CN112176037A - 检测car-t细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒 - Google Patents
检测car-t细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种检测CAR‑T细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒。本发明技术方案通过设计引物对和探针，以及优化PCR反应中的外界条件，解决了传统实时荧光定量PCR技术特异性弱的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞数检测技术领域，特别涉及一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，使可以特异性识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达，在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时，CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此，准确检测CAR基因的拷贝数是CAR-T药物质量控制的关键步骤和诊断的重要环节。
相关技术中，传统外源基因拷贝数的检测方法是Southern blot，虽然检测准确度高、特异性好，但是耗时、费力、并需要大量基因组DNA，难度系数较大。实时荧光定量PCR技术是近几年迅速发展的DNA/RNA定量技术，但是其特异性较差，涉及的参数复杂，不同参数会导致检测准确度和精密度的不同。
因此，在不影响特异性的情况下，如何高效检测CAR-T细胞的目的基因拷贝数，以获知CAR-T细胞在体内的变化情况，进而对患者的细胞治疗方案提供依据，成为目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒，以解决传统实时荧光定量PCR技术特异性弱的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法，包括如下步骤：
S1、使用含CAR基因的质粒作为标准品母液，提取未转导的T淋巴细胞DNA作为背景DNA模板进行梯度稀释，制成标准品；
S2、提取待测样品的DNA；
S3、根据针对CAR-T细胞的靶点基因设计第一引物对，或者根据慢病毒的wpre片段设计第二引物对；并设计探针；
S4、使用所述第一引物对和/或所述第二引物对，及所述探针对标准品和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应；根据每个标准品产生的RVS基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线，获得标准曲线的计算公式；其中，PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56～62℃，2s～1min，共41个循环；
S5、将待测样品的DNA的Ct值带入步骤S4中的标准曲线的计算公式，通过内因参数作为参照，并标准化校正基因的含量，获得待测样品的DNA的拷贝数。
可选地，在步骤S3中，所述第一引物对的序列如表1所示；和/或，
所述第二引物对的序列如表1所示。
可选地，在步骤S3中，所述探针包括第一探针和/或第二探针，所述第一探针的序列和所述第二探针的序列如表1所示。
可选地，在步骤S4中，所述PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56～62℃，2s～1min具体包括：
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；60℃，1min；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，10s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，8s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，6s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；60℃，2s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；62℃，2s。
表1 引物对序列和探针序列表
本发明还提供一种引物对，所述引物对包括如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的第一引物对和/或第二引物对。
本发明还提供一种探针，所述探针包括如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的探针。
可选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5中的一个或其组合；
所述荧光淬灭基团包括BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3中的一个或其组合。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的第一引物对和/或第二引物对；和/或，
所述试剂盒包含如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的探针。
可选地，所述试剂盒包含第一引物对和探针；和/或，
所述试剂盒包含第二引物对和探针。
相较于相关技术，本发明的有益效果是：
本发明技术方案通过设计引物对和探针，大大提高了实时荧光定量PCR检测中的特异性和灵敏性。同时，优化了PCR反应程序中的条件，大大缩短了PCR反应需要的时间，省时高效。这样，提高本发明中提供的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法提高了对CAR-T细胞目的基因拷贝数检测的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中不同引物对条件下PCR扩增产物的凝胶电泳图；
图2至图7为本发明实施例中不同PCR扩增条件下CAR-T细胞目的基因拷贝数的线性回归图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
本发明提出一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法，包括如下步骤：
S1、使用含CAR基因的质粒作为标准品母液，提取未转导的T淋巴细胞DNA作为背景DNA模板进行梯度稀释，制成标准品；
S2、提取待测样品的DNA；
S3、根据针对CAR-T细胞的靶点基因设计第一引物对，或者根据慢病毒的wpre片段设计第二引物对；并设计探针；
S4、使用所述第一引物对和/或所述第二引物对，及所述探针对标准品和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应；根据每个标准品产生的RVS基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线，获得标准曲线的计算公式；其中，PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56～62℃，2s～1min，共41个循环；
S5、将待测样品的DNA的Ct值带入步骤S4中的标准曲线的计算公式，通过内因参数作为参照，并标准化校正基因的含量，获得待测样品的DNA的拷贝数。
可选地，在步骤S3中，所述第一引物对的序列如表1所示；和/或，
所述第二引物对的序列如表1所示。
可选地，在步骤S3中，所述探针包括第一探针和/或第二探针，所述第一探针的序列和所述第二探针的序列如表1所示。
可选地，在步骤S4中，所述PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56～62℃，2s～1min具体包括：
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；60℃，1min；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，10s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，8s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，6s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；60℃，2s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；62℃，2s。
本发明还提供一种引物对，所述引物对包括如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的第一引物对和/或第二引物对。
本发明还提供一种探针，所述探针包括如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的探针。
可选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5中的一个或其组合；
所述荧光淬灭基团包括BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3中的一个或其组合。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的第一引物对和/或第二引物对；和/或，
所述试剂盒包含如上所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的探针。
可选地，所述试剂盒包含第一引物对和探针；和/或，
所述试剂盒包含第二引物对和探针。
为进一步阐述本发明一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法的技术效果，选用一下实施例组进行详细解释说明。应当理解，下述实施例组仅为本发明的部分实施例，仅用以说明在本发明提供的一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法下的对CAR-T细胞拷贝数的检测的效果，并不作为限制。
实施例1引物对的选择
1、实验步骤：
①如表1所示的碱基序列设计引物对和探针；
②分别以293T细胞基因组作为阴性对照组、以水作为无模板对照组、以ZL1801质粒(1*106copies/uL)作为模板实验组，进行实时荧光定量PCR测定；其中，测定的PCR反应体系如表2所示，PCR反应的程序如表3所示；
表2 PCR反应体系配制表
| PCR反应组分 | 加液量/ul |
| FastFire qPCR PreMix | 10.0 |
| WP-primer–F/H-CD247–F | 0.6 |
| WP-primer–R/H-CD247–R | 0.6 |
| WP probe | 0.4 |
| H2O | 7.4 |
| 模板 | 1.0 |
表3 PCR反应程序设置表
③选用2％的琼脂糖凝胶分析PCR扩增后的产物，并得到如图1所示的凝胶电泳图；
其中，2％的琼脂糖凝胶的制备如下：
称取琼脂糖适量，置250ml锥形瓶中，加入TAE电泳缓冲液(1x)使成1％琼脂糖的溶液，于微波炉高火加热溶解；待温度降至60℃以下，加入核酸染料(10μl/100ml)，摇匀；将凝胶液倒入胶模中，自然均匀铺满；待凝胶完全凝固(约30分钟)即可使用；
上样：1kb DNA Marker溶液上样10μl；各产物溶液上样10μl。
电泳：调节电泳仪电压120V，电泳45min；
④Ct值的计算：以平均Ct值对CAR基因拷贝数的对数值做图，线性回归分析，将样品Ct值代入方程，计算“CAR基因拷贝数的对数值”，从而求得“CAR基因拷贝数”，并得到如表4所示的不同引物对的Ct值的结果数据；
其中，
单个细胞的CAR基因拷贝数平均值＝CAR基因拷贝数/总的细胞数。
表4 不同引物对的Ct值
2、结果分析：
由表4可知，以1×106copies/ul ZL1801质粒为模板时，WP-primer引物和H-CD247引物的Ct值分别为25.51和25.26，其差值为0.25，小于0.5，判定为无显著差异。说明WP-primer引物和H-CD247引物的灵敏度相当。
由图1可知，对标准品(即以1×106copies/ul ZL1801质粒为模板的实验组)进行qPCR扩增，H-CD247引物1E+06标准品的PCR产物只有1条带，而WP-primer引物1E+06标准品的PCR产物有很多条带；对293T细胞基因组作为阴性对照组进行qPCR扩增，H-CD247引物阴性对照扩增产物比WP-primer引物阴性对照扩增产物条带少且亮度弱；对水作为无模板对照组进行qPCR扩增，H-CD247引物产物和WP-primer引物产物均出现微弱的目标条带和引物二聚体条带。说明，H-CD247引物的特异性强于WP-primer引物。
实施例2 PCR程序条件的选择
1、实验步骤：
①根据标定的CAR基因拷贝数标准品ZL1801浓度(copies/uL)，选用293T细胞空表基因组进行稀释；
②在超净工作台内，按下表5配制PCR反应液；
表5 PCR反应液的配制
③按下表6所示的PCR反应程序条件进行PCR反应，并得到如表7至表12所示的结果数据和入图2至图7所示的线性回归图。
表6 PCR反应程序
表7 实施例1“退火/延伸条件为56℃，10s”的结果数据表
表8 实施例2“退火/延伸条件为56℃，8s”的结果数据表
表9 实施例3“退火/延伸条件为56℃，6s”的结果数据表
表10 实施例4“退火/延伸条件为60℃，1min”的结果数据表
表11 实施例5“退火/延伸条件为60℃，2s”的结果数据表
表12 实施例6“退火/延伸条件为62℃，2s”的结果数据表
2、结果分析：
①由表7至表10以及图2至图5可知，在将“退火/延伸”步骤中的温度值设定为56℃时，将“退火/延伸”步骤中的时间值设定为10s、8s、6s时，实时荧光定量PCR的检测灵敏度均可以达到100copies/reaction；并且，随着“退火/延伸”时间的缩短，实时荧光定量PCR的检测灵敏度得以提高。具体地，在“退火/延伸：56℃，6s”时，PCR的检测灵敏度达到50copies/reaction。同时，将实施例1至实施例3中的结果数据和实施例4中设定的“退火/延伸：60℃，1min”的条件下的结果数据进行比较，可知，实施例1至实施例3中的检测灵敏度均远高于实施例4中的检测灵敏度。
②由表11和表12以及图6和图7可知，在“退火/延伸：62℃，2s”的PCR程序下的检测灵敏度仅能达到100copies/reaction；而在“退火/延伸：60℃，2s”的PCR程序下的检测灵敏度能达到50copies/reaction；说明在“退火/延伸”步骤中，随着“退火/延伸”温度的降低，实时荧光定量PCR的检测灵敏度得以提高。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、使用含CAR基因的质粒作为标准品母液，提取未转导的T淋巴细胞DNA作为背景DNA模板进行梯度稀释，制成标准品；
S2、提取待测样品的DNA；
S3、根据针对CAR-T细胞的靶点基因设计第一引物对，或者根据慢病毒的wpre片段设计第二引物对；并设计探针；
S4、使用所述第一引物对和/或所述第二引物对，及所述探针对标准品和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR反应；根据每个标准品产生的RVS基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线，获得标准曲线的计算公式；其中，PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56～62℃，2s～1min，共41个循环；
S5、将待测样品的DNA的Ct值带入步骤S4中的标准曲线的计算公式，通过内因参数作为参照，并标准化校正基因的含量，获得待测样品的DNA的拷贝数。
2.如权利要求1所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述第一引物对的序列如表1所示；和/或，
所述第二引物对的序列如表1所示。
3.如权利要求2所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述探针包括第一探针和/或第二探针，所述第一探针的序列和所述第二探针的序列如表1所示。
4.如权利要求1所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56～62℃，2s～1min具体包括：
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；60℃，1min；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，10s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，8s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；56℃，6s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；60℃，2s；或，
PCR的扩增反应的条件为：95℃，2min；95℃，2s；62℃，2s。
5.一种引物对，其特征在于，所述引物对包括如权利要求1至4所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的第一引物对和/或第二引物对。
6.一种探针，其特征在于，所述探针包括如权利要求1至4所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的探针。
7.如权利要求6所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5中的一个或其组合；
所述荧光淬灭基团包括BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3中的一个或其组合。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1至4任一项所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的第一引物对和/或第二引物对；和/或，
所述试剂盒包含如权利要求1至4任一项所述的检测CAR-T细胞目的基因拷贝数的方法中的探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含第一引物对和探针；和/或，
所述试剂盒包含第二引物对和探针。
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