CN114457083A - 一组特异识别孔雀石绿的单链dna核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用，属于食品安全生物技术领域。本发明利用链霉亲和素修饰磁珠辅助分离的Capture‑SELEX指数富集配体系统进化技术，经过9轮的反复孵育、分离亲和序列和无亲和序列、乳化液PCR扩增、制备单链的体外筛选，获得了核酸适配体，验证出3条有亲和力的识别孔雀石绿核酸适配体，从中选出具有亲和力和高特异性的DNA核酸适配体(MG‑36‑12，MG‑36‑16，MG‑36‑17)。将该DNA核酸适配体应用于实际样品的孔雀石绿检测，对水产养殖中孔雀石绿的分析检测具有应用前景。该核酸适配体容易人工合成，方便化学修饰，稳定性好，可长期保存。

Description

一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于食品安全生物技术领域，经过配体指数富集系统进化技术筛选获得对孔雀石绿具有亲和性和特异性的识别元件，即单链DNA核酸适配体的序列，具体涉及一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用。
背景技术
孔雀石绿(Malachite green，MG)是高效而低成本的阳离子型三苯甲烷染料，是治疗真菌、细菌和寄生虫感染的高效能药物。孔雀石绿可用于纸业、纺织业、丙烯酸行业，可作为驱虫药、食品和着色添加剂、医用消毒剂等。在水产品的养殖过程中，很多渔民用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等。作为杀菌剂，孔雀石绿可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，例如受真菌Saprolegnia感染的鱼卵和受寄生虫影响的淡水水产。在运输过程中，为了使鳞受损的鱼延长生命，鱼贩也常使用孔雀石绿。孔雀石绿进入水生动物体后经过一系列的代谢变成了隐性孔雀石绿，并在脂肪组织中蓄积，且通过食物链转化进入人体。孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，因此对人体具有许多不利影响。此外，水产养殖用水中残留的MG也可能对水资源造成严重污染。其在养殖业中的使用未得到美国食品与药物管理局(FDA)的认可；根据欧盟法案2002/675/EC的规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2μg/kg；日本也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留；我国在农业行业标准《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。但由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。
在水产养殖、水产品运输和售卖过程中添加使用孔雀石绿，一方面水中会有残留，一方面孔雀石绿进入水生动物体内经过一系列生物反应很容易转为毒性更强的隐性孔雀石绿，因此常将二者的总含量作为检测水产品中孔雀石绿残留量的限量指标。目前，检测孔雀石绿的检测分析方法有理化检测和免疫学检测，理化检测包括气相色谱质谱联用法、液相色谱质谱串联检测法、高效液相色谱法、气相色谱法、分光光度法以及薄层层析法；而免疫学检测通常采用酶联免疫检测法，包括了基于生物抗体酶联免疫法、基于仿生抗体的酶联免疫、化学发光免疫法等。理化检测通常需要使用检测仪器价格高，检测费时长，操作人员需要专门培训，操作复杂。免疫学检测针对特殊位点小分子免疫原筛选有一定的难度，制备抗体的成本昂贵，不同批次重复性和稳定性容易受影响，储存条件也比较严苛。免疫胶体金检测技术虽然具有快速、简单，不需要昂贵的检测仪器等优点，但是产品检测结果的准确度不高、灵敏度差。这些检测方法对样品前处理和环境有较高的要求。因此，开发其他快速检测方法检测样品中的孔雀石绿是十分有必要的。
核酸适配体(Aptamer)是1990年来新兴的一种靶标识别元件，是长度一般为20～100nt的单链寡核苷酸，通常为单链DNA、单链RNA和单链人工核酸组成的寡核苷酸链。在一定条件和环境下，核酸适配体可折叠形成发卡、假节、凸环、G-四联体等高级结构和空间构象，通过氢键作用、静电引力作用、范德华力等与目标靶标物结合。核酸适配体具有类似“抗体”的功能，其与靶标结合的亲和性和特异性可达pM，nM等级别，与抗体相比也具有优势：(1)分子量比较小，通常只有5～25kD，远小于抗体；(2)筛选和生产不需要使用动物，化学合成即可，生成批次差异小，成本较低；(3)相比抗体，其可以储存和运输条件不严苛，可反复热变性使用，也能进行标记和化学修饰；(4)适配体的靶标类型比较广泛，包括了细胞、细菌和酶、生长因子、抗体、核酸等生物大分子，甚至是氨基酸、核苷酸、金属离子、毒素、抗生素、有机染料等小分子。特别是一些免疫原性低或没有免疫原性的小分子难以产生抗体，但可以筛选其亲和的核酸适配体来替代抗体。经过筛选获得的核酸适配体结合一些生物传感器，如比色法、荧光法、电化学法等，把靶标和核酸适配体结合的反应转化为可观测的光电信号，实现目标靶标物的检测。
目前，筛选核酸适配体的方法主要是配体指数富集系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是一种体外筛选技术，在这基础上已经改进和发展了一些针对不同靶标，不同应用环境等的SELEX筛选技术。其中，针对小分子靶标物筛选中，通常通过靶标固定在基质上，如酶标板、磁珠、亲和层析柱等，这种固定方法由于空间排阻效应使小分子丧失部分结合适配体的识别位点，或改变了小分子的天然构象，影响适配体的筛选成功率和应用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体。该单链DNA核酸适配体能有效亲和的、特异性识别孔雀石绿。
目前，虽然已有孔雀石绿的适配体被筛选获得，使用较多的是RNA核酸适配体。
本发明的另一目的在于提供上述单链DNA核酸适配体的应用。尤其是应用于实际样品的检测，为推动其应用奠定了研究基础。
本发明以水产品中违法使用的孔雀石绿为筛选靶标，利用Capture-SELEX，经固定文库的方式，将初始筛选文库通过一段互补序列和链霉亲和素-生物素结合固定在磁珠上，靶标完全暴露在筛选体系中，并且是孔雀石绿草酸盐形式的靶标，通过磁铁将亲和序列和非亲和序列分离，筛选到对孔雀石绿具有亲和性和特异性的单链DNA核酸适配体。该适配体可用于快速、灵敏、特异地检测水产品及其水中的孔雀石绿，为实现孔雀石绿的快速检测提供了新的识别元件。
本发明筛选的核酸适配体的靶标为孔雀石绿草酸盐，分子式为C23H25N2·C2HO4·0.5C2H2O4，分子量为463.5，标准值为98.5％，相对扩展不确定度0.8％。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
为实现筛选孔雀石绿DNA核酸适配体，本发明采用Capture-SELEX利用磁性辅助分离的筛选技术，将初始随机文库通过一段互补序列和链霉亲和素-生物素结合固定在磁珠上，靶标完全暴露在筛选体系中，通过磁铁将亲和序列和非亲和序列分离，pcr扩增候选序列，单链序列制备等步骤每轮筛选，从第一轮开始每轮都进行反筛，在每一轮筛选中均用荧光定量PCR监测各项数据。在文库富集以后，用qPCR检测得到的各次级文库的亲和力，然后将筛选得到的9轮文库进行高通量测序，测序后合成了若干条候选序列检测亲和力，获得了3条结合孔雀石绿的单链DNA核酸适配体，其序列分别为：
MG-36-12：5′-CCATGCGACGGACAGCACGTGTCACCGCGATCAGCC-3′；
MG-36-16：5′-CCACCCGACAGCCAGTCACGCGCATCGTACAGACCG-3′；
MG-36-17：5′-CGCAGCGCGGCAGACAGTCAGGCTCAGCACGTGGCA-3′；
MG-76-16-6A：5′-AAAAAAGTTCGTGGTGTGCTGGATGTCCACCCGACAGCCAGTCACGCGCATCGTACAGACCGTGACACATCCAGCAGCACGA-3′。
36、76指的是核苷酸数目，12，16，17分别指的是序列代号。
MG-76-16-6A是MG-36-16的衍生物。
优选的，所述单链DNA核酸适配体的序列为人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
优选的，所述单链DNA核酸适配体的序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
优选的，所述单链DNA核酸适配体的序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米材料、小肽、siRNA或酶。
优选的，所述的荧光标记物为FAM荧光素；所述的纳米材料为氧化石墨烯。
以上经修饰或连接处理后的核酸适配体，仍具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与孔雀石绿的结合；经修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与孔雀石绿的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。
本发明特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体衍生物，该衍生物是由上述核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由上述核酸适配体改造成的肽核酸。
上述单链DNA核酸适配体或单链DNA核酸适配体衍生物在分离富集及分析检测孔雀石绿中的应用。
进一步，上述单链DNA核酸适配体或单链DNA核酸适配体衍生物在水产养殖、水产品中或其他基质和条件下检测孔雀石绿中的应用。
上述单链DNA核酸适配体或单链DNA核酸适配体衍生物在制备孔雀石绿检测试剂、分子探针、试剂盒或传感器中的应用。
一种特异识别孔雀石绿的试剂盒，包含上述单链DNA核酸适配体或单链DNA核酸适配体衍生物。
一种分子探针，包含上述单链DNA核酸适配体或单链DNA核酸适配体衍生物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的核酸适配体是DNA的单链核酸适配体，容易人工合成，方便化学修饰，稳定性好，可长期保存。
(2)相比其他方法筛选获得的孔雀石绿核酸适配体，本发明的孔雀石绿核酸适配体是由固定初始文库进行筛选，避免固定靶标小分子以致于丧失部分适配体的识别位点，用游离的，保持天然构象的靶标分子进行筛选，筛选到与天然构象的孔雀石绿进行亲和结合的DNA亲和序列。
(3)筛选过程使用的是孔雀石绿草酸盐为靶标，是孔雀石绿常见的结构形式之一，市面上出售的也多是草酸盐形式。
(4)本发明利用链霉亲和素修饰磁珠辅助分离的Capture-SELEX指数富集配体系统进化技术，经过9轮的反复孵育、分离亲和序列和无亲和序列、乳化液PCR扩增、制备单链的体外筛选，获得了核酸适配体，经微量等温滴定法验证出3条有亲和力的识别孔雀石绿核酸适配体，从中选出具有亲和力和高特异性的DNA核酸适配体(MG-36-12，MG-36-16，MG-36-17)。将该DNA核酸适配体应用于实际样品的孔雀石绿检测，对水产养殖中孔雀石绿的分析检测具有应用前景。
附图说明
图1是本发明中基于Capture-SELEX方法筛选孔雀石绿的核酸适配体ssDNA每轮保留率。
图2是本发明中筛选的与孔雀石绿具有高特异性、高亲和力的核酸适配体MG-36-12、MG-36-16、MG-36-17的二级结构预测图。
图3是本发明中筛选的与孔雀石绿具有高特异性、高亲和力的核酸适配体MG-36-12、MG-36-16、MG-36-17的亲和力ITC检测图；其中，(a)：空白对照(DPBS)；(b)：MG-36-12；(c)：MG-36-16；(d)：MG-36-17。
图4是本发明中筛选的与孔雀石绿具有高特异性、高亲和力的核酸适配体MG-36-12、MG-76-16-6A、MG-36-17的不同孔雀石绿浓度检测图。
图5是本发明中筛选的与孔雀石绿具有高特异性、高亲和力的核酸适配体MG-36-12、MG-76-16-6A、MG-36-17的特异性检测图。
图6是本发明中筛选的与孔雀石绿具有高特异性、高亲和力的核酸适配体MG-36-17在实际水样中的孔雀石绿检测柱形图。
图7是基于FAM荧光-氧化石墨烯荧光传感器检测孔雀石绿的原理图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、初始随机ssDNA文库和引物的合成
构建了长76nt的随机ssDNA文库，两端引物各20个碱基，中间随机区域36个碱基。
5′-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT-N36-TGACACATCCAGCAGCACGA-3′(N36代表36个随机核苷酸)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2、引物合成
S1：5′-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT-3′；
A2：5′-TCGTGCTGCTGGATGTGTCA-3′；
S1-FAM：5′-FAM-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT-3′；
A2-ployA：5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Spacer18-TCGTGCTGCTGATGTGTCA-3′；
A2-biotin：5′-biotin-TCGTGCTGCTGGATGTGTCA-3′；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
3、缓冲液信息
DPBS(pH 7.2～7.4)：137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，1mMCaCl2，0.5mM MgCl2。
4、文库固定
1)文库慢速变复性，文库干粉从冰箱取出，14000rpm离心，稀释20倍，离心混匀。筛选第一轮，以初始文库终浓度5μM，A2-biotin引物28μM，体系共280μL混合。一般用带滤芯的枪头操作，废弃枪头打入袋中，防止气溶胶污染。使用PCR仪进行变复性，程序为95℃10min，缓慢降到60℃，在60℃保持1min，最后缓慢降温至25℃(降温速率0.1℃/s)。
2)吸取1mL DynabeadsMyOne Streptavidin C1磁珠，1mL DPBS清洗磁珠5到6次，最后一遍暂时将磁珠保存于DPBS buffer中，防止磁珠干燥。从第二轮开始每轮使用80μLDynabeadsMyOne Streptavidin C1磁珠。
3)变复性后的文库取1μL稀释50倍，使用微量紫外分光光度计测浓度记为C1。将变复性的文库加入磁珠中，在室温下温和旋转孵育60min。使用磁铁将磁珠与上清分离，保留磁珠。在上清取1μL稀释50倍，测一下浓度记为C2，比较一下两次测的文库的浓度，计算一下文库固定率。
5、靶标与固定文库孵育
1)使用400μL DPBS加入磁珠中，清洗磁珠共6遍以去除易脱落的文库序列，第四次洗脱时以200μL DPBS反筛40min，上清分别记为Wash1～Wash6，其中Wash4为反筛上清。
2)将小分子孔雀石绿草酸盐溶解后，用DPBS稀释到200μM，取200μL加到上述1)中的磁珠中，摇床孵育40min，磁铁吸附，吸取上清记为Elution。
3)将Wash1～Wash6和Elution均12000rpm转离心2min；取罗氏8联排PCR管，每孔加入30μL q-PCR mix(包括引物S1、A2)，再分别加入Wash1～Wash6和Elution各2μL作为模板，进行荧光定量PCR。程序如下：95℃2min；95℃0.5min，60℃0.5min，72℃0.5min 25cycle。以q-PCR中Cq值计算每轮筛选的ssDNA保留率。方法为用已知浓度的文库稀释到不同浓度进行q-PCR，将浓度与对应的Cq值制作标准曲线，然后根据Wash1～Wash6和Elution样品的Cq值，代入标准曲线中，计算出分子数。每一轮筛选得到的与靶标或者反筛靶标结合的文库的分子数与投入的总文库序列数的比例，我们称之为保留率。
6、制备单链
1)将步骤5中的Elution加入到2mL e-PCR mix(包括引物S1-FAM、A2-ployA)里，混匀。再加入8mL乳浊液PCR扩增油，制备乳浊液。
2)分装到PCR管，每管100μL，乳浊液PCR扩增25cycle。程序为：95℃2min；95℃1min，60℃1min，72℃1min，扩增25cycle；
3)回收PCR产物，用5～5.5倍体积的正丁醇浓缩PCR产物。
4)将PCR产物通过7M尿素变性PAGE胶电泳，300V，分离单链，在紫外照胶仪下将76nt，带有荧光的片段切胶回收，加入2.2mL DPBS buffer煮胶回收、正丁醇浓缩单链DNA。
5)使用3.5KD透析袋，DPBS buffer过夜透析上述ssDNA，微量紫外测定浓度，获得的单链DNA作为次级文库，重复上述筛选流程。
按照如上第一轮的操作，总共筛选9轮，筛选大概流程类似，下表1中列出了各轮筛选间的差异。
表1 Capture-SELEX过程中每轮筛选条件
Figure BDA0003489271680000071
Figure BDA0003489271680000081
9轮筛选的保留率验证结果如图1所示，说明第9轮文库的亲和力很高，且正筛保留率高过反筛保留率，筛选结束，可以将每轮筛选文库进行高通量测序。
7、高通量测序和序列分析
将孔雀石绿草酸盐小分子核酸适配体各轮筛选所得单链核酸文库记为Pool(如Pool1为第一轮筛选获得的文库)，Pool 7的Wash4，Pool 7的Elution，Pool9的Wash4和Pool9的Elution样品进行高通量测序。将样品进行纯化(UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒，上海生工生物工程)，将样品作为模板进行PCR，UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒回收扩增出的双链。将扩增产物用高盐吸附到柱上，再进行低盐洗脱后使用Illumina平台上机高通量测序。得到的各个Pool的ssDNA序列信息按照出现频率从高到低进行排序，用NUPACK对序列进行二级结构分析(见图2)(http://www.nupack.org/)和ClustalX进行同源比对和MEGA-X进化树分析，挑选出24条序列进行合成和亲和力检测。如表2所示。
表2挑出的24条ssDNA序列信息
Figure BDA0003489271680000082
Figure BDA0003489271680000091
8、亲和力分析
将表2中的24条候选ssDNA序列进行微量等温滴定量热法(ITC)测定其解离常数Kd值，使用纯水滴纯水确保ITC仪器可正常使用，将10mM的孔雀石绿草酸盐溶液上样到滴定针中，100μM的克隆序列上样在池子中，19滴滴定模式进行测试，其中MG-36-12(即MG-12)，MG-36-16(即MG-16)，MG-36-17(即MG-17)在one set of sites模式进行拟合结合曲线。表明这3条核酸适配体与孔雀石绿草酸盐有亲和性，获得了Kd值，分别为169.78μM，71.94μM，102.46μM。其中MG-36-16的Kd值最小，表明与MG的亲和力最强(见图3)。
9、基于荧光-氧化石墨烯荧光传感器方法检测不同浓度的孔雀石绿分析
根据亲和力鉴定结果，将上述MG-36-12，MG-36-16，MG-36-17序列的5′端进行FAM荧光素标记，并进行稀释，取一定量体积至终浓度为10nM，分别与200μL的300、50、400μg/mL单层氧化石墨烯溶液进行混合孵育10分钟，淬灭荧光。将300μL的不同浓度孔雀石绿标准溶液，0、4、8、16、30、60、100、150、200、300、400、550、650、750、800、1,000、1,200、1,500、1,800、2,000、3,000、4,500、6,000、10,000、15,000、20,000ng/mL的孔雀石绿标准溶液，孵育20分钟。孔雀石绿与核酸适配体进行结合，导致核酸适配体构象折叠脱离氧化石墨烯，其FAM荧光得到恢复(原理图见图7)。经荧光-氧化石墨烯荧光传感器方法检测孔雀石绿实验发现MG-36-12，MG-36-17在该方法中检测孔雀石绿较为灵敏、准确，MG-36-16在该方法中检测效果不佳，于是通过在MG-36-16两端分别加长两端引物序列GTTCGTGGTGTGCTGGATGT与TGACACATCCAGCAGCACGA，并在其5′端增加PolyA6，记为MG-76-16-6A。将MG-76-16-6A应用于荧光-氧化石墨烯荧光传感器方法检测孔雀石绿。通过酶标仪检测其荧光恢复程度，实现孔雀石绿的检测(见图4)。
其中，MG-76-16-6A：5′-AAAAAAGTTCGTGGTGTGCTGGATGTCCACCCGACAGCCAGTCACGCGCATCGTACAGACCGTGACACATCCAGCAGCACGA-3′。
10、特异性分析
将上述MG-36-12，MG-76-16-6A，MG-36-17序列进行特异性分析。配制一定浓度的标准溶液母液，并用DPBS缓冲溶液稀释到相应浓度，包括孔雀石绿、呋喃西林代谢物、呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃它酮代谢物、氧氟沙星、氯霉素、隐色孔雀石绿、磺胺二甲嘧啶、结晶紫、磺胺吡啶、盐酸二氟沙星常用兽药。将每条核酸适配体的5′端进行FAM荧光素标记，并进行稀释，取一定量体积至终浓度为10nM，分别与200μL的300、50、400μg/mL的单层氧化石墨烯溶液进行混合孵育10分钟，淬灭荧光。分别加入1200、750、2000ng/mL的孔雀石绿标准溶液，其他靶标浓度为相应反应体系中孔雀石绿浓度的两倍如2400、1500、4000ng/mL进行孵育20分钟，孔雀石绿与核酸适配体进行结合，导致核酸适配体构象折叠脱离氧化石墨烯，其FAM荧光得到恢复，而其他靶标不能与孔雀石绿核酸适配体结合，其反应体系荧光值仍然很低(见图5)。
11、实际水样中加标孔雀石绿检测
将上述MG-36-17序列进行市场中活鱼售卖中养殖水的加标实验检测。将每条核酸适配体的5′端进行FAM荧光素标记，并进行稀释，取一定量体积至终浓度为10nM，与200μL的400μg/mL的单层氧化石墨烯溶液进行混合孵育10分钟，淬灭荧光。MG-36-17检测体系中分别加入100、1000、2000ng/mL的孔雀石绿标准溶液，进行孵育20分钟，孔雀石绿与核酸适配体进行结合，导致核酸适配体构象折叠脱离氧化石墨烯，其FAM荧光得到恢复(见图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttcgtggtg tgctggatgt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntgac 60
acatccagca gcacga 76
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S1
<400> 2
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> A2
<400> 3
tcgtgctgct ggatgtgtca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S1-FAM
<220>
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<400> 4
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> A2-biotin
<220>
<222> (1)..(1)
<223> biotin修饰
<400> 5
tcgtgctgct ggatgtgtca 20
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-1
<400> 6
ccgccacagg acagccagtc tgatcgccat gacgac 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-2
<400> 7
agcccgagct gcagccagaa tgtgccacgt gtacgt 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-3
<400> 8
cgagacacag tcacgtgcat ccagtcagca tgcgtc 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-4
<400> 9
tgcaacacaa cagccagtca tgccggtgca cagtca 36
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-5
<400> 10
ccccgacagc cggcacaatg tgtctgccac ggacgt 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-6
<400> 11
cgcaacgcgg caacagagca cagatcgcac agactg 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-7
<400> 12
cgagccgaac gagacgtcca gtccgtgccc acgcac 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-8
<400> 13
tgtgcccaca actccagtca cgttcgtcca gctcag 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-9
<400> 14
tctcgcaaca gccagcgtca tgtgaccacg gaacca 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-10
<400> 15
cgcgcagcgg cagacagtca gactgcgacg cacgtt 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-11
<400> 16
catgcccaac gacatgcagc acgtggccat gcacaa 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-12
<400> 17
ccatgcgacg gacagcacgt gtcaccgcga tcagcc 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-13
<400> 18
acgcatcgcg aacagccgtg ccgtgtccac gtacag 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-14
<400> 19
caccgccagg gacagccagt cacgtagccc ggaacg 36
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-15
<400> 20
cggccagacg acagccagtc accggacacg atcagg 36
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-16
<400> 21
ccacccgaca gccagtcacg cgcatcgtac agaccg 36
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-17
<400> 22
cgcagcgcgg cagacagtca ggctcagcac gtggca 36
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-18
<400> 23
ccgcagcacg gtcgtacagc agctgccacg gcatcc 36
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-19
<400> 24
cgcagacagc cagtcaggga gcgtccagtc cgacac 36
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-20
<400> 25
cgcacagcaa gacagccagt caacagccgc gaatgt 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-21
<400> 26
ccatgcagcc agcgtccacc gtccgtacag tacgtg 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-22
<400> 27
cgcgcacaga cagcgtcatg gccacgtaca gttcct 36
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-23
<400> 28
cgctacgaca gacagcgtcg agcacacaac gttgcg 36
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-24
<400> 29
acgcacgtac ggccagtcat atgcgcaccg cgttca 36
<210> 30
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MG-76-16-6A
<400> 30
aaaaaagttc gtggtgtgct ggatgtccac ccgacagcca gtcacgcgca tcgtacagac 60
cgtgacacat ccagcagcac ga 82

Claims (10)

1.一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体，其特征在于：该单链DNA核酸适配体为MG-36-12、MG-36-16、MG-36-17、MG-76-16-6A中的任一种，其序列分别为：
MG-36-12：5′-CCATGCGACGGACAGCACGTGTCACCGCGATCAGCC-3′；
MG-36-16：5′-CCACCCGACAGCCAGTCACGCGCATCGTACAGACCG-3′；
MG-36-17：5′-CGCAGCGCGGCAGACAGTCAGGCTCAGCACGTGGCA-3′；
MG-76-16-6A：5′-AAAAAAGTTCGTGGTGTGCTGGATGTCCACCCGACAGCCAGTCACGCGCATCGTACAGACCGTGACACATCCAGCAGCACGA-3′。
2.根据权利要求1所述的单链DNA核酸适配体，其特征在于：
所述单链DNA核酸适配体的序列为人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
3.根据权利要求1所述的单链DNA核酸适配体，其特征在于：
所述单链DNA核酸适配体的序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
4.根据权利要求1所述的单链DNA核酸适配体，其特征在于：
所述单链DNA核酸适配体的序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米材料、小肽、siRNA或酶。
5.特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体衍生物，其特征在于：所述单链DNA核酸适配体衍生物是由权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列，或者是由权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体改造成的肽核酸。
6.权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体或权利要求5所述的单链DNA核酸适配体衍生物在制备孔雀石绿检测试剂、分子探针、试剂盒或传感器中的应用。
7.一种特异识别孔雀石绿的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体或权利要求5所述的单链DNA核酸适配体衍生物。
8.一种分子探针，其特征在于：包含权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体或权利要求5所述的单链DNA核酸适配体衍生物。
9.权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体、权利要求5所述的单链DNA核酸适配体衍生物、权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的分子探针在分离富集及分析检测孔雀石绿中的应用。
10.权利要求1～4任一项所述的单链DNA核酸适配体、权利要求5所述的单链DNA核酸适配体衍生物、权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的分子探针在水产养殖、水产品中或其他基质和条件下检测孔雀石绿中的应用。
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