CN112280895B - 一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，包括上游外部引物F3，下游外部引物B3，上游内部引物FIP‑transcribe，下游内部引物BIP‑transcribe，上游环化引物LF，下游环化引物LB。本发明对新型冠状病毒N基因中一个片段的6个区域设计了6条特异引物，内引物组加上RNA聚合酶识别位点加速反应，本发明利用链置换Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录、耐热型RNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性。本发明操作简便，成本低，通过核酸染料可以实时观察荧光曲线变化，可以很好解决临床上新型冠状病毒检测遇到的复杂问题。

Description

一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试 剂盒

技术领域

本发明用于生物检测技术领域，涉及一种基于环介导转录等温扩增检测技术，具体来说 是一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒是至今发现的感染人的第七个冠状病毒，属于冠状病毒科，冠状病毒属，是 单链RNA病毒。其基因组包括11段编码序列，全长大约30kb，编码1个非结构蛋白，4个 结构蛋白和6个辅助蛋白。现在主要的检测新型冠状病毒的方法是基于特异性抗体IgG和IgM 或者病毒特异性抗原的免疫方法以及RT-PCR的核酸检测方法。

基于免疫的检测方法由于抗体产生具有窗口期，无法实现精准检测，容易漏诊。抗原的 检测方法其病毒蛋白检测可行性还存在争议。基于核酸的RT-PCR方法可以通过特异性扩增 RNA实现精准确诊，没有窗口期，准确率高，但是其检测时间长，需要进行热循环。

环介导等温扩增是日本科学家在2000年左右发明的技术，通过识别模板序列200bp左右 的序列中的六段位置实现，链置换酶发挥链置换作用来形成环介导等温扩增核心元件，形成 指数扩增。环介导等温扩增技术，引物设计简单，操作方便，对机器要求低，可以在水浴锅 进行反应，非常适合基层临床实时检测。同时，由于环介导等温扩增中会产生焦磷酸盐沉淀， 从外观上会直接表现出浑浊度的变化，可以直接肉眼观察，初步筛选。也可以通过核酸染料 进行实时荧光检测，从荧光曲线Ct值判断反应进行情况。技术选择性非常多，非常适合临床 实时检测的要求，可以在1h内直接出诊断报告，极大压缩诊断消耗的时间，但是该技术会有 很高的假阳性概率，这是其弊端。

RNA聚合酶是一类依赖启动子序列的聚合酶，其能在启动子识别区后转录成大量RNA 模板。通过RNA聚合酶的转录活性和逆转录酶的逆转录的特性可以实现原始模板的大量积累， 加速环介导反应。通过在环介导等温扩增产物茎环上引入RNA聚合酶识别位点，可以实现扩 增产物的快速积累，实现扩增级联放大的效果。本发明通过将反转录环介导恒温扩增和RNA 聚合酶联用实现扩增级联方法，实现扩增信号的扩大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒， 所述的这种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒要解决现有技术中的新 型冠状病毒检测速度慢、成本高以及操作复杂的技术问题。

本发明提供了一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，包括如下 引物：

上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO.1所示；

下游外部引物B3，其序列如SEQ ID NO.2所示；

上游内部引物FIP-transcribe，其序列如SEQ ID NO.3所示；

下游内部引物BIP-transcribe，其序列如SEQ ID NO.4所示；

上游环化引物LF，其序列如SEQ ID NO.5所示；

上游环化引物LB，其序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，FIP-transcribe包含三段序列，分别是F1C，RNA聚合酶识别位点以及F2序 列，即由内部F1片段互补序列，RNA聚合酶识别的启动子区以及F2片段组成。RNA聚合 酶识别位点为20-30个碱基的识别序列；如T7 RNA聚合酶识别序列TAATACGACTCACTATAG；BIP-transcribe包含三段序列，分别是内部B1片段互补序列，RNA聚合酶识别的启动子区以及B2片段组成，RNA聚合酶识别位点为20-30个碱基的识别序列，如T7 RNA聚合酶识别 序列TAATACGACTCACTATAG。在序列组成以及引物设计过程中，引物从5’到3’分别是和F3，F2， F1以及B3，B2，B1组成特殊扩增引物。

进一步的，F2和F1c之间以及B2和B1c之间的双链茎环结构存在RNA聚合酶识别位点，通过转录和反转录可以实现环介导扩增起始模板量积累，加速反应。

进一步的，所述试剂盒还包括环介导转录等温扩增反应试剂和指示剂。

进一步的，所述试剂盒还包括新型冠状病毒假病毒阳性对照。

进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照。

进一步的，所述的反应试剂还包括：Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶、RNA聚合酶、1mM dNTP混合物、1mM NTP混合物、20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、50mM KCl、0.1％Tween20和2mM MgSO₄。

进一步的，所述的RNA聚合酶为耐热型T7 RNA聚合酶、耐热型SP6 RNA聚合酶、耐热型T3 RNA聚合酶或者耐热型E.coli RNA聚合酶。

进一步的，所述的环介导转录等温扩增通过添加剂、二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻 糖和PEG8000来改变荧光曲线到达平衡点的时间。

进一步的，所述的指示剂为SYBR green I、羟基茶酚蓝指示剂或者钙黄绿素/Mn²⁺染色。

进一步的，所述外引物F3的浓度为0.2μM、外引物B3的浓度为0.2μM、内引物 FIP-transcribe的浓度为1.6μM、内引物BIP-transcribe的浓度为1.6μM、环化引物LF的浓度 为0.8μM、环化引物LB的浓度为0.8μM。

本发明还提供了一种采用上述的试剂盒检测新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：

(1)：提取样本RNA；

(2)：将样本RNA和阳性对照分别与引物、环介导转录等温扩增反应试剂和指示剂混合；

(3)：混合物先短暂离心再置于60℃荧光定量PCR仪反应45min，每30s读取一次信号， 检测通道为FAM通道；

(4)：应结束后观察荧光曲线变化或反应使馆浑浊度，以判断结果。

本发明对新型冠状病毒N基因(见其序列如SEQ ID NO.7所示)中一个片段的6个区域 设计了6条特异引物，内引物组加上RNA聚合酶识别位点加速反应，所述引物组由序列表中 序列1所示的上游外部引物F3、序列2所示的下游外部引物B3、序列3所示的上游内部引物FIP-transcribe和序列4所示的下游内部引物BIP-transcribe、序列5所示的上游环化引物 LF和序列6所示的下游环化引物LB组成。

本发明利用聚合酶，逆转录酶以及RNA聚合酶三种酶实现加速扩增反应。在恒温条件下 构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增，保证扩增的高度灵敏度和快速性；聚合酶需要有 5’-3’聚合活性，不能有5’-3’外切酶活性，可以在60℃左右反应，保证具有链置换活性。 逆转录酶需要耐高温，可以在50℃以上能稳定反应。RNA聚合酶需要耐热型，可以在50℃ 以上稳定反应。该技术对新型冠状病毒的检测灵敏度高、操作简便，成本低，通过核酸染料 可以实时观察荧光曲线变化。可以很好解决临床上新型冠状病毒检测遇到的复杂问题。

本发明的优势在于：

(1)：针对新型冠状病毒N基因的6个区域设计6条特异性引物，扩增产物具有高度特异性。 通过内引物组的转录反应，以及逆转录反应，可以级联放大信号，提高灵敏度。本发明在恒 温条件下反应，不需要价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，降低了检测成本。

(2)：本发明反应时间仅需要45min，提高了检测效率。仅需要观察荧光曲线或者浑浊度判 断反应结果，不需要打开反应管，避免污染的发生。

(3)：本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优势；检测新型冠状病毒方便快捷、成本 低廉，适合基层医疗单位推广使用。

(4)：该方法可快速扩增核酸，实时检测核酸扩增信号，直接定性。

附图说明：

图1为环介导转录等温扩增技术的示意图，图示所示通过RT-Transcriptase-LAMP实现精 准检测。图中所示箭头为转录方向，转录位点位于转录区末尾G碱基。

图2显示了环介导转录等温检测临床实际样本。

图3显示了环介导转录等温检测的特异性。

图4显示了环介导转录等温检测临床2号样本的灵敏度。

具体实施方式

实施例1引物设计

外部引物组的Tm值应该在55-63℃，碱基长度在15-25个。内部引物组5’端20个碱基左右的Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在60-68℃，内部引物组3’端20个碱基左 右的Tm值在55-63℃，内部引物组5’端和3’端之间为转录位点，要根据引物自身二级结构 微调转录区5’序列和3’序列，使得引物二级结构最小，整个内部引物组碱基长度在50-70之 间。环引物组的Tm值在60-66℃，碱基长度15-25个。所有引物的GC含量控制在30％-65％， 需要保证引物的5’端和3’端稳定性，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在 靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160-220，相对应的内部引物和外部引物之间的碱基控制在20个以内，内部引物组之间的碱基长度控制在120-180。这4-6条引物能够锚定在核酸的6-8个位置，依赖外部引物组的链置换作用和内部引物组5’端和模板互补的序列特征形成可放大信号的扩增元件，形成一系列不同长度的扩增产物。 环引物组可以加快扩增反应的进行，从而使得反应速率大幅提升。

本发明对新型冠状病毒N基因(见其序列如SEQ ID NO.7所示)中一个片段的6个区域 设计了6条特异引物，内引物组加上RNA聚合酶识别位点加速反应，所述引物组由序列表中 序列1所示的上游外部引物F3、序列2所示的下游外部引物B3、序列3所示的上游内部引物FIP-transcribe和序列4所示的下游内部引物BIP-transcribe、序列5所示的上游环化引物 LF和序列6所示的下游环化引物LB组成。

序列1：

序列2：

序列3：

序列4：

序列5：

序列6：

本发明共有六条引物，其中外引物两条，分别为F3和B3；内引物两条分别为为FIP-transcribe和BIP-transcribe；环引物两条，分别为LF和LB。F3引物Tm值60.39℃，GC比55％，碱基长度20。B3FIP-transcribe引物Tm值59.15℃，GC比56％，碱基长度18。 FIP-transcribe引物由三部分组成，5’端序列Tm值64.89℃，GC比60％，碱基长度20；内部 为T7RNA聚合酶识别位点，序列为AGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAA；3’端序 列Tm值59.34℃，GC比56％，碱基长度18。BIP-transcribe引物由三部分组成，5’端序列 Tm值64.20℃，GC比57％，碱基长度21；内部为T7 RNA聚合酶识别位点，序列为AGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAG；3’端序列Tm值59.95℃，GC比50％，碱基 长度20。LF引物Tm值60.09℃，GC比48％，碱基长度21。LB引物Tm值61.35℃，GC 比40％，碱基长度25。F3和B3之间是178个碱基长度，F2和B2之间是131个碱基长度。

本发明利用聚合酶，逆转录酶以及RNA聚合酶三种酶实现加速扩增反应。其中聚合酶需 要有5’-3’聚合活性，不能有5’-3’外切酶活性，可以在60℃左右反应，具有链置换活性。 逆转录酶需要耐高温，可以在50℃以上能稳定反应。RNA聚合酶需要耐热型，可以在50℃ 以上稳定反应。通过聚合酶，逆转录酶，以及引物的设计，形成茎环结构进行扩增，然后通 过RNA聚合酶识别启动子区，转录成RNA，然后再通过聚合酶和逆转录酶进行扩增，形成初始的扩增模板，这样扩增产物又可以进行转录成RNA作为初始模板，形成级联反应，加速反应到达平台期的速度。

实施例2为采用环介导转录等温扩增检测新型冠状病毒试剂盒的特检测临床样本的结果

1)样本采集

采集患者鼻咽拭子，标本放置-80℃保存。

2)提取样本RNA

利用Qiagen公司的miRNeasy Mini kit提取试剂盒提取样本RNA。

3)LAMP检测

新型冠状病毒反应体系为25μL，各组分的用量为：1mM dNTP混合物、1mM NTP混合物、20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂8O₄、50mM KCl、0.1％Tween20、2mM MgSO₄、8U Bst DNA 聚合酶、8U Mulv逆转录酶、8U RNA聚合酶、外引物F3和外引物B3浓度为0.2μM、内引 物FIP-transcibe和BIP-transcibe浓度为1.6μM、LF和LB浓度为0.8μM.、MB 0.3μM，加灭 菌纯化水至25μL体系。混匀后将混合物置于60℃荧光定量PCR仪器反应45min，每30s读 取一次荧光，检测通道为FAM通道，(具体原理如图1所示)。

同时设置无菌无核酸去离子水阴性对照和假病毒作为阳性对照，用以判定结果。

阴性对照没有出峰，阳性对照出峰判定试剂有效；阴性对照没有出峰，阳性对照没有出 峰判定试剂过期；阴性对照出峰，阳性对照出峰判定试剂污染，阴性对照出峰，阳性对照没 有出峰判定试剂污染且过期。

4)结果判定

1号为阳性对照，2-5号为临床样本4例，6号为阴性对照。结果如图2所示，判定临床样本和新型冠状病毒假病毒阳性对照为阳性，阴性对照为阳性，反应有效，结果可信，证明样本中存在新型冠状病毒。同时使用本套扩增体系和其他类型冠状病毒以及呼吸道常见病毒 质粒进行交叉验证，发现没有假阳性反应，证明该发明具有高特异性(如图3所示)。

实施例3采用环介导转录等温扩增检测新型冠状病毒试剂盒的灵敏度检测

将临床样本进行RNA提取，然后依次定量成2.5×10⁸copy/μl，2.5×10⁷copy/μl，2.5×10⁶copy/μl，2.5×10⁵copy/μl，2.5×10⁴copy/μl，2.5×10³copy/μl，2.5×10²copy/μl和2.5×10copy/μl， 在25μl反应体系加入1μl进行扩增，共进行8个浓度梯度检测，其对应终溶液检测限分别为 10¹⁰copy/ml，10⁹copy/ml，10⁸copy/ml，10⁷copy/ml，10⁶copy/ml，10⁵copy/ml，10⁴copy/ml 和10³copy/ml。结果如图4，可以看出该检测试剂盒的检测限可以达到1000copy/ml，具有很 高的灵敏度。

序列表

<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）

复旦大学

上海星耀医学科技发展有限公司

<120> 一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccagaatgga gaacgcagtg 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgtcaccac cacgaatt 18

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcggtgaac caagacgcag agaagctaat acgactcact atagggaaag gcgcgatcaa 60

aacaacg 67

<210> 4

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattccctcg aggacaaggc gagaagctaa tacgactcac tatagggaag agctcttcgg 60

tagtagccaa 70

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttattgggta aaccttgggg c 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccaattaa caccaatagc agtcc 25

<210> 7

<211> 1260

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(Coronavirus)

<400> 7

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims (10)

1.一种采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于包括如下引物：

上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO .1所示；

下游外部引物B3，其序列如SEQ ID NO .2所示；

上游内部引物FIP-transcribe，其序列如SEQ ID NO .3所示；

下游内部引物BIP-transcribe，其序列如SEQ ID NO .4所示；

上游环化引物LF，其序列如SEQ ID NO .5所示；

下游环化引物LB，其序列如SEQ ID NO .6所示。

2.如权利要求1所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：FIP-transcribe包含三段序列，分别是F1C，RNA聚合酶识别位点以及F2序列，RNA聚合酶识别位点为20-30个碱基的识别序列；BIP-transcribe包含三段序列，分别是B1C，RNA聚合酶识别位点以及B2序列，RNA聚合酶识别位点为20-30个碱基的识别序列。

3.如权利要求1所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括环介导转录等温扩增反应试剂和指示剂。

4.如权利要求1所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括新型冠状病毒假病毒阳性对照。

5.如权利要求1所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照。

6.如权利要求3所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：反应试剂还包括:Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶、RNA聚合酶、1mM dNTP混合物、1mM NTP混合物、20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、50mM KCl、0 .1％Tween20和2mM MgSO₄。

7.如权利要求6所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：RNA聚合酶为耐热型T7 RNA聚合酶、耐热型SP6 RNA聚合酶、耐热型T3RNA聚合酶或者耐热型E .coli RNA聚合酶。

8.如权利要求3所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：指示剂为SYBR green I、羟基茶酚蓝指示剂或者钙黄绿素/Mn²⁺染色。

9.如权利要求1所述的采用环介导转录等温扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述外引物F3的浓度为0 .2μM、外引物B3的浓度为0 .2μM、内引物FIP-transcribe的浓度为1 .6μM、内引物BIP-transcribe的浓度为1 .6μM、环化引物LF的浓度为0 .8μM、环化引物LB的浓度为0 .8μM。

10.一种非疾病诊断目的的采用权利要求1的所述的试剂盒检测新型冠状病毒的方法，其特征在于包括如下步骤:

(1)：提取样本RNA；

(2)：将样本RNA和阳性对照分别与引物、环介导转录等温扩增反应试剂和指示剂混合；

(3)：混合物先短暂离心再置于60℃荧光定量PCR仪反应45min，每30s读取一次信号，检测通道为FAM通道；

(4)：应结束后观察荧光曲线变化或反应试管浑浊度，以判断结果。

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