCCTTGCTG	GAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	ACACACAAGA	CCCAAAACTA	1200
TGCTACCTGC	TGGATGGAAT	CCTCTTCATC	ATAGTGGCGG	TCTCACTGCG	1250
CTTGTTCCTG	AGAGTGAAGT	TCAGCAGGAG	GCAGAGCCCG	CCGCGTACCA	1300
AGCAGGGCCA	GAACCAGCTC	TATAACGAGC	CGATCTGAAG	CAGAAGAGAG	1350
GAGTACGATG	TTTTGGACAA	GAGACGTGGC	CAAACCCTCA	AGTAGAAAAA	1-400
AAAGCCGAGA	AGGAAGAACC	CTCAGGAAGG	CTGTACAATG	AGCTACGAGA	1-450
AAGATAAGAT	GGCGGAGGCC	TACAGTGAGA	TAGGGTCGAG	GGCGAGCGCG	1500
CGGAGGGGCA	AGGGGCACGA	TGGCCTTTAC	AAGGTCTCGA	TACCGCCACA	1550
CAAGGACACC	TACGACGCCC	TTCACATGCA	GCCCTGCCCG	CTTCGTTAA	1599

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 4:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 575 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 4:

Met 1

Asn

Arg

Gly

Val 5

Pro Phe Arg His Leu Leu 10

Leu

Val

Leu

Gln 15

Leu

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gln

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gln

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gln·

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gln

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gln

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gln

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gln

Gly

Gln

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

He

Gln

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gln

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gln

Asn

Gln

Lys

180

185

190

181 085

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gln

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gln

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gln

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gln

Asp

Pro

Lys

Leu

260

z

265

270

Gln

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gln

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gln

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gln

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gln

Leu

Gln

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gln

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gln

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Asp

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Tyr

Leu

Arg

Ala

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Thr

Ala

420

425

430

Asn

Leu

Gln

Asp

Pro

Asn

Gln

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Arg

Ala

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Lys

Gln

Arg

Asn

Pro

Gln

Glu

Gly

Val

Tyr

465

470

475

480

Asn

Ala

Leu

Gln

Lys

Asp

Lys

Met

Pro

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

485

490

495

Thr

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gln

500

505

510

Asp

Ser

His

Phe

Gln

Ala

Val

Gln

Phe

Gly

Asn

Arg

Glu

Arg

Glu

515

520

525

Gly

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ala

Arg

Pro

Lys

Gly

530

535

540

Glu

Ser

Thr

Gln

Ser

Gln

Ser

Cys

Ala

Ser

Val

Phe

Ser

Ile

555

550

565

560

Pro

Thr

Leu

Trp

Ser

Pro

Trp

Pro

Ser

Gln

Leu

565

570

575

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 5:

(1) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 462 aminokwasów 'B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 5:

181 085

Met Asn Arg Gly 1

Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln

Leu

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gln

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gln

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gln

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gln

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gln

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gln

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gln

Gly

Gln

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gln

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gln

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gln

Asn

Gln

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gln

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gln

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gln

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gln

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gln

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gln

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gln

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gln

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gln

Leu

Gln

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gln

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gln

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Gln

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Ile

Leu

Asp

Ala

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly.

Ile

Val

Leu

Thr

405

410

415

Leu

Tyr

Cys

Arg

Leu

Lys

Ile

Gln

Val

Arg

Lys

Ala

Asp

Ile

Ala

420

425

430

Ser

Arg

Glu

Lys

Ser

Asp

Ala

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Arg

Asn

435

440

445

Gln

Glu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Lys

His

Glu

Lys

Pro

Gln

450

455

460

462

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 6:

(i) CECHY SEKWENCJI:

181 085 (A) DŁUGOŚĆ: 532 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 6:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

Val

Leu

Gln

Leu

1

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gln

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lye

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gln

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gln

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gln

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gln

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gln

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Aen

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gln

Gly

Gln

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gln

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gln

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gln

Asn

Gln

Lys

Lye

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gln

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gln

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gln

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gln

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gln

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gln

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gln

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gln

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gln

Leu

Gln

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gln

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gln

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Asp

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

420

425

430

181 085

Tyr

Gln

Gly

Gln

Asn

Gln

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Asp

Lys

Arg

Gly

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

Gln

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

465

470

475

480

Glu

Leu

Gln

Lys

Asp

Lys

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Met

485

490

495

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gln

Gly

500

505

510

Leu

Ser

Thr

Ala

Thr

Lys

Asp

Thr

Tyr

A3p

Ala

Leu

His

Met

Gln

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Arg

530 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 7:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 7:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 8:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 8:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 9:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 9:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC

181 085 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 10:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 10:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 11:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 11:

CGCGGGCGGC CGCTA 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 12:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 12:

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 13:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 48 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 13:

181 085

GGCAGAGAGG TGGTTATAAC AGTAATTTAC GACGACCGGG TGAGCGGA 58 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 15:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 15:

GGGAAGAGAA GGACGGGTGG TGAGGCGCAC ACA 33 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 10:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 10:

CAGAAAAGGC GTTGGAAGGA TGGTGACGCA CAGCGA 36 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 10:

(i) CECHY SEKWENCJI:

GGCAGACGAG GTAAGGGTAA ACTAGGGAGA AAG 33 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 17:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 17:

181 085

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 18:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 18:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 19:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 19:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 20:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 20:

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAGCTCTTCACCG (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 21:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 zasady (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 21:

181 085

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 22:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 22:

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 23:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 23:

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 24:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 171 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 24:

Met

Glu

His

Ser

Thr Phe 5

Leu

Ser

Gly Leu Val 10

Leu

Ala

Thr

Leu 15

Leu

Ser

Gln

Val

Ser

Pro

Phe

Lys

Ile

Pro

Ile

Glu

Leu

Glu

Asp

Arg

20

25

30

Val

Phe

Val

Asn

Cys

Asn

Thr

Ser

Ile

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Thr

Val

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Ser

Asp

Ile

Thr

Arg

Leu

Asp

Leu

Gly

Lys

Arg

Ile

50

55

60

Leu

Asp

Pro

Arg

Gly

Ile

Tyr

Arg

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ile

Tyr

Lys

65

70

75

80

Asp

Lys

Glu

Ser

Thr

Val

Gln

Val

His

Tyr

Arg

Met

Cys

Gln

Ser

Cys

85

90

95

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Gly

Ile

Val

Thr

Asp

Val

100

105

110

Ala

Ile

Thr

Leu

Ala

Leu

Gly

Val

Phe

Cys

Phe

Ala

Gly

His

115

120

125

181 085

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140

Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165 170 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 25:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 182 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 25:

Met	Glu	Gln	Gly	Lys c	Gly	Leu	Ala
Leu	Gln	Gly	Thr 20	5 Leu	Ala	Gln	Ser
Val	Tyr	Asp 35	Tyr	Gln	Glu	Asp	Gly 40
Glu	Ala 50	Lys	Asn	Ile	Thr	Trp 55	Phe
Leu 65	Thr	Glu	Asp	Lys	Lys 70	Lys	Trp
Pro	Arg	Gly	Met	Tyr 85	Gln	Cys	Lys
Leu	Gln	Val	Tyr 100	Tyr	Arg	Met	Cys
Ala	Thr	Ile 115	Ser	Gly	Phe	Leu	Phe 120
Leu	Ala 130	Val	Gly	Val	Tyr	Phe 135	Ile
Ser 145	Arg	Ala	Ser	Asp	Lys 150	Gln	Thr
Gln Asn	Pro Gln	Leu Leu	Lys Arg 180	Asp 165 Arg	Arg Asn	Glu	Asp

Val	Leu 10	Ile	Leu	Ala	Ile	Ile 15	Leu
Ile 25	Lys	Gly	Asn	His	Leu 30	Val	Lys
Ser	Val	Leu	Leu	Thr 45	Cys	Asp	Ala
Lys	Asp	Gly	Lys 60	Met	Ile	Gly	Phe
Asn	Leu	Gly 75	Ser	Asn	Ala	Lys	Asp 80
Gly	Ser 90	Gln	Asn	Lys	Ser	Lys 95	Pro
Gln 105	Asn	Cys	Ile	Glu	Leu 110	Asn	Ala
Ala	Glu	Ile	Val	Ser 125	Ile	Phe	Val
Ala	Gly	Gln	Asp 140	Gly	Val	Arg	Gln
Leu	Leu	Pro 155	Asn	Asp	Gln	Leu	Tyr 160
Asp	Gln 170	Tyr	Ser	His	Leu	Gln 175	Gly

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 26:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 220 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 26:

Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe 5 10 15

181 085

Leu	Ser	Tyr	Ala 20	Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala Leu Arg Val	Glu
25	30
Gly	Gly	Pro	Pro	Ser Leu Thr Val Asn	Leu Gly Glu Glu Ala Arg	Leu
		35		40	45
Thr	Cys	Glu	Asn	Asn Gly Arg Asn Pro	Asn Ile Thr Trp Trp Phe	Ser
	50			55	60
Leu	Gln	Ser	Asn	Ile Thr Trp Pro Pro	Val Pro Leu Gly Pro Gly	Gln
65				70	75	80
Gly	Thr	Thr	Gly	Gln Leu Phe Phe Pro	Glu Val Asn Lys Asn Thr	Gly
				85	90 95
Ala	Cys	Thr	Gly	Cys Gln Val Ile Glu	Asn Asn Ile Leu Lys Arg	Ser
			100	105	110
Cys	Gly	Thr	Tyr	Leu Arg Val Arg Asn	Pro Val Pro Arg Pro Phe	Leu
		115		120	125
Asp	Met	Gly	Glu	Gly Thr Lys Asn Arg	Ile Ile Thr Ala Glu Gly	Ile
	130			135	140
Ile	Leu	Leu	Phe	Cys Ala Val Val Pro	Gly Thr Leu Leu Leu Phe	Arg
145				150	155	160
Lys	Arg	Trp	Gln	Asn Glu Lys Phe Gly	Val Asp Met Pro Asp Asp	Tyr
				165	170 175
Glu	Asp	Glu	Asn	Leu Tyr Glu Gly Leu	Asn Leu Asp Asp Cys Ser	Met
			180	185	190
Tyr	Glu	Asp	Ile	Ser Arg Gly Leu Gln	Gly Thr Tyr Gln Asp Val	Gly
		195		200	205
Asn	Leu	His	Ile	Gly Asp Ala Gln Leu	Glu Lys Pro
	210			215	220
	(2)	INFORMACJE O SEQ ID Nr: 27:
		(i)	CECHY SEKWENCJI:
		(A) DŁUGOŚĆ: 228 aminokwasów

(B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)

TYP

CZĄSTECZKI:

aminokwas

(xi)

OPIS SEKWENCJI:

SEQ

ID

Nr:

27:

Met

Ala

Thr

Leu

Val

Leu

Ser

Met

Pro

Cys

His

Trp

Leu

Phe

5

10

15

Leu

Phe

Ser

Gly

Glu

Pro

Val

Pro

Ala

Met

Thr

Ser

20

25

30

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gln

Gly

Ser

Pro

Cys

Ser

Gln

Ile

Trp

Gln

35

40

45

His

Pro

Arg

Phe

Ala

Lys

Arg

Ser

Met

Val

Lys

Phe

His

50

55

60

Cys

Tyr

Thr

Asn

His

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ser

Gln

Pro

Gln

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Arg

Ile

Val

Gln

85

90

95

Thr

Gln

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Gln

Asn

Ile

Gln

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Asn

Gly

Ile

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gln

Lys

Cys

Asp

Ser

Ala

Asn

115

120

125

His

Asn

Val

Thr

Asp

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

130

135

140

Ser

Thr

Leu

Asp

Gln

Leu

Lys

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

Asp

Gly

Ile

145

150

155

160

Ile

Leu

Ile

Gln

Thr

Leu

Ile

Leu

Phe

Ile

Val

Pro

Ile

165

170

175

181 085

Phe

Leu Leu Leu 187

Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu

Glu Asp

180

157

His

Thr

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Ile

Asp

Gln

Thr

Ala

Thr

Tyr

Glu

Asp

150

277

270

Ile

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Val

Lys

Trp

Ser

Val

Gly

Glu

His

217

210

227

Pro

Gly

Gln

Glu

220 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 28:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1375 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ IG Ng:

ACGTAGGTAC ACCAGCAGAG

CCGTTGTAGG AGCGGCAGTC CCG'GTA'GGCA

GCAGACGCGA AGACAGCGAA GAGTCCGG:'GGΓ

GAGCAGTAAG ACGGCGCCGC GCAG;CAG.CTC

AAGCACAAAA GAACGAGAAG GGAACAG;ΆCC

ACACCGCCAC GGGGCGTAAA AJCACC’CCCG

CGGCGAACGG CGGGTGAAGG AlA^t^T^CCC^T

ACGGCACACC ACCAGGTTGG OGACACC^O!

ACAGGGGCAA AGAACAACGG CAGATACTCA

CAACGGCAAC AGGAGCAGGG CTATTGTTCG

CCGCCGGGAG T'GCCAGGAGA GAGCCCGACC

GAGGAAGAAC GGCGGAGGAC AATCTAGAAG

AAAAGAAAAC ACGGCGCGCC GTGTCTCAGC

CCGTAACGCG GGCGGAGGGG GCAGAGtCCAG

CACGCGGAGA AGAGGAAGGG

CAACGGAAAC AGCAGGAACA GGCT:'GGCGCC

CCGCGACGAA AGAAGGGGGA GCT^C^TTC^^T^CT;

GGGCCCAGGG TAACGGCGGG TTGACCCGGA

ACCGGAGGCG CGCGACCCCG AAGCACCAGA

GACCTGAGGG GAGGGGAAAG CTTGGACCAG

CACCGGAAGC CGGAACGGAA A^ACCGCAAC\

2 8:
CGCGACCCCA	GA(A;CCCGrGC	5(7
GGCA;CCCCGG	CCTCCCTCK	107
GTAA¢GCGG'G	CGGCΓ¢AJTGC	107
GGAA?AC.CGA	agtggtgcctg	277
GGAA<GC;ίGG’	CCCAGAAGAA	207
CCGCACGCCC;	A'TGCT¢AAAAC	307
CCGΛCCG’G£C\	TGATCG<GACCG	350
CACG'GCCCCC	TGATCATCAA	477
(GCCGGTG^C^	σΤί^ΑΑΑΑΑΟ	450
GAΊGGACGGC	CGc^ccrccrGAC	500
CTGACCGTGAΪ	AGAGCCCCCC	500
TCGCCCAAAT	AAAAACATAC	600
GGAACAGGCG	CG3ATAGT<A;C	650
ACCΐ?CCAίATA	AGTT<GCAC^T	700
CGGGGCAGCA	GTCTATiAAGA	750
CACGCGACGT	GACAGTTGAA	800
CGCGCCAACG	(AAACTTCCGΓC	807
CAACCACGAC	GGGGCGGGAA	907
TGAGAGACGA	GCTCCCGCTC	907
GGCGAGTACG	CTGGGAAACCT	1077
CGGGAGCGGC	GAAGTGAACC	1007

181 085

TGGTGGTGAT	GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGGG	1100
TGGGGACCCA	CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TCGAGGA.CCA	1150
GGAGGCAAAG	GTCTCGAAGC	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	CC^GA^C^C^CC^^	1200
AGGCGGGGAT	GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG	ACTCGGGACA	TCTCCCTCCT	1250
GAATCCAACA	TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TCTACC;CCAA	1300
TCCC					1304

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 29:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ?: 398 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas

(xi)

OPIS SEKWENCJI: SEQ ID

Nr:

29:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

Val

Leu

Gln

Leu

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gln

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gln

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gln

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gln

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gln

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gln

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

Hrs

Leu

Gln

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gln

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gln

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gln

Asn

Gln

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gln

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gln

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gln

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gln

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gln

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gln

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gln

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

181 085

Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr

305 310 315 320

Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro

325 330 335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350

Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365

Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro

385 390 395 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 30:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 719 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 30:

CΟCTCTTTCC CAACCACCCG C''CC''CCG CCCΑCCCCCG GATOCCCTGC 50

Ο'TTTΟTCTC CGΟTCCCCTC ΟTCCTCAΟTT CCCCCCCTCG CCTCCCTCGG 100

CAAGGCCACA A^AACCG^ GATCCCTTTΓ C‘T^1C^(G^'T^<C 150 ^CftAd^C GCTCCTCCCA CCGCCCCTCC ACC'CACCCG AGT<GCT;<CrG 200

GCCAAAAAAC GCCCT'0'CT GA^dACC C CTCCCCCTTC CCCAC^G^ 250

CCCCCTCCAC TTΟΟ'ΟTCG' CAΑCTCCCCG ATTC'TAAC;AC 300

CTCACCCCTC CTTCTTAACT CAGCTCCCTC TGATCGCGCT 350

CCCTCCACAC CCCCCCTTTC GCC0CΑCCCG ACTT0000CC TGATCATCCA 400

CC'TCTT'CC 'TCCC'CCCT CTCTCTCCCG 450

CC''CG'CG' CCTC0''TTC C CTTCCCTCC C CAACTCOTGAC 500 'CCCACC^O TTC'CCCCCC 'GCOrGACCC TCCCCTTCCG AGAGCCCCCC 550

Τ^Τ'^'^ 00010^3^0 CTCTCCCCCC CCCCCCCCTC /'''''ΟΑΤΑΟ 600

CGGCCCCG'' ^00010100 1^010^0 C CCCCCTCCCG <CCATAGT<CCC 650

CCΟTGCCΟCT C0'0TCT0TT 0CGCAC0CCC CACCCCTCCG ΑσΊΚΟ 700

CC'Ο'TΟCTC CTCΟT'CΟT 719 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 31:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 203 (B) TYP: aminokwas

181 085 (D) TOPOLOGIA: linicwa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (ii) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 31:

Met Asn Arg Gly

Val 5

Pro

Phe Arg His Leu 10

Leu

Leu Val

Leu

Gln 15

Leu

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gln

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gln

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gln

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gln

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gln

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gln

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gln

Lys

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gln

Gly

Gln

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gln

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gln

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gln

Asn

Gln

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

195 200 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 32:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 768 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy

(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID Nr:	3 2:
GCTAGCAGAG	CCCAAATCTT	GTGACAAAAC		CCACCGTGCC	50
CAGCACCTGA	ACTCCTGGGG	GGACCGCCAG	CCTTTCG’CG'C	CCCCCCCAAA	100
CCCAAGGACA	CCCTCATGAT	CTC^CC^C^C^G^CC	GCGCGAGGCG	catgcgt<gst	150
GGTGGACGTG	AGCCACGAAG	ACCCCGAACC	CGCGAACGAC	tggtacgtcgj	200
ACGGCGTGGA	GGTGCATAAT	GCCCCAACAA	ACAGGCGGAA	DG3AGCAGTAC	250
AACAGCACGT	ACCGGGTGGT	CAGCCCCCGC	GCGGCCCCGA	ACCAGGACCTG	300
GCTGAATGGC	AAGGAGTACA	AGCGCAGLCCC	AGC:GGCίCGCA.	GCCCTCCCAG	350
CCCCCATCGA	GAAAACCATC		AACAAGAGCC		400

181 085

CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AGAACCA<G3T 450

CAGCCTGACC CGCTTCCCCA ACCTCCTCGA TTTACTCGAC ATCGCArT:C; 500

AGCCCCAGAC CGACGGGTAC TCCACGGTGA ACAAGACGTC CACGCCCTTC 550

GCCTCCCATC CTCGCCCTCC CCACCTCCAC GTGCCAACTC TCATCGTιCCA 600

TAAGGGTACC CCCTACTGCC CAGAGTTCCT CTGCCCCACC GTGATGCATG 650

GCCCCTCCCA TAGCCATCAC TCTGCGACGA CCCACTCCTT GTCTCCCC:CGC 700

CCCTGGTCCC ATCACATCCC CCCCACCTCC GCGAACGCCG ΑσΟΓΜΑΟ^ 750

CCCCCCCACG ATCCATCC 768 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 33:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 254 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 33:

Glu

Pro

Lys

Ser

Cye

Asp

Lye

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

1

5

10

15

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

Val

Ser

Hie

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

50

55

60

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gln

65

70

75

80

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

100

105

110

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

•115

120

125

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

130

135

140

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Leu

Gln

Leu

Asp

Glu

Thr

Cys

Ala

Glu

225

230

235

240

Ala

Gln

Asp

Gly

Glu

Leu

Asp

Gly

Leu

Trp

Thr

Asp

Pro

245

250

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 34:

181 085 (i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 174 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy

(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID Nr:	44:
CCAAGGGCCT	CTGCCCTCCC	TGCCCCACCG	ACAGGCTCCG	CCCTCCCTGA	50
CCCGCAGACA	GCCTCTGCCC	TCCCTGACCC	GCCAGCAGCC	TCTGCCCTCC	100
CTGCGGCCCT	GGCGGTGATC	TCCTTCCTCC	TCGGGCTGGG	CCTGGGGGTG	150
GCGTGTGTGC	TGGCGAGGAC	GCGT			174

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 315:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 58 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas

	(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEQ ID	Nr:	35:
Pro Arg	Ala	Ser Ala Leu Pro Ala Pro	Pro	Thr Gly Ser Ala Leu Pro
1		5	10	15
Asp Pro	Gln	Thr Ala Ser Ala Leu Pro	Asp	Pro Pro Ala Ala Ser Ala
		20 25		30
Leu Pro	Ala	Ala Leu Ala Val Ile Ser	Phe	Leu Leu Gly Leu Gly Leu
	35	40		45
Gly Val	Ala	Cys Val Leu Ala Arg Thr	Arg
50		55
(2)	INFORMACJE 0 SEQ ID Nr: 36:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 345 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: kwas nukleinowy

(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID Nr:	36:
ACGCGTTTCA	GCAGGAGCGC	AGAGCCCCCC	GCGTACCAGC	ACGGGCCAGGAA	50
CCAGCTCTAT	AACGAGCTCA	ATCTAGCACG	AAGAGACGAG	TACGATGTTT	100
TGGACAAGAG	ACGTGGCCGG	GACCCTGAGA		GCCGAGAACGG	150
AAGAACCCTC	AGGAAGGCCT	GTACAATGAA	CTGCAGGAAG	ATAAGATCG3C	200

181 085

CACAACCTCC	AGTGAAATTG	CAATACCACA	CGAGCCCCGG	ACAGACAAGA	250
CACACAATGA	CCTTTACCAA	CATCTCAGTA	CAACCACCAA	CACCACCTAC	300
CCCACCCTTC	ACATGCAGGC	CCTGCCCCCT	CACTAACGCG	GCCGO	345

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 37:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 111 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: aminokwas

(xi)

OPIS SEKWENCJI:

SEQ

i ID

Nr:

37:

Thr 1

Arg

Phe

Ser

Arg 5

Ser

Ala

Glu

Pro

Pro 10

Ala

Tyr

Gln

Gly 15

Gln

Asn

Gln

Leu

Tyr 20

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu 25

Gly

Arg

Glu

Glu 30

Tyr

Asp

Val

Leu

Asp 35

Lys

Arg

Gly

Arg 40

Asp

Pro

Glu

Met

Gly 45

Gly

Lys

Pro

Arg

Arg 50

Lys

Asn

Pro

Gln

Glu 55

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu 60

Leu

Gln

Lys

Asp

Lys 65

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr 70

Ser

Glu

Ile

Gly

Met 75

Lys

Gly

Glu

Arg

Arg 80

Arg

Gly

Lys

Gly

His 85

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gln 90

Gly

Leu

Ser

Thr

Ala 95

Thr

Lys

Asp

Thr

Tyr 100

Asp

Ala

Leu

His

Met 105

Gln

Ala

Leu

Pro

Pro 110

Arg

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 38:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 38:

Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu 'sp Gly 15 10 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 39:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

181 085 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 39:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu 15 10 15

Leu Asp Gly (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 40:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 40:

Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala 15 10 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 41:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa

	(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	białko
	(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	SEQ ID Nr:	41:
Pro	Thr	Trp	Ser Thr Pro	Val His Ala	Asp Pro Gln Leu	Cys Tyr
1			5		10	15
Leu	Asp	Ala

Ile (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 42:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 42:

Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly 15 10 15 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 43:

(i) CECHY SEKWENCJI:

181 085 (A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (N) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ IN Nr: 53:

Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly 1 0 10 10 (2) INFORMACJE O SEQ IN Nr: 55:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1i2 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (N) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ	IN	Nr:
Gln	Ser	Phe Gly Leu Leu	Asp	Pro	Lys	Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly
1		0				W 10
Ile	Leu	Phe Ile Tyr Gly	Val	Ile	Leu	Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val
		27			20	37
Lys	Phe	Ser Arg Ser Ala	Glu	Pro	Pro	Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
		30		57		50
Gln	Leu	Tyr Asn Glu Leu	Asn	Leu	Gly	Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
	07		00			57
Leu	Asp	Lys Arg Arg Gly	Arg	Asp	Pro	Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
50		77				70 87
Arg	Lys	Asn Pro Gln Glu	Gly	Leu	Tyr	Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
		80				57 50
Met	Ala	Glu Ala Tyr Ser	Glu	Ile	Gly	Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
		177			170	117
Gly	Lys	Gly His Asp Gly	Leu	Tyr	Gln	Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
		110		127		120
Asp	Thr	Tyr Asp Ala Leu	His	Het	Gln	Ala Leu Pro Pro Arg
	137		130			157

(2) INFORMACJE O SEQ IN Nr: 50:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna

181 085 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 45:

Arg

Val

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

Tyr

Gln

Gly

1

5

10

15

Gln

Asn

Gln

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

20

25

30

Asp Val Leu 35 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 46:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

(xi)

OPIS

SEKWENCJI:

SEQ

ID Nr: 46:

Lys Lys

Leu

Val

Lys Lys

Phe

Arg Gln

Lys

Gln

Arg

Gln

Asn

Gln

1

5

10

15

Leu Tyr

Asn

Glu

Leu Asn

Leu

Gly Arg

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

20

25

30

(2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 47:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 47:

Arg

Thr

Gln

Ile

Lys

Leu

Cys

Ser

Trp

Arg

Asp

Lys

Asn

Ser

Ala

1

5

10

15

Ala

Asn

Gln

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

20

25

30

Asp Val Leu 35

181 085 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 48:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 48:

Arg 1

Thr

Arg

Phe

Ser 5

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro 10

Pro

Ala

Tyr

Gln

Gln 15

Gly

Gln

Asn

Gln

Leu 20

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn 25

Leu

Gly

Arg

Glu 30

Glu

Tyr

Asp Val Leu 35 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 49:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (•xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 49:

Arg 1

Thr

Arg

Asp

Pro 5

Glu

Met

Gly Gly

Lys 10

Pro

Arg

Lys

Asn 15

Pro

Gln

Glu

Gly

Leu 20

Tyr

Asn

Glu

Leu Gln 25

Lys

Asp

Lys

Met

Ala 30

Glu

Ala

Tyr Ser Glu Ile 35 (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 50:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 50:

181 085

Arg 1	Thr	Arg	Ile	Gly 5	Met Lys	Gly	Glu	Arg Arg 10	Arg	Gly Lys	Gly His 15
Asp	Gly	Leu	Tyr 20	Gln	Gly Leu	Ser	Thr 25	Ala Thr	Lys	Asp Thr 30	Tyr 'sp
Ala	Leu	His	Met	Gln	Ala
(2)	INFORMACJE O	SEQ	ID Nr:	51:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEJOWENCJI: SEQ ID Nr: 511 ^'^ΟΟ-'^ CCCCCGΟT'C CCCΟC'CCCΟ CCCACCCCΟC ACCCTA'CGC ^'^Ο'^Α

CTG (2) INFORMACJE O SEQ ID Nr: 52:

(i) CECHY SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nie istotny (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEEKWEJCJI: SEQ ID Nr: 55:

Asp Pro Lys 'la Glu 'la Lys 'la Glu 'la Lys Ala Glu 'la Lys 'la _X 5 10 15

Glu 'la Asp Leu 20

181 085

FIG. 1a f

CD4:ę

OSFGLLDPK

369

-PTWSTPVHADPK

15

LCYLLDGLCYLLDGΊ

CD4:₇

LGEPO

LCYILDA369

-P7WSTPVHADPQ LCYILDAILOŚĆ

KOMÓREK

FIG. 1b

CD4--7

CD4.7

CD4:ę

CD16PI

NATĘŻENIE FLUORESCENCJI

CD4

181 085

FIG. 2

ODPOWIEDNIA ILOŚĆ KOMÓREK

FIG. 3

ODPOWIEDNIA ILOŚĆ KOMÓREK

NATĘŻENIE FLUORESCENCJI

181 085

ŚREDNI

STOSUNEK

Czas w sekundach

181 085

ŚREDNI

STOSUNEK

Czas w sekundach

181 085

STOSUNEK E/T

181 085

ILOŚĆ

KOMÓREK

NATĘŻENIE FLUORESCENCJI

CD4:ę 60% Poz.

CD4:-i 13% Poz.

CD4:»7 60% Poz.

CD4:f C11G/D15G 38% Poz

NIE ZAKAŻONE 4% Poz.

181 085

STOSUNEK E/T

181 085

FIG. 7a

CDI 6

CDIftf

OSFGLLDPKLCYLLDG <

189

-FSPPGADPKLCYLLDG CD16ę

ŚREDNI

STOSUNEK

FIG. 7b

Czas w sekundach

181 085

FIG. 8a

F34· Y511 OSFGLLDPKL CYLLDG1LFI YGVILTALFL RVKFSRSAEP PAYQQGQNQL

J

E6O* D66*

YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPOEGLYN ELOKDKMAEA _I I

G122* A133* L139

101 YSE1GMKGER RRGKGHDGLY OGLSTATKDT YDALHMOALP PR _I

181 085

FIG. 9a

CD16:<~C11G/D15G/D66*

\| CD16:5	IM
^=7
\| CD16:5:;(48-65)

=8

W»»

CD16.7

CD16:7:f(48-65) 7

f

CD16 5:r(48-65) CD16.7:; (48-65)

RVKPSRSAEPPAYQQG<

KKLVKKFRQKKQRI

RTOIKKLCSWRDKNSA

IMQLYNELNLGRREEYDVL

MQLYNELNLGRREEYDVL

NQLYNELNLGRREEYDVL

FIG. 9b %UWOLNIONEGO

CHROMU

1

STOSUNEK E/T .01 —o- CD16.;

—B—CD16:;D66” —B—CD16 ;D66* C11G/D15G —CD16:; E60° C11G/D15G

100

181 085

FIG. 9c

CD16:f D66* CD16:5:f (48-65) CD 16'7:ę (48-65) CD16'7:f (48-59) CD16:5

CD16:7

FIG. 9d

ŚREDNI

STOSUNEK

Czas w sekundach

181 085 % UWOLNIONEGO CHROMU

STOSUNEK E/T

181 085

ŚREDNI

STOSUNEK

CD16:7:ę(48-65) □ E60Q + ·' D63N _Δ · Y62F o - E61Q a ” Y62S % UWOLNIONEGO CHROMU

STOSUNEK E/T

181 085 % UWOLNIONEGO CHROMU

Czas w sekundach

181 085

FIG. 11a

CD16.7ę(33-65) CD16.7 ζ (71-104) CD16'7.ę(104-138)

INL-GRREE I2KDKMAE? 1ST-ATKD

YDVL qSEI >ALHMQA

1YD.

rtrfsrsaeppayqqgqnc

RTRDPEMGGKPRRKNPQEi

RTRIGMKGERRRGKGHD'

FIG. 11b

STOSUNEK E/T

181 085

FIG. 12

181 085

3.0

2.5

ŚREDNI

STOSUNEK

2.0

1.5

1.0

ŚREDNI

STOSUNEK

FIG. 13a

CD18:IIA

-100.0 σ

a° oo ·^ΒΒβ<£>0%

-· “·«=<,„

2° □ CD16.IIC

A CD16:IIB1 ;ⁿssHI *** _B......

0.0

100.0

Czas w sekundach

FIG. 13b

Δ CD16:I1B2

200.0

2.5		. , . , ,—,
2.2		. 0 « '“««β
1 9		⁸ *0»· . . Β ο”®“α·α_Βοο
1 6	A	Β ⁴ '
1 4		Α β Α
1 1	α·_Λβ	9
α_βΒ?°^β _β·^β° ‘ Λ'	⁰ β^Α ^Α « «^Β ΛΛ
08 n s	„ o	0 ,

H □

-100.0

0.0

100.0 200.0 300.0

CD4.IIB1

CD4:IIB2

CD4:IIA

Czas w sekundach

181 085

CD4.IIA

CD4.IIB2

CD4:IIB1

STOSUNEK E/T

181 085

FIG. 15a

236 RKKRISANST DPVKAAQFEP PGROMIAIRK (269-311) r>

ROLEETNNDY (276-311) (282-311) (299-311) |-t> [£>

276 ETADGGYMTL NPRAPTDDDK NIYLTLPPND

-4-J

HYNSNN

Y9B2*

Y298*

% ZABICIA

.01

1 10 STOSUNEK E/T

100

181 085

ŚREDNI

STOSUNEK

Czas w sekundach

STOSUNEK E/T

181 085

FIG„16 (Seq. ID No: 24)

NEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPIEELE 51 LLSDITRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK

IOI PATVAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHET

DRVFVNCNTS ITWVEGTVGT DKESTVQVHY RMCQSCVELD GiRLSGAADTO ALLRNDQVYQ

151	PLRDRDDAQY	SHLGGNWARN	K*
FIG. 17 (Seq ID	NO: 25)
1	HEQGKGLAVL	ILAIILLOGT	LAQSIKGNHL	VKVYDYQEDG	svlltcdaea
51	KNITWFKDGK	MIGFLTEDKK	KWNLGSNAKD	PRGMYQCKGS	QNKSKPLQVY
101	YRMCQNCIEL	NAATISGFLF	AEIVSIFVLA	VGVYFIAGQD	\|GVRQSRASDK
151	QTLLPNDQLY	QPLKDREDDQ	YSHLQGNQLR	RN*
FIG.18 (Seq ID	No: 26)
1	MPGGLEALRA	LPLLLFLSYA	CLGPGCQALR	VEGGPPSLTV	NLGEEARLTC
51	ENNGRNPNIT	WWFSLQSNIT	WPPVPLGPGQ	GTTGQLFFPE	VNKNTGACTG
101	CQVIENNILK	RSCGTYLRVR	NPVPRPFLDM	GEGTKNRIIT	AEGIILLFCA
151	WPGTLLLFR	KjRWQNEKFGV	DMPDDYEDEN	LYEGLNLDDC	SMYEDISRGL
201	.QGTYQDVGNL	HIGDAQLEKP *\|
FIG. 19 (Seq ID	No: 27)
1	MATLVLSSMP	CHWLLFLLLL	FSGEPVPAMT	SSDLPLNFQG	SPCSQIWQHP
51	RFAAKKRSSH	VKFHCYTNHS	GALTWFRKRG	SQQPQELVSE	EGRIVQTQNG
101	SVYTLTIQNI	QYEDNGIYFC	KQKCDSANHN	VTDSCGTELL	VLGFSTLDQL
151	KRRNTLKDGI	ILIQTLLIIL	FIIVPIFLLL	dkJddgkagme	EDHTYEGLNI

201 DQTATYEDIV TLRTGEVKWS VGEHPGQE*

181 085

BamHI/BstY1 Bgl2/BstY1

G GAT CCC AAG GCC AGG CTA AAG CCG AAG CCG CGA AGG CCG AGG CTA AGG CCG AAG CĄG ATC TG

DPKAEAKAEAKAEAKAEADL

FIG. 28

181 085 ¢040 % SPECYFICZNEGO UWOLNIENIA 20 0-

CD4.Z

CD-HD1-EM) Ig CD7.Z CD4(D1-D4) IgCD7 CD4<D1.D2) lgCD7E CD4(D1.D2) lg CD7 Niezak.

-20+.01

Ή 1-1 1 1 m| 1 1 Ιΐι·η r I lllllll I IHIH|

1 10 100 1000

EFEKTOR: OBIEKT

FIG. 21

FIG. 22

181 085

D1-D4XCD4

Sekwencja kwasów nukleinowych

GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AGACATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC AAGAGGGGGA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA AACGGGTTAC CCAGGACCCT AAGCTCCAGA CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCC (SEQ ID NO: 28)

Sekwencja aminokwasowa

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGNKWL FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL LEAKTGKLHQ gWLWKRAT QLQKNLTCEV VSKREKPVW LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL (SEQ ID NO: 29)

CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC 51 CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG 101 TAGGCACTTG CTTCTGGTGC 151 AGGGAAACAA AGTGGTGCTG 201 TGTACAGCTT CCCAGAAGAA 251 CCAGATAAAG ATTCTGGGAA 301 CCAAGCTGAA TGATCGCGCT 351 AACTTCCCCC TGATCATCAA 401 CATCTGTGAA GTGGAGGACC 451 GATTGACTGC CAACTCTGAC 501 CTGACCTTGG AGAGCCCCCC 551 TCCAAGGGGT AAAAACATAC 601 TGGAGCTCCA GGATAGTGGC 651 AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT 701CTCCAGCATA GTCTATAAGA 751 CACTCGCCTT TACAGTTGAA 801 CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC 851 GAACAAGGAA GTGTCTGTAA 901 TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC 951 TATGCTGGCT CTGGAAACCT 1001 GTTGCATCAG GAAGTGAACC 1051 AAAATTTGAC CTGTGAGGTG 1101 AGCTTGAAAC TGGAGAACAA 1151 GGTGTGGGTG CTGAACCCTG 12 01 ACTCGGGACA GGTCCTGCTG 12 51 TCCACCCCGG TGCACGCGGA 13 01

GKKGDTVELT CTASQKKSIQ 51 DSRRSLWDOG HFPLIIKNLK 101 THLLQGQSLT LTLESPPGSS 151 TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV 201 KLTGSGELWW QAERASSSKS 251 HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA 3 01 WGPTSPKLML SLKLENKEAK 3 51 ESNIKVLPTW STPVHADP

FIG. 23

181 085

D1-D2<CD4

Sekwencja kwasów nukleinowych

GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC 51

CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG 101

CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC 151

TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG 201

GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA 251

GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA 301

ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT 351

GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA 401

GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC 451

AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC 501

ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC 551

TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC 601

AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC 651

ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT 701

AGACATCGTG GTGCTAGCT (SEQ ID NO: 30)

Sekwencja aminokwasowa

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGNKWL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ 51

FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK 101

IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS 151

PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV 201

VLA (SEQ ID NO: 31)

FIG. 24

181 085

Zawias, domeny CH₂ i CH₃ ludzkiej IgGl

Sekwencja kwasów nukleinowych

GCTAGCAGAG CCCAAATCTT CAGCACCTGA ACTCCTGGGG CCCAAGGACA CCCTCATGAT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT AACAGCACGT ACCGGGTGGT GCTGAATGGC AAGGAGTACA CCCCCATCGA GAAAACCATC CAGGTGTACA CCCTGCCCCC CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AGTGGGAGAG CAATGGGCAG GTGCTGGACT CCGACGGCTC CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG AGGCTCTGCA CAACCACTAC CTGCAACTGG ACGAGACCTG GCTCTGGACG ACGGATCC

GTGACAAAAC TCACACATGC GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC GCCAAGACAA AGCCGCGGGA CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC AGTGCAAGGT CTCCAACAAA TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC CCGGAGAACA ACTACAAGAC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC GGAACGTCTT CTCATGCTCC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT TGCTGAGGCC CAGGACGGGG (SEQ ID NO: 32)

CCACCGTGCC	51
CCCCCCAAAA	101
CATGCGTGGT	151
TGGTACGTGG	201
GGAGCAGTAC	251
ACCAGGACTG	301
GCCCTCCCAG	351
CCGAGAACCA	401
AGAACCAGGT	451
ATCGCCGTGG	501
CACGCCTCCC	551
TCACCGTGGA	601
GTGATGCATG	651
GTCTCCGGGG	701
AGCTGGACGG	751

Sekwencj a aminokwasowa

EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD 51 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN 101 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPR£ PQVYTLPPSR DELTKNQVSL 151 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 201 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GLQLDETCAE AQDGELDGLW 251 TTDP (SEQ ID NO: 33)

FIG. 25

181 085

Domena transbłonowa CD7 Sekwencja kwasów nukleinowych

CCAAGGGCCT CTGCCCTCCC TGCCCCACCG ACAGGCTCCG CCCTCCCTGA 5χ

CCCGCAGACA GCCTCTGCCC TCCCTGACCC GCCAGCAGCC TCTGCCCTCC 101

CTGCGGCCCT GGCGGTGATC TCCTTCCTCC TCCGGCTGGG CCTGGGGGTG 151

GCGTGTGTGC TGGCGAGGAC GCGT (SEQ ID NO: 34)

Sekwencja aminokwasowa

PRASALPAPP TGSAŁPDPQT ASALPDPPAA SALPAALAVX SFLLGLGLGV 51

ACVLARTR (SEQ ID NO: 35)

FIG. 26

Wewnątrzkomórkowa domena zeta Sekwencja kwasów nukleinowych

ACGCGTTTCA GCAGGAGCGC AGAGCCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA 31

CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG TACGATGTTT 101

TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGAGAAGG 151

AAGAACCCTC AGGAAGGCCT GTACAATGAA CTGCAGAAAG ATAAGATGGC 201

GGAGGCCTAC AGTGAGATTG GGATGAAAGG CGAGCGCCGG AGGGGCAAGG 251

GGCACGATGG CCTTTACCAG GGTCTCAGTA CAGCCACCAA GGACACCTAC 301

GACGCCCTTC ACATGCAGGC CCTGCCCCCT CGCTAAAGCG GCCGC (SEQ ID NO: 36)

Sekwencja aminokwasowa

TRFSRSAEPP AYQQGQNQLY HELNLGRREE YDVLDKRRGR DPEMGGKPRR 51

KNPQEGLYNE LQKDKMAEAY SEIGMKGERR RGKGHDGLYQ GLSTATKDTY 101

DALHMQALPP R (SEQ ID NO: 3η

FIG. 27

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek do leczenia HIV u ssaka, zawierający rekombinowane komórki terapeutyczne oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że komórki terapeutyczne wykazują ekspresję związanego z błonabiałkopodobnego receptora chimerycznego zawierającego część zewnątrzkomórkową obejmującą fragment CD4 zawierający aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-:200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od części wewnątrzkomórkowej domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadający sekwencję SEQ ID NO: 35, region zawiasowy domen CH2 i CH3 z cząsteczki ludzkiej IgG posiadający sekwencję SEQ ID NO: 33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5 lub część przezbłonową CD34 lub białkową alfa helisę.
2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że fragment CD4 jest oddalony od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 4,8 nm lub o co najmniej 7,2 nm.
3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, ze komórkę terapeutyczną wybiera się spośród komórek T, komórek B, neutrofili, komórek dendrytycznych lub pęcherzykowych komórek dendrytycznych.
4. Komórka, znamienna tym, że wykazuje ekspresję związanego z błoną białkopodobnego receptora chimerycznego zawierającego część zewnątrzkomórkową obejmującą fragment CD4 zawierający aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od części wewnątrzkomórkowej domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadający sekwencję SEQ ID NO: 35, region zawiasowy domen CH2 i CH3 z cząsteczki ludzkiej IgG posiadający sekwencję SEQ ID NO: 33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5 lub część przezbłonową CD34 lub białkową alfa helisę.
5. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że fragment CD4 jest oddalony od błony ' komórki terapeutycznej o co najmniej 4,8 nm lub o co najmniej 7,2 nm.
6. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że pochodzi od komórki wybranej spośród komórek T, komórek B, neutrofili, komórek dendrytycznych lub pęcherzykowych komórek dendrytycznych.
7. Białkopodobny chimeryczny receptor błonowy zawierający część zewnątrzkomórkową obejmującą fragment CD4 zawierający aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od części wewnątrzkomórkowej domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadający sekwencję SEQ ID NO: 35, region zawiasowy domen CH2 i CH3 z cząsteczki ludzkiej IgG posiadający sekwencję SEQ ID NO: 33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5 lub część przezbłonową CD34 lub białkową alfa helisę.
8. Receptor według zastrz. 7, znamienny tym, że fragment CD4 jest oddalony od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 4,8 nm lub o co najmniej 7,2 nm.

Wynalazek odnosi się do receptorów, które obejmują fragmenty CD4, wiążące HIV, lecz nie czynią komórek gospodarza podatnych na infekcję HIV. Wynalazek dotyczy więc nowej i skutecznej terapeutyki schorzeń powodowanych przez HIV.

Rozpoznanie antygenu przez komórkę T poprzez receptor komórki T jest podstawą obszaru zjawisk immunologicznych. Komórki T zarządzają odpornością, którą nazywa się odpornością komórkową. Wiąże się to ze zniszczeniem przez komórki układu odpornościowego obcych tkanek lub zainfekowanych komórek. Istnieją różne komórki T, włączając komórki

181 085 „pomocnicze” i „supresorowe”, które modulują odpowiedź immunologiczną oraz komórki cytotoksyczne (lub „zabijające”), które mogą bezpośrednio zabijać komórki nienormalne.

Komórka T, która rozpoznaje i wiąże swoisty antygen prezentowany na powierzchni innej komórki uaktywnia; może się następnie namnożyć i, jeśli jest to komórka cytotoksyczna, może zabić związaną komórkę.

HIV i immunopatogeneza

W 1984 HIV okazał się czynnikiem etiologicznym AIDS. Od tego czasu definicję AIDS rewidowano wiele razy pod względem tego, jakie kryteria powinna zawierać diagnoza. Jednakże, pomimo zmian parametrów diagnostycznych, prostym, ogólnym określeniem AIDS jest zakażenie HIV i następujący rozwój trwałych ustrojowych symptomów, określanych jako schorzenia AIDS, takie jak wtórne infekcje, nowotwory i schorzenia neurologiczne. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12 wyd., McGraw Hill (1991).

HIV jest retrowirusem ludzkim z grupy lentiwirusów. Cztery poznane retrowirusy należą do dwóch odmiennych grup: ludzkie retrowirusy limfotropowe (lub białaczki) typu T, HTLV-1 i HTLV-2 oraz wirusy niedoboru odporności u ludzi, HIV-1 i HIV-2. Pierwsze są wirusami transformującymi, natomiast drugie są wirusami cytopatycznymi.

Stwierdzono, ze HlV-1 jest najbardziej powszechną przyczyną AIDS na całym świecie. Podobieństwo sekwencji między HIV-1 i HIV-2 wynosi około 40%, przy czym HIV-2 jest nieco bardziej związany z grupą wirusów niedoboru odporności małp (SIV). Patrz Curran i in., Science 329: 1357-1359 (1985); Weiss i in., Nature 324: 572-575 (1986).

HIV posiada zwykłe geny retrowirusowe (env, gag i pol) jak również sześć genów dodatkowych związanych z replikacjąi innymi czynnościami biologicznymi wirusa. Jak ustalono poprzednio, ogólnym określeniem AIDS jest całkowita immunosupresja, najczęściej odporności komórkowej. Ta supresja odporności prowadzi do różnych oportunistycznych schorzeń, zwłaszcza pewnych infekcji i nowotworów.

Stwierdzono, że główną przyczyną uszkodzenia odporności w AIDS jest ilościowy i jakościowy niedobór w subpopulacji limfocytów grasiczopochodnych (T), populacji T4. Tę subpopulację komórek określa się fenotypowo dzięki obecności cząsteczki powierzchniowej CD4, która okazała się komórkowym receptorem dla HIV. Dalgleish i in., Nature 312: 763 (1984). Mimo, że komórka T4 jest głównym typem komórki zakażanym przez HIV, zasadniczo każda ludzka komórka, która wykazuje ekspresję cząsteczki CD4 na swojej powierzchni, zdolna jest do wiązania i zakazania się HIV.

Tradycyjnie komórkom T CD4’ przypisano rolę pomocniczych/indukujących, wykazujących działanie poprzez dostarczenie sygnału aktywującego do komórek B lub indukowanie limfocytów T, posiadających wzajemnie oddziałujące markery CD8, powodując, ze stają się one komórkami cytotoksycznymi/supresorowymi, Reinherz i Schlossman, Celi 19: 821-827 (1980); Goldstein i in., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).

HIV wiąże się specyficznie i z wysokim powinowactwem, przez rozciągnięcie aminokwasów w otoczce wirusa (gpl20), z częścią regionu V1 cząsteczki CD4, umiejscowioną w pobliżu jego końca N. Po związaniu następuje łączenie się wirusa z błoną komórki docelowej i internalizacja. Zinternalizowany wirus używa enzymu odwrotnej transkryptazy do transkrypcji swojego genomowego RNA na DNA, który jest zintegrowany z DNA komórkowym, gdzie istnieje w czasie życia komórki jako „prowirus”.

Prowirus może pozostać w utajeniu lub uaktywnia się, aby transkrybować mRNA i genomowy RNA, co prowadzi do syntezy białka, gromadzenia, formowania nowego wirionu i pączkowania wirusa z powierzchni komórki. Chociaż precyzyjny mechanizm, dzięki któremu wirus wywołuje śmierć komórki nie został ustalony, uważa się, że głównym mechanizmem jest masowe pączkowania wirusa z powierzchni komórki, prowadzące do rozerwania błony plazmatycznej i w efekcie do nierównowagi osmotycznej.

W czasie trwania infekcji organizm gospodarza wytwarza przeciwciała przeciw białkom wirusowym, obejmującym główne glikoproteiny otoczkowe gp120 i gp41. Mimo tej odporności humoralnej choroba postępuje, czego skutkiem jest śmiertelna immunosupresja, objawiająca się wielokrotnymi oportunistycznymi infekcjami, obecnością pasożytów we krwi, demencjąi śmiercią. Niewydolność przeciwciał antywirusowych gospodarza w powstrzymy4

181 085 waniu postępu choroby jest jednym z najbardziej dokuczliwych i alarmujących aspektów infekcji i źle wróży próbom szczepień opartych na konwencjonalnym podejściu.

W skuteczności odpowiedzi humoralnej na wirusy niedoboru odporności, mogą odgrywać rolę dwa czynniki. Po pierwsze, jak inne wirusy RNA (a zwłaszcza jak retrowirusy), wirusy niedoboru odporności wykazują wysokie tempo mutacji w odpowiedzi na nadzór odpornościowy gospodarza. Po drugie, same glikoproteiny otoczkowe są cząsteczkami silnie glikozylowanymi, wykazującymi kilka epitopów odpowiednich do wiązania przeciwciał o wysokim powinowactwie. Stały obiekt antygenowy, jakim jest otoczka wirusa, daje gospodarzowi niewielką możliwość ograniczenia infekcji przez wytwarzanie specyficznych przeciwciał.

Komórki zakażone wirusem HIV wykazują na swej powierzchni ekspresję glikoproteiny gp120. Gp120 pośredniczy w przypadkach fhzji między komórkami CD4+ przez reakcję podobną do tej, dzięki której wirus dostaje się do wnętrza- komórek niezakażonych, co prowadzi do formowania krótko żyjących, wielojądrowych komórek olbrzymich. Utworzenie się syncytium jest zależne od bezpośredniej interakcji glikoproteiny otoczkowej gp120 z białkiem CD4, Dalgleish i in., jak wyżej: Klatzman i in., Nature 312: 763 (1984); McDougal i in., Science 231: 382 (1986); Sodroski i in., Nature 322: 470 (1986); Lifson i in., Nature 323: 725 (1986); Sodroski i in., Nature 321: 412 (1986).

Dowodem, ze wiązanie CD4-gp 120 jest odpowiedzialne za infekcję wirusową komórek, posiadających antygen CD4 jest odkrycie, że między gpl20 i CD4 tworzy się specyficzny kompleks (McDougal i in., jak wyżej). Inni badacze wykazali, że linie komórek, nie zakażających się HIV, przekształcały się w linie komórkowe zdolne do zakażenia się po transfekcji i ekspresji ludzkiego genu CD4 cDNA, Maddon i in., Cell 46: 333-348 (1986).

Programy terapeutyczne oparte na rozpuszczalnym CD4 jako biernym czynniku, zakłócającym adsorpcję wirusa i przenoszenie komórkowe za pośrednictwem syncytium były proponowane i z powodzeniem demonstrowane in vitro przez wiele grup (Deen i in., Nature 331: 82-84 (1988); Fisher i in., Nature 331: 76-78 (1988); Hussey i in., Nature 331: 78-81 (1988); Smith i in., Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker i in., Nature 331: 84-86 (1988)); następnie opracowano białka połączone CD4 immunoglobuliny o przedłużonych okresach półtrwania oraz umiarkowanej aktywności biologicznej (Capon i in., Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker i in., Nature 339: 68-70 (1989); Bym i in., Nature 334: 667-670 (1990); Zettlmeissl i in., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990). Mimo że sprzężone immunotoksyny CD4 lub białka połączone wykazują silną cytotoksyczność wobec zakażonych komórek in vitro (Chaudhary i in., Nature 335: 369-372 (1988); Till i in., Science 242: 1166-1168 (1988)), utajenie syndromu niedoboru odporności powoduje, że mało prawdopodobne jest, aby każda terapia jednego rodzaju była skuteczna w eliminowaniu obciążenia wirusem, a antygenowość obcych białek połączonych prawdopodobnie ogranicza ich dopuszczalność w leczeniu, wymagającym powtarzającego się dawkowania. Doświadczenia z małpami dotkniętymi SIV pokazały, że rozpuszczalny CD4, jeśli jest podany zwierzętom bez niedoboru krwinek wykazujących CD4, może ograniczyć miano SlV i podwyższyć in vitro pomiary potencjału szpikowego (Watanabe i in., Nature 337: 267-270 (1989)). Jednakże po przerwaniu leczenia zauważono szybki powrót aktywności wirusowej, sugerujący, że konieczne może być podawanie przez całe życie, aby zabezpieczyć przed postępującym osłabieniem układu odpornościowego.

Komórki T i receptory Fc

Ekspresja na powierzchni komórki najliczniejszej postaci receptora antygenu komórek T (TCR) wymaga koekspresji co najmniej 6 oddzielnych łańcuchów polipeptydowych (Weiss i in., J. Exp. Med. 160: 1284-1299 (1984); Orloffhashi i in., Nature 316: 606-609 (1985); Berkhout i in., J. Biol. Chem. 263: 8528-8536 (1988); Sussman i in., Cell 52: 85-95 (1988)), łańcuchów α/β wiążących antygen, trzech polipeptydów kompleksu CD3 i ζ. Jeśli brakuje któregokolwiek z łańcuchów, trwała ekspresja pozostałych członków kompleksu nie następuje. ζ jest polipeptydem ograniczającym dla ekspresji na powierzchni całkowitego kompleksu (Sussman i in., Cell 52: 85-95 (1988)) i uważa się, że pośredniczy on przynajmniej w części komórkowych programów aktywacji uruchamianych przez receptor rozpoznania ligandu (Weissman i in., eMbO J. 8: 3651-3656 (1989); Frank i in., Science 249: 174-177

181 085 (1990)). Integralny homodimer błonowy typu I ζ o 32 kDa, posiada 9-resztową zewnątrzkomórkową domenę bez miejsc dla N-związanych przyłączeń glikanowych i 112-resztową (myszy) lub 113-resztową (człowiek) domenę wewnątrzkomórkową (Weissman i in., Science 238: 1018-1020 (1988); Weissman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988)). Izotyp ζ nazywany η teta) (Baniyash i in., E Blol. Chem. 263: 9879-9878 (1988); Orloff i in., J. Biol. Chem. 264: 1481.-14817 (1989)), który powstaje w wyniku alternatywnej ścieżki składania mRNA (Jin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3233 (1990)), obecny jest w mniejszych ilościach w komórkach, wykazujących ekspresję receptora antygenu. Uważa się, ze heterodimery ζ-η pośredniczą w tworzeniu się fosforanów inozytolu, jak również w inicjowanej przez receptor, programowanej śmierci komórki nazywanej apoptozą (Merćep i in., Science 242: 571-574 (1988); Merćep i in., Science 246: 1162-1165 (1989)).

Tak jak ζ i η, łańcuch γ (gamma) związany z receptorem Fc podlega ekspresji na powierzchni komórki w kompleksach z dodatkowymi polipeptydami, z których pewne pośredniczą w rozpoznaniu ligandu, a inne mają nie ustaloną funkcję. γ posiada strukturę homodimerycznąi ogólną organizację bardzo podobną do organizacji ζ oraz jest składnikiem receptora FceRI o wysokim powinowactwie IgE obu komórek tucznej/bazolilowej, który składa się z co najmniej trzech oddzielnych łańcuchów polipeptydowych (Blank i in., Nature 337: 187-189 (1989); Ra i in., Nature 241: 752-754 (1989)), i jednego z receptorów o niskim powinowactwie do IgG reprezentowanego u myszy przez FcYRIIa (Ra i in., J. Biol. Chem. 264: 15323-15327 (1989)), i u ludzi przez ekspresję podtypu CD16 u makrofagów i naturalnych komórek zabijających, CD16tm (CD 16 transbłonowy) (Lanier i in., Nature 342: 803-805 (1989); Anderson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)), i z polipeptydem o nieustalonej funkcji (Anderson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)). Wcześniej donoszono, ze y podlega ekspresji w liniach komórek T myszy, CTL, w których tworzy homodimery jak również heterodimery γ-ζ i γ-η (Orloff i in., Nature 347: 189-191 (1990)).

Receptory Fc pośredniczą w fagocytozie kompleksów odpornościowych, transcytozie i komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) (Raveth i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Unkeless i in., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); i Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16-25 (1988)). Wcześniej wykazano, że jeden z izotypów mysiego receptora Fc niskiego powinowactwa, FcRyIIIB1, pośredniczy w internalizacji obiektów opłaszczonych przeciwciałami Ig do zagłębień opłaszczonych klatryną (clathrin) i ze inny receptor niskiego powinowactwa, FcRyIIIA pośredniczy w ADCC przez asocjację z jednym lub więcej członkiem małej rodziny „cząsteczek wyzwalających” (Miettinen i in., Cell 58: 317-327 (1989); i Hunziker i Mellman, J. Cell Biol 109: 3291-3302 (1989)). Te cząsteczki wyzwalające, łańcuch ζ receptora komórek T (TCR), łańcuch η TCR i łańcuch γ receptora Fc oddziaływują z domenami rozpoznania ligandu różnych receptorów systemu immunologicznego i mogą autonomicznie inicjować komórkowe programy efektorowe, obejmujące cytolizę, następnie agregację (Samelson i in., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman i in., Science 239: 1018-1020 (1988); Jin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 87: 3319-3323 (1990); Blank i in., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier i in., Nature 342: 803-805 (1989); Kurosaki i Raveth, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs i in., Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990); oraz Irving i Weiss Cell 64: 891-901 (1991)).

Jednakże w rysunkowych porównaniach między rodzinami mysich i ludzkich receptorów Fc niskiego powinowactwa stało się jasne, ze ludzkie FcRyIIA i izotypy C nie mają odpowiednika mysiego. Częściowo dlatego ich funkcje nie sąjeszcze określone.

Ponieważ czynniki humoralne oparte tylko na CD4 mogą mieć ograniczone zastosowanie in vivo, we wcześniejszych pracach badano możliwość powiększenia odporności komórkowej przeciw HIV. Zidentyfikowano preparaty chimer białkowych, w których zewnątrzkomórkowa domena CD4 łączy się z domenami transbłonowymi i/lub wewnątrzkomórkowymi receptora komórki T, receptora Fc IgG lub elementami receptora komórki B, przekazującymi sygnał (U.S.S.N. 07/847 566 i 07/665 961, dołączone tu jako odnośnik). Cytolityczne komórki T, wykazujące ekspresję chimer, zawierających zewnątrzkomórkową domenę CD4 powo6

181 085 dują silną, niezależną od MHC, destrukcję obiektów komórkowych wykazujących ekspresję białek otoczkowych HTV. Niezwykle ważnym i nowym składnikiem tego podejścia była identyfikacja pojedynczego receptora komórki T, receptora Fc i łańcuchów receptora komórki B, których agregacja wystarcza do zainicjowania odpowiedzi komórkowej. Jednym ze szczególnie użytecznych zastosowań tego podejścia było wynalezienie chimer między CD4 i ζ, η lub γ, które kierują cytolityczne limfocyty T, w celu rozpoznania i zabicia komórek wykazujących ekspresję gp120 HIV (U.S.S.N. 07/847 566 i 07/665 961 załączone tu jako odnośnik).

Istota wynalazku