CN112921119B - 环介导切刻等温-crispr联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

环介导切刻等温-crispr联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环介导切刻等温‑CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明对裂谷热病毒S基因中一个片段的设计了5条引物，并利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增；利用切刻酶切刻活性和Bst DNA聚合酶链置换活性生成大量单链片段。再利用Cas12a蛋白和向导RNA形成的二元复合体的模板依赖顺式切割活性介导的反式切割活性进行检测，快速、高效和准确；该技术对裂谷热病毒的检测灵敏度高、操作简便，成本低，可以和胶体金试纸偶联实现快速实时检测，可以很好补充裂谷热病毒快速检测的方案。

Description

环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂 盒及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
裂谷热(Rift valley fever，RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus，RVFV)引起的急性出血性人兽共患病，属于布尼亚病毒目白纤病毒科白蛉病毒属，经蚊虫传播，可感染动物和人。人感染后通常无症状或者症状较轻少数发展为急性肝炎、出血热或者脑炎综合症。其基因组为单股负链RNA病毒，基因组可分为L(大)、M(中)、S(小)三个节段。裂谷热在我国被列为一类传染病，对我国的公共卫生安全有现实性的威胁，建立一种快速准确检测裂谷热病毒的方法显得尤为重要。
环介导等温扩增是日本科学家在2000年左右发明的技术，通过识别模板序列200bp左右的序列中的4-6段位置实现，链置换酶发挥链置换作用来形成环介导等温扩增核心元件，形成指数扩增。环介导等温扩增技术，引物设计简单，操作方便，对机器要求低，甚至可以在水浴锅进行反应，非常适合实时检测。结果判断方法很多，可以为荧光、可视化染料以及浊度变化，非常适合临床实时检测的要求，可以在1h内直接出诊断报告，极大压缩诊断消耗的时间。
切刻酶是一类核酸内切酶可以识别特异性的切刻位点，其能在识别位点链上形成切刻位点，形成单链缺口。通过DNA聚合酶的链置换能力和切刻酶的特性可以实现链置换反应，生成大量重复的单链片段。通过在环介导等温扩增产物茎环上引入切刻酶识别位点，可以在实现指数扩增的同时，进行切刻置换形成重复单链。
CRISPR技术是一种基因剪切技术，利用Cas蛋白和向导RNA进行组装，通过识别模板序列从而激活Cas蛋白活性实现序列剪切功能。Cas12a是一种RNA向导的蛋白，通过向导RNA和模板序列识别后，可以实现模板链的顺式切割活性和非模板链的反式切割活性，其反式切割活性没有序列特异型，可以是任意一段短单链DNA序列。通过荧光共振转移技术以及Cas12a的反式切割活性可以实现信号放大功能，实现靶标的检测。
环介导等温扩增反应虽然灵敏、快速和方便，但是其反应往往出现假阳性，通过Cas12a探针切割环介导等温扩增产物可以极大减少假阳性率，如HOLMES和DETECTOR方法。但是这些方法对于向导RNA的设计要求极为苛刻，需要在扩增产物上有PAM位点且向导RNA的二级结构序列符合Cas12a蛋白结合序列，这往往和环介导等温扩增反应引物的设计不能兼得，导致设计失败。
发明内容
针对现有技术中裂谷热病毒检测速度慢以及操作复杂的技术问题，本发明提供环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法，可以实时检测荧光信号，也可以和市场上商业化试纸条进行联合实现可视化快速检测。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一方面，提供环介导切刻等温扩增引物组，所述引物组包括：如SEQ IDNO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。
所述环介导切刻等温扩增引物组即作为环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组。
本发明是根据NCBI中裂谷热S片段基因序列(NC_014395.1)(见SEQ ID NO.7所示)设计引物的。
本发明中，FIP-nick包含三段序列，分别是F1C，切刻酶识别位点以及F2序列，切刻酶识别位点为3-9个碱基的识别序列；BIP-renick包含三段序列，分别是B1C，切刻酶识别位点反向序列以及B2序列，切刻酶识别位点为3-9个碱基的识别序列。
本发明的第二方面，提供环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，包括本发明第一方面的环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组，即包括：如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括环介导切刻等温扩增反应试剂，所述环介导切刻等温扩增反应试剂包括:Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶、切刻酶、1mM dNTP混合物、1mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％Tween20和2mM MgSO4。
在本发明的一个实施方式中，所述切刻酶选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI或Nt.CviPII中的一种或几种，优选为Nt.BstNBI。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括用以增加环介导切刻等温扩增终末反应物产量的添加剂，所述添加剂选自二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖或PEG8000。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，所述外引物F3浓度为0.2μM、外引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP-nick浓度为1.6μM、下游内部引物BIP-renick浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括CRISPR切割试剂，所述CRISPR切割试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、荧光探针、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mMMgCl2和100μg/ml BSA。使用时，所述CRISPR切割试剂加入到含有待检靶标分子的扩增体系中。
在本发明的一个实施方式中，所述向导RNA的序列如SEQ ID NO.6所示。
向导RNA包含两段特征序列，5’端是种属特异序列，是20个碱基左右长度RNA，形成发卡结构；3’端序列是模板识别序列，是18-24个碱基长度RNA，本方法的模板识别序列设计不需要PAM位点引导。
在本发明的一个实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12a或具有与Cas12a类似顺式切割单链介导反式切割活性的Cas蛋白，可以来源于FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、AacCas12b或Cas14；即，所述Cas蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、AacCas12b或Cas14中的一种或几种，优选为LbCas12a。
在本发明的一个实施方式中，所述荧光探针的序列为Fam-atatatatat-Dab，其中Fam和Dab分别是荧光基团和淬灭基团。其是一段单链DNA序列，序列长度在6–20个之间，5’端荧光基团可以是FAM，TET或JOE，3’端淬灭基团可以是DAB或BHQ。
在本发明的一个实施方式中，所述CRISPR切割试剂中，所述Cas蛋白的浓度为50-200nM，向导RNA的浓度为100-400nM，Cas蛋白和向导RNA之间的比例在1：1和1：1.5之间，荧光探针的浓度为500nM-1μM。
在本发明的一个实施方式中，所述CRISPR切割试剂中包括：向导RNA 100nM、LbCas12a 100nM、荧光探针500nM、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mMMgCl2和100μg/mlBSA。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括裂谷热病毒假病毒作为阳性对照和无核酸酶水作为阴性对照。
本发明的第三方面，提供环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的方法，分为两步，第一步为环介导切刻等温扩增，第二步为CRISPR切割检测；
所述环介导切刻等温扩增方法是结合茎环介导扩增和切刻链置换反应，得到的终末产物有大量重复单链产物。
本发明提供的环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的方法一方面对环介导等温扩增进行改进，另一方面和CRISPR进行联检。该方法可快速扩增核酸，实时检测核酸扩增信号，极大减少假阳性率。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的方法，包括如下步骤：
(1)：提取样本RNA；
(2)：将样本RNA与环介导切刻等温扩增引物、环介导切刻等温扩增反应试剂混合；
(3)：混合物先短暂离心再置于58℃反应30min；
(4)：反应后加入CRISPR切割试剂，37℃反应30min；
(5)：应结束后观察荧光曲线变化，以判断结果。
在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，可以每1min读取一次信号，检测通道为FAM。
本发明对裂谷热病毒S基因中一个片段的设计了5条引物，即如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增；利用切刻酶切刻活性和Bst DNA聚合酶链置换活性生成大量单链片段。再利用Cas12a蛋白和向导RNA形成的二元复合体的模板依赖顺式切割活性介导的反式切割活性进行检测，快速、高效和准确；该技术对裂谷热病毒的检测灵敏度高、操作简便，成本低，可以和胶体金试纸偶联实现快速实时检测，可以很好补充裂谷热病毒快速检测的方案。
本发明通过将反转录环介导恒温扩增和切刻酶联用可以实现一管式单链生成反应。
本发明通过切刻扩增生成大量单链产物，用Cas12a进行切割时会产生大于同等产量双链模板的信号，且其向导RNA设计不需要考虑PAM位点，极大降低设计失败的概率，可以方便快速检测裂谷热病毒。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1):针对裂谷热病毒S片段基因分别设计了环介导切刻等温扩增引物，扩增产物具有特异性，在CRISPR联合检测下具有高度特异性，假阳性率极低。
(2)本发明反应时间在1h以内，提高了检测效率。只需要等温单重荧光通道检测设备，对仪器要求小。
(3)本发明的联合检测技术还可以和商业化的胶体金试纸条联用，实现可视化检测，极大降低检测成本。
附图说明
图1环介导切刻等温-CRISPR联合检测技术原理图；
图2环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热假病毒的灵敏度；
图3环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热的特异性
图3中，ZIKV：寨卡病毒；DENV：登革热病毒；JEV：日本乙脑病毒；YFV：黄热病毒；
图4环介导切刻等温-CRISPR联合检测和胶体金试纸条结合实时检测裂谷热病毒的示意图。
具体实施方式
本发明的第一方面，提供环介导切刻等温扩增引物组，所述引物组包括：如SEQ IDNO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。
所述环介导切刻等温扩增引物组即作为环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组。
本发明是根据NCBI中裂谷热S片段基因序列(NC_014395.1)(见SEQ ID NO.7所示)设计引物的。
本发明中，FIP-nick包含三段序列，分别是F1C，切刻酶识别位点以及F2序列，切刻酶识别位点为3-9个碱基的识别序列；BIP-renick包含三段序列，分别是B1C，切刻酶识别位点反向序列以及B2序列，切刻酶识别位点为3-9个碱基的识别序列。
本发明的第二方面，提供环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，包括本发明第一方面的环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组，即包括：如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括环介导切刻等温扩增反应试剂，所述环介导切刻等温扩增反应试剂包括:Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶、切刻酶、1mM dNTP混合物、1mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％Tween20和2mM MgSO4。
在本发明的一个实施方式中，所述切刻酶选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI或Nt.CviPII中的一种或几种，优选为Nt.BstNBI。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括用以增加环介导切刻等温扩增终末反应物产量的添加剂，所述添加剂选自二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖或PEG8000。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，所述外引物F3浓度为0.2μM、外引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP-nick浓度为1.6μM、下游内部引物BIP-renick浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括CRISPR切割试剂，所述CRISPR切割试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、荧光探针、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mMMgCl2和100μg/ml BSA。使用时，所述CRISPR切割试剂加入到含有待检靶标分子的扩增体系中。
在本发明的一个实施方式中，所述向导RNA的序列如SEQ ID NO.6所示。
向导RNA包含两段特征序列，5’端是种属特异序列，是20个碱基左右长度RNA，形成发卡结构；3’端序列是模板识别序列，是18-24个碱基长度RNA，本方法的模板识别序列设计不需要PAM位点引导。
在本发明的一个实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12a或具有与Cas12a类似顺式切割单链介导反式切割活性的Cas蛋白，可以来源于FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、AacCas12b或Cas14；即，所述Cas蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、AacCas12b或Cas14中的一种或几种，优选为LbCas12a。
在本发明的一个实施方式中，所述荧光探针的序列为Fam-atatatatat-Dab，其中Fam和Dab分别是荧光基团和淬灭基团。其是一段单链DNA序列，序列长度在6–20个之间，5’端荧光基团可以是FAM，TET或JOE，3’端淬灭基团可以是DAB或BHQ。
在本发明的一个实施方式中，所述CRISPR切割试剂中，所述Cas蛋白的浓度为50-200nM，向导RNA的浓度为100-400nM，Cas蛋白和向导RNA之间的比例在1：1和1：1.5之间，荧光探针的浓度为500nM-1μM。
在本发明的一个实施方式中，所述CRISPR切割试剂中包括：向导RNA 100nM、LbCas12a 100nM、荧光探针500nM、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mMMgCl2和100μg/mlBSA。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒中，还包括裂谷热病毒假病毒作为阳性对照和无核酸酶水作为阴性对照。
本发明的第三方面，提供环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的方法，分为两步，第一步为环介导切刻等温扩增，第二步为CRISPR切割检测；
所述环介导切刻等温扩增方法是结合茎环介导扩增和切刻链置换反应，得到的终末产物有大量重复单链产物。
本发明提供的环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的方法一方面对环介导等温扩增进行改进，另一方面和CRISPR进行联检。该方法可快速扩增核酸，实时检测核酸扩增信号，极大减少假阳性率。
在本发明的一个实施方式中，环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的方法，包括如下步骤：
(1)：提取样本RNA；
(2)：将样本RNA与环介导切刻等温扩增引物、环介导切刻等温扩增反应试剂混合；
(3)：混合物先短暂离心再置于58℃反应30min；
(4)：反应后加入CRISPR切割试剂，37℃反应30min；
(5)：应结束后观察荧光曲线变化，以判断结果。
本发明环介导切刻等温-CRISPR联合检测技术原理如图1所示。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
引物设计和向导RNA设计
外部引物组的Tm值应该在52–60℃，碱基长度在15–25个。内部引物组5’端20个碱基左右的Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在57–65℃，内部引物组3’端20个碱基左右的Tm值在52–60℃。上游内部引物F2和F1c之间加入切刻酶的位点序列，下游内部引物B2和B1c之间加入切刻酶的位点反向互补序列。所有引物的GC含量控制在30％-65％，需要保证引物的5’端和3’端稳定性，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160-220，相对应的内部引物和外部引物之间的碱基控制在20个以内，内部引物组之间的碱基长度控制在120–180。这4–6条引物能够锚定在核酸的6–8个位置，依赖外部引物组的链置换作用和内部引物组5’端和模板互补的序列特征形成可放大信号的扩增元件，形成一系列不同长度的扩增产物。
本发明对裂谷热病毒S片段基因((见SEQ ID NO.7)中一个片段的设计了6条特异引物，如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ IDNO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick以及SEQID NO.5所示的上游环化引物LF。
本发明利用链置换Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶以及特殊发卡引物实现加速扩增反应。其中聚合酶需要有5’-3’聚合活性，不能有5’–3’外切酶活性，可以在58℃左右反应。逆转录酶需要耐高温，可以在50℃以上能稳定反应。通过聚合酶，逆转录酶，以及引物的设计，形成茎环结构进行扩增，加快反应。利用切刻酶的切刻活性和Bst DNA聚合酶的链置换活性生成大量单链片段。
针对向导RNA设计首先找到环介导等温扩增片段，在F2-B2之间删选18-24碱基长度的片段，通过和固定的LbCas12a重复序列5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU3’组合判断二级结构，排除无法正确成环的序列，找出最优二级向导RNA序列，即如SEQ ID NO.6所示的向导RNA。
利用Cas12a和向导RNA形成的二元复合体顺式切割大量单链模板，介导反式切割探针，产生大量荧光信号。
实施例2
用假病毒模拟样本检测环介导切刻等温-CRISPR联合检测方法灵敏度
1)提取核酸
将含有裂谷热S基因片段序列的假病毒用Qiagen RNA提取试剂盒提取RNA。
2)环介导切刻等温扩增
将提取好的裂谷热假病毒RNA分别定量到107copies/ml，然后倍比稀释到106copies/ml，105copies/ml，104copies/ml，103copies/ml，102copies/ml和101copies/ml，用环介导切刻等温扩增试剂58℃扩增30min。
3)信号检测
环介导切刻等温扩增产物和CRISPR检测试剂混合，37℃反应30min，每min收集一次荧光信号，检测通道为FAM，通过判断荧光信号高度判断反应是否为阳性。
结果如图2，该方法可以最低检测到103copies/ml，灵敏度高，能降低假阳性率。
实施例3
用假病毒模拟样本检测环介导切刻等温-CRISPR联合检测方法特异性
将1ng/μl寨卡病毒、登革热病毒、日本乙脑病毒和黄热病毒样本依次进行环介导切刻等温扩增反应和CRISPR检测，检测其特异性，结果如图3，这些病毒和裂谷热病毒都没有反应，表明序列设计具有特异性。
实施例4
将两步法环介导切刻等温-CRISPR联合检测技术和TwistAmp公司MileniaHybriDetect 2横向流动试纸条联用，检测带有FAM标记的探针，从而判断反应是否进行。样本首先和环介导切刻扩增试剂混合，进行扩增，然后加入CRISPR检测试剂(其中探针序列不变，5’端荧光基团为FAM，3’端标记基团为Biotin)，反应后将试纸条加入反应管，大约2min后就可以看到结果，T带有单一紫红色条带表示阳性。具体示意图见图4。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggttaagg ctgcccca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcagcagtg aatagcaact 20
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agacagcagc ctaagtggct ggagtcacat accccaatcc cgaccgtaa 49
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgacagca gctgacggct tatgtgactc agccatgaga agaggagaga 50
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcccattgga atccacaagt cc 22
<210> 6
<211> 45
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uaauuucuac uaaguguaga ucuuguaagc cugagcggcu gccau 45
<210> 7
<211> 1690
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acacaaagac cccctagtgc ttatcaagta tatcatggat tactttcctg tgatatctgt 60
tgatttgcag agtggtcgtc gtgttgtgtc agtggagtac tttagaggag atggtcctcc 120
caggatacct tattctatgg ttgggccctg ttgtgtcttt ctcatgcacc atcgtcctag 180
tcacgaggtt cgcttgcgat tctctgattt ctacaatgtc ggagaattcc cataccgagt 240
cggacttgga gactttgcat caaacgttgc acctccacca gcgaagcctt ttcagagact 300
tattgatcta ataggccata tgactcttag tgatttcaca aggttcccca atctgaaaga 360
agccatatcc tggcctcttg gagaaccctc actggctttc tttgacctaa gctctactag 420
agtgcatagg aatgatgaca ttagaaggga tcagattgcc actctagcaa tgaggagttg 480
caagatcacc aatgatctag aggactcctt tgttggctta cacaggatga tagcgactga 540
ggccatcctc agagggattg acctgtgcct gttgccaggc tttgatctca tgtatgaggt 600
tgctcacgta cagtgcgttc ggcttctgca agcagcaaaa gaggacattt ctaatgctgt 660
agttccaaac tcagccctca ttgttcttat ggaggagagc ctgatgctgc gctcatcact 720
tcccagcatg atggggagaa acaactggat tccagttatt cctccaatcc cagatgttga 780
gatggaatca gaggaggaga gtgatgatga tggatttgtt gaggttgatt agaggttaag 840
gctgccccac cccccacccc ccaatcccga ccgtaacccc aactcccctt ccccccaacc 900
ccctgggcag ccacttaggc tgctgtcttg taagcctgag cggctgccat gacagcagct 960
gacggcttcc cattggaatc cacaagtcca aaggctttca agaattctct cctcttctca 1020
tggcttataa agttgctatt cactgctgca ttcattggct gcgtgaacgt tgcagcaacc 1080
tcctcttttg ttctacctcg gaggtttggg ttgatgaccc gggagaactg cagcagatac 1140
agagagtgag catctaatat tgcccttaga tagtctcctg gtagagaagg atccaccatg 1200
ccagcaaagc tggggtgcat catatgcctc gggtatgcag gggataggcc gtccatggta 1260
gtcccagtga caggaagcca ctcactcaag acgaccaaag cctggcatgt ccagccagcc 1320
aaggcggcag caactcgtga tagagtcaac tcatcccggg aaggattccc ttcctttagc 1380
ttatacttgt tgatgagagc ctccacagtt gctttgcctt ctttcgacat tttcatcatc 1440
atcctcctgg gcttgttgcc acgagttaga gccagaacaa tcattttctt ggcatccttc 1500
tcccagtcag ccccaccata ctgctttaag agttcgataa ctctacgggc atcaaaccct 1560
tgataagcaa actctcggac ccactgttca atctcattgc ggtccactgc ttgagcagca 1620
aactggatcg caagctcttg atagttgtcc attattgtaa tagtgtttgt atctctaggg 1680
agctttgtgt 1690

Claims (6)

1.一种环介导切刻等温扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括：如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF；
所述环介导切刻等温扩增引物组即作为环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组。
2.一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，包括：如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF；
还包括环介导切刻等温扩增反应试剂，所述环介导切刻等温扩增反应试剂包括:BstDNA聚合酶、Mulv逆转录酶、切刻酶、1mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM (NH4)2SO4、50mM KCl、0.1% Tween20和2mM MgSO4；
所述外部引物F3浓度为0.2µM、外部引物B3浓度为0.2µM、上游内部引物FIP-nick浓度为1.6µM、下游内部引物BIP-renick浓度为1.6µM、上游环化引物LF浓度为0.8µM；
还包括CRISPR切割试剂，所述CRISPR切割试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、荧光探针、50mMTris-HCl、100mM NaCl、10mMMgCl2和100 μg/ml BSA；
聚合酶需要有5’- 3’聚合活性，不能有5’ – 3’ 外切酶活性，可以在58 °C反应，逆转录酶耐高温，在50 °C以上能稳定反应；
所述切刻酶选自Nt.BstNBI；
所述Cas蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、AacCas12b或Cas14中的一种。
3.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，还包括用以增加环介导切刻等温扩增终末反应物产量的添加剂，所述添加剂选自二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖或PEG8000。
4.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述向导RNA的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述荧光探针的序列为Fam-atatatatat-Dab，其中Fam和Dab分别是荧光基团和淬灭基团。
5.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR切割试剂中，所述Cas蛋白的浓度为50-200nM，向导RNA的浓度为100-400nM，Cas蛋白和向导RNA之间的比例在1：1和1：1.5之间，荧光探针的浓度为500nM-1μM。
6.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，还包括裂谷热病毒假病毒作为阳性对照和无核酸酶水作为阴性对照。
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