CN111705062A

CN111705062A - 二苯乙烯类雌激素核酸适体及其应用

Info

Publication number: CN111705062A
Application number: CN202010649061.6A
Authority: CN
Inventors: 林俊生; 苏艺; 蒋灵丽; 杜烨芃; 郭方可
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111705062B

Abstract

本发明公开了二苯乙烯类雌激素核酸适体，包括Apt‑7、Apt‑21和Apt‑31中的至少之一，其中，Apt‑7的序列如SEQ ID NO.01所示，Apt‑21的序列如SEQ ID NO.02所示，Apt‑31的序列如SEQ ID NO.03所示。本发明的核酸适体能够高特异性识别和高亲和性结合二苯乙烯类雌激素，可应用于检测二苯乙烯类雌激素的相关方法中，在二苯乙烯类雌激素的检测方面以及在降低二苯乙烯类雌激素对人体的侵害方面具有重要意义。

Description

二苯乙烯类雌激素核酸适体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及二苯乙烯类雌激素核酸适体及其应用。

背景技术

二苯乙烯类雌激素是一类人工合成的非甾体雌激素，目前主要有三种物质，分别为：己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)、己烷雌酚(Hexestrol，HEX)和双烯雌酚(Dienesterol，DIES)；此类激素20世纪60年代时广泛用于治疗子宫出血、月经失调、胎儿引产及动物催肥；二苯乙烯类雌激素脂溶性强，可通过食物链进入人体，临床研究发现使用这类激素的第二代甚至第三代均受到不良影响，女性出现阴道恶性肿瘤、乳腺癌，男性精子减少等现象，同时干扰人体内分泌系统。因此非常需要开发快速、灵敏检测二苯乙烯类雌激素的方式。目前二苯乙烯类雌激素检测方法主要有两大类：第一类是利用理化性质检测，包括气相色谱或者液相色谱，气质联用、液质联用等的技术，但这类检测方式都需要专业技术人员操作昂贵的仪器设备，而且需要进行样品的预处理，整个过程费时耗力；第二类是免疫检测法，目前主要是利用ELSA法检测动物中二苯乙烯类雌激素的残留量，但是免疫检测所需要的抗体本质上是蛋白质，在生产、运输、储存等环节受到很大的制约。因此，建立简单、灵敏、快速的检测方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种二苯乙烯类雌激素核酸适体。

本发明的另一目的在于提供上述核酸适体的应用。

本发明的技术方案如下：

二苯乙烯类雌激素核酸适体，包括Apt-7、Apt-21和Apt-31中的至少之一，其中，Apt-7的序列如SEQ ID NO.01所示，Apt-21的序列如SEQ ID NO.02所示，Apt-31的序列如SEQ ID NO.03所示。

在本发明的一个优选实施方案中，为Apt-7、Apt-21和Apt-31中的至少之一。

在本发明的一个优选实施方案中，所述Apt-7、Apt-21和Apt-31中的碱基中的A、T、C和G中的至少之一为修饰碱基，以增强其抗核酸水解酶的能力。

进一步优选的，所述修饰碱基为硫修饰碱基、氟修饰碱基或甲氧基修饰碱基。

本发明的另一技术方案如下：

上述二苯乙烯类雌激素核酸适体在检测二苯乙烯类雌激素中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，采用纳米金比色检测法。

在本发明的一个优选实施方案中，所述二苯乙烯类雌激素包括己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚。

本发明的再一技术方案如下：

一种二苯乙烯类雌激素的检测方法，使用上述二苯乙烯类雌激素核酸适体。

在本发明的一个优选实施方案中，其为纳米金比色检测法。

本发明的有益效果是：本发明的核酸适体能够高特异性识别和高亲和性结合二苯乙烯类雌激素，可应用于检测二苯乙烯类雌激素的相关方法中，在二苯乙烯类雌激素的检测方面以及在降低二苯乙烯类雌激素对人体的侵害方面具有重要意义。

附图说明

图1本发明的技术方法示意图。

图2本发明实施例2中核酸适体筛选过程中第14轮筛选的qPCR监测结果图。其中：E1：靶标快速筛选产物的扩增曲线；E2：靶标慢速筛选产物的扩曲线；W1：基体对照物(DPBS加甲醇)慢速筛选产物的扩增曲线；W2：基体对照物(DPBS加甲醇)快速筛选产物的扩增曲线；C：阴性对照。

图3本发明实施例2中三条适体的二级结构示意图。

图4本发明实施例3中的纳米金比色法特异性检测结果图。

图5本发明实施例3中的磁珠-qPCR法特异性检测结果图。

图6本发明实施例3中的SGI法特异性检测结果图。

图7本发明实施例4中的磁珠-qPCR法亲和性检测结果图。

图8本发明实施例4中的SGI法亲和性检测结果图。

图9本发明实施例5中的核酸适体的Kd值计算结果图。

图10本发明实施例6中的纳米金比色法检测二苯乙烯类雌激素代表物质己烯雌酚应用结果图。

图11为本发明实施例8中的修饰适体xsApt-7的制备结果图。

图12为本发明实施例8中的双链修饰适体制备后酶切鉴定结果图。

图13为本发明实施例8中的单链修饰适体xsApt-7制备后酶切鉴定结果图。

图14为本发明实施例9中的xsApt-7与己烯雌酚特异性检测结果图。

图15为本发明实施例9中的xsApt-7与己烯雌酚亲和性检测结果图。

图16为本发明实施例9中的xsApt-7与己烯雌酚亲和性检测线性区间图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1二苯乙烯类雌激素DNA适体的筛选

本实施例的SELEX流程见图1，以链霉亲和素修饰的磁珠为固定相，采用固定文库，靶标洗脱的方式进行筛选。

1.核酸文库与链霉亲和素修饰磁珠的固定

第一轮筛选时，取从TaKaRa公司合成的初级文库lib干粉1OD(序列信息：5’-ttcagcactccacgcatagc(SEQ ID NO.04)-n40-cctatgcgtgctaccgtgaa(SEQ ID NO.05)-3’)，放入离心机中12000rpm/min，离心10min，然后在通风橱中加入260μL DPBS(0.9mMCaCl₂，2.7mM KCl，0.5mM MgCl₂·6H2O，0.137M NaCl，1.1mM KH₂PO4，8.1mM Na₂HPO₄)溶解。溶解后用涡旋仪震荡约1min，然后再离心12000rpm/min，10min，配制成5μM的文库溶液。然后取从金斯瑞合成的bio-P3引物干粉5nmol，离心12000rpm/min，10min后，在通风橱中加入50μL DPBS溶解成终浓度为100μM引物储液，涡旋震荡1min后，离心12000rpm/min，10min。取上述100μM bio-P3引物储液稀释为10μM备用。初级文库lib与生物素修饰引物bio-P3于PCR仪上进行退火杂交，退火程序为95℃10min；随后以1℃/10s的速率降到60℃，60℃维持1min，随后继续以1℃/10s的速率降到25℃，完成退火。取1mL(10mg/mL)的链霉亲和素修饰的磁珠，用1mL的DPBS冲洗磁珠，用磁力架磁分离约2min后去除上清，重复洗涤6次，清洗去除保存磁珠用的缓冲液；将上述处理过的文库与引物混合物加入到链霉亲和素修饰的磁珠中，在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育30min.第二轮及随后的筛选，文库浓度调整为700nM(200μL)和磁珠用量(70μL)进行相应的调整即可。

2.靶标的筛选及文库富集监测

固定后液体磁分离去上清，后用400μL washing buffer(含0.68％甲醇的DPBS溶液为washing buffer)加入磁珠中冲洗6次，将未结合的ssDNA冲洗干净。每一次洗涤上清都要留样，用于qPCR检测。洗涤后先快筛：加入200μL200μM靶标DES(DES由0.28％的甲醇的DPBS溶解)到SA磁珠中(靶标选择二苯乙烯类雌激素的代表物质己烯雌酚)，快筛，然后磁分离取出上清，标记为E1；慢筛：加入200μL(200μM)靶标DES到SA磁珠中，室温孵育30min，然后磁分离取出上清，标记为E2，向磁珠中加入200μL的washing buffer清洗一次，磁分离取上清，标记为W1。最后将所有上清采用EvaGreen染料的实时荧光定量PCR扩增，分析靶标洗脱效果，根据文库量的变化来监测筛选的进程。

3.次级文库的ePCR扩增

1)95℃预热PCR仪；

2)将200μL含ssDNA的洗脱液(其中100μL SS1，100μL SS2)，加入到总体系为2mL的PCR mixed中进行扩增。上游引物为5’-FAM-ttcagcactccacgcatagc-3’(SEQ ID NO.06)，下游引物为：5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO.07)-spacer18-ttcacggtagcacgcatagg(SEQ ID NO.08)-3’。

3)在PCR仪中按以下程序扩增

预变性：95℃5min；20-30个循环：95℃30s，60℃30s，72℃30s；后扩增：72℃5min。

4.次级配体库的回收、纯化

将ePCR产物用正丁醇浓缩，随后经浓缩后的产物进行8％尿素变性胶分离。切胶煮胶回收目的片段(本实施例使用长短链引物进行PCR，单链模板会比下游模板链短约25nt)。回收样品透析过夜纯化。

5.核酸适体的下一轮筛选

将回收得到的次级文库测量此时的单链浓度，通过计算确保每轮投入量为700nM，从第二轮开始磁珠用量为70μL，重复第一轮筛选过程进行下一轮筛选。

实施例2核酸适体的克隆和测序以及候选适体二级结构的预测

1.PCR产物的回收

利用非修饰的上下游引物，对第14轮筛选(图2)得到的次级文库进行扩增，随后进行3％琼脂糖胶分离，切胶回收目的条带，利用Axygan牌琼脂糖胶回收试剂盒进行目的产物回收。

2.连接及连接产物的转化

1)在微量离心管中加入1μL全式金pEASY-T5 Zero载体、4μL核酸适体PCR产物；

2)在25℃反应10min进行连接(pEASY-T5 Zero载体试剂盒中自带有连接酶)；

3)将连接后产物加入50μL DH5α感受态细胞中，冰中放置20min；

4)42℃热激30s后，再冰上放置2min；

5)加入250μL的经37℃预热的LB培养基(不含抗性)，37℃，220rpm振荡培养60min；

6)离心使体积为100μL左右，将其涂布于含有(100μg/mL)氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养静置培养16小时以形成单菌落。

3.单克隆筛选、测序和二级结构预测

挑取上述的单菌落溶于10μL无菌蒸馏水中，取5μL用于PCR鉴定阳性克隆(克隆鉴定引物为M13F和M13R)；将阳性克隆剩余的5μL用于菌体培养，培养条件为37℃，220rpm振荡培养8小时以上，培养菌体经质粒提取后，送上海生工进行核苷酸序列测定。测序结束后挑选三条候选适体命名为Apt-7(SEQ ID NO.01：5’-ttcagcactccacgcatagccacagtcacaccacggaacgctcaaatgcgctgcgtgatgcctatgcgtgctaccgtgaa-3’)、Apt-21(SEQ ID NO.02：5’-ttcagcactccacgcatagccacacagaaagcgggccgagcatcatgcacagtgcgatgccctatgcgtgctaccgtgaa-3’)和Apt-31(SEQ ID NO.03：5’-ttcagcactccacgcatagccacgcaaacgggggttgctgccacatattgctgcgagatccctatgcgtgctaccgtgaa-3’)。

通过mfold软件(http：//unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)设置温度为25℃、Na⁺浓度为153.2mM，Mg²⁺浓度为0.5mM进行单链DNA分子进行二级结构预测，结果见图1。结果表明，Apt-7，Apt-21，Apt-31二级结构为茎环结构，吉布斯自由能分别为Apt-7：ΔG＝-12.46KJ/mol；Apt-21：ΔG＝-12.02KJ/mol；Apt-31：ΔG＝-14.2KJ/mol，结果显示这三条适体结构具有较高的稳定性，二级结构见图3。

实施例3：核酸适体与二苯乙烯类雌激素特异性检测

1.纳米金比色法检测特异性

1)纳米金准备：设置本实施例一个管内总体积为400μL(总体系)，向1.5mL离心管中加入100μL制备好的纳米金，加入200μLddH₂O；

2)加适体保护纳米金：然后加入终浓度为300nM的适体Apt-7(即向其中加入12μL10μM DPBS配置的适体)，取上述管在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育20min；

3)加靶标：实验组1-5号管中依次加入40μL 10mM的己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)、双烯雌酚(DIES)、雌酮(E1)和β-雌二醇(E2)溶液(靶标溶液及类似物溶液终浓度为1000μM；对照组0号管中加入40μL基体溶液；

4)取上述管在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育30min；

5)加NaCl：再加入7μL 2M NaCl(即终浓度为35mM的NaCl)，取上述管在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育10min；

6)补足体积：每管加41μL ddH2O补足400μL总体积；

7)检测：将样品置于96孔板中拍照，用于肉眼比色。同时取100μL于96孔板中用酶标仪于450-750nm波段扫描，计算靶标A650/A520比值与基体A650/A520比值差值，即ΔA650/A520比值；

8)Apt-21和Apt-31操作同Apt-7。

检测结果见图4，图4显示实施例2获得的三条候选适体与纳米金孵育后，再加入己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚后均能使得纳米金变色为灰蓝色，说明三者均可以候选适体结合；而加入雌酮和β-雌二醇后纳米金不变色，说明这两种类似物与候选适体不结合；这结果表明三条候选适体均能特异性得识别结合二苯乙烯类雌激素，且能区分开其他雌激素类似物。

2.磁珠-qPCR法检测特异性

磁珠-qPCR实验是模拟筛选过程，将候选适体序列固定于磁珠上后，通过类似筛选过程，最后有靶标的一组对适体的竞争力会比基体组的强，根据Ct值的比较，有靶标组的Ct值会比无靶标的对照组Ct值小，而高浓度靶标Ct值比低浓度靶标Ct值小，而且ΔCt值(ΔCt＝Ct基体-Ct实验组)会与靶标浓度梯度呈现一定的相关性。

1)退火互补：取21μL 10μM的bio-P3引物，537μL DPBS缓冲液，43μL 10μM候选适体Apt-7；将上述溶液混匀后分装到PCR管中，在PCR仪中95℃变性10min，每30秒降温0.5℃，缓慢降温至60℃，60℃持续10min，然后再每30秒降温1℃缓慢降温至20℃，使得适体与引物变复性互补；

2)取链霉亲和素修饰的磁珠120μL，用400μL DPBS清洗6次，最后一次磁分离去上清后备用；

3)将1)中的引物适体复合物加入到备用的磁珠中，在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育1h；

4)磁分离弃去上清，用400μL washing buffer加入磁珠中用枪头吹打冲洗6次，将未结合到磁珠上的ssDNA冲洗干净；

5)最后一次洗涤后的磁珠混匀后平分到6份离心管中，依次编号0-5，磁分离弃去上清；

6)向0号管中加入100μLwashing buffer作为基体对照，1-5号离心管中分别加入100μL100μM的不同靶标溶液，靶标依次为己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)、双烯雌酚(DIES)、雌酮(E1)和β-雌二醇(E2)；

7)圆周混匀仪上10r/min，室温孵育20min；

8)磁分离，分别取出上清，并作为模板，进行RT-qPCR；运行结束后导出扩增曲线图与Ct值，0号管Ct值记为Ct₀，计算ΔCt值(ΔCt＝Ct-Ct₀，其中Ct为1-5号管的Ct值数据)；

9)其他候选适体Apt-21、Apt-31操作同上。

结果见图5，从图5可以纵坐标可以看出适体Apt-7、Apt-31对二苯乙烯类雌激素：己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)和双烯雌酚(DIES)的ΔCt值均高于对照物雌酮(E1)和β-雌二醇(E2)，而ACt越大说明结和性越强；而Apt-21相对来说特异性识别DIES与对照物E1和E2性不如另外两条。此方法结果表明两条适体均能与二苯乙烯类雌激素物质结合，且能特异性得与雌激素类似物区分开，结合二苯乙烯类雌激素特异性良好。

3.SYBR Green I法检测特异性

利用SYBR Green I(SGI)染料法，该方法它主要是SYBR Green I染料只结合DNA的双链小沟区，不结合单链区。而候选适体序列与靶标结合前后，如果由此而改变了结构，双链区域增加，则结合的SYBR Green I数量增多，由此荧光强度；反之双链区域减少则荧光减弱甚至消失，通过检测荧光值的变化可作为检测适体靶标能否结合的信号。

1)将600μL 1μM的候选适体Apt-7进行预变性处理，首先将适体在金属浴95℃加热10min，接下来放置于冰水中静置10min，最后室温下放置10min；

2)准备6只棕色离心管，依次编号为0-5号，每管中加入100μL 1μM适体Apt-7，88μLDPBS缓冲液；然后0号管中加入0μL washing buffer，而1-5号管中依次加入10μL的己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)、双烯雌酚(DIES)、雌酮(E1)和β-雌二醇(E2)溶液(靶标溶液及类似物溶液终浓度为0.05μM)，圆周混匀仪10r/min，室温孵育45min；

3)每管中加2μL100×SGI染料，圆周混匀仪10r/min，避光室温孵育2h；

4)候选适体Apt-21、Apt-31以及阴性适体yxApt操作步骤同Apt-7；

5)进行荧光分光光度检测，将每管中200μL样品中加1800μL DPBS稀释到2mL放于一次性聚乙烯比色皿中进行荧光比色；

6)设置发射光谱扫描，激发波长为495nm，狭缝EX 5nm，Em 5nm，扫描波长为505-600nm；

7)以上实验重复三次，每次六组平行。结果见图6。

由图6可以看出，实施例2获得的三条候选适体对二苯乙烯类雌激素(DES、HEX、DIES)的结合性明显强于类似物雌酮(E1)和B-雌二醇(E2)，能够特异性识别二苯乙烯类雌激素；而且也可以看出用此种方法时三条候选适体与二苯乙烯类雌激素中的己烷雌酚(HEX)结合性略强些。

实施例4：核酸适体与二苯乙烯类雌激素亲和性检测

1.磁珠-qPCR法检测亲和性

1)本实施例三组平行，取42μL 10μM的bio-P3引物，加84μL 10μM Apt，加1074μLDPBS，混匀程序退火；

2)取磁珠240μL，用1000μL DPBS清洗6次；将退火后的样品加入磁珠，室温固定1h；

3)然后用1000μL Washing buffer清洗磁珠6次；

4)最后一次平分为13等份后弃去上清。适体为阴性适体，Apt-7，Apt-21，Apt-31。将实验组按照0、10、20、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500μM的顺序浓度进行靶标加样。

5)室温下孵育20min

6)磁分离取上清，上清由于qPCR，检测Ct值，计算ΔCt。检测结果见图7。

结果可看出随着靶标浓度的增大，实验组三条适体的筛选上清qPCR后Ct值减小，但阴性适体的Ct值无明显变化。即说明靶标越多从磁珠上竞争得到的适体量也随之增加，证明了实施例2的三条适体与靶标有亲和力。

2.SYBR Green I法检测亲和性

1)适体进行预变性处理，首先将适体在金属浴95℃加热10min，接下来放置于冰水中静置10min，最后与室温下放置10min。200μL总体系中，加100μL 1μM的适体，加2μL 100XSGI染料，加10μL靶标，加88μL DPBS。(每组三个平行)

2)将100μL 1μM适体和10μL终浓度梯度分别为0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μM的靶标室温孵育45min；

3)加2μL 100X SGI染料，避光，圆周混匀2h。

4)进行荧光分光光度检测。将200μL样品中加1800μL DPBS稀释到2mL放于一次性不可重复使用聚乙烯比色皿随后进行荧光比色。

5)仪器为日立F-7000，进行发射光谱扫描，激发495nm，狭缝EX 5nm，Em 5nm，扫描波长为505-650nm。本实验结果见图8。

结果可看出随着靶标浓度的增大，实验组三条适体的荧光强度也呈梯度下降，但阴性适体的荧光值无明显变化。即说明靶标与实验组适体结合后双链区域减少，证明了实施例2中的三条适体与靶标有亲和力。

实施例5：K_d值检测

横轴为靶标浓度，纵轴为(F₀-F)/F₀，统计亲和性数据进行计算，用graphpad软件中的拟合曲线得出K_d值，结果见图9。

K_d值结果依次为：Apt-7：K_d＝(51.73±7.351)nmol/L；Apt-21：K_d＝(120.6.73±11.60)nmol/L；Apt-31：K_d＝(80.64±7.840)nmol/L。k_d值大小：Apt-7＜Apt-31＜Apt-21。

实施例6：纳米金比色法检测二苯乙烯类雌激素代表物质己烯雌酚的应用

1)纳米金准备：设置本实施例一个管内总体积为400μL(总体系)，向1.5mL离心管中加入100μL制备好的纳米金，加入200μL ddH₂O(实验设置三组平行)

2)加适体保护纳米金：然后加入终浓度为300nM的适体(即向其中加入12μL 10μMDPBS配置的适体)，取上述管在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育20min；

3)加靶标：0号为基体对照组，1-10号为实验组，0-10号管中依次加入靶标溶液终浓度为0μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，200μM，400μM，600μM，800μM，1000μM，取上述管在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育30min。

4)加NaCl：再加入7μL 2M NaCl(即终浓度为35mM的NaCl)，取上述管在圆周混匀仪上10r/min，室温孵育10min.

5)补足体积：每管加41μL ddH2O补足400μL总体积。

6)检测：将样品置于96孔板中拍照，用于肉眼比色。同时取100μL于96孔板中用酶标仪于450-750nm波段扫描，同时检测A650和A520数值，计算A650/A520比值。本实验结果见图10。

结果可看出随着靶标浓度的增大，实验组三条适体的纳米金也由紫红色逐渐聚集变为蓝黑色，但阴性适体的荧光值无明显变化。即说明靶标与实验组适体结合后，适体无法保护纳米金而在加了氯化钠的环境中聚沉。说明适体Apt-7、Apt-21、Apt-31均能与靶标亲和性结合，其中Apt-7的亲和性强于其他两者。

实施例7：修饰核酸适体的制备

前期研究结果表明，利用Taq酶体系，能够将适体的所有碱基全部替换为含硫修饰的碱基，其经过修饰的适体具备了抵抗限制性外切酶和DNase I的功能，因此，本实施例利用含硫修饰碱基改造核酸适体骨架。以四种硫代磷酸脂修饰的脱氧核苷酸(dNTPαSs)代替四种非修饰的脱氧核苷酸(dNTPs)作为原料进行PCR，PCR程序与体系见下表，通过碱变性的方法回收单链修饰适体。

1)PCR体系

2)PCR程序

预变性：95℃5min；

40个循环：95℃30s，60℃30s，72℃30s；

后扩增：72℃5min。

实施例8：修饰核酸适体的鉴定

1.电泳鉴定

图11为修饰适体制备后8％尿素-PAGE胶电泳图，由图可以看出成功PCR得到了修饰适体。

2.双链修饰适体抗DNase I酶切鉴定

1)取普通适体Apt-7作为模板，分别进行普通碱基PCR和修饰碱基PCR；

2)PCR后的样品进行8％尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶回收80bp处条带。回收后的样品用正丁醇浓缩，测量浓缩后样品浓度，确保后续实验使用的DNA样品为相同浓度；

3)按照下述体系(10μL酶切体系：PCR产物6μL；DNase I酶1μL；10xDNase I buffer1μL；ddH₂O 2μL)加样。(DNase I buffer为100mM Tris-HCl(pH＝7.5)，25mM MgCl₂，1mMCaCl₂溶液)。

4)设置酶浓度梯度实验，DNase I酶浓度依次为30，300U/L。

5)将10μL样品置于离心管中，离心后于PCR仪中37℃反应30min；

6)向离心管中加入2μL 15mM EDTA终止反应(终浓度为2.5mM)，继续在PCR仪中65℃反应10min使酶失活。

7)使用8％尿素-PAGE凝胶电泳检测酶切效果。

图12为酶切鉴定结果图。泳图可知，当酶量为30U/L时，修饰适体可以抵抗酶切。

3.单链修饰适体抗DNase I酶切鉴定

1)取普通适体Apt-7作为模板，利用生物素修饰的下游引物分别进行普通碱基PCR和修饰碱基PCR；利用碱变性的方式回收普通和修饰的单链DNA；

2)将回收的普通和修饰的适体进行正丁醇浓缩，测量浓缩后样品浓度，确保后续实验使用的ssDNA样品为相同浓度；

4)设置酶浓度梯度实验，DNase I酶浓度依次为20，200U/L。

5)将10μL样品置于离心管中，离心后于PCR仪中37℃反应30min；

7)使用8％尿素-PAGE凝胶电泳。

图13为酶切鉴定结果图。泳图可知，当酶量为20U/L时，普通适体被酶切水解掉一部分，修饰适体可以抵抗部分酶切；当酶量为200U/L时，修饰适体可以抵抗酶切。

实施例9：修饰核酸适体xsApt-7检测二苯乙烯类雌激素代表物质己烯雌酚的应用

1.修饰核酸适体xsApt-7与己烯雌酚特异性鉴定

利用纳米金比色方法进行高低浓度组的修饰核酸适体的特异性性检测。利用相同的方法，本检测中将300nM的适体适体与纳米金孵育1h；加入终浓度为500μM和1000μM的五种靶标溶液(同时检测己烯雌酚(DES)，己烷雌酚(HEX)，双烯雌酚(DIES)，雌酮(E1)，雌二醇(E2)小分子靶标)反应30min后加终浓度为35mM的NaCl，孵育10min后检测颜色变化，并用酶标仪检测A650/A520比值。实验结果见图14，加入己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚后纳米金均变为灰蓝色，说明三者均可以修饰适体xsApt-7结合，证明适体进行修饰后仍能结合二苯乙烯类雌激素；而加入对照物雌酮和雌二醇后纳米金不变色，说明这两种类似物与修饰适体xsApt-7不结合或者结合力弱，证明修饰适体xsApt-7对二苯乙烯类雌激素特异性良好。

2.修饰核酸适体xsApt-7与己烯雌酚亲和力鉴定

实验步骤如实施例6中利用纳米金比色方法进行修饰核酸适体的亲和性检测。本检测中将300nM的适体适体与纳米金孵育1h；加入终浓度为20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，200μM，400μM，600μM，800μM，1000μM，1200μM，1400μM的靶标溶液反应30min后加终浓度为35mM的NaCl，孵育10min后检测颜色变化，并用酶标仪检测A650/A520比值。实验结果见图15。显示当加入600μM-800μM的己烯雌酚溶液时纳米金开始变色，知道靶标到1200μM时肉眼见纳米金变色为灰蓝色结果证明修饰适体xsApt-7能与己烯雌酚亲和结合；图16是靶标浓度为横坐标，A650/A520为纵坐标(表示纳米金聚集程度)，纳米金比色实验数据的线性拟合，由图可见当靶标浓度在0μM到1000μM区间呈线性关系。

上述各实施例采用固定文库的方法，初步获得了抗二苯乙烯类雌激素的核酸适体，该适体能特异性识别二苯乙烯类雌激素。并制备得到了xsApt-7，用于实际环境中稳定检测靶标的修饰核酸适体，此修饰适体能特异性与亲和性结合二苯乙烯雌激素。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 二苯乙烯类雌激素核酸适体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcagcactc cacgcatagc cacagtcaca ccacggaacg ctcaaatgcg ctgcgtgatg 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcagcactc cacgcatagc cacacagaaa gcgggccgag catcatgcac agtgcgatgc 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcagcactc cacgcatagc cacgcaaacg ggggttgctg ccacatattg ctgcgagatc 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcagcactc cacgcatagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctatgcgtg ctaccgtgaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcagcactc cacgcatagc 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcacggtag cacgcatagg 20

Claims

1.二苯乙烯类雌激素核酸适体，其特征在于：包括Apt-7、Apt-21和Apt-31中的至少之一，其中，Apt-7的序列如SEQ ID NO.01所示，Apt-21的序列如SEQ ID NO.02所示，Apt-31的序列如SEQ ID NO.03所示。

2.如权利要求1所述的二苯乙烯类雌激素核酸适体，其特征在于：为Apt-7、Apt-21和Apt-31中的至少之一。

3.如权利要求1或2所述的二苯乙烯类雌激素核酸适体，其特征在于：所述Apt-7、Apt-21和Apt-31中的碱基中的A、T、C和G中的至少之一为修饰碱基，以增强其抗核酸水解酶的能力。

4.如权利要求3所述的二苯乙烯类雌激素核酸适体，其特征在于：所述修饰碱基为硫修饰碱基、氟修饰碱基或甲氧基修饰碱基。

5.权利要求1至4中任一权利要求所述的二苯乙烯类雌激素核酸适体在检测二苯乙烯类雌激素中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：采用纳米金比色检测法。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述二苯乙烯类雌激素包括己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚。

8.一种二苯乙烯类雌激素的检测方法，其特征在于：使用权利要求1至4中任一权利要求所述的二苯乙烯类雌激素核酸适体。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：其为纳米金比色检测法。

10.如权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于：所述二苯乙烯类雌激素包括己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚。