CN113444835A - 2019新型冠状病毒n基因检测的引物组、恒温荧光检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了2019新型冠状病毒N基因检测的引物组、恒温荧光检测试剂盒及方法。引物组包括两组LAMP引物组合，可分开使用也可合在一起使用。本发明提供的2019新型冠状病毒N基因检测的恒温荧光检测试剂盒，采用N蛋白基因的双重恒温荧光扩增内外环引物组进行检测，大大提高了检测灵敏度，有效避免了漏检。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及2019新型冠状病毒N基因检测的引物组、恒温荧光检测试剂盒及方法。
背景技术
2019新型冠状病毒属于RNA病毒，存在很不稳定，容易变异的特点。目前新型冠状病毒核酸检测试剂盒存在有反转录效率低下；扩增的循环数不够；灵敏度低，检测结果不稳定等问题。经常要做三四次核酸检测，甚至是四五次，才知道是阳性还是阴性。即便如此，可能还有很多检测出来是阴性，但已经出现白肺，或者有些核酸检测阳转阴，但其实是假阴性的检测结果。这都是由于靶基因的选择及其设计引物存在较大难度，造成的试剂灵敏度及特异性差，检测结果不稳定等问题。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明提供一组2019新型冠状病毒N基因检测的引物组。本发明的另一个目的是提供一种2019新型冠状病毒N基因检测的恒温荧光检测试剂盒及方法。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一组2019新型冠状病毒N基因检测的引物组，其包括1#外引物F3、1#外引物B3、1#内引物FIP、1#内引物BIP、1#环引物LF和1#环引物LB，其中，1#所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述1#外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述1#内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述1#内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述1#环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述1#环引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
一组2019新型冠状病毒N基因检测的引物组，其包括2#外引物F3、2#外引物B3、2#内引物FIP、2#内引物BIP、2#环引物LF和2#环引物LB，其中，2#所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述2#外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述2#内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述2#内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述2#环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述2#环引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
一组2019新型冠状病毒N基因检测的引物组，其包括1#外引物F3、1#外引物B3、1#内引物FIP、1#内引物BIP、1#环引物LF、1#环引物LB、2#外引物F3、2#外引物B3、2#内引物FIP、2#内引物BIP、2#环引物LF和2#环引物LB，其中，1#所述外引物F3的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述1#外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述1#内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述1#内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述1#环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述1#环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；其包括2#外引物F3、2#外引物B3、2#内引物FIP、2#内引物BIP、2#环引物LF和2#环引物LB，其中，2#所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述2#外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述2#内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述2#内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述2#环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述2#环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
如上所述的引物组在制备用于检测2019新型冠状病毒N基因的试剂盒中的应用。
一种2019新型冠状病毒N基因检测的恒温荧光检测试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的引物组。
如上所述的恒温荧光筛查试剂盒，该试剂盒还包括链置换Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、SYTO-9、Tris-HCl、betaine、KCl和MgCl2。
如上所述的恒温荧光筛查试剂盒，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为N基因体外转录RNA序列的质粒作为阳性对照，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。
一种对2019新型冠状病毒N基因检测的方法，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)从样品中提取RNA；
(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述2019新型冠状病毒N基因检测的引物组；
(3)荧光定量PCR仪设定：63℃，15s；63℃，45s，采集信号，共45个循环；
(4)结果判定：若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性(有核酸扩增)，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性(无核酸扩增)。
如上所述的恒温显色方法，优选地，在步骤(2)中，所述等温扩增的反应体系，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有N-1:反应液：8×105U/L Rnasin，200mM dNTPs，10mM Tris-HCl，20mM KCl，3.5mM MgCl2，0.8M betaine，3.2Μm的各内引物，0.4μM各外引物，1.6μM各环引物，SYTO-9总共22μL，Bst聚合酶0.8μL，AMV酶0.2μL，样品RNA模板2.0μL。
如上所述的恒温显色方法，优选地，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用含N基因体外转录RNA的序列的质粒作为阳性对照进行检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的2019新型冠状病毒N基因检测的引物组，用于等温扩增进行检测新型冠状病毒N基因的核酸。引物组包括两组LAMP引物组合，可分开使用也可合在一起使用。本发明提供的2019新型冠状病毒N基因检测的恒温荧光检测试剂盒，采用N蛋白基因的双重恒温荧光扩增内外环引物组进行检测，大大提高了检测灵敏度，有效避免了漏检。本发明提供了特性、灵敏的新型冠状病毒N基因恒温显色扩增筛查检测新方法，采用双LAMP引物组的扩增组合，有效避免了漏检，大大提高了检测的灵敏度，且特异性强，与其它菌不发生交叉，在35-45min即可完成对新型冠状病毒N基因的快速筛查检测，性能指标优于国内外同类方法水平。
本发明提供的新型冠状病毒N基因双重恒温荧光筛查检测试剂盒，具有技术成熟稳定、测试成本低，更适合于基层推广的优势，更适合于社区化验室、企业化验室、县区卫生所等基层实验室的快速筛查检测，成果具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。
附图说明
图1为引物对筛选结果；图中，NC为阴性对照，PC为阳性对照。
图2为2组引物对组合后的检测结果；图中，NC为阴性对照，PC为阳性对照。
图3为灵敏度测试扩增结果；图中，NC为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。本发明实施例中所用的AMV反转录酶可购自BioLabs M0277，Bst聚合酶可购自BioLabs M0537L恒温荧光扩增反应液购自广州双螺旋公司；LightCycler 480购自罗氏。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 N基因恒温荧光扩增引物组的筛选
从新型冠状病毒国家科技资源服务系统(http://nmdc.cn/#/nCoV)下载已上传的2019-nCoV序列，经比对分析和变异分析结果，选择与其它冠状病毒/细菌/人体基因组无交叉的N基因作为检测靶标，N基因位于病毒的Nucleocapsid蛋白区，根据公开的序列人工合成制备N基因质粒体外转录RNA阳性对照样本。选取N基因的保守区，采用Primer Premier5.0软件自行设计4组恒温荧光扩增引物对，分别标记为1#primer、2#primer、3#primer、4#primer。每组引物包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，并使用Primer blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。
采用阳性对照和阴性对照(无核酸酶的灭菌水)通过对4组引物进行筛选，结果显示，其中，1#primer和2#primer出峰时间较早、且较稳定(如图1所示，图中，NC为阴性对照，PC为阳性对照)，而3#primer和4#primer未检出信号。将初步选择的1#primer和2#primer引物组进行合管试验，结果见图2所示图中PC表示阳性对照，NC为阴性对照，”两组引物扩增结果重合，说明检测效果较好，能有效避免漏检。
2019新型冠状病毒N基因双重恒温荧光扩增内外环引物组，包括如下引物：
1#外引物F3(SEQ ID NO.1)：5′-CCCCAAAATCAGCGAAATGC-3′
1#外引物B3(SEQ ID NO.2)：5′-CCACCACGAATTCGTCTGG-3′
1#内引物FIP(SEQ ID NO.3)：5′-CGTTGTTTTGATCGCGCCCCTTTCATTACGTTTGGTGGACCCT-3′
1#内引物BIP(SEQ ID NO.4)：5′-AATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTTTAGCTCTTCGGTAGTAGCCA-3′
1#环引物LF(SEQ ID NO.5)：5′-TGGTTACTGCCAGTTGAATC-3′
1#环引物LB(SEQ ID NO.6)：5′-TAACACCAATAGCAGTCCAGATG-3′；
2#外引物F3(SEQ ID NO.7)：5′-CACCCGCAATCCTGCTAAC-3′
2#外引物B3(SEQ ID NO.8)：5′-TTTGCTCTCAAGCTGGTTCA-3′
2#内引物FIP(SEQ ID NO.9)：5′-CCTCTGCTCCCTTCTGCGTAGATTTAATGCTGCAATCGTGCTACA-3′
2#内引物BIP(SEQ ID NO.10)：5′-AACTCCAGGCAGCAGTAGGGTTTGTCAAGCAGCAGCAAAGC-3′
2#环引物LF(SEQ ID NO.11)：5′-GCCTTTTGGCAATGTTGTTCCTT-3′
2#环引物LB(SEQ ID NO.12)：5′-CTCCTGCTAGAATGGCTGGC-3′。
实施例2双重恒温荧光检测方法的建立
采用实施例1中自行设计并确认新型冠状病毒N基因检测1#primer和2#primer引物组合管(内引物、外引物和环引物)，配制成新型冠状病毒N基因双重恒温荧光扩增检测反应体系，混匀后置于荧光PCR仪中进行恒温荧光扩增。采用的25μL扩增体系，其中反应液22μL含有：其中8×105U/L RNasin、200mM dNTPs、10mM Tris-HCl(pH＝8.3)、20mM KCl、3.5mMMgCl2、0.8M betaine、各自为3.2μM的内引物(1#内引物FIP、1#内引物BIP、2#内引物FIP、2#内引物BIP)、各自为0.4μM的外引物(1#外引物F3、1#外引物B3、2#外引物F3、2#外引物B3)、各自为1.6μM的环引物对(1#环引物LF、1#环引物LB、2#环引物LF、2#环引物LB)、SYTO-9，共22μL，再加入Bst聚合酶(105U/L)0.8μL，AMV酶(4×106U/L)0.2μL，RNA模板2.0μL。混匀后置于LightCycler480中进行恒温荧光扩增。
反应条件为：荧光定量PCR仪：63℃，15s；63℃，45s，采集信号，共45个循环。
使用1ng/μL N基因体外转录RNA作为检测样本，结果判定时：有明显S形扩增曲线，且曲线光滑，为阳性，无S形扩增曲线为阴性。
实施例3灵敏度检测
将N基因体外转录的RNA质粒阳性样本，以10倍比梯度进行稀释，浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，采用实施例2中的恒温荧光扩增反应体系进行检测，验证本发明所设计的新型冠状病毒N基因双重恒温荧光扩增内外环引物组所建立的筛查检测方法的灵敏度。结果显示，在30分钟以内，100fg/μL两个平行均稳定检出，10fg两个平行只有一个检出，检出限为10fg/μL。结果如图3所示。
实施例4特异性检测
采用实施例2的恒温荧光检测方法，冠状病毒OC43型质粒冠状病毒NL63型质粒、腺病毒质粒、对冠状病毒229E型质粒、乙型流感病毒RNA、冠状病毒HKU1型质粒、肺炎克雷伯菌核酸、甲型流感病毒RNA、肺炎支原体质粒、MERS冠状病毒质粒、呼吸道合胞病毒质粒、副流感病毒质粒、鼻病毒质粒、肺炎衣原体质粒、军团菌核酸、肺炎链球菌质粒、金黄色葡萄球菌核酸等做特异性扩增试验。检测结果均无扩增曲线，说明本发明建立的方法所用的引物组的特性强，与其它病原不发生交叉反应。
实施例5新型冠状病毒N基因双重恒温荧光筛查检测试剂盒
本发明中提供的N基因双重恒温荧光筛查检测试剂盒，采用的恒温扩增技术基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括内引物(4条)、外引物(4条)及环引物(4条)，6对特异性引物组依靠链置换Bst DNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。通过逆转录酶，恒温扩增则进行RNA高效扩增。此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段采用的是恒温扩增产物显色技术：SYBR Green是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR GreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
本发明制备的新型冠状病毒N基因双重恒温荧光筛查检测试剂盒包括实施例1中的引物组，即1#外引物F3、1#外引物B3、1#内引物FIP、1#内引物BIP、1#环引物LF、1#环引物LB、2#外引物F3、2#外引物B3、2#内引物FIP、2#内引物BIP、2#环引物LF和2#环引物LB。根据需要试剂盒还包括链置换Bst DNA聚合酶、逆转录酶、SYTO-9、dNTPs、Tris-HCl、KCl、betaine和MgCl2。
根据使用方便，可配置成按反应体系加的试剂，可选择如表1所示。
表1试剂盒产品内容
实施例6使用试剂盒的检测方法
采用实施例5中的试剂盒对样品的检测，可适用样本类型有：咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等样本；样品应当避免反复冻融。
检测具体操作步骤如下：
1、样本RNA提取(也可以按照其他提取试剂盒操作进行)
转移20μL蛋白酶K至1.5mL离心管中，转移200μL样本(如咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等样本)的保存液至装有蛋白酶K的离心管中，震荡混匀5s；转移200μL BufferVGB、蛋白酶K、Carrier RNA至样品中，涡旋混匀15s；56℃水浴10min；加入裂解液；向裂解液中加无水乙醇溶液转移至Spin Column中；弃去滤液；将Spin Column移至1.5mL RNasefree离心管上；用RNase free dH2O清洗，把样本RNA用于检测实验或保存于-80℃。
2、试剂配制检测
(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，B-I及R-I为液体，取出后应放置于冰盒上。
(2)试剂配制
若有N个待检样本，则参照下表，按照N+3个数量计算各组分用量(N个待检样本+1个阴性对照+1个阳性对照+1份备用)，将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30s，分装于0.2mL PCR管中
试剂使用量
N-1 22×(N+3)μL
B-1 0.8×(N+3)μL
R-1 0.2×(N+3)μL
反应液总体积23×(N+3)μL
(3)添加待检样本模板
向步骤1中已含有反应液的PCR管中分别加入2μL模板，离心30s，应立即进行扩增反应。
(4)扩增反应(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)
荧光定量PCR仪：63℃，15s；63℃，45s，采集信号，共45个循环。
(5)检测结果判定
空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明检测体系有效：空白对照、阴性对照无“S”型扩增曲线(无核酸扩增)，阳性对照有“S”扩增(有核酸扩增)。
样本检测结果判定：若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性(有核酸扩增)，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性(无核酸扩增)。
序列表
<110> 大连民族大学
<120> 2019新型冠状病毒N基因检测的引物组、恒温荧光检测试剂盒及方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccaaaatc agcgaaatgc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaccacgaa ttcgtctgg 19
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttgttttg atcgcgcccc tttcattacg tttggtggac cct 43
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattccctcg aggacaaggc gttttagctc ttcggtagta gcca 44
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggttactgc cagttgaatc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taacaccaat agcagtccag atg 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacccgcaat cctgctaac 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttgctctca agctggttca 20
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctctgctcc cttctgcgta gatttaatgc tgcaatcgtg ctaca 45
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aactccaggc agcagtaggg tttgtcaagc agcagcaaag c 41
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccttttggc aatgttgttc ctt 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcctgctag aatggctggc 20
Claims (10)
1.一组2019新型冠状病毒N基因检测的引物组，其特征在于，其包括1#外引物F3、1#外引物B3、1#内引物FIP、1#内引物BIP、1#环引物LF和1#环引物LB，其中，1#所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述1#外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述1#内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述1#内引物BIP的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述1#环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述1#环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一组2019新型冠状病毒N基因检测的引物组，其特征在于，其包括1#外引物F3、1#外引物B3、1#内引物FIP、1#内引物BIP、1#环引物LF和1#环引物LB，其中，1#所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述1#外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述1#内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述1#内引物BIP的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述1#环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述1#环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，其还包括权利要求2所述的引物组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物组在制备用于检测2019新型冠状病毒N基因的试剂盒中的应用。
5.一种2019新型冠状病毒N基因检测的恒温荧光检测试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求1-3中任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括链置换Bst DNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、SYTO-9、Tris-HCl、betaine、KCl和MgCl2。
7.根据权利要求5所述的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为N基因体外转录RNA序列的质粒作为阳性对照，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。
8.一种对2019新型冠状病毒N基因检测的方法，其特征在于，该方法是非诊断目的的检测方法，具体包括以下步骤：
(1)从样品中提取RNA；
(2)对步骤(1)提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1-3中任一项所述的2019新型冠状病毒N基因检测的引物组；
(3)荧光定量PCR仪设定：63℃，15s；63℃，45s，采集信号，共45个循环；
(4)结果判定：若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述等温扩增的反应体系，具体如下：反应总体积为25μL，其中，
所述反应体系中含有N-1:反应液：8×105U/L Rnasin，200mM dNTPs，10mM Tris-HCl，20mM KCl，3.5mM MgCl2，0.8M betaine，3.2Μm的各内引物，0.4μM各外引物，1.6μM各环引物，SYTO-9总共22μL，Bst聚合酶0.8μL，AMV酶0.2μL，样品RNA模板2.0μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，同时设置无核酸酶水为阴性对照；采用含N基因体外转录RNA的序列质粒作为阳性对照进行检测。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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