CN118086315A - 一种识别原多甲藻酸-1的核酸适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域,特别涉及一种识别原多甲藻酸‑1的核酸适配体及其应用。核酸适配体包括下列选择。(1):AZA‑Apt‑02所示的核苷酸序列;或(2):AZA‑Apt‑09所示的核苷酸序列;或(3):AZA‑Apt‑23所示的核苷酸序列;或(4):AZA‑Apt‑23b48所示的核苷酸序列;或(5):具有与(1)或(2)或(3)或(4)的序列至少90%同源性的核苷酸序列;或(6):(1)、(2)、(3)、(4)的序列或具有与(1)或(2)或(3)或(4)的序列至少90%同源性的核苷酸序列被化学修饰的核酸序列。本发明的核酸适配体可作为一种有效的分子识别元件。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,特别是涉及一种识别原多甲藻酸-1的核酸适配体及其应用。
背景技术
原多甲藻酸(Azaspiracids, AZAs)是一类属于原多甲藻酸族(Azaspiracidshellfish poisoning, AZPs)的亲脂聚醚海洋毒素,由原多甲藻(Protoperidiniumcrassipes)产生。误食受AZAs污染的贝类后,会引起恶心、呕吐、严重腹泻和胃肠部痉挛等不适,该中毒症状与腹泻性贝毒 (Diarrhetic Shellfish Poison,DSP)引起的中毒症状非常相似。此外,AZAs的毒性比较稳定,常规的烹饪和加工处理无法去除。建立有效的AZAs检测方法对该类海洋贝类毒素进行密切监控,对于提高水产品安全、保护人体健康具有非常重要的意义。
目前已发现70多种AZAs异构体,其中原多甲藻酸-1(Azaspiracid-1, AZA1)广泛存在。目前原多甲藻酸监测方法主要有小鼠检测法、液相色谱-串联质谱联用、免疫测定技术等。缺陷在于:小鼠检测法往往存在大量假阳性和假阴性结果,可信度不高;液相色谱-串联质谱联用技术成本高、检测时间长、对检测人员要求高、操作比较复杂,不适于高通量检测;免疫测定技术所用抗体应用成本高、储存条件苛刻、稳定性有限。
核酸适配体(aptamer)是基于指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从随机寡核苷酸文库中筛选获得的对靶物质(如细胞、病毒、毒素、蛋白质和维生素等)具有很高特异性与亲和力的寡核苷酸序列。与传统的识别元件体相比,适配体易于体外大量合成,重复性好、稳定性高、成本低,可应用于各类生物传感器中,在细胞生物学、生物医学、食品安全检测中具有巨大潜力。目前尚未见有关于原多甲藻酸核酸适配体筛选的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种识别原多甲藻酸-1的核酸适配体及其应用。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种识别原多甲藻酸-1的核酸适配体,核酸适配体包括下列选择,
(1):AZA-Apt-02 所示的核苷酸序列;
或(2):AZA-Apt-09 所示的核苷酸序列;
或(3):AZA-Apt-23 所示的核苷酸序列;
或(4):AZA-Apt-23b48 所示的核苷酸序列;
或(5):具有与(1)或(2)或(3)或(4)的序列至少90%同源性且能特异性结合AZA1的核苷酸序列;
或(6):(1)、(2)、(3)、(4)的序列或具有与(1)或(2)或(3)或(4)的序列至少90%同源性且能特异性结合AZA1的核苷酸序列被化学修饰的核酸序列。
所述化学修饰为以下任意一种或多种:硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。
作为对上述技术方案的改进,可对上述核酸适配体核苷酸序列上的某一位置进行修饰,例如,磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等,保证修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合AZA1的亲和力,或虽没有明显提升亲和力但稳定性更高。
所述适配体或修饰后适配体进一步连接标记物。
所述标记物包括荧光标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、放射性标记物、地高辛标记物、siRNA标记物、治疗性标记物、生物素标记物或酶标记物。
作为对上述技术方案的改进,可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光标记物、地高辛标记物、放射性标记物、纳米发光材料标记物、治疗性标记物、小肽标记物、生物素标记物、酶标记物或siRNA标记物等,保证修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合AZA1的亲和力,或虽没有明显提升亲和力但稳定性更高。
AZA-Apt-02:AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCCCCCCGTATTTGTATTACCTATGCGTGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-09:AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCCCAGCTGGACCCATGACCCCCGGAGGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-23:AGCAGCACAGAGGTCAGATGCAGCTCAAGTTCAAATTGTGTGTTCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-23b48:ACAGAGGTCAGATGCAGCTCAAGTTCAAATTGTGTGTTCGGTACCTAT。
一种所述核酸适配体的应用,所述适配体在下述任意一种中的应用:
(1)分离纯化 AZA1中的应用;
(2)标记 AZA1中的应用;
(3)定量或定性检测 AZA1中的应用;
(4)制备用于靶向 AZA1的试剂或药物中的应用;
(5)制备用于分析、检测、诊断或治疗 AZA1相关疾病的试剂或药物或试剂盒中的应用。
所述AZA1结构式为:。
综上所述,本发明的优点及积极效果为:
(1)本发明采用MRGO-SELEX技术,以AZA1作为靶标,筛选了一组对AZA1具有高亲和力和高特异性的核酸适配体,扩充了检测AZA1的分子探针种类。
(2)与抗体相比,该核酸适配体具有分子量小、稳定性好、易于修饰、可以通过人工合成等优势,免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程,获取成本低,是理想的分子探针。
附图说明
图1是本发明的适配体筛选过程原理图。
图2是本发明实施例提供的筛选过程中PCR扩增产物的电泳图;其中,泳道:1. 50bp DNA Ladder, 2-10. PCR扩增产物。50 bp DNA Ladder条带从下到上依次是:50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp。
图3是本发明实施例提供的筛选过程中制备单链的电泳图,其中,泳道:1. 69nt-ssDNA, 2. 50 bp DNA Ladder, 3. S1-PCR回收ssDNA。50 bp DNA Ladder条带从下到上依次是:50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp。
图4是本发明实施例提供的筛选过程中筛选15轮的回收率效果图。
图5是本发明实施例提供的利用磁性氧化石墨烯鉴定预选适配体的亲和力结果。
图6是本发明实施例提供的截断优化适配体的亲和力分析数据效果图。
图7是本发明实施例提供的截断优化适配体的特异性分析数据。
图8是本发明实施例4提供的检测原理图。
图9是本发明实施例4中样品检测的实时信号响应及检测线性范围测试图,其中A为样品检测的实时信号响应图,B为检测线性范围测试图。
图10是本发明实施例4的特异性检测实时信号响应和检测效果图,其中A为特异性检测实时信号响应图,B为检测效果图。
具体实施方式
下面将结合实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明采用基于磁性还原氧化石墨烯的SELEX技术(MRGO -SELEX技术),以AZA1为靶标,筛选获得AZA1适配体,并进一步通过序列分析,得到适配体与AZA1结合的结合位点。基于分析结果对筛选获得的适配体序列进行优化,获得对AZA1具有高亲和力和识别特异性的适配体。
实施例1
特异性结合原多甲藻酸-1核酸适配体的筛选,如图1所示,具体步骤为:
(1).适配体筛选所用随机ssDNA文库和引物信息如表1所示,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中,随机文库中“29N”表示29个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。文库和引物分别用筛选缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 7.4)配制成100 μM的贮存液,于-20℃保存备用。
(2).采用基于磁性还原氧化石墨烯的SELEX技术(MRGO-SELEX) 进行适配体筛选,共计筛选15轮,每一轮所使用的筛选条件,包括ssDNA浓度,靶标 AZA1的浓度、MRGO的用量、反筛靶标种类和浓度,孵育时间、模式和筛选流程等,见表2。具体筛选方法如下:
筛选模式Ⅰ:靶标 AZA1与随机文库ssDNA按表2比例混合,37℃条件下1500 rpm震荡孵育一段时间;然后,按比例加入一定量的MRGO,再次孵育。最后,采用磁铁将悬浊溶液进行分离,取上清液,用于后续PCR扩增以及单链次级文库的制备。
筛选模式Ⅱ:随机文库ssDNA与一定量的MRGO按比例混合,37℃条件下1500 rpm孵育一段时间;然后,按比例加入靶标 AZA1,进行再次孵育。最后,将溶液进行磁分离,取上清液,进行纯化、PCR扩增以及单链次级文库的制备。
筛选模式Ⅲ:随机文库ssDNA与一定量的MRGO按比例混合,37℃条件下1500 rpm孵育一段时间;然后,按比例加入反筛靶标,包括冈田酸(OA)、扇贝毒素(PTXs)、软骨藻酸(DA)、石房蛤毒素(STX)、膝沟藻毒素(GTX1/4),再次孵育一段时间。之后,将所获溶液进行磁分离,弃上清,将黑色磁性物质使用筛选缓冲液清洗三次,除去非特异性吸附的反筛靶标以及反筛靶标-核酸复合物。最后,将黑色磁性物质分散到含有一定浓度靶标 AZA1的筛选缓冲液中,再次进行孵育、磁分离操作步骤。取上清液,进行纯化、PCR扩增以及单链次级文库的制备。
表 1 SELEX中使用的DNA序列
表 2 每轮SELEX中的实验条件
孵育时间 T核酸文库与靶标(模式Ⅰ)或磁性还原氧化石墨烯(模式Ⅱ、Ⅲ)孵育/T核酸文库与靶标和磁性还原氧化石墨烯同时孵育/T加入反筛靶标后孵育。
所述PCR扩增及单链次级文库的制备,具体步骤为:
(1). PCR反应体系体积为50 μL,各试剂用量为:2.0 μL上游引物(10 μM),2.0 μL下游引物(10 μM, 5'phosphate标记),1.0 μL dNTP Mixture (dATP 25 μM、dCTP 25 μM、dGTP 25 μM、dTTP 25 μM),1.0 μL Taq plos DNA polymerase(5U/μL),2.0 μL模板(筛选所得上清液),42 μL灭菌水。PCR反应程序的参数设置可以参考如下示例,PCR反应程序的各参数根据文库长度、引物、PCR产物的长度及GC含量等参数进行条件优化而获得。
Step1 (预变性):94℃ 5 min;
Step2 (扩增):94℃ 30 s→61℃ 15 s→72℃ 15 s,20 个循环;
Step3 (最终延伸):72℃ 5 min;
Step4 (临时保存):4℃。
(2).8% PAGE凝胶电泳鉴定PCR产物。将PCR扩增产物在100 V条件下电泳45 min,采用泡染法,使用GelRed核酸染料泡染20 min后,将胶片放入凝胶成像仪中成像并观察PCR扩增产物的条带位置及纯度。电泳图片如图2,从图2可以看出,PCR扩增产物条带清晰无杂带,且条带位置正确,说明PCR没有发生非特异性扩增,扩增产物符合实验要求。
(3).采用乙醇沉淀法回收扩增产物。具体操作为酚:氯仿:异戊醇按25:24:1比例混合,取等体积混合液与PCR产物混合,轻摇混匀,4℃条件下9000 rpm离心15 min,取上清液。重复以上步骤3次。按V上清液:V无水乙醇:V3M NaAc =10:20:1的比例混合,-20℃条件下静置1.0 h后,4℃条件下12000 rpm离心10 min,弃上清液,沉淀用预冷的70%乙醇洗涤3次后,自然条件下晾干备用。
(4).使用酶解法制备单链。酶解反应体系各试剂用量为:179 μL经纯化的PCR产物,20 μL 10 × λ-核酸外切酶酶解缓冲液,1.0 μL 10 × λ-核酸外切酶。37℃酶解反应30 min后,75℃加热10 min结束酶解反应。切胶回收酶解产物获得单链。电泳图片如图3,酶解所得单链核酸的条带位置与原始单链核酸文库的条带位置相同,且无杂带,酶解实验制得的单链核酸可以用于后期实验。
(5).以每轮次筛选实验最后所得上清为模板,进行qPCR检测分析。qPCR反应体系体积为20 μL,各试剂用量为:0.2 μL上游引物(10 μM),0.2 μL下游引物(10 μM),5.0 μL模板(经纯化的上清),4.6 μL灭菌水,10 μL SGExcel FastSYBR qPCR 预混液。qPCR反应程序的参数设置可以参考如下示例,PCR反应程序的各参数根据文库长度、引物、PCR产物的长度及GC含量等参数进行条件优化而获得。
Step1 (预变性):94℃ 5 min;
Step2 (扩增):94℃ 30 s→61℃ 15 s→72℃ 15 s,20个循环;
Step3 (最终延伸):72℃ 5 min;
Step4 (溶解曲线):60℃→ 94℃。
(6).qPCR结果分析,根据qPCR的溶解曲线中同源双链和异源双链的出峰情况,判断筛选进程。各筛选轮次所得次级文库中同源双链和异源双链的比例如图4。
上述筛选获得原多甲藻酸-1核酸适配体的序列分析及亲和力测定,具体步骤为:
(1).经过15轮正向和反向交替筛选,与AZA1具有较好亲和力和特异性的核酸序列得到富集。用未修饰的引物对最后一轮筛选轮次所得的上清液进行PCR扩增,经PAGE凝胶电泳检定后纯化,最后进行高通量测序。
(2).利用MEGA 6.06和iTOL分析所得高频序列的同源性,绘制进化树,利用Multiple Em for Motif Elicitation (MEME)分析同源序列的保守区域,利用UNAfold在37°C, 150 mM Na+, 2 mM Mg2+条件下进一步分析预选序列的二级结构及自由能,根据以上分析结果,每个家族中选择2条最具代表性序列作为AZA1适配体预选序列,进行亲和力分析。
(3).对预选适配体进行亲和力分析。通过MRGO-荧光竞争法测定所选定的预选适配体与AZA1的亲和力。5'端有羧基荧光素(FAM)标记的候选适配体95℃加热5 min后迅速冷却至4℃,在500 μL体系中,将浓度介于5-200 nM的不同浓度的预选适配体与最终浓度为1.5 μg/μL的MRGO混合,37℃避光条件下孵育1.0 h,磁分离,沉淀经洗涤后,与500 μL AZA1混合,37℃避光条件下孵育2.0 h,磁分离,利用荧光分光光度计对收集的上清液进行荧光强度测量(用 490 nm光激发,测 520 nm发射光强度),通过荧光强度绘制的结合饱和度曲线的非线性拟合,计算出每个序列的解离常数(K d )。其中,3条具有较好亲和力的解离常数测定结果如图5所示,即相应序列如下:
AZA-Apt-02:AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCCCCCCGTATTTGTATTACCTATGCGTGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-09:AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCCCAGCTGGACCCATGACCCCCGGAGGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-23:AGCAGCACAGAGGTCAGATGCAGCTCAAGTTCAAATTGTGTGTTCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGAA
实施例2
对上述筛选获得原多甲藻酸-1核酸适配体的结合位点分析及序列优化,具体以AZA-Apt-23为例,步骤如下:
(1).适配体AZA-Apt-23进行结合位点分析及序列优化。利用Mfold软件获得二级结构后使用RNA Composer软件获得适配体的三级结构,利用ChemSpider数据库获得AZA1的三级结构。然后利用AutoDock 4.2软件进行分子对接模拟。分析适配体与AZA1的结合位点。适配体的关键序列TCAGC与AAGTTCAA可能与AZA1的结合起关键作用,与AZA1存在相互作用。
(2).根据结合位点分析结果对适配体AZA-Apt-23进行截断实验,AZA-Apt-23以及截断所得序列如表3(截取序列依次为Apt-23a-d)。利用圆二色光谱(Circular dichroism,CD)对各截断序列与AZA1之间的相互作用进行测量。测量在氮气气氛下进行,CD实验参数为:数据采集间隔0.5 nm,响应时间1 s,带宽5.0 nm,扫描速度200 nm/min,扫描次数3。在光程为1 cm的石英池中,测量适配体(2 μM)在AZA1 (100 nM)存在前后的200-400 nM范围内的CD,测量AZA1溶液或缓冲液的背景信号,并从CD谱中减去。在274nm波长下,加热速率为1℃/min,进行CD熔化测量。其中,信号变化最大的为序列AZA-Apt-23b。
(3).在截断序列AZA-Apt-23b的基础上,通过对序列两端碱基进行增减的方式继续对序列进行优化,序列如表4所示。进一步通过CD光谱法分析,发现Apt-23b48的CD信号变化最大,借助MRGO-荧光竞争法测量Apt-23b48与AZA1的亲和力,亲和力测定结果如图6所示,发现解离常数为29.8±8.3 nM,去除冗余碱基后,适配体的亲和力没有发生明显变化。
表3. AZA-Apt-23的截断序列
表4. 基于Apt-23b的截断序列
实施例3
采用与亲和力试验相似的MRGO-荧光竞争法,对截断适配体Apt-23b48进行特异性分析。将MRGO与5'端有羧基荧光素(FAM)标记的适配体Apt-23b48在500 μL的反应溶液中37℃黑暗孵育60 min,控制MRGO的最终浓度为1.5 μg/μL,适配体Apt-23b48的最终浓度为100nM,经磁分离和洗涤后,沉淀分别与最终浓度为10 nM的AZA1以及其它几种毒素混合,37℃黑暗孵育60 min,磁分离,测定上清液的荧光强度(用 490 nm光激发,测 520 nm发射光强度)。通过比较AZA1与其它不同海洋毒素的相对荧光比率来估计适配体的特异性。相对荧光比由ΔFtoxin/ ΔFAZA1给出,其中ΔFAZA1和 ΔFtoxin分别为AZA1和其它毒素存在时的ΔF值。ΔF = F - F0,其中F和F0分别为实验组和阴性对照的荧光强度。截断适配体Apt-23b48的特异性分析如图7所示,发现所获得的适配体对AZA1外的其它多种海洋毒素不具有亲和性,说明所得适配体具有较好的特异性。
实施例4
原多甲藻酸-1(AZA1)检测原理:如图8所示,核酸适配体AZA-Apt-23b48通过捕获核酸固定到磁性微球表面。然后,加入两个辅助DNA片段hairpin-1和hairpin-2 (H1和H2)参与杂交链反应(HCR),形成线性DNA纳米结构。当加入AZA1时,适配体片段会特异性地与AZA1结合,导致DNA纳米结构从磁珠上脱落,从而导致磁珠表面DNA浓度发生变化。磁珠表面DNA浓度的变化,用聚阳离子敏感薄膜电极以鱼精蛋白为指示剂测量,实验所用序列如表5所示。
表5. 检测实验所用各序列及名称
原多甲藻酸-1(AZA1)的具体检测方法为:
(1).所用核酸链在HCR buffer(20 Mm Tris-HCl, 150 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2.5 mM MgCl2, pH 7.5)中溶至10μM浓度。将捕获核酸和核酸适配体在95℃变性10min,冰上冷却,静置1.0 h。将辅助DNA在95℃下加热5min后缓慢冷却至室温形成发夹结构。
(2).链酶亲和素磁珠 (SA-MBs)用Tris缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, pH 7.4)洗涤3次,以10 mg/mL重悬于洗涤缓冲液中。生物素标记的捕获DNA(50 μL 1.0 μM)首先与SA-MBs (50 μL)在37℃下振荡孵育60 min。悬浮液用磁力分离后弃上清,用洗涤缓冲液洗涤磁珠3次,用阻断缓冲液(5% BSA)在4℃下阻断链霉亲和素修饰磁珠表面过夜,获得捕获DNA修饰磁珠(MBs-capture DNA)。洗涤3次后,取50 μL适配体(1.0 μM)与捕获DNA修饰的磁珠混合,37℃振荡孵育60 min。洗涤三次,磁分离,获得核酸适配体修饰的磁珠。将新制备的H1(100 μL 5.0 μM)和H1(100 μL 5.0 μM)与核酸适配体修饰的磁珠混合,37℃孵育90 min,启动杂交链式反应(HCR)生成DNA纳米结构。磁分离后得到DNA纳米结构修饰的功能化磁珠(MBs-HCRs)。
(3).采用改进的电沉积方法,将NiCo2S4材料作为固体接触层沉积在清洗后直径为3mm的玻碳电极上。将290.79 mg六水氯化镍、582.10 mg六水氯化钴和300.52 mg硫乙酰胺溶解于50 mL去离子水中制备沉积液。采用循环伏安法(CV)在- 1.2 V至0.2 V电位范围内扫描,速率为10 mV/s,用去离子水和乙醇清洗GC/NiCo2S4电极3次,然后在红外灯下干燥。将传感膜组分(共5 mg),包括DNNS (1 wt%)、ETH 500 (1 wt%)、PVC (49 wt%)和o-NPOE (49wt%)溶解于1 mL THF中。在GC/NiCo2S4电极上覆盖40 μL的膜混合物,并在室温下自然蒸发形成相应的薄膜。测量前,先在0.01 M NaCl溶液中测量电极电位,得到基线电位。采用CHI660E电化学工作站,在室温下以1600 rpm的恒定搅拌速率测量电动势(EMF)响应。电位测定采用原电池:Ag/AgCl (3.0 M KCl)/样品溶液/敏感膜/NiCo2S4/GC电极。
(4).吸取含有AZA1的待测溶液(0.5、1.0、10、50、100、150、200、250、300 pM) 1.0mL,加入 0.6 μL功能化磁珠(MBs-HCRs),混合后37℃孵育30 min,磁分离去除上清,沉淀用0.01 M NaCl洗涤3次,加入20 μg/mL 10 μL鱼精蛋白溶液,37℃孵育5 min,磁分离,取上清液,上清液加入到体积为1000 μL的测定体系中,测定100 s内的电位变化。测定结果如图9。图9中A显示体系中加入不同浓度AZA1后的实时电位变化,随着AZA1浓度的增加,电位变化逐渐增大;检测线性相关性如B所示,AZA1在10-250 pM范围内具有良好的线性关系,该方法的检出限(LOD)为7.6 pM (3σ)。
(5).吸取含有AZA1或市购获得其它竞争毒素的浓度均为200 pM进行测定。测定结果如图10,AZA1可以使电位信号发生明显变化,而其它毒素与对照组相比,均未引起明显的电位信号变化。这是因为所选适配体只对AZA1具有高特异性和亲和力,对其它毒素亲和力非常弱,因此其它毒素无法使适配体与其互补打开,导致核酸纳米结构脱落,从而引起电位信号变化。以上结果证实构建的电化学适配体传感器可实现原多甲藻酸-1(AZA1)的特异性检测。
Claims (6)
1.一种识别原多甲藻酸-1的核酸适配体,其特征在于,核酸适配体包括下列选择,
(1):AZA-Apt-02 所示的核苷酸序列;
或(2):AZA-Apt-09 所示的核苷酸序列;
或(3):AZA-Apt-23 所示的核苷酸序列;
或(4):AZA-Apt-23b48 所示的核苷酸序列;
或(5):具有与(1)或(2)或(3)或(4)的序列至少90%同源性且能特异性结合AZA1的核苷酸序列;
或(6):(1)、(2)、(3)、(4)的序列或具有与(1)或(2)或(3)或(4)的序列至少90%同源性且能特异性结合AZA1的核苷酸序列被化学修饰的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的识别原多甲藻酸-1的核酸适配体,其特征在于:所述化学修饰为以下任意一种或多种:硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。
3.根据权利要求1或2所述的识别原多甲藻酸-1的核酸适配体,其特征在于:所述适配体或修饰后适配体进一步连接标记物。
4.根据权利要求3所述的识别原多甲藻酸-1的核酸适配体,其特征在于:所述标记物包括荧光标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、放射性标记物、地高辛标记物、siRNA标记物、治疗性标记物、生物素标记物或酶标记物。
5.根据权利要求1所述的识别原多甲藻酸-1的核酸适配体,其特征在于:
AZA-Apt-02:AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCCCCCCGTATTTGTATTACCTATGCGTGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-09:AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCCCAGCTGGACCCATGACCCCCGGAGGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-23:AGCAGCACAGAGGTCAGATGCAGCTCAAGTTCAAATTGTGTGTTCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGAA
AZA-Apt-23b48:ACAGAGGTCAGATGCAGCTCAAGTTCAAATTGTGTGTTCGGTACCTAT。
6.一种权利要求1所述核酸适配体在下述任意一种中的应用,
(1)分离纯化 AZA1中的应用;
(2)标记 AZA1中的应用;
(3)定量或定性检测 AZA1中的应用;
(4)制备用于靶向 AZA1的试剂或药物中的应用;
(5)制备用于分析、检测、诊断或治疗 AZA1相关疾病的试剂或药物或试剂盒中的应用。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105505939A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 中国人民解放军第二军医大学 | 与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体及其应用 |
CN108779467A (zh) * | 2016-01-22 | 2018-11-09 | 国立大学法人东京大学 | 用于筛选核酸适配体的方法 |
CN111272901A (zh) * | 2020-03-14 | 2020-06-12 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种贝类中亲脂性毒素的高分辨质谱检测方法 |
CN116042630A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-05-02 | 湖南师范大学 | 一种特异性结合猪传染性肠胃炎病毒s蛋白的核酸适配体及其应用 |
CN117587021A (zh) * | 2023-10-20 | 2024-02-23 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 特异性结合inhb蛋白的核酸适配体、应用、试剂盒 |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105505939A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 中国人民解放军第二军医大学 | 与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体及其应用 |
CN108779467A (zh) * | 2016-01-22 | 2018-11-09 | 国立大学法人东京大学 | 用于筛选核酸适配体的方法 |
CN111272901A (zh) * | 2020-03-14 | 2020-06-12 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种贝类中亲脂性毒素的高分辨质谱检测方法 |
CN116042630A (zh) * | 2022-12-08 | 2023-05-02 | 湖南师范大学 | 一种特异性结合猪传染性肠胃炎病毒s蛋白的核酸适配体及其应用 |
CN117587021A (zh) * | 2023-10-20 | 2024-02-23 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 特异性结合inhb蛋白的核酸适配体、应用、试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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万译文等: "石墨烯-管尖固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法 测定贝类中3种原多甲藻酸贝类毒素", 分析科学学报, vol. 36, no. 3, 30 June 2020 (2020-06-30), pages 324 - 330 * |
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