CN117965547A - 一种特异性识别α-鹅膏毒素的核酸适配体及其筛选和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性识别α‑鹅膏毒素的核酸适配体及其筛选和应用，属于生物技术领域。本发明公开了α‑鹅膏毒素(α‑amatoxin，α‑AMA)特异适配体的核酸序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18，并基于Kd最低为6.128nM的适配体Apt‑14构建电化学及比色多信号检测α‑amatoxin平台，在玻碳电极上镀金后修饰适配体，利用适配体与靶标特异性结合释放适配体互补链，引发HCR扩增进行信号放大，检出限为5ng/mL，效果良好。本方法操作简单，无酶扩增模式更有利于现场检测。

Description

一种特异性识别α-鹅膏毒素的核酸适配体及其筛选和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性识别α-鹅膏毒素的核酸适配体及其筛选和应用。

背景技术

Amanitaphalloides被认为是世界上最毒的蘑菇，大部分毒蘑菇中毒事件是由误食Amanitaphalloides引起的。从Amanitaphalloides中分离鉴定的鹅膏肽类毒素有22种，主要有鹅膏毒肽(Amatoxins)，Phallotoxins，Virotoxins，Muscarine，botenic acid，Isoxazole衍生物以及Muscimol，Coprine等。根据毒素的氨基酸和结构可以分为Amatoxins，Phallotoxins和Virotoxins三大类。

Amanitins是一种双环八肽化合物，根据其侧链取代基团的不同又可以将Amatoxins分为α-鹅膏毒肽(α-amanitin，α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-amanitin，β-AMA)、γ-鹅膏毒肽(γ-amanitin，γ-AMA)等9种。其中，α-AMA和β-AMA是毒蘑菇中引起绝大多数致命影响的毒素，化学性质稳定，耐高温耐干燥和酸碱，一般的烹调加工不会破坏其毒性，易溶于甲醇，乙醇和水，分子量在973-990Da。因此尽管经过烹饪后仍会对身体造成一系列的危害。据研究表明，一株20g左右的Amanitaphalloide往往含有5-8mg的Amatoxins，其摄入量对于一个成年人来说是致命的。对于疑似误食事件发生后，毒蘑菇中毒的重要诊断指标是对血浆等生物体液中Amatoxins检测，但由于血浆可以帮助排除毒素，导致患者在误食30小时后再就医时，血浆中Amatoxins的检测呈现阴性，这对误食者的治疗有很大的隐患。

α-AMA是真核生物依赖的RNA聚合酶II的有效抑制剂，可以阻断mRNA转录和蛋白质合成，药物代谢动力学表明α-AMA可以随着胆汁酸的肠肝循环到肝脏与RNA聚合酶II的位点进行不可逆结合，诱导肝细胞坏死。α-AMA的口服半数致死剂量(LD₅₀)在人体中大约为0.1mg/kg。根据摄入的量，肝、肾和中枢神经系统可能发生不同程度的损伤，在严重腹痛、呕吐和腹泻发作之前有6至12h的潜伏期，随后是持续48-72h的明显恢复期，之后患者经历症状的复发，例如腹痛和血性腹泻，导致恢复或导致死亡的快速恶化。大多数α-AMA中毒患者在5-8天内死于肝、肾、心、脑、肺和其他器官的多器官衰竭。因此，建立对高效、简便、灵敏的α-AMA检测方法，为预防误食毒蘑菇中α-AMA具有重要意义。

目前主要依靠液相色谱-质谱法(LC-MS)对α-AMA进行检测。虽然大多数的检测方法对α-AMA可以进行检测，但这些检测手段具有明显的优缺点，如大型仪器具有精确的灵敏度但其成本高，耗时长，需要专业的检测人员等。即时测流免疫层析法的检测时间短，ELISA操作简单，但极容易出现假阳性。因此对毒蘑菇的鉴别以及建立α-AMA的快速检测方法尤为重要。基于适配体的检测传感器具有检测快速，操作简单，设备成本低等优点。

适配体是一段单链寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)，可以通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选得到的。适配体可以与靶标如金属离子，抗生素，小分子，蛋白质甚至全细胞或者细菌等微生物进行特异性结合，因此在生化分析，环境监测以及食品安全领域等方面具有广阔应用场景。与抗体相比，适配体可以通过体外实现高纯度合成，成本低廉。此外，适配体具有高度热稳定性，低免疫原性，化学稳定性及易于标记修饰。

经过30多年的发展，适配体的筛选技术已经开发出许多种，根据筛选方式不同，分为固定文库-SELEX，固定靶标-SELEX，以及不固定文库和靶标的均相-SELEX，其中根据是否需要固定材料又详细分为氧化石墨烯-SELEX，磁珠-SELX，Capture-SELEX以及毛细管电泳-SELEX等。Capture-SELEX是一种基于固定文库对小分子靶标的筛选方法。氧化石墨烯-SELEX利用单链DNA与氧化石墨烯之间的范德华力，静电引力和氢键被吸附在氧化石墨烯上，当靶标出现时，单链核酸与靶标之间的作用力大于与氧化石墨烯之间的作用力。氧化石墨烯-SELEX免标记免固定，弥补了Capture-SELEX需要固定步骤的不足。基于SELEX的方法，筛选出α-AMA的核酸适配体，并将该序列核酸用于对α-AMA的检测。

发明内容

本发明旨在提供一种特异性识别α-AMA的核酸适配体及其筛选和应用，通过将磁珠-SELEX与氧化石墨烯-SELEX相结合，筛选得到特异性识别α-AMA的核酸适配体，与现有适配体相比，具有更高的亲和力与特异性。

本发明的第一方面提供了特异性识别α-AMA的核酸适配体Apt-14，所述核酸适配体的核酸序列为SEQ ID NO.14所示序列。

进一步的，所述核酸适配体的一级结构为：

5’-CATGCTTCCCCAGGGAGATGTTACCATCTGGCATAGGAGGTCAGGGTGCGTTTGGTATTGAGGAACATGC-3’，二级结构具有突出的茎和环，该序列的吉布斯自由能ΔG＝-3.83kcal/mol。

进一步的，所述核酸适配体的3’端或5’端经修饰物修饰。

进一步的，所述修饰物为电化学标记物，羧基。

本发明的第二个方面提供了一种修饰电极，所述修饰电极上含有上述核酸适配体Apt-14。

本发明的第三个方面提供了一种制备特异性识别α-AMA的检测传感器的方法，所述方法如下：

(1)用氧化铝粉末对玻碳电极进行打磨，并用乙醇和去离子水超声清洗；

(2)在步骤(1)玻碳电极表面电沉积金；

(3)将互补链与纳米金溶液混合反应获得标记纳米金的DNA溶液；

(4)将所述核酸适配体Apt-14滴加在步骤(2)的玻碳电极表面上进行孵育12～16h；随后加入6-巯基-1-己醇孵育，冲洗并晾干；

(5)将步骤(3)的标记纳米金的DNA溶液滴加至步骤(4)的玻碳电极表面进行杂交，水洗并晾干，获得检测传感器。

在一种实施方式中，步骤(1)中，用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末依次对玻碳电极打磨至镜面。

在一种实施方式中，步骤(2)中，将玻碳电极浸入HAuCl4溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内循环伏安扫描8～12周。

在一种实施方式中，步骤(3)中，所述互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

在一种实施方式中，步骤(3)中，将互补链与纳米金溶液混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入PB缓冲液，室温震荡0.5～1h；再分批加入含氯化钠的PB缓冲液，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得标记纳米金的DNA溶液。

在一种实施方式中，步骤(4)中，在0.5～1.5mM 6-巯基-1-己醇中孵育0.5～1.5h。

在一种实施方式中，步骤(5)中，向玻碳电极表面滴加5～10μL的0.5～1.5μM标记纳米金的DNA溶液

在一种实施方式中，步骤(5)中，在35～38℃下杂交0.5～1.5h。

本发明的四个方面提供了根据一种特异性识别α-AMA的检测传感器，所述检测传感器根据上述方法制备得到。

本发明的第五个方面提供了一种不以疾病的诊断为目的的检测α-AMA的方法，所述方法为利用所述检测传感器进行检测。

在一种实施方式中，所述方法如下：

(1)将待测样品滴加至所述检测传感器，孵育一定时间；

(2)用去离子水反复吹打清洗检测传感器，并收集清洗液；

(3)向清洗液中加入H1溶液和H2溶液，孵育一定时间，收集反应液；

(4)向反应液中加入纳米金颗粒溶液，室温孵育后，加入NaCl溶液，静置5～15min，测定吸光度。

在一种实施方式中，步骤(1)中，孵育0.5～1.5h。

在一种实施方式中，步骤(3)中，H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

在一种实施方式中，步骤(3)中，H1和H2的终浓度为0.5～1.5M。

在一种实施方式中，步骤(3)中，在35～38℃下孵育1.5～2.5h。

在一种实施方式中，步骤(4)中，反应液与纳米金颗粒20～40min。

在一种实施方式中，步骤(4)中，NaCl溶液的浓度为0.1～0.5M。

本发明的第六方面提供了上述特异性识别α-AMA的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤，

S1：构建初始文库，所述初始文库的序列如下所示：

5’-CATGCTTCCCCAGGGAGATG-N30-TTTGGTATTGAGGAACATGC-3’，其中，N表示碱基A，G，C或T，N30表示随机区域核苷酸的长度为30个碱基；

S2：将所述初始文库与链霉亲和素磁珠孵育，将初始文库标记在磁珠上；将靶标与标记好的磁珠结合，通过磁分离技术去除非特异性结合的序列，留上清液，即得第一富集文库；所述靶标为α-AMA；

S3：对所述第一富集文库进行PCR扩增，得到扩增产物，进行纯化，得到第二富集文库；

S4：用所述第二富集文库替代S2中的初始文库，重复步骤S2和S3，得到第三富集文库；

S5：将所述第三富集文库与α-AMA混合，孵育，得到混合物，将该混合物与氧化石墨烯混合，孵育，离心后得到上清液，为第四富集文库；

S6：将所述第四富集文库与α-AMA混合，孵育后，与氧化石墨烯混合孵育，离心后，留上清液，进行PCR扩增，得到扩增产物；

S7：对所述扩增产物进行纯化，得到富集文库；

S8：用所述的富集文库代替S5中的第三富集文库，重复步骤S6和S7，直至筛选出具有高亲和力和强特异性的核酸适配体。

本发明的第七方面提供了所述核酸适配体或所述修饰电极或所述检测传感器在检测α-AMA的应用。

有益效果：

本发明的有益效果如下：

本发明设计了一个随机单链DNA文库，筛选得到了具有高亲和力，强特异性，性质稳定可以结合α-AMA的核酸适配体Apt.14，该适配体与已报道的适配体相比，对α-AMA的结合能力更强，Kd最低为6.128nM，远远低于同批筛选到的其他适配体。

进一步，本发明基于该核酸适配体构建了一种电化学检测传感器，可以实现尿液和实际样品中α-AMA的直接检测，检出限为5ng/mL，加标回收率范围为90.86％至110.68％；基于该适配体的检测方法不需要大型复杂的仪器设备和专业的技术人员操作，检测方法具有简单、成本低等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明中具体的方案与技术，下面将对该专利所用的技术以及结果进行附图介绍。

图1为本发明提出的筛选α-AMA的实验方法流程示意图；

图2为本发明中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9的二级结构示意图；

图3为本发明中SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.18的二级结构示意图；

图4为本发明SEQ ID NO.14与α-AMA的亲和力实验结果图；

图5为基于本发明的生物传感器检测α-AMA的原理示意图；

图6为本发明实施案例的电化学传感器对α-AMA检测的检测限结果；

图7为本发明实施案例的电化学传感器对α-AMA检测的特异性检测结构。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：核酸适配体的筛选

(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物(由上海生工生物工程有限公司合成)：

随机ssDNA文库：

5’-CATGCTTCCCCAGGGAGATG-N30-TTTGGTATTGAGGAACATGC-3’，其中，N30表示30个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。

5’上游引物：5’-CATGCTTCCCCAGGGAGATG-3’；

5’磷酸化下游引物：5’-P-GCATGTTCCTCAATACCAAA-3’；

5’生物素固定引物：5’-biotin-AAAAAAA-GCATGTTCCTCAATACCAAA-3’。

将随机ssDNA文库和三条引物均用BB缓冲液(Tris-HCl:20Mm，MgCl₂：50mM，KCl：5mM，CaCl₂：2Mm，pH 7.6)配制成100μM贮存液，于-20℃备用。

(2)以靶标孵育，PCR扩增，单链制备为一个循环。用磁珠固定文库，用靶标竞争结合的方法筛选，进行俩轮磁珠筛选后，将制备的单链与靶标孵育结合后加入氧化石墨烯溶液进行筛选，氧化石墨烯筛选七轮，共计筛选九轮，筛选流程见图1。具体筛选方法如下：

(1)随机ssDNA文库95℃高温条件下变性5min后与5’生物素固定引物在37℃，500rpm条件下杂交2h，以PBS溶液为空白对照组，通过NanoDrop对文库进行测量三次，并计算均值为文库的质量浓度。

(2)将杂交后的文库与互补引物(5’上游引物和5’磷酸化下游引物)混合后(100μL终浓度均为5μM)置于使用PCR仪设置如下程序，95℃5min，缓慢降温到60℃，速率0.1℃/s；60℃1min；缓慢降温至25℃，降温速率为0.1℃/s，得到变复性好的文库与互补引物混合液。

(3)取25μL 10mg/mL的链霉亲和素磁珠原液置于离心管中，磁分离后去除上清液，用PBS清洗磁珠三次，除去保护液。随后，加入步骤(2)中变复性好的文库与互补引物混合液，混匀，室温500rpm混合孵育2h，磁分离之后，收集固定有文库的磁珠并回收上清，以PBS溶液为空白对照组，通过NanoDrop微量紫外可见分光光度计对上清回收液进行测量三次，并计算均值为文库回收的质量浓度，计算文库固定效率。

(4)对步骤(3)中得到的磁珠用PBS进行清洗三次后，加入100μL 5μg/mLα-AMA，金属浴37℃2h孵育。磁分离后，回收上清，测回收的DNA质量浓度。

(5)次级文库扩增。以步骤(4)的回收上清为模板，取4μL上清液进行扩增，得到双链DNA。扩增体系(50μL)和PCR程序如下：

体系：

组分	体积
		2xTaqPCRMatsterMix	25μL
上游引物	1μL(100μM)
		磷酸化下游引物	1μL(100μM)
超纯水	19μL
		模板DNA	4μL

程序：

(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳验证：PCR产物采用3％琼脂糖凝胶进行电泳。使用凝胶成像仪成像，观察电泳条带是否单一明亮，条带是否处在70bp的位置。

(7)单链文库的制备：将获得的PCR产物采用纯化试剂盒进行纯化处理，去除PCR反应体系中的其他物质。用NanoDrop微量紫外可见分光光度计测定纯化好的核酸浓度，以确定酶切所需的大致时间。取纯化后的产物，加入1/10体积的酶切缓冲液和适量核酸外切酶混合均匀，于37℃下反应直至酶切完全。酶切完成后于65℃下灭酶10min以停止酶切反应。酶切产物进行纯化，利用苯酚/氯仿进行萃取后，70％的乙醇进行沉淀。将其置于50℃烘箱进行干燥处理后，加入50μL去离子水溶解作为下一轮筛选的ssDNA文库。

(8)重复上述步骤一次，进行磁珠筛选第二轮对具有亲和力的适配体进行富集，然后进行氧化石墨SELEX。

(9)对制备的50μL单链DNA文库变性后，加入50μL终浓度为1μg/mL的α-AMA溶液，混匀后于金属浴37℃2h孵育。取1mg/mL氧化石墨烯离心去上清后，用100μL的混合液复溶后孵育，混匀后于金属浴37℃1h孵育。孵育后离心，于12000rpm，4℃条件下离心15min，回收上清液。重复离心2次，直到没有氧化石墨烯沉淀出现。

(10)重复步骤(5)～(9)，重复7轮后，将氧化石墨烯第七轮的PCR纯化产物送至上海生工进行高通量测序。供筛选到14条适配体序列，图2和图3分别为测序所得序列的二级结构预测示意图。

表1筛选得到的适配体

实施例2：核酸适配体的亲和力特异性分析

采用纳米金颗粒比色方法进行亲和力的分析。对实施例1中筛选到的适配体进行溶解稀释。将不同浓度的适配体(0、50、100、200、400、800、1600和3200nM)与1μg/mLα-AMA在室温下孵育30min，随后加入40μL的纳米金颗粒(AuNPs)溶液并在室温下孵育30min，然后加入1MNaCl使最终浓度为40mM。使用紫外分光光度计测量520nm处的吸光度值。将适配体浓度作横坐标，(A′-A₀)/A₀用作纵坐标，并且使用GraphPad Prism 8.0软件中One site-Specificbinding程序计算Kd。A′表示各浓度适配体下的波长520nm的吸收值。A₀表示当适体浓度为0时波长520nm的吸收值。根据Kd与亲和力的关系，Apt.14与α-AMA结合的Kd最低为6.128nM。亲和效果最好，亲和力结果如图4所示。其余筛选到的适配体与α-AMA结合的Kd均大于6.128nM，亲和力最差的适配体Kd为68.01nM，亲和效果略差于Apt.14。

表2候选序列亲和力如下：

适配体

Apt1

Apt2

Apt3

Apt4

Apt5

Apt6

Apt7

Apt8

Apt9

Kd

31.61nM

36.25nM

40.58nM

26.06nM

62.61nM

34.68nM

37.11nM

31.35nM

39.02nM

适配体

Apt10

Apt11

Apt12

Apt13

Apt14

Apt15

Apt16

Apt17

Apt18

Kd

43.08nM

28.67nM

47.42nM

18.15nM

6.128nM

37.98nM

19.44nM

37.96nM

68.01nM

实施例3：核酸适配体用于检测传感器的制备

(1)制备特异性检测α-AMA的电化学传感器

选取与α-AMA亲和力最好及Kd最低的Apt.14，为了评估该适配体的应用性能，制备双信号检测α-AMA平台，原理如图5所示。

具体如下：

在玻碳电极(GCE)上进行镀金：首先，在抛光布上用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末依次对玻碳电极打磨至镜面，再分别用乙醇和去离子水超声处理60s，去除电极上吸附的杂质直至电极表面光滑反光，烘干。随后，将玻碳电极浸入3mM HAuCl4溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内循环伏安扫描10周，得到金纳米粒子修饰的玻碳电极(Au/GCE)。

将20μL浓度为90～100mM互补链(SEQ ID NO.19)与1mL纳米金溶液混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入113μLPB缓冲液，室温震荡0.5～1h；再分批加入pH7.4、含浓度为0.14～0.16M氯化钠的PB缓冲液90～100μL，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得标记纳米金的DNA溶液。

以标记巯基的Apt.14作捕获探针，首先，将10μL 50nM Apt.14溶液均匀的滴加在Au/GCE上。在室温下储存过夜后，将电极浸入1mM 6-巯基-1-己醇(MCH)中1h。去离子水冲洗并晾干后，再向电极表面滴加7μL的1μM标记纳米金的DNA溶液在37℃下杂交1h，之后用超纯水冲洗电极后，晾干，获得基于适配体Apt.14的电化学传感器。

(2)检测α-AMA的方法

将10μL含有α-AMA的样品滴在电极表面孵育1h后，用移液器取10μL去离子水，在电极表面进行反复吹打清洗后，将10μL移至200μL离心管后，加入DNA发夹结构(H1，H2，体系终浓度为1μM)，分引发杂交链式反应(HCR)，37℃孵育2h，得到HCR产物。采用纳米金比色检测，取30μL HCR产物，加入150μL AuNPs，在室温下孵育30min后，加入20μL 0.3MNaCl溶液，静置10min，测定体系在520nm波长处的吸光度。

当α-AMA存在时，电极上的适配体和α-AMA发生特异性结合，释放出互补链(信号探针)。生成的双链DNA结构表现出强的负电性，与溶液中带负电纳米金相互排斥。随着盐浓度增加，纳米金的稳定性持续降低，并发生聚集，导致溶液的颜色从粉色变为紫色。当体系中不存在α-AMA时，信号探针不会游离到上清液中，单独的H1，H2不会发生杂交链式反应，即稳定存在于溶液中，单链H1和H2的粘性末端通过静电作用吸附纳米金表面上，保护纳米金免受高盐浓度引起的聚集，溶液仍保持红色。

实施例4：基于核酸适配体的检测传感器对不同浓度α-amatoxin的检测

将α-AMA稀释为不同浓度，稀释获得浓度为0.1ng/mL，0.5ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1μg/mL。将一系列浓度的α-AMA滴在电极表面孵育1h后，用移液器取10μL去离子水，在电极表面进行反复吹打清洗后，将10μL移至200μL离心管后，加入DNA发夹结构(H1，H2，体系终浓度为1μM)，分引发杂交链式反应(HCR)，37℃孵育2h，得到HCR产物，并采用实施例3中相同的方法进行比色检测。电流的信号随着α-AMA浓度的增加而增加。基于α-AMA浓度和电流信号拟合绘制标准曲线，Y＝15.33X+62.9(R²＝0.992)，检出限为5ng/mL，如图6所示。

实施例5：基于核酸适配体的检测传感器特异性验证

配制如下待测样品溶液，β-AMA，γ-AMA各毒素浓度为50μg/mL，α-AMA浓度为1μg/mL，以及空白样品，采用实施例3的方法进行，来验证该传感器的特异性，比色结果如图7所示。本发明实施例3制备的电化学传感器具有良好的特异性，可用于在实际应用中。

使用标准加标方法对该电化学传感器在真实样品中的性能进行评估。采用加标回收法检测空白蘑菇和尿液样品中的，α-AMA。加标浓度分别为100、10和1ng/mL，下表给出了回收率，范围为90.86％至110.68％。

表3加标回收实验结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种特异性识别α-鹅膏毒素的核酸适配体Apt-14，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

2.如权利要求1所述的核酸适配体Apt-14，其特征在于，所述核酸适配体Apt-14的3’端或5’端经修饰物修饰。

3.一种修饰电极，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸适配体Apt-14。

4.一种制备特异性识别α-鹅膏毒素的检测传感器的方法，其特征在于，所述方法如下：

(1)用氧化铝粉末对玻碳电极打磨至镜面，并用乙醇和去离子水超声清洗；

(2)在步骤(1)玻碳电极表面电沉积金；

(3)将互补链与纳米金溶液混合反应获得标记纳米金的DNA溶液；

(4)将权利要求1所述核酸适配体Apt-14滴加在步骤(2)的玻碳电极表面上进行孵育12～16h；随后加入6-巯基-1-己醇孵育，冲洗并晾干；

(5)将步骤(3)的标记纳米金的DNA溶液滴加至步骤(4)的玻碳电极表面进行杂交，水洗并晾干，获得检测传感器；

所述互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将玻碳电极浸入HAuCl4溶液中，于-0.2～0.6V电位范围内循环伏安扫描8～12周；步骤(3)中，将互补链与纳米金溶液混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入PB缓冲液，室温震荡0.5～1h；再分批加入含氯化钠的PB缓冲液，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得标记纳米金的DNA溶液。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，在0.5～1.5mM 6-巯基-1-己醇中孵育0.5～1.5h；步骤(5)中，向玻碳电极表面滴加5～10μL的0.5～1.5μM标记纳米金的DNA溶液。

7.根据权利要求4～6任一所述方法制备得到的特异性识别α-鹅膏毒素的检测传感器。

8.如权利要求1或2所述的核酸适配体Apt-14、权利要求4所述的修饰电极或权利要求7所述的检测传感器在检测α-鹅膏毒素的应用。

9.一种不以疾病的诊断为目的的检测α-鹅膏毒素的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求7所述检测传感器进行检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法如下：

(1)将待测样品滴加至所述检测传感器，孵育一定时间；

(2)用去离子水反复吹打清洗检测传感器，并收集清洗液；

(3)向清洗液中加入H1溶液和H2溶液，孵育一定时间，收集反应液；

向反应液中加入纳米金颗粒溶液，室温孵育后，加入NaCl溶液，静置5～15min，测定吸光度。