CN111295713B - 稳定同位素标记的核酸作为内标物的核酸定量方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
为了定量分析样品或者复杂介质内存在的核酸,核酸提取或者精制过程不要的。但是核酸提取及精制收率(yield)根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。所以核酸的提取及精制收率的有效归一化(normalization)成为以原样品为基准的正确定量分析核酸的必要条件。本发明是有关没有目标核酸的增幅,对存在于样品或者复杂介质内的核酸进行定量分析的方法。
Description
技术领域
本发明是有关提高了准确度和可靠性的核酸(Nucleic acids;DNA及RNA)的定量分析方法,具体是有关利用稳定同位素(stable isotope)标记的核酸(stable isotopelabelled nucleic acids(DNA or RNA);以下称为'SILD')为内标物(internal standard)的核酸定量分析方法。
背景技术
基因分析包括根据PCR和排序(sequencing)技术扩增基因和分析其碱基序列过程。基因分析在以下领域中广泛被利用。如,疾病诊断、突变检测、病原性细菌和病毒的检测等医学领域;基因变形农产品检测,食材原产地判别,污染于食材的微生物检测等食品及卫生领域;如微生物群集分析、对生物体的毒性分析、生物多样性保存的环境领域;亲子判别、个人识别、犯罪嫌疑人识别等法医领域。
通过新一代碱基测序(next generation sequencing;NGS)技术开发,可对数十、数百个不同样品,也可进行同时对数千、数万个遗传基因分析的高效率遗传基因组(genome)分析。NGS技术在很多领域有效被利用。包括根据全转录组测序的所有遗传基因表达谱分析及大规模、高精密度微生物群集分析;根据同类群组分析的集团遗传特性和疾病标记发掘;根据个人遗传基因分析的疾病预测等个体化医学等领域。
最近血液内‘循环核酸或者自由核酸(circulating cell free nucleic acid)’被发现。通过后续研究还发现了循环核酸具有很大的医学意义,因此为了利用循环核酸的精密分析法的必要性突显。
在正常状态下血液中的循环核酸的量为20-100ng/ml,但是如果发生乳房癌、血癌等癌症的时候会出现大幅增加到200-500ng/ml的现象。具有些报告显示不仅对癌症在心肌梗塞、感染、急性炎症、过度运动及压力中也会出现循环核酸量变化的现象。即具有了单纯只通过测定血液中的循环核酸量也可以早期诊断主要疾病的可能性。为此,首先需要对血液中循环核酸进行正确并可靠的定量分析。
核酸定量法一般使用紫外光谱法(UV spectrometry)定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction;qPCR)数码聚合酶链反应(digital PCR)及荧光定量法等。所述定量法因为受到样品或者介质中存在的其他成分的阻碍,没有精制过程时无法正确定量分析核酸的量。但是对于复杂介质中的核酸,准确度和可靠性高的定量分析法还没被开发出来。
专利文献1公开了一种核酸的定量方法。该核酸定量方法以如下阶段构成。把与样品中的被分析物质核酸能区分并且能和该核酸同时能扩增的多种核酸构建体,以不同量各添加到样品里的阶段;使用能与所述被分析物质核酸和核酸构建体反应的扩增试剂,把所述样品以核酸扩增步骤来处理的阶段;从所述相对量计算被分析物质核酸量的阶段。所述各个核酸构件体都不同;各个核酸构建体可以区分开来并且也能与被分析物质核酸也能区分开来。核酸构建体在能与相同的扩增试剂反应的这一特点,与核酸构建体和被分析物质核酸类似。
但是所述方法会根据在校准曲线制作中的使用的各种核酸构建体的分析中的核酸而发生变化,并且核酸构建体具有要与被分析物相同速度扩增的前提,因此不能认为是具有可靠的定量分析方法。
专利文献2公开了一种有关为生成校正曲线而可计算目标核酸的特性水平的,一般的基准核酸的使用。专利文献2是有关导入被标识为公示量荧光段的普遍基准核酸的定量方法。这与专利文献1一样,因具有用在校准曲线的核酸要以相同速度扩增的前提,所以存在基本错误。
如所述,没有目标核酸的扩增也可以精确定量核酸的方法至今还没公开。
【现有专利文献】
(专利文献1)韩国专利注册公报第10-0312800号
(专利文献2)韩国专利注册公报第10-2017-0083053号
发明内容
技术问题
为了定量分析样品或者复杂介质内的核酸,需要有核酸的提取或者精制过程。但是核酸的提取率和精制率会根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。因此核酸的提取和精制收率的有效归一化(normalization)是,以原样品为基准的准确定量分析核酸的必要条件。本发明的目的在于没有目标核酸的扩增,定量分析样品或者存在于复杂介质内的核酸量的方法。
解决问题的手段
本发明的主要目的是为提供一种能提高样品中核酸(Nucleice acids;DNA或者RNA)定量分析的准确度和可靠行的方法,具体是有关把SILD做为内标物(internalstandard)的核酸定量分析方法。
为了准确定量分析存在于样品或者介质内的核酸,需要核酸提取或者精制过程。但是核酸的提取率和精制率根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。因此核酸的提取及精制率的有效归一化(normalization)是把原样品做为基准的准确定量分析核酸的必要条件。
本发明是有关在核酸精制及预处理过程中,为了收率的归一化而把SILD使用为内标物的分析方法。
为了间接归一化核酸提取和精制率而利用较多的方法是,把已知量的特定遗传基因作为内标物添加到样品里,经提取及精制后,再测定遗传基因量,从而计算提取及精制率。这种方法精制对象核酸具有多种尺寸的状态下,所添加的作为内标物的核酸具有单一尺寸,但是核酸提取率很大程度上受核酸的大小的影响,所以这种方法具有难于利用在整体提取率归一化的缺点。并且还有一种方法是,为了解决这种大小问题,把大小、分布相同的已知量核酸作为外部标准物质,对此另行进行提取及精制反应并定量分析,从而根据套组、实验者等来预测收率。但这种方法,因为根据每个反应容器和样品的介质形态不同而具有不同的精制率,所以也不能确定是一种完美的归一化方法。为了克服所述已有方法的缺点,本发明进行了,即作为内标物,也可以对整个精制效率进行归一化方法的发明。
本发明是有关对核酸提取及精制收率进行归一化的方法,把SILD作为内标物。SILD虽然与作为分析对象的普通的核酸具有相同的化学,生物特性,但是因为稳定同位元素(13C,15N)而发生分子量的差异。并且,这些差异在最终分析仪器(重量分析仪)中,可以以不同质量-电荷之比(m/z)被检测及定量。即,对各个样品中算出的正常核酸的量和内标物核酸量,可以同时并且区分开里进行定量。样品中算出的内标物特性因为与分析对象核酸的提取、精制、酶反应、定量分析的效率相同,所以内标物的信标对相同反应,作为分析对象物质拥有的反应效率的尺度。
如果预先知道作为内标物的核酸的量或者往核酸定量标准物质添加相同量的内标物,这种分析方法一本称为同位素稀释质谱法(isotope dilution massspectrometry),这在分析化学领域利用为物质定量分析法。但是同位素稀释质谱法必须准备被分析对象物质置换为同位元素的内标物。在分析化学领域,主要对象的物质因为分子量小、结构单纯,置换为同位元素的内标物准备相对容易,从工业用试剂公司也可以容易购买。但是核酸,因为分子量非常大(基因核酸一般是10kb的长度、分子量7MDa以上,血液内循环核酸一般是长度150bp、分子量为100kDa左右)结构复杂,所以不容易准备同位素稀释内标物。虽然具有以上困难曾经有过如下开发,把大肠菌放入,只以无机元素构成的最小培养基和添加被同位元素置换的氮源(硫酸铵,ammonium sulfate)及碳素源(甘油,glycerol)的培养基里进行培养,把整个核酸以稳定同位元素标记的方法。本发明着眼于如上技术,生产出以稳定同位元素标记的大肠菌基因核酸,并把该核酸利用为介质内核酸分析的内标物。
作为内标物的SILD在分析开始的时候,相同量添加到分析对象样品和比较对象样品(对照群或者标准物质)。被13C,15N等稳定同位元素置换的SILD,因为与原样品中的分析对象核酸有相同的化学特性,不仅在核酸提取和精制过程,在随后的酶反应、质量分析过程中原则上具有相同效率。在作为最终分析阶段的质量分析结果中,因为被稳定同位元素置换而检测出不同的电荷-质量之比(m/z)值,所以根据所添加的内标物核酸的信标进行分离。
所述质量分析过程使用了液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-massspectrometry,LC-MS)分析方法。
另外,因为在分析开始的时候往分析对象样品和比较对象样品(对照群或者标准物质)添加了相同量的SILD,所以从各个样品出来的内标物的仪器信号值(在质量分析仪里的峰面积)作为各个样品的精制、酶反应、质量分析效率的客观尺度。
本发明是有关一种核酸的定量分析方法的发明,包括如下内容步骤。1)13C及/或者15N的SILD准备阶段;2)把所述被置换的核酸(SILD)作为内标物,相同量添加到分析对象样品及对照群样品里的阶段;3)从所述分析对象样品及所述对照群样品中获得核酸的阶段;4)以单一核苷的水准,把从所述3)阶段获得的核酸加水分解阶段;5)利用从所述4)阶段得到的核苷通过质量分析,获得与正常核苷被置换的核酸(SILD)中的核苷的检测值的阶段;6)利用从所述被置换的核酸(SILD)中的核苷检测值应分析对象样品和对照群样品中一样的特点,在分析对象样品核酸量进行归一化的阶段。
在这里核酸指的是DNA或者RNA,样品指的是以下物质中的至少一种以上。所述物质包括全血、血浆、血清、尿、唾液、汗、牛奶、动物提取液、植物提取液、细胞提取液、细胞培养液、饮用水、自来水、河水、江水、海水。
13C及/或者15N的SILD是从大肠菌、人体、小白鼠、酵母、植物、果蝇、极小的线虫中的至少一种物质中得到的,最好是从大肠菌得到的。
从样品得到核酸的阶段可能是提取及精制阶段。
把核酸以单一核苷水准加水分解的方法是如下方法中的至少一种以上。如,酶反应、酸处理、热处理、放射线处理、超音波处理。特别是,核酸总量的99.5%以上(重量基准)被加水分解成单一核苷。
所述归一化阶段利用如下公式计算。
在这里,核酸(分析对象)指的是分析对象样品的核酸量,核酸检测值(分析对象)指的是分析对象样品中核酸质量分析的检测值,核酸(对照群)指的是对照群样品中的核酸量,核酸检测值(对照群)指的是对照群核酸质量分析中的检测值,SILD检测值(对照群)指的是对照群样品中被置换核酸(SILD)的质量分析检测值,SILD检测值(分析对象)指的是分析对象样品中被置换核酸(SILD)的质量分析检测值。
发明效果
本发明的效果如下。把SILD作为内标物,对介质中的核酸提取和精制过程中发生的收率的差异进行归一化。并且,所添加的内标物,可以对精制后的酶反应和质量分析效率也进行归一化。比如,残留一些不纯物质的时候,酶反应或者质量分析的离子化效率可能会所有变化,因为内标物同样也受到所述效果,所以可以利用内标物的信标比值对分析对象物质所受的阻碍效果进行归一化。综合所述,SILD作为内标物的使用,可以归一化介质样品为核酸定量分析中伴随的所有程序及反应效率,可以改善介质核酸定量分析的准确度。
附图说明
图1是把SILD利用为内标物,对介质内核酸进行定量的过程模式图。‘*’表示稳定同位素标识物质。
图2是为把SILD作为内标物而生产出的大肠菌基因DNA的质量分析结果。
图3是把SILD作为内标物,对DNA提取及精制效率进行归一化结果的示意图。
图4是把SILD作为内标物,对人体血清中的自由核酸(cell free DNA)量的测定结果示意图。
具体实施方式
本发明是一种有关介质内核酸的定量分析法,包括如下阶段为特点。1)把SILD作为内标物,往分析对象样品和比较对象样品(对照群或者标准物质)相同量添加阶段,2)从个样品中提取或者精制核酸的阶段,3)精制的核酸通过酶反应,以单一核苷水平加水分解阶段,4)通过液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)对各个核苷和稳定同位素被置换的核苷分离、检测、定量阶段,5)利用内标物的信标,归一化整个阶段的效率差,定量计算分析对象样品内的核酸量的阶段。
图1是把SILD利用为内标物,对介质内核酸进行定量的过程模式图。把SILD相同量添加到分析对象样品和比较对象样品(或者标准物质样品)中后,对两个样品依次进行提取及精制、通过酶化反应的加水分解、质量分析。在最终质量分析结果中,相同量添加的SILD信标成为两个样品的整个反应效率和收率的尺度,根据图中描述的公式,正确是根据如下记载的公式,可以计算介质内核酸的绝对量或者相对量。
在这里,核酸(分析对象)指的是分析对象样品的核酸量,核酸检测值(分析对象)指的是分析对象样品的核酸在质量分析中的检测值,核酸(对照群)指的是对照群样品的核酸量,核酸检测值(对照群)指的是对照群样品中的核酸通过质量分析中的检测值,SILD检测值(对照群)指的是对照群样品中被置换核酸(SILD)在质量分析中的检测值,SILD检测值(分析对象)指的是分析对象样品中被置换核酸(SILD)在质量分析中的检测值。
为了实施本发明,首先有必要生产SILD。
1.SILD的生产及确认
SILD的生产是根据参考文献(Appl Microbiol Biotechnol(2010)88:771-779)所述的方法进行的。简单的说明如下。使用了只由必需无机元素构成的LMR培养基(176mMKH2PO4,25mM NaOH,10μl H2SO4,12.6mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,10microMole FeSO4,0.2%Trace metal solution)组成中利用了以15N置换的(NH4)2SO4,用0.2%的13C置换的甘油(glycerol)作为(Cambridge Isotope Laboratory)碳素源添加的培养基。大肠菌使用了标准菌株KCTC11。从稳定同位素培养基中培养出的大肠菌中的基因DNA提取利用了GeneluteBacterial genomic DNA kit(Sigma-Aldrich)。
为了确认被提取的基因DNA是否以稳定同位素标记,利用DNase I(Takara)和Phosphodiesterase I(Affymetrics)把约500ng的DNA加水分解成核苷水平,通过LC-Quadrupole-TOF(AB SCIEX 5600)质量分析仪检测各个核苷(参照图2)。
如图2所示,在一般培养基培养的大肠菌DNA和稳定同位素培养基培养的大肠菌DNA,dCMP和TMP的分子量相差12,dAMP和dGMP相差15。这种差异相当于是假设每个核苷中的碳元素和氮元素都被置换的条件下,所发生的相差。并且,在稳定培养基中培养出来的DNA中分子量小的正常核苷不会被检测。所以,根据本发明的实施方案,可确认大肠菌DNA以接近于100%水平,标记为稳定同位素的事实。
2.介质DNA的提取和精制效率归一化及DNA定量分析
把标记为稳定同位素的大肠菌DNA作为内标物添加的时候,为了确认介质DNA提取及精制效率是否正确归一化,把蛋白质医药品保管用缓冲存储器(hGH buffer:2.25%Mannitol,0.5%Glycine,0.15%Sodium phosphate,5mg/mL Bovine serum albumin)作为代表性介质。往缓冲存储器添加作为分析对象样品的100ng的已知量DNA,作为内标物添加相当于100ng的SILD。把相同量的SILD作为标准物质添加到已知量的human placental DNA及dNMP样品中。添加了SILD的样品,利用PCR purification kit(QPK,Qiagen),QiaAmp DNABlood mini kit(QBD,Qiagen),Serum/plasma cell free DNA midi kit(Sigma,Sigma-Aldrich)QiaAmp circulating nucleic acid kit(QC,Qiagen)等4中不同套组进行提取及精制(图3)。DNA利用DNase I(Takara)和Phosphodiesterase I(Affymetrics)加水分解成核苷酸(dNMP)水准后,再用Shrimp alkaline phosphatase(Takara)加水分解成核苷(dN)。被加水分解的4种核苷,通过LC-Quadrupole-TOF(AB SCIEX 5600)进行定量分析。从各个被精制的样品中计算出来的正常核苷的峰面积和SILD中得到的核苷峰面积为基础,利用下面公式计算出介质内DNA量。下面公式只适用在分析对象样品和内标物适用相同的100ng的情况。
按套组归一化前和归一化后的定量结果在图3中进行比较。没有用SILD归一化而进行定量的结果与最初基准值相比,根据套组显示20-70%水平的定量值。反而,在本发明提出的用SILD精制及加水分解反应的归一化结果中可以得到相对于基准值的90-105%水平的定量值。这种结果意味着,在介质内核酸定量分析中,把SILD利用为内标物,可以显著提高定量的正确度。还确认了利用SILD内标物,甚至在省略了核酸精制过程,也可以达到非常正确的核酸定量的事实。
在图3所示,没有归一化的时候,核苷的峰面积是基准值的50%程度,可以确认被酵素加水分解的效率及质量分析的离子化效率比精制的核酸低。这种效率降低的原因可解释为,是因为包含在hGH缓冲存储器里的阻碍因素没有被精制过程除去。但是如果利用SILD,因为对低的加水分解效率和离子化效率也可以进行归一化,所以最终结果的核酸定量值达到基准值的101.5%,可以很正确的定量。根据如上观察结果可以得到,利用SILD作为内标物,与介质内核酸量提取和精制套组无关甚至不精制的时候也是可以非常准确测定核酸量的结果。
3.人体血清中的自由DNA定量分析
以安全同位元素标记的大肠菌DNA作为内标物添加的时候,为了确认介质DNA提取和精制效率是否正确归一化,对人体血清中的自由DNA进行了定量分析。在对血清中的自由DNA进行精制之前往16个人体血清0.5ml样品里添加了约50ng的SILD。并且,往作为定量基准的已知量的dNMP标准混合物(4种核苷,每个浓度为20ng/ml)也添加了相同量的SILD作为内标物。
添加SILD的样品利用Circulating cell free DNA purification kit(Qiagen)提取了DNA。被提取的DNA如所述相同方法通过加水分解后在LC-MS定量分析。其结果在图4中所示。图4中显示的测定范围为50-500ng/ml,比一般的没有归一化的DNA提取和精制效率实验中计算结果20-100ng/ml显示出相当高的值分布。若考虑到DNA精制中使用的套组的精致效率为40%,在本发明中使用的测定方法对此精制效率进行了完整的归一化,所以判断得到了约2倍高的测定值。通过以上的结果可以确认本发明提供的‘把稳定同位素标记DNA利用为内标物的介质内DNA测定法’可以对DNA的精制效率、被酵素导致的加水分解效率、在LC-MS中的变动性可以同时进行归一化,是可以准确定量的方法。
工业利用可能性
本发明是把SILD作为内标物来使用,目的是对介质内核酸的提取和精制过程中发生的收率的差异进行归一化。并且所添加的内标物也可以归一化精制后的酶反应及质量分析效率差异。比如,剩余一些不纯物质的时候,酶反应或者质量分析离子化效率可能会发生变化,因为内标物也同样受这种效果,可以利用内标物的信标比,可以归一化分析对象物质所受的阻碍效果。综所所述,SILD作为内标物的使用可以对介质样品的核酸定量分析中进行的所有程序和反应的效率进行归一化,以此可以改善介质核酸定量分析的准确度。
Claims (8)
1.一种核酸的定量分析方法,包括:
1)被13C和/或者15N的稳定同位元素置换的核酸SILD的准备阶段;
2)把所述被置换的核酸SILD作为内标物,往分析对象样品和核酸量是已知的对照群样品里各添加相同质量的量的阶段;
3)从所述分析对象样品及所述对照群获得核酸的阶段;
4)把从所述3)阶段获得的核酸,以单一核苷水平加水分解的阶段;
5)在质量分析中,从所述4)阶段获得的核苷,获得与正常核苷置换的核酸SILD中的核苷检测值的阶段;
6)利用所述被置换核酸SILD中的核苷的检测值应该与分析对象和对照群样品中的一样的特性,对分析对象样品核酸的量进行归一化的阶段,
所述归一化阶段利用如下公式计算的核酸的定量分析方法;
在这里,核酸(分析对象)指的是分析对象样品的核酸量,核酸检测值(分析对象)指的是分析对象样品中的核酸在质量分析中的检测值,核酸(对照群)指的是对照群样品的核酸量,核酸检测值(对照群)指的是对照群核酸在质量分析中的检测值,SILD检测值(对照群)指的是对照群样品中被置换核酸SILD在质量分析中的检测值,SILD检测值(分析对象)指的是分析对象样品中被置换核酸SILD在质量分析中的检测值。
2.根据权利要求1所述的定量分析方法,其特征在于,所述的核酸指的是DNA或者RNA,样品指的是以下物质中的一种以上,所述物质包括全血、血浆、血清、尿、唾液、汗、牛奶、动物提取液、植物提取液、细胞提取液、细胞培养液、饮用水、自来水、河水、江水或海水。
3.根据权利要求2所述的定量分析方法,其特征在于,所述核酸是DNA,所述样品是血清。
4.根据权利要求1所述的定量分析方法,其特征在于,所述被置换核酸SILD来自于肠菌、人体、小白鼠、酵母、植物、果蝇、极小的线虫中的一种。
5.根据权利要求4所述的定量分析方法,其特征在于,所述被置换核酸SILD是来自大肠菌。
6.根据权利要求1所述的定量分析方法,其特征在于,所述步骤3)的获得阶段为提取及精制。
7.根据权利要求1所述的定量分析方法,其特征在于,所述加水分解是酶反应、酸处理、热处理、放射线处理、超音波处理中的一种以上。
8.根据权利要求1所述的定量分析方法,其特征在于,基于重量基准,所述单一核苷水平是核酸总量的99.5%以上被加水分解成单一核苷。
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2018
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