CN111676226B - 一种六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途，六价铬的核酸适配体序列为如下所示的DNA片段。该核酸适配体可以是各种同源性较高的类似序列或有本发明序列得到的衍生物。本发明的核酸适配体及其衍生物可用于环境、食品和生物有害因子的检测、分离、纯化及其他制品、制备六价铬检测探针等。具有能够与六价铬高特异性和高亲合的结合力、能够化学合成、性质稳定、分子量小、生物相容性好、易于保存等优点。

Description

一种六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途，具体涉及一种可结合六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途。

背景技术

六价铬为吞入性毒物/吸入性极毒物，皮肤接触可能导致过敏；更可能造成遗传性基因缺陷，吸入可能致癌，对环境有持久危险性。六价铬是很容易被人体吸收的，它可通过消化、呼吸道、皮肤及粘膜侵入人体。通过呼吸空气中含有不同浓度的铬酸酐时有不同程度的沙哑、鼻粘膜萎缩，严重时还可使鼻中隔穿孔和支气管扩张等。经消化道侵入时可引起呕吐、腹疼。经皮肤侵入时会产生皮炎和湿疹。危害最大的是长期或短期接触或吸入时有致癌危险。国家对水中的铬(Ⅵ)的排放有着严格的规定。目前，水中的六价铬测定技术仍然以分光光度法为主，由于原子光谱测定六价铬需要进行离子分离，导致步骤繁琐和影响分析速度。因此，为了能够快速、高效地检测水质中的六价格已成为一重大需求。

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体进化的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能够特异性结合靶标物质的单链寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸适配体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多优势，如具有更高的亲合力与特异性，无免疫原性，能够化学合成、成本低、可进行标记、稳定性好和易于保存等优点。核酸适配体的靶分子更为广泛，包括金属离子、有机小分子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质、细胞和组织等，并能从单一靶标扩展至完成的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。

但是，目前尚未发现与六价铬具有高亲合力且低成本的核酸适配体。如果获得一种六价铬核酸适配体，将有望提供一种新的检测六价铬的手段和扩展应用范围。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够与六价铬高特异性和高亲合力结合、能够化学合成、生物相容性好、分子量小、稳定、易于保存的六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种六价铬(Cr⁶⁺)的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

序列：

5’-CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-3’；

进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化、氟化或同位素化。

进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记。

进一步地，所述核酸适配体衍生物所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是所述核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。

进一步地，所述的核酸适配体衍生物在用于环境有害因子检测中的用途。

本发明还提供了所述的核酸适配体衍生物在用于六价铬分离与纯化中的用途。

本发明还提供了核酸适配体衍生物在制备六价铬类检测探针中的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的核酸适配体可以高亲合力、高特异性地结合六价铬，具有稳定性好、无毒性、易于修饰等优点，有利于大规模工业化生产及应用。

(2)本发明的核酸适配体具有易修饰特性，可以通过修饰信号物质，将六价铬的紫外吸收信号转化为其他信号(如荧光等)，从而实现对六价铬的高灵敏度检测。

附图说明

图1为本发明实施例中核酸适配体探针与Cr⁶⁺之间亲合力的测定结果。

图2为本发明实施例中核酸适配体探针对Cr⁶⁺特异性的测定结果。

图3为本发明实施例中无标记荧光核酸适配体探针对Cr⁶⁺的检测结果。

图4为本发明实施例中核酸适配体纳米材料对Cr⁶⁺的可视化检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

一种本发明的六价铬的核酸适配体，该核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列所示的DNA片段，即能够特异性结合六价铬的特征序列：

5’-CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-3’

上述的核酸适配体的核苷酸序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。

一种六价铬的核酸适配体序列，该适配体的序列包含有与上述特征序列的核苷酸的全部都相同的序列。

上述核酸适配体核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氟化、氨基化、巯基化或同位素化。

上述核酸适配体的核苷酸序列上可结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记(甚至连接上放射性物质等)。

上述核酸适配体可衍生出其他的核酸适配体，衍生出的核酸适配体的核苷酸序列可以为以下三种序列中的任意一种：

(1)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上(例如可将上述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)；

(2)与本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；

(3)上述本实施所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。

上述本实施例所列核酸适配体的核苷酸序列的骨架还可衍生出硫代磷酸酯骨架，上述核酸适配体还可改造成相应锁核酸或肽核酸。

上述本实施例的六价铬的核酸适配体具有以下用途：①环境、食品和生物有害因子检测中的用途；②分离与纯化中的用途；③药物设计与开发中的用途；④制备六价铬类检测探针中的用途。

本实施例的上述六价铬CAS号为7440-47-3。

上述本实施例的六价铬的核酸适配体主要利用磁珠捕获法进行筛选，具体筛选过程包括以下步骤：

(a)优化核酸文库：其中DNA文库的结构分为三部分。中间是一段40个碱基的随机序列；随机序列的两侧是两条DNA手臂，为20个固定碱基的PCR扩增所必须的序列，同时5’端的固定序列与固定探针(BDNA)进行互补杂交。固定探针是一端标有生物素的与文库固定序列互补的DNA链，用于文库的固定。

随机文库Lib:

5’-ATTGGCACTCCACGCATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’(注：N代表A、T、C、G中任一碱基)；

5’引物：5'-ATTGGCACTCCACGCATAGG-3'；

3’引物：5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'；

5’带荧光引物：5’-FAM-ATTGGCACTCCACGCATAGG-3’；

3’带间隔臂的引物：5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'

BDNA固定探针：5'-CCTATGCGTGGAGTGCCAAT-biotin-3'

(b)初筛：文库预处理方法：将1.3nmol的文库(约10¹⁴条DNA链)、2.9nmol BDNA溶于289μL的DPBS缓冲液(0.9mmol/L CaCl₂、2.7mmol/L KCl、1.5mmol/L KH₂PO₄、0.5mmol/LMgCl₂、136.9mmol/L NaCl、8.1mmol/L Na₂HPO₄)中，95℃预变性10min，之后以0.1℃每秒的速度降温到60℃保持1min，再以0.1℃每秒降温到25℃进行缓慢变复性。将杂交文库加入到已清洗5次的1mL量的链霉亲和素化磁珠颗粒中，并在摇床内室温下孵育半小时。接着使用磁铁吸附磁珠，并除去上清，用400μL DPBS缓冲液对磁珠进行悬浮并清洗6遍。然后加入六价铬靶标溶液，并将其放置摇床内在室温下孵育40min。用磁铁吸附磁珠，并回收上清溶液，得到初筛核酸文库，其中含有DNA与六价铬的复合物。

(c)纯化：将步骤(b)得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增引物采用(a)中所列的5’端带荧光引物与3’端带间隔臂的引物。扩增产物使用SDS变性PAGE进行单链制备分离，再通过煮胶、正丁醇浓缩与透析形成次一级核酸文库。其中，PCR反应扩增条件为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，扩增N(最优轮数)个循环；72℃延伸7min。采用梯度PCR，以初始核酸文库作为模版优化退火温度，最终得到退火温度为60℃。而每轮筛选产物的最优扩增轮数都是经过轮数优化获得的。在轮数优化后，将剩余的文库在相同条件下进行扩增。将PCR后文库进行单链制备，用于下一轮的筛选，单链制备方法：将PCR产物与正丁醇按体积比为1：5进行混合，震荡混合30s，在6000rpm下离心15s，溶液呈现分层状态，除去上层正丁醇液体，保留下层溶液，并使得下层溶液体积约50μL，往溶液中加入等体积的2×TBE溶液，并在95℃下加热10min。趁热将样品上样到变性胶PAGE上，使用300V电压进行跑胶20min，在紫外灯照射下对荧光条带进行切除收集，并碎胶。往碎胶中加入1.2mL DPBS缓冲液，并在95℃下煮泡15min，离心，收集上层清液，重复1～2次。往收集液中加入体积比为1：5的正丁醇溶液，并震荡30s，在6000rpm转速下离心3min，移除上层正丁醇。重复2～3次，使得最后样品体积在100μL左右。最后将样品在DPBS溶液中，4℃冰箱过夜透析。

(d)循环：以上述得到的次一级核酸文库替代起始核酸文库并重复上述的步骤(b)～(c)，每次循环时使用新的链霉亲和素化磁珠，直至的得到包含有与六价铬高亲和力和高特异性结合的核酸适配体的核酸文库。

(e)筛选效率评价：采用qPCR测定筛选效率，即筛选过程中DNA的富集情况。检测信号是DNA文库在qPCR过程中的C_q值，转换为六价铬对文库的保留率。首先，制备一系列浓度的核酸文库溶液，并使用qPCR进行测定，获取得到浓度与Cq值相关的线性方程。然后，再测定六价铬竞争下来的DNA文库浓度，根据测定量与投入量之比得到文库保留率。筛选效率越高，保留率越高。当保留率达到平台期时，对文库进行克隆测序。

考察1：上述本实施例的六价铬与其核酸适配体之间的亲合力主要用qPCR方法进行测定，具体测定过程包括以下步骤：

(1)测定核酸浓度与qPCR测定Cq值之间的标准曲线

对核酸适配体探针浓度与qPCR测定的Cq值之间线性关系测定：以DPBS为溶剂，配置不同浓度(1000,100,10,1,0.1pM)的核酸文库Lib溶液；移取10μL上述溶液配好的溶液，并加入2μL预配置好的mixture溶液(其中包含dNTP，evagreen酶，前后向引物，缓冲液)，并将其震荡混匀，通过获得的Cq值与浓度对数进行线性拟合。

(2)qPCR对探针与六价铬亲和力的测定：

首先，移取200μL包裹链霉亲和素磁性微球悬浮液，然后使用磁铁吸附磁珠，除去上层清液，并用200μL DPBS缓冲液清洗4次；

使用DPBS配置2μL浓度为100μM固定探针，先与适配体探针进行孵育杂交，再与上述清洗后的链霉亲和素磁性微球孵育35min，然后使用磁铁吸附磁珠并除去上清，接着用200μL DPBS缓冲液清洗2次，并加入200μL DPBS重悬，并将其5等份；

分别往上述捕获了核酸适配体探针的磁珠悬浮液里加入等体积不同浓度(1、4、16、64、256μM)的六价铬溶液，在室温下反应15min，再使用磁铁吸附磁珠并移取上层溶液，分别标号为1，2，3，4，5，移取10μL上述反应标记的溶液至对应编号的qPCR管，并往每个管中加入2μL预配置好的mixture溶液(其中包含dNTP，evagreen酶，前后向引物，缓冲液)，然后将其震荡混匀，使用qPCR对溶液中的核酸进行定量分析，将测定获取的Cq值带入进上述建立的线性式中获得不同靶标浓度下竞争下来的适配体分子数，并使用Y＝B_max*X(K_d+X)(Y为核酸分子的保留率，X为所用的六价铬的浓度，B是一个常数，max是最大值的意思)公式进行拟合计算核酸适配体和靶标结合的K_d值。如图1所示，最后拟合得到的六价铬与其核酸适配体K_d值为6.1μmol/L。

考察2：上述本实施例的六价铬与其核酸适配体之间的特异性主要用荧光恢复方法进行测定，具体测定过程包括以下步骤：

(1)探针的设计

六价铬核酸适配体3'端标记Cy3荧光染料(适配体荧光探针)：

5'-CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-Cy3-3'；

将适配体互补序列的5'端标记BHQ-2荧光猝灭基团(猝灭探针)：

5'-BHQ-2-GCACGCATAGGCCAGAATCAGAGGCAACATTAGAGGGTGTGCTTGATTTGCCCTATGCGTGG-3'；

(2)特异性的测定：以DPBS为溶剂，分别配置浓度为2μM的适配体荧光探针与猝灭探针的溶液，各移取75μL体积进行混合并将其震荡混匀，在室温下孵育30min备用。将混合溶液平均分为三等份(每份50μL)，接着往三份溶液中里分别加入50μL浓度为2μM的六价铬溶液(Cr⁶⁺)、50μL浓度为6μM的硫酸铁溶液(阴性对照，Negative)、以及50μL的筛选缓冲溶液(空白对照，Blank)，并在室温条件下反应10min，接着将溶液转移至96孔板内，使用多功能扫描仪进行荧光发射光谱扫描，获得上述3种反应溶液的荧光发射光谱曲线。从图2中可以看出，该核酸适配体探针对Cr⁶⁺具有较高的反应特异性，证明本专利提供的核酸适配体能够对Cr⁶⁺以较高的特异性识别。

考察3：采用无标记荧光法对六价铬进行测定，具体测定过程包括以下步骤：

固定核酸适配体的浓度为2μM，并往里加入等体积的2×Evagreen染料并将其震荡，形成300μL的混合溶液。将混匀后的溶液在95℃条件下加热10min，然后降温至室温，分别加入终浓度为10nM、20nM、40nM、80nM、160nM的Cr⁶⁺溶液50μL。结果如图3所示，由荧光发射光谱结果可见，随着Cr⁶⁺的浓度增加，荧光信号逐渐降低，且荧光信号与Cr⁶⁺浓度之间呈现良好的线性关系。

考察4：采用纳米材料聚集沉淀法对六价铬进行测定，具体测定过程包括以下步骤：

此处选取十面体纳米银作为纳米材料，移取125μL十面体纳米银，并往里加入125μL浓度为10μM的核酸适配体溶液并震荡混匀，在室温下反应30min后备用。将上述溶液平均分为5等份，分别加入终浓度为50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的Cr⁶⁺溶液50μL，并在室温下反应15min，并转移至96孔板内放置与多功能全波长扫描仪进行测定。由图4可以看出，随着Cr6+浓度的升高，十面体纳米银本体的吸收值逐渐下降。且该检测方法在50nM到800nM范围内呈现良好的线性范围。证明本专利提供的核酸适配体检测方法能够快速有效地测定六价铬。

以上所述仅是本发明的实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 生态环境部华南环境科学研究所

<120> 一种六价铬的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccacgcatag ggcaaatcaa gcacaccctc taatgttgcc tctgattctg gcctatgcgt 60

gc 62

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> n=a或g或c或t

<400> 2

attggcactc cacgcatagg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

attggcactc cacgcatagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

ttcacggtag cacgcatagg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 探针

<400> 5

cctatgcgtg gagtgccaat 20

<210> 6

<211> 62

<212> DNA

<213> 荧光探针

<400> 6

ccacgcatag ggcaaatcaa gcacaccctc taatgttgcc tctgattctg gcctatgcgt 60

gc 62

<210> 7

<211> 62

<212> DNA

<213> 淬灭探针

<400> 7

gcacgcatag gccagaatca gaggcaacat tagagggtgt gcttgatttg ccctatgcgt 60

gg 62

Claims (7)

1.一种六价铬（Cr⁶⁺）的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如 SEQID NO：1 所示：

序列：

5’-CCACGCATAGGGCAAATCAAGCACACCCTCTAATGTTGCCTCTGATTCTGGCCTATGCGTGC-3’。

2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化、氟化或同位素化。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米材料、聚乙二醇、酶或叶酸标记。

4.一种六价铬的核酸适配体衍生物，其特征在于，所述核酸适配体衍生物是权利要求1或2或3中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是权利要求1或2或3中所述核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。

5.一种如权利要求1~3中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求4所述的核酸适配体衍生物在用于环境有害因子六价铬检测中的用途。

6.一种如权利要求1~3中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求4所述的核酸适配体衍生物在用于六价铬分离与纯化中的用途。

7.一种如权利要求1~3中任一项所述的核酸适配体或者如权利要求4所述的核酸适配体衍生物在制备六价铬类检测探针中的用途。

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