CN110923237A - 一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01至09中的任一所示。本发明能够与罗红霉素特异性结合，可依此制备罗红霉素定量检测试剂盒。

Description

一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用。
背景技术
罗红霉素属于大环内酯抗生素，主要作用于革兰氏阳性菌、厌氧菌、衣原体和支原体等。这类抗生素已成为全球第二大用量抗生素，同时其在环境中的污染未能得到有效控制的现状以及对人类健康产生的不利影响引起了重视。目前检测罗红霉素常用方法为液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法和质谱法(分析试验室，2018，v.37(05)：43-46.)等，但这些方法仪器昂贵，需要专门的技术人员且又操作复杂、费时耗力。因此，有必要寻找一种快速、简便、高效的检测罗红霉素的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种罗红霉素特异性结合核酸适体。
本发明的另一目的在于提供上述罗红霉素特异性结合核酸适体的应用。
本发明的再一目的在于提供一种
本发明的技术方案如下：
一种罗红霉素特异性结合核酸适体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01至09中的任一所示。
在本发明的一个优选实施方案中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
本发明的另一技术方案如下：
上述罗红霉素特异性结合核酸适体在检测罗红霉素中的应用。
一种罗红霉素检测试剂盒，包括罗红霉素特异性结合核酸适体溶液，其溶剂为DPBS，该罗红霉素特异性结合核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.01至09中的任一所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述罗红霉素特异性结合核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括标准罗红霉素溶液，其以DPBS为溶剂。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括染料溶液，其以DPBS为溶剂，该染料能够结合ssDNA中的双链部位。
进一步优选的，所述染料为SYBR Green I。
本发明的有益效果是：本发明能够与罗红霉素特异性结合，可依此制备罗红霉素定量检测试剂盒。
附图说明
图1为本发明实施例1中优化罗红霉素靶标溶液浓度qPCR曲线图。
图2为本发明实施例1中罗红霉素适体第16轮筛选qPCR曲线图。
图3为本发明实施例2中阳性克隆在8％尿素变性胶电泳中结果。
图4至图12依次为本发明实施例2中的SEQ ID NO.01至SEQ ID NO.09序列二级结构示意图。
图13为本发明实施例3中SGI法非线性拟合曲线图，横坐标为靶标浓度，纵坐标为荧光比值(F-F0)/F0，F0为不加靶标组对照。
图14为本发明实施例4中抗生素终浓度均为0.4098μM时，不同抗生素与SEQ IDNO.01结合图，横坐标为各抗生素组，纵坐标为荧光比值(F-F0)/F0，**代表极显著差异，N均为5。
图15为本发明实施例5中在开发检测罗红霉素试剂盒前不同浓度罗红霉素溶液组和DPBS溶液组的荧光强度图情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图16为本发明实施例中在检测罗红霉素试剂盒应用中的标准曲线图，Y＝10.30*X+0.009355，R2＝0.9931，横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度比值(F-F0)/F0。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1罗红霉素核酸适体的筛选
一、文库与磁珠表面可逆性联接：
1)设计单链寡核苷酸库文库：5’-ATTGGCACTCCACGCATAGG(SEQ ID NO.10)(Nn)CCTATGCGTGCTACCGTGAA(SEQ ID NO.11)-3’。其中N为随机碱基，n＝20-60，优选n＝40。由上海生工公司合成，产品为装在离心管的干燥粉剂。按照行业内技术人员所熟知的PCR技术设计引物。Nn之前的序列为上游引物，Nn之后的序列为上游引物结合区。把含文库的离心管在室温下离心10min，14000xg，再按终浓度2μM加入DPBS(0.1g CaCl2，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，0.1g MgCl2·6H2O，8g NaCl，1.15g Na2HPO4，加水定容到1L)溶液摇匀溶解，离心10min，置4℃冰箱备用；
2)文库与含生物素修饰的上游互补链退火结合。本发明采用的引物互补链为生物素修饰的寡核苷酸序列(5’CCTATGCGTGGAGTGCCAAT-biotin，SEQ ID NO.12)与随机文库按2∶1摩尔比混合后于PCR仪上退火，退火条件为95℃8-12min，优选为10min；随后以1℃/10s的速率降到60℃，60℃1-5min，优选为60℃维持1min，随后继续以1℃/10s的速率降到25℃完成退火；
3)取100μL链霉亲和素磁珠混悬液，用DPBS溶液清洗6遍，每遍200μL，再用Pickpen(芬兰Bio-Nobile)吸收磁珠，每次去除上清后再悬浮；
4)联接文库：将退完火的文库与清洗后的链霉亲和素磁珠室温孵育10min-2h，优选为30min。再用DPBS溶液清洗3-6遍，优选为5遍，每遍200μL。每次用Pickpen吸收磁珠，依次收集各洗涤上清样本，分别标为洗涤1，洗涤2，洗涤3，洗涤4，洗涤5；第二轮及随后的筛选，文库浓度均为700nM(100μL)，磁珠混悬液用量为70μL/轮。二、通过靶标结合挑选候选序列：
1)快洗脱：在洗涤后再用200μL靶标溶液(罗红霉素粉末溶于DPBS溶液中)洗脱得到能与靶标快速结合的适体，靶标溶液的浓度为300-500μM，并且筛选前通过优化靶标浓度大小(此时模板浓度为0.1μM，靶标浓度大小依次设置为0.1mM、0.5mM、1mM及5mM，qPCRnix体系具体如表1所示)证明该浓度范围不会影响qPCR扩增(图1)。在实验过程中靶标溶液浓度逐渐降低，前4轮为500μM，随后第5轮降至400μM，第6轮及以后每轮靶标溶液浓度均为300μM。Pickpen吸收磁珠，收集上清样本，标为快洗脱；
2)慢洗脱：每一轮在用靶标溶液快速洗脱后，再加入靶标溶液室温孵育一定时间(浓度大小与该轮用靶标溶液快速洗脱过程一致)进行慢洗脱，时间为20-30min，即第1轮筛选孵育时间为30min，第2轮为25min，第3轮及以后每轮降至为20min并且保持不变。Pickpen吸收磁珠，收集上清样本，标为慢洗脱；
3)慢洗脱后洗涤：在慢洗脱后加入200μL DPBS溶液洗涤，其室温孵育时间与慢洗脱室温孵育时间保持一致，Pickpen吸收磁珠，收集上清样本，标为慢洗脱后洗涤；
三、实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)监控筛选过程：
30μL qPCRmix体系(每管已按30μL的体系分装)中加入2μL各上清样本，离心混匀，qPCR监测，其程序为预变性：95℃3min；26个循环：95℃30S，60℃30S，72℃30S；延伸：72℃30S。(图2)
qPCRmix体系成分表1：
试剂 总体积1040μL
ddH2O 806μL
10×Pfu酶buffer 100μL
Pfu酶(5U/μL) 4μL
dNTPmix(2.5mM) 80μL
LibS1(100μM) 5μL
LibA2(100μM) 5μL
Eva Green 40μL
备注：LibS1为上游引物：5’-ATTGGCACTCCACGCATAGG-3’(SEQ ID NO.13)；LibA2为下游引物：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’(SEQ ID NO.14)。
四、候选序列的扩增：
1)乳浊液PCR(E-PCR)：取出2管乳浊液PCRmix(E-PCRmix)(每管已按1mL的体积分装)，室温解冻，将E-PCR mix溶液置于离心机中离心2min；
E-PCRmix体系成分表2：
试剂 总体积1000μL
ddH2O 806μL
10×Pfu酶buffer 100μL
Pfu酶(5U/μL) 4μL
dNTPmix(2.5mM) 80μL
LibS1-FAM(100μM) 5μL
LibA2-ployA(100μM) 5μL
备注：LibS1-FAM为荧光修饰的上游引物：5’-FAM-ATTGGCACTCCACGCATAGG-3’(SEQID NO.15)；
LibA2-ployA：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.16)
-Spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAG(SEQ ID NO.17)-3’。
2)取50mL离心管一只，加入2mL的E-PCR mix，随后加入200μL elution溶液(50～100μL elution1与100～150μL elution 2混合后总体系为200μL，具体比例依据qPCR监测情况而定)，涡旋振荡仪震荡1min左右使其混匀；
3)准备EM90 Oil(2％EM90，0.05％Tritonx-100，47.95％Mineral oil)，吸取8mL加入2)中的50mL离心管中，涡旋震荡2min使其成为乳浊液且放置1min后不分层；
4)将3)中乳浊液分装至PCR八联管中扩增，PCR程序为预变性：95℃5min；20-28个循环：95℃30s-5min，优选为1min，60℃30s-1min，优选为1min，72℃30s-1min，优选为1min；延伸：72℃5min。
五、ssDNA的制备和回收：
1)随后将上述E-PCR扩增产物(约2.2mL)用正丁醇浓缩；
2)将1)中浓缩产物用8％尿素变性胶分离，切胶回收目的片段(本实验使用长短链引物进行E-PCR，故目的条带与其部分互补链长度不同，碱基数相差25bp)；
3)将回收样本置于DPBS溶液中4℃透析过夜，即为次级文库，用于下一轮的筛选，如此反复。
六、用Nano-300仪器测定回收的ssDNA样品浓度，测定前室温离心2min，转速1400xg。以DPBS溶液为空白对照组，ssDNA样本测量三次，并计算均值。根据文库长度估算出其摩尔浓度，次级文库投入量固定700nM(100μL)并进行下一轮筛选，其操作与上一轮相同。
实施例2罗红霉素核酸适体的克隆、测序及序列分析
一、待测序PCR产物的制备：
经16轮筛选得到ssDNA文库用普通上下游引物进行PCR扩增，随后琼脂糖电泳在紫外灯下切下含有目的条带DNA的琼脂糖凝胶，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的产物。
二、连接及连接产物的转染：
1)在200μL离心管中加入1μL pEASY-Blunt Zero载体(已含有连接酶)、3μLPCR产物(扩增时将Pfu酶改为taq酶)及1μL无菌水；
2)轻轻混合，25℃反应10min；
3)加连接产物(5μL)加入50μL Trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30min；
4)42℃热激90S，立即置于冰上2min；
5)加入800μL的经37℃预热的LB培养基(不含抗性)，37℃，200RPM振荡培养60min；1500xg离心1min，弃掉部分上清，保留150μL，轻弹悬浮菌体，将150μL菌液涂板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
三、阳性克隆检测及测序：
1)挑选白色菌落接种至含氨苄青霉素的液体培养基(3.5mL/管)中，200rpm、37℃培养6小时左右；
2)取2μL混合液于20μLPCR体系，用M13Forward Primer和M13Reverse Primer鉴定阳性克隆(图3)；
3)测序：挑取阳性转化子送专业公司进行测序。
四、序列分析及模拟二级结构：
所获测序序列具体如表3所示：
表3与罗红霉素结合的第一至第九条候选适体
Figure BDA0002275367850000061
Figure BDA0002275367850000071
用Mfold软件(http：//unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/download-mfold预测时的离子浓度及温度设置分别设置为[Na+]＝153mM，[Mg++]＝0.5mM，折叠温度25℃(与筛选过程中保持一致，其他参数默认)对上述9条适体进行二级结构预测(图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12)。可以明显看出，序列SEQ ID NO 01至09在二级结构结构上具有一定的相似性：由2-4个多分支环结构组成，这些结构形成12-24个碱基对(包括A-T，G-C配对)，形成茎环发夹结构和内环结构。理论上，碱基对越多结构越稳定，形成的自由能就越低。
实施例3罗红霉素核酸适体的解离常数(Kd)测定
利用SYBR Green I(SGI)能结合ssDNA中的双链部位这一性质，当加入靶标后，靶标与适体结合变构，引起荧光强度规律性改变。
1)取2μM 550μL适体进行预变性95℃处理10min，随后立即置于冰上10min，冰上放置时间0-20min，优选为10min，再将其放置室温10min；
2)随后将适体分装至11个1.5mL的离心管中，并分别加入149μL浓度分别为0μM、0.15μM、0.3μM、0.45μM、1μM、4μM、6μM、10μM、12μM、20μM、30μM的罗红霉素溶液，置于圆周混匀仪上以转速10rpm/min室温孵育45min，每一组实验组与对照组均设置3个平行组；
3)在靶标适体复合物中加入1μL100×SYBR Green I染料，置于圆周混匀仪上按转速10rpm/min室温避光孵育2小时；
4)测荧光：用DPBS溶液将上述200μL体系稀释至2mL，利用日立F-7000荧光分光光度计，进行荧光光度测定。激发波长EX 495；发射波长Em 505；狭缝激发和发射均为5nm；
Kd值计算：对照组不含靶标为F0，以(F-F0)/F0为纵坐标，浓度为横坐标。利用GraphPad prism 6.0软件进行拟合曲线分析，获得拟合曲线(图13)和Kd＝(0.3852±0.0403)μM。以罗红霉素浓度为横坐标(x)，以荧光强度比值为纵坐标(y)进行相关性分析，结果显示罗红霉素溶液在0.0112～0.745μM与荧光强度比值呈现良好的线性关系，相关系数(r2)为0.9884。
实施例4罗红霉素核酸适体的特异性评价
1)根据核酸适体的亲和力考察结果，对适体与其靶标的结合进行特异性评价。取2μM 250μL适体进行预变性95℃处理10min，随后立即置于冰上10min，再将其放置室温10min；
2)随后将适体分装至5个1.5mL离心管中，并分别加入体积均为149μL的DPBS溶液、5.5μM罗红霉素溶液、5.5μM红霉素溶液、5.5μM阿奇霉素溶液及5.5μM克拉霉素溶液，置于圆周混匀仪上按转速10rpm/min室温孵育45min，每一组实验组与对照组均设置3个平行组；
3)加入1μL 100×SYBR Green I染料，置于圆周混匀仪上按转速10rpm/min室温避光孵育2小时；
4)测荧光：用DPBS溶液将上述200μL体系稀释至2mL，利用日立F-7000荧光分光光度计，进行荧光光度测定。激发波长EX 495；发射波长Em 505；狭缝激发和发射均为5nm；
SEQ ID NO.01所示的适体的荧光强度如图14所示，适体与罗红霉素的荧光强度比值均高于适体与其他对照组的荧光强度比值，且罗红霉素与红霉素、阿奇霉素、克拉霉素的P值分别为P＜0.0001、P＜0.0001、P＜0.0001。在统计学上，当P＜0.01时，代表极显著差异，从而验证该序列是高特异性适体。
实施例5利用适体检测样本中的罗红霉素
1)A1、A2、A3、A4管中分别加入50μL2μM的适体(序列如SEQ ID NO.01所示，该适体前期已经按步骤先预变性10min，再冰上放置10min，最后室温放置10min)；
2)B1、B2、B3、B4管中分别加入体积均为149μL的DPBS溶液、0.2μM罗红霉素溶液1、2μM罗红霉素溶液2、4μM罗红霉素溶液3(终浓度在0.0112～0.745μM之间呈现线性关系，以罗红霉素溶液初始浓度0.2μM、2μM、4μM为例)；
3)C1、C2、C3、C4管中分别加入1μL 100×SGI染料；
4)D1、D2、D3、D4管中分别加入1800μL DPBS溶液；
5)将A1与B1管混合均匀并室温孵育30min至2h，优化为1h后，加至C1管中混合均匀并室温避光孵育5min至1h，优化为10min，最后加至D1管中混合均匀。同理，将A2与B2管混合均匀并室温孵育1h后，加至C2管中混合均匀并室温避光孵育10min，最后加至D2管中混合均匀；将A3与B3管混合均匀并室温孵育1h后，加至C3管中混合均匀并室温避光孵育10min，最后加至D3管中混合均匀；将A4与B4管混合均匀并室温孵育1h后，加至C4管中混合均匀并室温避光孵育10min；，最后加至D1管中混合均匀。
6)测荧光：利用日立F-7000荧光分光光度计，进行荧光光度测定。激发波长EX495；发射波长Em 505；狭缝激发和发射均为5nm。
结果如图15所示，可以看到罗红霉素溶液组相对荧光强度均比DPBS溶液组荧光值高，且随着罗红霉素溶液浓度变大，罗红霉素溶液组相对荧光强度呈现出规律性的量效关系，据此原理进一步开发试剂盒。
实施例6检测罗红霉素的试剂盒的应用
用于检测罗红霉素的试剂盒所含试剂：A管(1管)含200μL 2.5μM的抗罗红霉素适体溶于1×DPBS、B瓶(1瓶)含10mL 1×DPBS、C管(1管)含100μL 1μM标准罗红霉素溶液溶于1×DPBS、D管(1管)含100μL10×SGI染料溶于1×DPBS，E管(2管)含100μL 10×DPBS，加备EP管。每个EP管的总体系V体系＝125μL，检测步骤如下：
1)取9支EP管并标记序号(1-9)，依次在EP管1至EP管9中各加A管液体2.5μL，各管同时加热至95℃变性10min，冰上冷却10min，室温回温10min；
2)另取3支EP管并标记序号(样本1-3)，依次分别加入9μL待测样本液体和E管液体1μL，混匀；
3)取2μL D管中10×SGI染料用1×DPBS稀释至10μL 2×SGI染料；
4)在EP管1至EP管6中依次加入C管液体0μL、1μL、2.5μL、3μL、3.5μL、4μL，在EP管7、8、9中各加入经2)步骤处理的待测样本V样本＝5μL；用B瓶中的液体将各管均定容至122μL；混匀，室温孵育1h；各管分别加入D管液体3μL，室温避光孵育10min；
5)测荧光，利用荧光分光光度计(日立F-7000的光槽最低检测溶液体积为100μL)进行荧光光度测定。激发波长EX 495；发射波长Em 505；狭缝激发和发射均为5nm。根据EP管1-6描绘标准曲线，拟合方程(图16)，通过测得的各荧光值F与公式Y＝10.30*X+0.009355求得EP管7、8、9的罗红霉素浓度X(EP7)、X(EP8)、X(EP9)分别为0.0198μM、0.0204μM、0.0211μM，即
Figure BDA0002275367850000091
故待测样本中罗红霉素的平均浓度
Figure BDA0002275367850000092
为0.51μM
Figure BDA0002275367850000093
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种罗红霉素特异性结合核酸适体及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 1
attggcactc cacgcatagg cacacccacc ggcctagcca caccatgctg ctgttgccca 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 2
attggcactc cacgcatagg ttgaccaaca acgcgtgctg cccgtcacat cgttcgggtt 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 3
attggcactc cacgcatagg cccaccgcac cgcaagggaa tcaggactga tcgcacacta 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 4
attggcactc cacgcatagg cacacccact gcaccacgtg ttgcgcatgt cggcatcgaa 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 5
attggcactc cacgcatagg cagcgcgaac agggggaacg gtccgttgca ctaggttggt 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 6
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 6
attggcactc cacgcatagg tgagccacat gcagcaccat gatgtgtggg tttgggttgg 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 7
attggcactc cacgcatagg tcgacgcccc accccgtagc tatcccgtgt ccatgttgcg 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 8
attggcactc cacgcatagg caccacacca gcaacgcggc atgccatggt cacgagtgtc 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 9
<211> 80
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 9
attggcactc cacgcatagg cacacccaca tcccgctacc aggacgtcgt gccgcgtcta 60
cctatgcgtg ctaccgtgaa 80
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 10
attggcactc cacgcatagg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 11
cctatgcgtg ctaccgtgaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 12
cctatgcgtg gagtgccaat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 13
attggcactc cacgcatagg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 14
ttcacggtag cacgcatagg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 15
attggcactc cacgcatagg 20
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 16
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 17
ttcacggtag cacgcatag 19

Claims (8)

1.一种罗红霉素特异性结合核酸适体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.01至09中的任一所示。
2.如权利要求1所述的一种罗红霉素特异性结合核酸适体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
3.权利要求1或2所述的罗红霉素特异性结合核酸适体在检测罗红霉素中的应用。
4.一种罗红霉素检测试剂盒，其特征在于：包括罗红霉素特异性结合核酸适体溶液，其溶剂为DPBS，该罗红霉素特异性结合核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.01至09中的任一所示。
5.如权利要求4所述的一种罗红霉素检测试剂盒，其特征在于：所述罗红霉素特异性结合核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
6.如权利要求4或5所述的一种罗红霉素检测试剂盒，其特征在于：还包括标准罗红霉素溶液，其以DPBS为溶剂。
7.如权利要求4或5所述的一种罗红霉素检测试剂盒，其特征在于：还包括染料溶液，其以DPBS为溶剂，该染料能够结合ssDNA中的双链部位。
8.如权利要求7所述的一种罗红霉素检测试剂盒，其特征在于：所述染料为SYBR GreenI。
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