CN112695038A - 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用 - Google Patents

大环内酯类抗生素核酸适体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112695038A
CN112695038A CN202110165998.0A CN202110165998A CN112695038A CN 112695038 A CN112695038 A CN 112695038A CN 202110165998 A CN202110165998 A CN 202110165998A CN 112695038 A CN112695038 A CN 112695038A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
artificial sequence
amplification
macrolide
macrolide antibiotic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110165998.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112695038B (zh
Inventor
林俊生
杜烨芃
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaqiao University
Original Assignee
Huaqiao University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaqiao University filed Critical Huaqiao University
Priority to CN202110165998.0A priority Critical patent/CN112695038B/zh
Publication of CN112695038A publication Critical patent/CN112695038A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112695038B publication Critical patent/CN112695038B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9446—Antibacterials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了大环内酯类抗生素核酸适体及其应用，其包括如SEQ ID NO.11所示的序列。本发明在不依赖昂贵仪器和专业操作训练的情况下，便可便捷快速有效地检测样品中的大环内酯类抗生素，特别针对在水体及食品中残留大环内酯类抗生素的检测，进而可以溯源降低和防止大环内酯类抗生素对环境和人体的危害，具有重要意义。

Description

大环内酯类抗生素核酸适体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及大环内酯类抗生素核酸适体及其应用。
背景技术
大环内酯类抗生素包括红霉素、罗红霉素、阿奇霉素。由于其广谱和高效的特点在世界范围内大规模使用，导致地表水体中的大环内酯类抗生素浓度超标。特别是由于红霉素的滥用导致的水源污染。其在自然界中极难分解，直接破坏生态平衡和环境安全，并对人类健康造成严重威胁，特别是影响人体的肠胃消化正常菌群系统。预防和治理污染，首先需要可行的检测方法。目前大环内酯类抗生素的检测方法主要包括高效液相色谱法和气相色谱法，所需仪器昂贵，不适应现场快速地分析检测。因此，如何简便快速、准确、灵敏地检测出污染物已成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种大环内酯类抗生素核酸适体。
本发明的另一目的在于提供上述大环内酯类抗生素核酸适体的应用。
本发明的再一目的在于提供一种大环内酯类抗生素的检测方法。
本发明的技术方案如下：
大环内酯类抗生素核酸适体，其包括如SEQ ID NO.11所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，如SEQ ID NO.11所示。
本发明的另一技术方案如下：
上述大环内酯类抗生素核酸适体在检测大环内酯类抗生素中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述大环内酯类抗生素为红霉素。
在本发明的一个优选实施方案中，采用纳米金比色检测法。
在本发明的一个优选实施方案中，采用重组酶聚合酶扩增法。
本发明的再一技术方案如下：
一种大环内酯类抗生素的检测方法，使用上述大环内酯类抗生素核酸适体。
在本发明的一个优选实施方案中，所述大环内酯类抗生素为红霉素。
在本发明的一个优选实施方案中，其为纳米金比色检测法。
在本发明的一个优选实施方案中，其基于重组酶聚合酶扩增法。
本发明的有益效果是：
1、本发明能够高亲和力高特异性地识别并结合红霉素。
2、本发明在不依赖昂贵仪器和专业操作训练的情况下，便可便捷快速有效地检测样品中的大环内酯类抗生素，特别针对在水体及食品中残留大环内酯类抗生素的检测，进而可以溯源降低和防止大环内酯类抗生素对环境和人体的危害，具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中的抗红霉素适体的制备过程示意图。
图2为本发明实施例1中的核酸适体筛选过程中Round 20的qVCR监测结果。其中，Target eluting：靶标洗脱产物的扩增曲线；DPBS washing：对照DPBS洗涤产物的扩增曲线。
图3为本发明实施例2中的单克隆PCR鉴定结果。其中，箭头指示用于对应的克隆为阳性克隆。
图4为本发明实施例2中的Ery_06二级结构预测图。
图5为本发明实施例3中的核酸适体与红霉素结合的分析图。
图6为本发明实施例4中用纳米金比色法对核酸适体的特异性分析图。
图7为本发明实施例5中的核酸适体的Kd值计算结果图。
图8为本发明实施例6中的红霉素检检测原理示意图。
图9为本发明实施例6中的红霉素梯度浓度检测图。
图10为本发明实施例6中的特异性检测图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
如图1所示，通过固定文库，利用靶标洗脱的方式进行适体筛选。
一、核酸文库与基质(链霉亲和素生物磁珠)的固定
采用人工合成ssDNA适体文库，文库由5'-aggaattcacgtctcactggat(SEQ IDNO.01)(N40)atgcagtgagtcaggatatcg(SEQ ID NO.02)-3’组成；第一轮筛选时，将1OD文库溶解于260μL DPBS(1mM CaCl2，2.5mM KCl，1.5mM KH2PO4，0.5mM MgCl2*6H2O，137mM NaCl，8mMNa2HPO4，pH 7.2)中，随后和2倍浓度的含生物素修饰的上游引物互补序列(5'-biotin-tccttaagtgca-3’，SEQ ID NO.03)，于PCR仪上进行退火杂交，退火程序为95℃ 10min，以1℃/10s的速率降到25℃，完成退火。利用1mL链霉亲和素生物磁珠与退火产物进行孵育30min，用DPBS洗涤5次去除未固定的文库，完成核酸文库与基质(链霉亲和素生物磁珠)的固定。第二轮及随后的筛选，回收的次级文库溶解于210μL DPBS和磁珠用量为70μL。
二、靶标红霉素的结合筛选及文库富集监测
文库固定后，添加靶标200μL红霉素(优选200μM in DPBS)室温筛选30min，随后磁分离收集洗涤上清；和文库固定时的洗涤上清一起进行采用EvaGreen染料的实时荧光定量PCR扩增，分析靶标洗脱效果，根据文库量的变化来监测筛选的进程(图2)。
三、核酸适体候选序列的扩增
1、95℃预热PCR仪；
2、将200μL含ssDNA的洗脱液，加入到总体系为2mL的PCRmixed中进行扩增。正向扩增引物序列为5'-aggaattcacgtctcactggat-3’(SEQ ID NO.04)，反向扩增引物序列为5'-biotin-cgatatcctgactcactgcat-3’(SEQ ID NO.05)。
3、在PCR仪中按以下程序扩增
预变性：95℃ 5min；10-25个循环：95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s；后扩增：72℃5min。
四、次级文库的制备
将PCR产物(2.2mL)进行乙醇沉淀，随后加入200μL的DPBS稀释浓缩后的产物。加入30μL链霉亲和素生物磁珠与稀释后的产物在室温下孵育30min完成固定，去除上清。加入100μL(0.1M)的NaOH溶液孵育30min，分离上清溶液，向上清溶液中加入10μL(1M)的HCl溶液中和pH和100μL的DPBS稀释至210μL并进行核酸浓度定量。
五、核酸适体的下一轮筛选
将收集的次级文库固定到链霉亲和素生物磁珠上，进行下一轮筛选，筛选方法与第一轮筛选相同。
实施例2
一、PCR产物的回收
利用非修饰的上下游引物，对实施例1的最后一轮筛选进行扩增，随后进行非变性胶分离，切胶回收目的条带，利用琼脂糖胶回收试剂盒进行目的产物回收。
二、适体的克隆
1、在微量离心管中加入0.5μL pEASY-T5 ZERO载体、1μL核酸适体PCR产物以及3.5μL的无菌蒸馏水；
2、在25℃反应10min；
3、全量(10μL)加入100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；
4、42℃热激30s后，再冰上放置30s；
5、加入800μL的经37℃预热的LB培养基(不含抗性)，37℃，220RPM振荡培养60min；
6、离心使体积为100μL左右，将其涂布于含有(100μg/mL)氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养静置培养16h以形成单菌落。
三、单克隆筛选、测序和二级结构预测
挑取上述的单菌落溶于10μL无菌蒸馏水中，取5μL用于PCR鉴定阳性克隆(克隆鉴定引物为M13F和M13R)(图3)；将阳性克隆剩余的5μL用于菌体培养，培养条件为37℃，220RPM振荡培养8小时以上，培养菌体经质粒提取后，送商业公司进行核苷酸序列测定。测序结果(5’端到3’端)如表1所示：
表1单克隆筛选测序结果
Figure BDA0002936286430000041
Figure BDA0002936286430000051
注：带下划线部分为引物固定序列，括号内的数字为序列重复次数
测序结果表明，候选序列库中与Ery_06重复的次数居多，代表其富集程度最高；通过mfold软件设置温度为25℃、Na+浓度为137mM，Mg2+浓度为0.5mM进行各单克隆单链DNA分子进行二级结构预测，结果显示，Ery_06二级结构含有突出的环和茎(如图4所示)，其吉布斯自由能为ΔG＝-6.90，该结构具有相对较高的稳定性。因此对该序列进行深入表征和研究。该序列长度：83个碱基；序列类型：DNA，核酸；链数：单链；拓扑学：直链状；序列种类：ssDNA。
实施例3
琼脂糖凝胶追逐扩散试验主要是利用适体和小分子靶标在琼脂糖凝胶中扩散速度的差异，出现结合信号，表明两者形成了复合物。
一、配制琼脂糖凝胶
向20mL的DPBS中加入琼脂糖(优选0.6g达到琼脂糖胶不易破裂的刚性)，加热至琼脂糖完全融化无气泡后加入2μL核酸染料(优选GelRed或SYBR GOLD I)并混匀，倒入特制的模具。在室温静置30min后凝固。
二、适体扩散
向每孔中加入实施例2的核酸适体(Ery_06)溶液，避光室温下扩散30min。适体的优选体积和浓度分别为1.6μL和10μM，低于优选体积或者浓度会导致后期成像结果不明亮。
三、靶标和DPBS扩散
向第一排每孔中加入2.4μL的靶标溶液，向第二排每孔中加入2.4μL的DPBS，避光室温下扩散9h。靶标溶液的优选浓度为2mM，保证追逐扩散的过程中有充分的靶标和适体结合，形成扩散条带。
四、凝胶成像观察
利用Tanon凝胶成像系统在激发波长302nm下观察两排复孔的亮度差异，结果如图5所示。
实施例4：
纳米金在分散状态下呈现红色，发生聚集后变为紫色到蓝色。正常情况下，向纳米金悬浮液中加入一定量的盐溶液或者阳离子聚合物会破坏其稳定性，使得纳米金凝聚。当纳米金悬浮液中存在单链DNA适配体，ssDNA能够非特异性地包裹在纳米金表面，从而对盐诱导的聚集具有抵抗作用，保护纳米金在高浓度的盐溶液中不发生凝聚，溶液保持红色。向吸附了抗大环内酯抗生素适体的纳米金悬浮液中加入待测样品，适体与靶标结合并从纳米金表面解离，失去保护的纳米金在盐溶液中聚集呈现蓝色，且其变色程度与靶标浓度呈正相关。利用纳米金比色法，纳米金能够非特异性地吸附核酸，在不同的聚集程度下呈现的颜色不同。大环内酯抗生素(红霉素、罗红霉素和阿奇霉素)和非大环内酯抗生素(链霉素和青霉素)在未加入适体的情况均能使纳米金聚集从而改变颜色。纳米金吸附适体后，纳米金和适体竞争结合靶标，若适体能够结合靶标，则不引起纳米金聚集和颜色变化，敏感度越高，反之越低。通过比较聚集程度的差异得到敏感度。
一、纳米金吸附核酸适体
实验组加入实施例2的核酸适体(Ery_06，优选6μL 10μM)，50μL(1mM)的纳米金溶液和100μL的无菌蒸馏水；对照组加入50μL(1mM)的纳米金溶液和106μL的无菌蒸馏水。室温避光圆周混匀仪上孵育30min。核酸适体的总量不足无法包被所有纳米金颗粒，导致后期提前发生聚集引起的颜色变化；总量过高，导致后期抗生素孵育过程中抗生素竞争结合的是未包被纳米金的游离核酸适体。
二、抗生素孵育
向实验组(三组分别含大环内酯抗生素红霉素、罗红霉素和阿奇霉素)和对照组(两组分别含非大环内酯抗生素青霉素和链霉素)中分别加入20μL的DPBS和优选浓度为1mM溶解于DPBS中的相应抗生素。室温避光圆周混匀仪上孵育30min。
三、进行吸光度测定和聚集程度计算
13nm的纳米金在分散状态下在520nm波长处有最大吸收峰，而聚集的纳米金在620nm出现最大吸收峰，因此除了肉眼比色外，可通过酶标仪检测620nm和520nm的吸光度，通过计算A620/A520比值衡量适配体与靶标结合程度，结果如图6所示。
实施例5：
利用SYBR Green I(SGI)染料法，该方法主要是利用适体和靶标结合后会在一定程度上改变结构中的双链占比，从而引起SGI信号的随富集程度而递变。
一、适体与靶标的孵育
将核酸适体(实施例2中的Ery_06)和不同浓度的靶标(0-1μM)进行孵育，于圆周混匀仪上进行45min孵育。优选的核酸适体的体积和浓度为10μL和10μM，使得适体总量高于靶标总量。
二、适体靶标复合物与SGI的孵育
将适体靶标复合物和SGI(优选10μL10×)进行圆周孵育，室温，45min。
三、进行荧光分光光度计测定
利用日立F-7000荧光分光光度计，进行荧光光度测定。激发波长EX 495；发射波长Em 530；狭缝激发和发射均为5nm。
四、Kd值计算
对照组不含靶标为F0，以F-F0为纵坐标，浓度为横坐标利用GraphPad 7.0软件进行拟合分析，获得拟合曲线和Kd值，结果如图7所示。
实施例6：
本实施例基于传感器原理，敏感元件适体与靶标的特异性结合再通过重组酶介导链置换核酸扩增，传感信号得以放大。本实施例所用的检测装置由三个部件组成：1、载体；2、封面；3、试纸。其中载体包括一个反应池和一个用于放置试纸的试纸槽，两者相连，反应池的上方预制一个加样孔。
本实施例的实验原理如图8所示，将Biotin(生物素)修饰的上游引物互补序列与核酸适体(实施例2的Ery_06)杂交，得到的杂交链与链霉亲和素生物磁珠孵育，完成核酸适体在磁珠表面的可逆固定；向此磁珠中加入待检测样本，若样本中的靶标抗生素与磁珠上可逆固定的核酸适体特异性结合，核酸适体发生构象改变从磁珠表面游离到上清溶液，通过磁分离获得上清，将其作为扩增反应的DNA模板经载体封面的加样孔加入反应池，扩增反应产物为双链DNA带有分别以Biotin和6-羧基荧光素(6-FAM)修饰的单链；扩增产物与检测试纸加样端接触后即被吸附扩散，产物上的Biotin与试纸结合垫上过量的Streptavidin(链霉亲和素)包被的红色纳米颗粒结合形成复合物(DNA产物-红色纳米颗粒)，复合物接着扩散后，其6-FAM与检测线上的Anti-FAM(抗6-羧基荧光素抗体)结合，此时检测线变红；过量的红色纳米颗粒持续扩散，颗粒表面的Streptavidin与质控线上的Biotin结合，此时质控线变红。当检测线与质控线都为红色时，为阳性反应，表明检测的水体样本中含有待检测靶标抗生素；检测线不显色，而质控线为红色时，为阴性反应，表明检测的样本中不含待测靶标抗生素。
上述原理中所采取的扩增方式为RPA(重组酶聚合酶扩增法，recombinasepolymerase amplification)，传统的PCR需要扩增仪器，不断变化的温度和较长的扩增时间。而RPA扩增方式在恒定温度下便可在短时间内扩增DNA，不依赖扩增仪器，增加了便利性。其关键蛋白和酶主要包括SSB蛋白，recA重组酶，Bsu DNA聚合酶，肌酸激酶和Exo核酸外切酶，关键缓冲液为MgAc溶液，缓冲液中的Mg2+能够提高酶的活性从而缩短扩增时间。此扩增反应所用到的引物与传统的PCR引物不同，PCR引物通常在10-20nt即可。而RPA引物的长度不得低于30nt，因此所用的优选RPA正向扩增引物序列为5'-Biotin-aggaattcacgtctcactggattcacgcac-3’(SEQ ID NO.16)，优选反向扩增引物序列为5'6-FAM-cgatatcctgactcactgcatggggctatc-3’(SEQ ID NO.17)，扩增的双链产物序列如表2所示。
表2双链产物序列
Figure BDA0002936286430000081
注：B为5’端Biotin，F为5’端6-FAM
一、上游引物互补序列与核酸适体的杂交
将生物素修饰的上游引物互补序列(优选28μL 10μM)与58μL(10μM)未经修饰的Ery_06充分混匀后完成杂交。
二、将杂交链固定到链霉亲和素生物磁珠表面
得到的杂交链与链霉亲和素生物磁珠混匀，室温下在圆周混匀仪上孵育30min，杂交链上的生物素与链霉亲和素形成共价键，从而固定到磁珠表面。
三、抗生素孵育
红霉素梯度浓度实验：将100μL不同浓度的红霉素(1pM，10pM，100pM，1nM，10nM和100nM)分别与步骤二中得到的磁珠混匀，室温下在圆周混匀仪上孵育30min。红霉素与核酸适体的特异性结合引起核酸适体发生构象变化，从而导致核酸适体从上游引物互补序列脱落到上清之中。通过磁分离取相应的上清溶液用于后续的扩增反应。
抗生素特异性检测实验：将100μL(200μM)的红霉素，罗红霉素，阿奇霉素，链霉素和青霉素分别与步骤二中得到的磁珠混匀，室温下在圆周混匀仪上孵育30min。具有特异性结合的抗生素引起核酸适体发生构象变化，从而导致核酸适体从上游引物固定序列脱落到上清之中。通过磁分离取相应的上清溶液用于后续的扩增反应。
四、重组酶辅助的扩增反应
利用RPA核酸扩增试剂扩增步骤三中获得的上清。每个检测样品对应一个RPA反应干粉管，每个反应干粉管中各反应组分和所加入的优选体积如表3所示。
表3
RPA反应体系配方 体积(μL)
基础体系 41.5μL
正向扩增引物 2μL
反向扩增引物 2μL
DNA模板(步骤三中获得的上清) 2μL
280mM MgAc(pH 7.2) 2.5μL
总体积 50μL
基础体系成分如下：
41.5μL去离子水内含1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
此步骤的操作顺序如下：
1.向反应池中依次加入41.5μL基础体系、正向扩增引物(优选2μL 10μM)、反向扩增引物(优选2μL 10μM)、2μL DNA模板和MgAc(优选2.5μL 280mM，pH 7.2)。过量引物导致无法扩增；适量Mg2+提高RPA体系中酶的活性从而提高扩增效率，但是过量Mg2+会引起非特异性扩增。
2.将反应池置在水浴中，注意加样孔高于水平面。孵育30min，优选孵育温度为37-39℃。
五、试纸条检测扩增产物
利用一次性核酸检测试纸条检测步骤四中获得的扩增产物。试纸条的红色结合垫为经羟胺处理过的链霉亲和素包被的红色纳米颗粒，硝酸纤维素薄膜的检测线为稀释在1×PBS的Anti-FAM抗体，质控线为Biotin。
步骤四结束后，将检测装置取出并竖置，反应池中的反应体系因重力作用，流入与之相连的试纸槽底部，得以从试纸加样端的样品垫向上扩散，待试纸吸收完反应体系后，向加样孔内加入200μL TBS试纸缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)加快反应体系的扩散。15至30min内记录判读区的检测结果。红霉素梯度浓度检测和抗生素特异性检测结果分别如图9和图10所以。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggaattcac gtctcactgg at 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcagtgag tcaggatatc g 21
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccttaagtg ca 12
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggaattcac gtctcactgg at 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgatatcctg actcactgca t 21
<210> 6
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggaattcac gtctcactgg atagccggcg cacttaagga ttgcacttcg atgtccgtga 60
gcatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 7
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaattcac gtctcactgg atggccggcg cacttaagga ttgcacttcg atgtccgtga 60
gcatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 8
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggaattcac gtctcactgg atcaagtagg cggggatggg cactttgcac ttaaggtaga 60
tcatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 9
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggaattcac gtctcactgg atcaagtggg cggggatggg cactttgcac ttaaggtaga 60
tcatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 10
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggaattcac gtctcactgg atccttgcac ttaccccgca cttaaggccc agataaactg 60
acatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 11
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggaattcac gtctcactgg attcacgcac gccaaggact gcacttaagg ttagatagcc 60
ccatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 12
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggaattcac gtctcactgg attcacgcac tttgcactta aggctcctca cgtattcacc 60
tcatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 13
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggaattcac gtctcactgg atgaccaatg cactttgcac ttaacggacc tccggacacc 60
tggatgcagt gagtcaggat atcg 84
<210> 14
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggaattcac gtctcactgg atcccctatg cacttaagga gcgcacttcg attgtcatgt 60
ccatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 15
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggaattcac gtctcactgg ataccgccca gcactttgca cttaagggaa caggatcatg 60
acatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aggaattcac gtctcactgg attcacgcac 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgatatcctg actcactgca tggggctatc 30
<210> 18
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aggaattcac gtctcactgg attcacgcac gccaaggact gcacttaagg ttagatagcc 60
ccatgcagtg agtcaggata tcg 83
<210> 19
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tccttaagtg cagagtgacc taagtgcgtg cggttcctga cgtgaattcc aatctatcgg 60
ggtacgtcac tcagtcctat agc 83

Claims (10)

1.大环内酯类抗生素核酸适体，其特征在于：其包括如SEQ ID NO.11所示的序列。
2.如权利要求1所述的大环内酯类抗生素核酸适体，其特征在于：如SEQ ID NO.11所示。
3.权利要求1或2所述的大环内酯类抗生素核酸适体在检测大环内酯类抗生素中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述大环内酯类抗生素为红霉素。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：采用纳米金比色检测法。
6.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：采用重组酶聚合酶扩增法。
7.一种大环内酯类抗生素的检测方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的大环内酯类抗生素核酸适体。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述大环内酯类抗生素为红霉素。
9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：其为纳米金比色检测法。
10.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：其基于重组酶聚合酶扩增法。
CN202110165998.0A 2021-02-05 2021-02-05 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用 Active CN112695038B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110165998.0A CN112695038B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110165998.0A CN112695038B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112695038A true CN112695038A (zh) 2021-04-23
CN112695038B CN112695038B (zh) 2023-05-26

Family

ID=75516567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110165998.0A Active CN112695038B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112695038B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110923237A (zh) * 2019-11-15 2020-03-27 华侨大学 一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用
CN117487813A (zh) * 2023-12-19 2024-02-02 江南大学 特异性识别阿奇霉素的单链dna适配体序列及其应用
CN117487813B (zh) * 2023-12-19 2024-06-07 江南大学 特异性识别阿奇霉素的单链dna适配体序列及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103387991A (zh) * 2013-08-05 2013-11-13 上海交通大学 改进无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体及其应用
CN107119054A (zh) * 2017-05-04 2017-09-01 重庆师范大学 基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用
CN111398576A (zh) * 2020-05-15 2020-07-10 西华大学 一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法
CN111705062A (zh) * 2020-07-07 2020-09-25 华侨大学 二苯乙烯类雌激素核酸适体及其应用
US20200340042A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Mcmaster University In vitro selection for nucleic acid aptamers
CN111979248A (zh) * 2020-07-21 2020-11-24 湖南大学 核酸适体的保护片段及含有该保护片段的核酸适体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103387991A (zh) * 2013-08-05 2013-11-13 上海交通大学 改进无固定点靶物质的青霉素类抗生素适配体及其应用
CN107119054A (zh) * 2017-05-04 2017-09-01 重庆师范大学 基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用
US20200340042A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Mcmaster University In vitro selection for nucleic acid aptamers
CN111398576A (zh) * 2020-05-15 2020-07-10 西华大学 一种氧氟沙星快速灵敏检测的试剂盒及探针和方法
CN111705062A (zh) * 2020-07-07 2020-09-25 华侨大学 二苯乙烯类雌激素核酸适体及其应用
CN111979248A (zh) * 2020-07-21 2020-11-24 湖南大学 核酸适体的保护片段及含有该保护片段的核酸适体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
巫朦朦;韩旭艳;蔡蓉凤;李茂林;田亚平;周楠迪;: "庆大霉素特异性单链DNA适配体的筛选、表征和应用" *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110923237A (zh) * 2019-11-15 2020-03-27 华侨大学 一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用
CN110923237B (zh) * 2019-11-15 2022-07-01 华侨大学 一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用
CN117487813A (zh) * 2023-12-19 2024-02-02 江南大学 特异性识别阿奇霉素的单链dna适配体序列及其应用
CN117487813B (zh) * 2023-12-19 2024-06-07 江南大学 特异性识别阿奇霉素的单链dna适配体序列及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112695038B (zh) 2023-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chi et al. Direct fluorescence detection of microRNA based on enzymatically engineered primer extension poly-thymine (EPEPT) reaction using copper nanoparticles as nano-dye
CN108676844B (zh) 一种双酶放大汞离子生物传感器的构建
Hu et al. A TdT-mediated cascade signal amplification strategy based on dendritic DNA matrix for label-free multifunctional electrochemical biosensing
EP2167691B1 (en) Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
CN109001167B (zh) 一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒
Chen et al. Ultra-sensitive detection of Pb2+ based on DNAzymes coupling with multi-cycle strand displacement amplification (M-SDA) and nano-graphene oxide
EP3286329B1 (en) Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
CN103436608B (zh) 基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒
CN107604042A (zh) 基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法
CN110218818B (zh) 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法
Xu et al. Novel rolling circle amplification biosensors for food-borne microorganism detection
CN112695038B (zh) 大环内酯类抗生素核酸适体及其应用
JP3789317B2 (ja) 特定の核酸を検出定量するための等長プライマー伸長法およびキット
Tian et al. Sensitive colorimetric detection of microrna based on target catalyzed double-arm hairpin DNA assembling
CN113640268A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法
JP2020533974A (ja) 呼吸器合胞体ウイルス種のニッキング及び伸長増幅反応（ｎｅａｒ）
KR102366854B1 (ko) 회전환 증폭 기반 분자 진단 방법
CA3059246A1 (en) New method for visual quantitative detection of dual heavy metal ions
CN108949917B (zh) 一种汞离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器
CN109355408B (zh) 一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物、试剂盒及其方法
CN103571932A (zh) 基于耐热核酸酶hii的单核苷酸多态性检测方法
Zhang et al. Detection of DNA methyltransferase activity using allosteric molecular beacons
US20220136040A1 (en) Using tethered enzymes to detect nucleic acids
CN110551797B (zh) 基于t5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法
CN112359143A (zh) 一种基于y型探针组的等温指数扩增方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant