CN106939335A - 一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法 - Google Patents

一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法 Download PDF

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孙伟明
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杨滨
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Abstract

本发明提供了一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法，通过与临床检测数据的结果比对，验证方法的准确性、重现性、特异性等检测性能。该方法的线性范围为0.1 nM~40 nM，检出限可达到0.025 nM，可有望用于临床检验，具有显著的社会效益。

Description

一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法。
背景技术
肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。在我国，肝衰竭的主要是由肝炎病毒（主要是乙型肝炎病毒，hepatitis Bvirus，HBV）引起的。截至目前，已经在人血清中发现了几十种基因突变位点，随着越来越多的抗病毒核苷酸药物的大量使用，将会产生更多的新的基因突变位点。有些突变利于乙肝患者的恢复，有些突变则会起到抑制作用，例如人血清中存在的少量抵抗慢加急性肝衰竭控制基因，可有效减缓发病过程，提高治疗效果。因此，深入探索与研究人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的突变的位点及序列，建立新的、特异性强的、灵敏度高的、可靠的检验方法，对于肝衰竭患者的高效诊断、病情的及时治疗等都具有重要意义。
目前，临床上对肝病患者基因突变的诊断方法主要有PCR产物直接测序法和反向线性杂交法，这两种方法是目前公认的广泛用于临床的检测方法。产物直接测序法的优点是提供的信息量丰富，可以检测已知与未知的突变，缺点是检测灵敏度较低，病毒突变株比例达到20％～25％；反向线性杂交法的优点是检测灵敏度较高，可检测到≥5％的突变株，但只能检测已知突变，且目前技术上对同一突变位点（如rt 184位点）中的多种突变形式的分辨力有限，此外，使用反向线性杂交法的试剂和配套仪器成本较高。其他检测多位点突变的方法还有DNA芯片法、限制性片段长度多态性分析法、克隆测序法、焦磷酸测序法、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法（MALDI-TOF-MS）等。虽然这些检测方法具有较高的检测准确率和特异性，但是具有一些明显的不足和缺陷，比如检测时间长（往往需要几个小时、十几个小时，乃至更长时间），检测成本高（样本的检测过程中耗材多且昂贵），检测前处理复杂，对操作者的技术要求高等。因此，我们需要探索并建立一种更精确、灵敏、高效、成本低的分析方法，以期用于临床上检测人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因。
发明内容
临床上对人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因突变的诊断方法主要有PCR产物直接测序法和反向线性杂交法，这两种方法是目前公认的广泛用于临床的检测方法。但是这些方法往往伴随着检测时间长、灵敏度低、检测成本高等缺点。
为了解决以上的问题，本发明借助超分支滚环扩增技术，构建了一种灵敏度高、特异性强、检测结果准确可靠、检测成本低等特点的方法用于检测人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所设计的基因序列如下：
本发明中所用到的DNA引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中国，上海）合成并纯化，具体序列如下：
P1：CCCGAATACACAAAG，P2：CTAGTTAAGTACGCT，锁式探针PLP：AAACAGAGTTGGCCCGAATACACAAAGAGCGTACTTAACTAGTTGAGGATGGTG。
检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法，将目标DNA和40 nmol/L锁式探针PLP溶液在37℃条件下杂交反应1h，使锁式探针5’端和3’端无限接近；再向上述溶液中加入6 U E. coli DNA 连接酶，0.05% BSA 和0.024mmol/L NAD+，在e-coli DNA连接酶作用下锁式探针封闭成环；溶液中加入核酸外切酶I、III，37℃反应2h，接着将体系升温至95℃环境中10min灭活；上述溶液中接着加入40 nmol/LP1、P2，以及9.6 U Bst DNA 聚合酶和0.2 mmol/L dNTP，在63℃下进行超分支滚环扩增反应1小时，之后95℃加热10min终止扩增反应；利用SYBR Green I作为荧光指示剂，最终进行荧光检测。
所述的方法如下：
（1）选择合适的信号放大技术：根据控制肝衰竭基因的突变位点及序列均不同，以及碱基间的相互作用等特点，选择超分支滚环扩增技术用于放大检测信号，提高检测灵敏度，构建检测人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。
（2）设计可准确检测人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法：根据基因测序等方法，确定常见的突变位点，设计合适的探针DNA，采用超分支滚环扩增放大技术，设计可高效诊断血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。
（3）可行性分析：为了确保所构建方法的合理行，采用荧光分析仪等手段对方法进行表征，并研制方法检测的可行性。
（4）绘制线性曲线：在所构建的新型检测方法切实可行的基础上，通过优化实验条件，检测不同浓度的目标DNA，绘制线性曲线，计算检出限及检测范围。
（5）临床实际样本的检测结果：我们直接收集临床实际样本，用于验证该方法的检测灵敏度、准确度、可信度等指标。
本发明的优点在于：
1）设计了一种检测灵敏度高、特异性好的新方法，用于准确检测人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。
2）采用低成本、耗时短的超分支滚环扩增技术，构建检测人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的新方法。
3）本发明的检测范围为0.1~40 nmol/L，检测限可以达到0.05 nmol/L，且能较好地识别完全互补、单碱基错配、双碱基错配等序列，可以实现临床上对人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的准确检测。
附图说明
图1本发明所设计的实验原理。
图2本发明的可行性分析。
图3本发明检测目标DNA时绘制的线性曲线。
具体实施方式
实施例1
1）所设计的基因序列如下：
本发明中所用到的DNA引物序列（primer）由生工生物工程有限公司（中国，上海）合成并纯化，具体序列如下：
E.coli DNA 连接酶 (包含e-coli DNA 连接酶, 10×连接酶缓冲溶液, 10×牛血清白蛋白 (0.05 %))购自大连宝生物有限公司，核酸外切酶I、III(Exo I、Exo III)及其相应缓冲液购自Thermo公司，三磷酸脱氧核糖核苷混合液(dNTPs)购自生工生物工程有限公司（中国，上海），Bst DNA 聚合酶及其相应缓冲液购自钮英伦生物技术（北京）有限公司。SYBRGreen I购自下厦门百维信生物公司。The quality control corn samples werepurchased from Clover Technology Group. Inc (Beijing, China). 所用试剂均为AR级别，实验所用蒸馏水均由Milli-Q超纯水系统净化。DNA缓冲液：50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.4）。
2）实验仪器及实验参数设置：
本发明中所设计的检测方法主要用到的仪器有：
Milli-Q 超纯水系统（Millipore，Bedford，USA），实验用水均为其净化的超纯水；
PHS-3C 型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；
FINNPIPETTE 可调式移液器（上海热电仪器有限公司）；
Cary Eclipse 荧光光度计（Varian, USA）；
通过荧光分析仪给出信号检测值，具体的检测参数设置为：
激发波长：488 nm，发射波长500 ~ 600 nm。狭缝宽度：10.0 nm. 我们取518 nm处得荧光强度作为定量分析的依据。
3）基于超分支滚环扩增技术设计的方法的原理：
在目标物突变型乙肝耐药性基因存在下，锁式探针PLP和目标基因发生特异性结合。同时使得锁式探针PLP的5’端和3’端无限接近，在e-coli DNA连接酶的作用下封闭成环，在外切酶以及Bst酶的催化作用下发生滚环扩增延伸，形成一条具有大量重复序列且与锁式探针互补的线状单链。P2和该线状单链结合在Bst酶的催化下从其3’开始延伸，延伸产生的长链DNA则作为P1结合的模板，在DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物，被置换的延伸产物又可以作为互补模板, 由锁式探针的滚环扩增起始引物进行延伸。最终，在溶液形成大量的长度分布不连续的双链DNA。这里，以SYBR Green I作为荧光指示剂，利用SYBR Green I可以嵌入双链DNA结构中并发光的特点，通过荧光强度的变化来测定目标DNA的含量。
4）本发明的实验步骤：
首先，将一定浓度的目标DNA和40 nmol/L锁式探针PLP溶液在37℃条件下杂交反应1h，使锁式探针5’端和3’端无限接近。再向上述溶液中加入6 U E. coli DNA 连接酶，0.05%BSA 和0.024mmol/L NAD+（烟酰胺腺苷二核苷酸），在e-coli DNA连接酶作用下锁式探针封闭成环。溶液中加入核酸外切酶I、III(Exo I、Exo III)，37℃反应2h，接着将体系升温至95℃环境中10min灭活。HRCA反应：上述溶液中接着加入40 nmol/LP1、P2，以及9.6 U Bst DNA聚合酶和0.2 mmol/L dNTP，在63℃下进行超分支滚环扩增反应1小时，之后95 ℃加热10min终止扩增反应。利用SYBR Green I作为荧光指示剂，最终进行荧光检测。
5）方法的可行性分析：
为了验证本发明设计的原理准确性，我们做了以下对比实验。比较了无目标物的空白背景和在目标物突变型DNA、野生型DNA存在下经过HRCA扩增后荧光强度的变化。当体系无目标物存在下，HRCA扩增无法启动，体系的荧光较弱，当目标物野生型DNA存在时，HRCA扩增无法启动，产生较弱的荧光，当目标物突变型DNA存在时，经HRCA扩增后，产生较强的荧光。这是由于目标突变型DNA可以与锁式探针发生特异性结合并封闭成环，在酶的催化下发生超分支滚环扩增。以上结果表明，该发明可以对目标DNA突变型基因给出准确的检测。
6）线性曲线的绘制：
经验证，本发明设计的方法完全可行，经优化实验条件后，我们对不同浓度的目标DNA野生型基因进行定量检测。体系的荧光强度随着目标DNA浓度的增加而逐渐增大。同时实验结果表明，在0.1~40 nmol/L范围内，荧光强度与野生型DNA的浓度的对数成良好的线性关系，其检测限可以达到0.05 nmol/L，其线性方程为：
Y=0.61X-508.11 R=0.99985
（其中Y为荧光强度；X为野生型DNA浓度的对数；R为相关系数。）
7）实际样品的检测
通过收集临床实际样本，对比临川检测数据，通过本发明所述方法可以快速、准确鉴定人血清中是否含有抵抗慢加急性肝衰竭控制基因，检测结果如可行性分析结果（图2）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建医科大学
<120> 一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法
<130> 9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccgaataca caaag 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctagttaagt acgct 15
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaactctgt tccaccatcc tcaa 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaactctgt ttcaccatcc tcaa 24
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaacagagtt ggcccgaata cacaaagagc gtacttaact agttgaggat ggtg 54
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccaactctgt accaccatcc tcaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccaactctga tccaccatcc tcaa 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccaactctct tccaccatcc tcaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cctactctgt tccaccatcc tcaa 24

Claims (2)

1.一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的引物，其特征在于；所述的引物序列为P1：CCCGAATACACAAAG，P2：CTAGTTAAGTACGCT，锁式探针PLP：AAACAGAGTTGGCCCGAATACACAAAGAGCGTACTTAACTAGTTGAGGATGGTG。
2.利用权利要求1所述的引物检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法，其特征在于：将目标DNA和40 nmol/L锁式探针PLP溶液在37℃条件下杂交反应1h，使锁式探针5’端和3’端无限接近；再向上述溶液中加入6 U E. coli DNA 连接酶，0.05% BSA 和0.024mmol/L NAD+，在e-coli DNA连接酶作用下锁式探针封闭成环；溶液中加入核酸外切酶I、III，37℃反应2h，接着将体系升温至95℃环境中10min灭活；上述溶液中接着加入40nmol/LP1、P2，以及9.6 U Bst DNA 聚合酶和0.2 mmol/L dNTP，在63℃下进行超分支滚环扩增反应1小时，之后95℃加热10min终止扩增反应；利用SYBR Green I作为荧光指示剂，最终进行荧光检测。
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