CN117363806A - 一种半重叠引物核酸恒温扩增方法、试剂盒及应用 - Google Patents

一种半重叠引物核酸恒温扩增方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种半重叠核酸(HOPE)恒温扩增方法、试剂盒及应用。本发明通过设计半重叠引物，即5’端互补配对引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，启动核酸的自循环合成或重叠区域扩增；进一步地，本发明中通过设计和引入加速引物提高扩增反应速度。本发明方法实现了恒温条件下核酸的简单、快速、高效、特异、灵敏的扩增或富集靶基因的目的。该方法可应用于所有物种，包括动植物、细菌、真菌和病毒等的快速核酸检测。该方法具有引物设计简单、操作方便、检测快速、成本低、设备要求低、准确性高、特异性好、适用性广等特点，通过添加1条或2条加速引物即可实现和LAMP相近的扩增速度，降低了引物的设计难度，同时减低了反应的成本。

Description

一种半重叠引物核酸恒温扩增方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种半重叠引物核酸(HOPE)恒温扩增方法、试剂盒及应用，属于核酸检测技术领域。
背景技术
随着分子生物学技术的快速发展，核酸扩增技术已被广泛应用于临床诊断、食品卫生、环境检测等各个领域。目前，主要的核酸扩增技术为聚合酶链反应(PCR)，该技术通过高温变性、低温退火、中温延伸对靶分子实现扩增，具有特异性强，灵敏度高的特点。但热循环过程需要热循环仪，热循环仪体积大、价格较高，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。且PCR的检测时间相对较长(1-2小时)，也已经无法满足人类快速检测要求，尤其是传染性致病微生物，及时控制传染源对疾病的防控至关重要，如新型冠状病毒，诺如病毒，寨卡病毒等。
目前已开发出多种等温扩增技术，它们分别通过不同的酶和特异性引物在恒定温度下使模板进行快速扩增。与传统PCR方法相比，等温扩增技术不需要热循环仪，仪器设备要求简单，价格低廉且大大缩短了扩增时间，这使其特别适合现场检测和即时诊断。因此，在临床医学、检验医学、分子生物学、水和食品安全等不同领域中，特别是在致病菌、病毒等传染性微生物的检测中显示出很好的应用前景。
恒温扩增技术可以分成两类，第一类是依赖于特异性引物延伸的扩增反应；第二类是依赖于限制性内切酶的扩增反应。第一类主要包括：依赖核酸序列扩增(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)、滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、RNA转录信号介导的RNA扩增(Signal-mediated amplification of RNA technology，SMART)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(Recombinase Aided Amplification，RAA)、荧光核酸恒温扩增(SimultaneousAmplification and Testing，SAT)、交叉引物扩增(Crossing Priming Amplification，CPA)等。第二类主要包括：置换扩增(Strand displacement ampli-fication，SDA)、切口酶扩增(Nicking enzyme amplification，NEAR)等。目前应用最广泛的LAMP是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，它针对目的基因的6-8个区域设计4-6条特异性引物(包括2条内引物、2条外引物，和/或2条loop引物)，利用一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。LAMP具有反应体系稳定；LAMP只有在loop引物存在的情况下才具有与PCR可比较的扩增灵敏度，但是其缺点是非特异性扩增和扩增产物污染，在实验室较难避免。特别是，当LAMP的反应时间超过40分钟以后，有很大概率会发生非特异性扩增，导致假阳性结果。此外，LAMP操作过程中也极易受到环境污染而产生假阳性结果；LAMP的引物设计包括8个区域，设计6条，引物设计难度较高，同时也增加了引物合成的成本。RCA在恒定温度下以单链环状DNA为模板，在有强链置换活性的phi29 DNA聚合酶的作用下，通过引物与模板环退火而进行滚环式DNA合成，它高灵敏度、高序列特异性。RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增、检测RNA时不再需要预先进行RNA的逆转录。但线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。优点是快速、支持在同一个管中同时进行多个扩增反应、可定量、引物设计简单、灵敏度高、特异性高。但该反应需要三个酶的参与，成本较高。CPA的优点：操作简单，在水浴锅内63℃左右条件下1h即可得到大量产物，结合胶金试纸条技术可快速得到检测结果，但CPA反应方法不稳定，有假阳性现象。因此，开发一种操作简便、体系简单、扩增高效的等温扩增技术对恒温扩增技术的推广应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是：提供一种新的恒温扩增技术及其相应的产物检测方法，命名为HOPE恒温扩增技术，也称为“希望”扩增法；本发明通过设计半重叠引物，即5’端互补配对引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，启动核酸的自循环扩增和重叠互补扩增，并通过探针进行扩增产物的检测，从而实现恒温条件下核酸的简单、快速、高效、特异、灵敏的扩增目的。
为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种非诊断与治疗目的的半重叠引物核酸恒温扩增方法或富集靶基因的方法，包括以下步骤：
步骤1：采用以下两种方法中的任意一种设计引物：
方法一：基于靶序列上自3’至5’端开始依次标记为1a，2a，3a，其对应互补序列标记为1s，2s，3s，根据靶序列及其互补序列设计两条半重叠引物，包括OPF：5’-2a-1s-3’和OPR:5’-2s-3a-3’；其中，1a、2a、3a是靶基因上18～25bp的序列片段；
方法二：基于靶序列上自3’至5’端开始依次标记为1a，4a，2a，5a，3a，其对应互补序列标记为1s，4s，2s，5s，3s，根据靶序列及其互补序列设计两条半重叠引物和加速引物，所述半重叠引物包括OPF:5’-2a-1s-3’和OPR:5’-2s-3a-3’，所述加速引物包括AF：4a和/或AR：5s；其中，1a、2a、3a、4a、5a是靶基因上18～25bp的序列片段；
步骤2：以靶序列的DNA或RNA为模板，以步骤1中方法一或方法二设计的引物作为扩增引物，利用具有链置换作用的DNA聚合酶进行等温扩增反应，即实现靶基因的扩增；
所述扩增反应的模式如下(图1)：
上游半重叠引物OPF的1s序列首先与模板1a结合，引物上的2a处于游离状态，具有链置换作用的DNA聚合酶的作用延伸合成带有OPF引物特定序列的互补链；以此链为模板，下游引物OPR，以上一步骤中形成的单链为模板启动合成新链，形成基础结构2a 1s 2s 3s2a；基础结构通过呈链状，或自身互补配对折叠；基础结构的3’端2a区域与互补链的3’端2s区域互补，继续扩增，形成2a 1s 2s 3s 2a1s 2s 3s 2a产物；之后，这些分子不断通过正义链的2a1s区域，分别与反义连的2s1a或2s区域结合扩增，或者，反义连的2s3a区域，分别与正义链的2a3s或者2a区域结合合成扩增和，放大核酸产物，最终实现指数级的核酸扩增。
预测的扩增模式：在靶核酸存在的情况下，OPF/OPR可以结合到靶核酸上，在链置换DNA聚合酶作用下，OPF/OPR引物起始引导核酸合成，生成一系列不同类型的扩增子(OPF-nth和OPR-nth；n≥1)，这些扩增子通过分子内的自我折叠，形成哑铃状(stem-loop)的DNA分子结构，这些哑铃状的DNA分子不仅可以通过DNA分子3’端的热力学摆动与哑铃结构的中间部分形成回文结构，启动核酸扩增的自循环，也可以通过OPF/OPR引物与loop区域的再结合，启动新DNA链的合成，形成一系列不同类型的扩增子(OPF-nth/OPR-nth；n≥1)，不断放大，重复上述循环。不同扩增子不断自循环扩增和不断由OPF/OPR引物再循环放大扩增，周而复始，达到对靶核酸进行指数级别扩增的目的。
优选地，该方法步骤1中还包括根据引物设计探针，相应地所述步骤2中的等温扩增反应还加入了探针。
优选地，所述探针是在引物AF或AR的5’端加上荧光染料基团，3’端加上荧光淬灭基团。
优选地，所述步骤2中的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶，VentDNA聚合酶和phi29 DNA聚合酶中的至少一种。
优选地，所述的具有链置换功能的DNA聚合酶为市售产品，比如Bst DNA聚合酶系列，Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，phi29 DNA聚合酶等。
优选地，如果模板为RNA，需要先进行逆转录反应，逆转录反应涉及的逆转录酶为市售产品，如AMV逆转录酶、SSⅢ逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、LSAT逆转录酶等。
优选地，所述的HOPE恒温扩增的反应体系中包括：逆转录酶，链置换DNA聚合酶，特异性扩增引物组、Mg2+、dNTPs、Tris-HCl、NH4 +、K+、Triton X-20等。
本发明的第二方面，提供一种用于HOPE恒温扩增反应或富集靶基因的试剂盒，所述试剂盒中至少包括：靶基因的模板DNA或RNA，和具有链置换作用的DNA聚合酶，所述试剂盒中还至少包括了引物和/或探针，或包括记载了引物和/或探针设计方法的载体(所述载体可以是说明书等)；所述引物为针对靶基因设计的半重叠引物或半重叠引物与加速引物。本发明具体实施例中提供了用于扩增SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒中包括了半重叠引物或半重叠引物和加速引物的组合，所述半重叠引物包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ IDNO：2所示的下游引物，所述加速引物包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物和/或如SEQ ID NO：4所示的下游引物。本发明具体实施例中还提供了用于富集或扩增呼吸道呼吸道合胞病毒A的试剂盒，所述试剂盒中包括了半重叠引物或半重叠引物和加速引物的组合，所述半重叠引物包括如SEQ ID NO：6所示的上游引物和如SEQ ID NO：7所示的下游引物，所述加速引物包括如SEQ ID NO：8所示的上游引物和/或如SEQ ID NO：9所示的下游引物。
优选地，所述试剂盒中还包括逆转录酶，Mg2+溶液、dNTPs、Tris-HCl、NH4 +溶液、K+溶液、Triton X-20、荧光染料，或它们的混合液。
本发明的第三方面，提供上述的半重叠引物核酸恒温扩增方法在检测病毒中的应用，所述应用不以诊断与治疗为目的，例如用于检测食品中的病毒。
优选地，所述检测的方法为凝胶电泳检测法、通过荧光定量PCR仪进行实时荧光定量检测的方法或化学显色(例如通过加入指示剂显色)的可视化检测方法，具体可选用以下方法中的任意一种：
凝胶电泳检测：HOPE扩增产物可以琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳胶片呈现自上而下的ladder状条带。
实时荧光检测一：在反应中加入DNA双链特异性结合染料的情况下(SYTO 9，SYBRgreen I等)，随着DNA产物的不断积累，反应中DNA产物浓度不断增加，导致结合到双链DNA的荧光染料不断增加，释放的荧光信号不断增强，通过荧光定量PCR仪，实现扩增产物的实时检测，产生扩增曲线；或者在紫外光下，通过终点肉眼观察燃料释放的绿色荧光信号。
实时荧光检测二：通过将AF/AR标记3’端荧光集团和5’端标记猝灭集团，在反应中，随着自循环和AF/AR的3’端荧光集团在Bst 4.0酶，或通过额外添加其他高保真聚合酶的作用下，被切割下来，产生荧光信号。随产物增加，释放的荧光信号增加，通过荧光定量PCR仪，实现扩增产物的实时检测，产生扩增曲线；或者在紫外光下，通过终点肉眼观察燃料释放的绿色荧光信号。
可视化检测一：在反应体系中加入pH指示剂(如甲酚红，中性红等)，随着扩增反应，反应缓冲液的pH从碱性变成中性和微酸性，则反应缓冲液的颜色发生相应的改变(如红-黄等)；或者在反应中添加其他指示剂(如羟基萘酚蓝HNB等)，HNB是一种金属离子指示剂，HNB与镁离子结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色。
本发明的第四方面，提供一种基于半重叠引物核酸恒温扩增检测病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括：恒温扩增缓冲液、MgSO4溶液、dNTP、Bst DNA聚合酶和无核酸酶水，所述试剂盒中还包括引物和/或探针，或者，包括记载了引物和/或探针设计方法的载体(例如说明书)。
优选地，所述试剂盒为检测SARS-CoV-2病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括了引物和探针，所述引物为半重叠引物或半重叠引物和加速引物的组合，所述半重叠引物包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物，所述加速引物包括如SEQID NO：3所示的上游引物和/或如SEQ ID NO：4所示的下游引物。
优选地，所述试剂盒为检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括了引物和探针，所述引物为半重叠引物或半重叠引物和加速引物的组合，所述半重叠引物包括如SEQ ID NO：6所示的上游引物和如SEQ ID NO：7所示的下游引物，所述加速引物包括如SEQID NO：8所示的上游引物和/或如SEQ ID NO：9所示的下游引物。
本发明通过特殊的引物设计，提供一种新的核酸恒温扩增技术，命名为HOPE恒温扩增技术，也称为“希望”扩增法。通过设计半重叠引物，即5’端互补配对引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，启动核酸的自循环合成或重叠区域扩增。从而实现恒温条件下核酸的简单、快速、高效、特异、灵敏的扩增或富集靶基因的目的。该方法可应用于所有物种(包括动植物、细菌、真菌和病毒等的快速核酸检测。该方法具有引物设计简单、操作方便、检测快速、成本低、设备要求低、准确性高、特异性好、适用性广等特点。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
核酸床边诊断(POCT)是未来分子检测技术的发展趋势，核酸床边诊断技术通常采用恒温扩增技术，环介导的恒温扩增技术(LAMP)是最知名的恒温扩增技术之一，可在63-65℃，60分钟内完成反应，被广泛用于开发各种传染病及其他疾病的POCT诊断技术；LAMP的引物设计包括8个区域，设计6条，引物设计难度较高，同时也增加了引物合成的成本，引物过多引起的非特异性扩增，特别是，当LAMP的反应时间超过40分钟以后，有很大概率会发生非特异性扩增，导致假阳性结果；本发明利用2条特异性引物，即可实现扩增，通过添加1条或2条加速引物即可实现和LAMP相近的扩增速度，降低了引物的设计难度，同时降低了反应的成本。
附图说明
图1为本发明的HOPE扩增原理图；
图2为本发明引物设计图；
图3为本发明HOPE扩增加速原理图；
图4为本发明HOPE扩增实现探针检测原理图；
图5为SARS-CoV-2的HOPE引物设计方案；
图6为结合本发明的半重叠核酸恒温扩增方法和荧光法检测SARS-CoV-2的结果；该图中数字和字母表示的含义为：1.引物仅为OPF/OPR，2.引物包含加速引物，NTC.无模板空白对照的扩增结果；
图7为结合本发明的半重叠核酸恒温扩增方法和凝胶电泳检测SARS-CoV-2的结果；该图中数字和字母表示的含义为：1.不添加加速引物；2.添加加速引物；N:NTC；M：mark；
图8HOPE产物桑格测序结果；
图9为本发明的HOPE法结合荧光法检测SARS-CoV-2的灵敏度测试结果；
图10为RSVA的HOPE引物设计方案；
图11为本发明的HOPE法结合荧光法进行检测RSVA的灵敏度测试结果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明提供一种半重叠引物核酸(HOPE)恒温扩增方法，该方法针对目的基因的3个区域设计2条特异性引物(包括2条半重叠引物OPF和OPR)，利用一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。
引物设计如下：
基于靶序列自3’端开始依次标识为1a、2a、3a的3个不同的区域，其中1a、2a、3a是靶基因上约20bp长的序列片段，1s、2s和3s分别是1a、2a、3a的互补区。
(1)3个区域：1a,2a,3a其对应互补序列(complementary)1s,2s,3s
3’-1a-2a-3a-5’
5’-1s-2s-3s-3’
(2)2条半重叠引物
OPF:5’-2a-1s-3’
OPR:5’-2s-3a-3’
(3)引物设计的其他参考原则：
1、引物的Tm值如下：
1a/3a＝59～61℃；2a＝64～65℃；AR/AF＝59～61℃
2、引物长度及区域之间的距离
引物长度：1a 18-25nt；2a 20-28nt；3a 18-25nt；4a；5a 18-25nt
1a 2a之间距离18-50nt；2a 3a之间距离18-50nt；
3、避免二级结构
引物的设计应使其不易形成二级结构。
4、引物末端的稳定性
从以下末端区域计算6bp的dG应小于-4kcal/mol。
扩增反应模式(根据实施例3的测序结果推导的扩增反应模式)(如图1所示)如下：
1、上游半重叠引物OPF的1s序列首先与模板1a结合，引物上的2a处于游离状态，Bst DNA聚合酶的作用延伸合成带有OPF引物特定序列的互补链；
2、以此链为模板，下游引物OPR，以上一步骤中形成的单链为模板合成新链，形成基础结构2a 1s 2s 3s 2a。基础结构可以通过呈链状，或自身互补配对折叠。
3、基础结构的3’端2a区域与互补链的3’端2s区域互补，继续扩增，形成2a 1s 2s3s 2a 1s 2s 3s 2a产物；
4、之后，这些分子不断通过正义链的2a1s区域，分别与反义连的2s1a或2s区域结合扩增，或者，反义连的2s3a区域，分别与正义链的2a3s或者2a区域结合扩增，放大核酸产物，最终实现指数级的核酸扩增。
预测的扩增反应原理(如图1所示)如下：
1、上游半重叠引物OPF的1s序列首先与模板1a结合，引物上的2a处于游离状态，Bst DNA聚合酶的作用延伸合成带有OPF引物特定序列的互补链；
2、以此链为模板，下游引物OPR，以上一步骤中形成的单链为模板启动反向新链的合成。
3、剥离的单链OPR-2nd和OPF-2nd的5’端和3’端序列(2a或2s)完全相同(即重叠)，与中间序列(2s或2a)可以形成完全互补的双链结构，因此，通过分子内的核酸自我折叠和分子内的动态平衡，各自形成2种哑铃状(loop和stem结构)的单分子DNA；
4、其中一种是哑铃状单分子DNA的3’端(2a或2s)通过互补配对形成哑铃的柄部(即2a-2sDNA双链结构)，在聚合酶的作用下可以继续启动DNA的合成延伸，形成单分子DNAOPR-3rd和OPF-3rd；
5、OPF和OPR引物的3’端分别结合到OPR-3rd和OPF-3rd的loop区域，在链置换DNA聚合酶作用下启动延伸，形成OPR-4th和OPF-4th；
6、之后，这些分子不断通过自身折叠启动自循环和通过OPF和OPR引物结合，产生新的OPR-和OPF-1st，2nd,3rd,4th,……,nth(n≥1)产物，不断合成和放大核酸产物，最终实现指数级的核酸扩增。
进一步的本技术方案可以通过加速引物增加反应速度：
针对目的基因的4-5个区域设计4条特异性引物(包括2条半重叠引物(OPF和OPR)，单个或一对加速引物(AF or AR))，利用一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。
引物设计如下：
基于靶序列自3’端开始依次标识为1a、4a、2a、5a、3a的5个不同的区域(图2)，其中1a、4a、2a、5a、3a是靶基因上约20bp长的序列片段，1s、4s、2s、5s、3s分别是1a、4a、2a、5a、3a的互补区。
(1)5个区域：1a,4a,2a,5a,3a其对应互补序列(complementary)1s,4s,2s,5s,3s
3’-1a-4a-2a-5a-3a-5’
5’-1s-4s-2s-5s-3s-3’
(2)2条半重叠引物
OPF:5’-2a-1s-3’
OPR:5’-2s-3a-3’
(3)1个或1对加速引物
AF：4a
AR：5s
如图3所示，加速引物通过增加和模板，及中间产物的结合区域，进行扩增，加快反应速度。
产物检测：
1)凝胶电泳检测：HOPE扩增产物可以琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电脑检测，电泳胶片呈现自上而下的ladder状条带。
2)实时荧光检测一：在反应中加入DNA双链特异性结合染料的情况下(SYTO 9，SYBR green I等)，随着DNA产物的不断积累，反应中DNA产物浓度不断增加，导致结合到双链DNA的荧光染料不断增加，释放的荧光信号不断增强，通过荧光定量PCR仪，实现扩增产物的实时检测，产生扩增曲线；或者在紫外光下，通过终点肉眼观察燃料释放的绿色荧光信号。
3)实时荧光检测二：通过将AF/AR标记3’端荧光集团和5’端标记猝灭集团，在反应中，随着自循环和AF/AR的3’端荧光集团在Bst 4.0酶，或通过额外添加其他高保真聚合酶的作用下，被切割下来，产生荧光信号。随产物增加，释放的荧光信号增加，通过荧光定量PCR仪，实现扩增产物的实时检测，产生扩增曲线，原理如图4所示。
4)可视化检测一：在反应体系中加入pH指示剂(如甲酚红，中性红等)，随着扩增反应，反应缓冲液的pH从碱性变成中性和微酸性，则反应缓冲液的颜色发生相应的改变(如红-黄等)；或者在反应中添加其他指示剂(如羟基萘酚蓝HNB等)，HNB是一种金属离子指示剂，HNB与镁离子结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色。
实施例1HOPE法检测SARS-CoV-2(荧光法)
SARS-CoV-2(新型冠状病毒)属于冠状病毒属，是一种具有包膜的单链RNA病毒。SARS-CoV-2感染以后会出现高热不退、干咳、气促、呼吸困难、肺炎等症状，严重病例中，会出现凝血功能障碍、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、多器官衰竭等症状，甚至能危及生命。新冠病毒具有高传染性，主要的传播途径有呼吸道飞沫传播、接触、气溶胶和粪口等。如何快速筛查被新冠病毒感染的人群是一项非常急迫的任务。目前的筛查手段是QPCR，该方法受限于仪器设备，且检测时间相对较长(2-3小时)，因此急需开发快速、简便、准确、经济检测手段，尤其适宜于大面积筛查的快速诊断试剂盒。
根据SARS-CoV-2的S基因序列(GenBank:MN908947.3)，设计HOPE引物，引物设计方案见图5，序列见表1。将含有目的靶标S基因的质粒(生工生物工程公司合成)经T7体外转录试剂盒(NEB#E2040)进行体外转录，使用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪测定浓度并进行梯度稀释，作为模版，采用HOPE等温扩增方法进行扩增，HOPE等温扩增反应体系如表2所示。
表1.SARS-CoV-2的HOPE引物序列(由上海生工生物有限公司合成)
表2.HOPE等温扩增反应体系
组分 浓度 体积/μL
10x恒温扩增缓冲液 / 2.5
MgSO4 100mM 1
dNTP 100mM 2.5
Bst 4.0 8U/μL 1
引物OPF/OPR 25μM 1
引物AF/AR 20μM 0/1
Syto 9 1x 1
模板 104copies/μL 3(5*)
无核酸酶水 12/13
HOPE扩增条件：64℃ 1分钟；50个循环，每分钟收集SYBR Green荧光信号。结果如图6所示，添加加速引物的反应在14min后呈现指数扩增，未添加加速引物的在20分钟呈现指数扩增，NTC无扩增。
实施例2HOPE法检测SARS-CoV-2(凝胶电泳)
将实施例1的反应产物进行凝胶电泳检测，结果如图7所示，其中泳道1不添加加速引物的反应产物，泳道2为添加了加速引物的反应产物，N为NTC即无模板空白对照。可以看出HOPE的反应产物电泳胶片呈现自上而下的ladder状条带，NTC无扩增。
实施例3HOPE法检测SARS-CoV-2电泳产物的桑格测序
将实施例2的反应条带1，2，3切胶回收，送生物工程(上海)股份有限公司进行T克隆桑格测序，结果如图8所示，产物大小分别为154bp，283bp，542bp。根据产物的序列，推导出如图1所示的扩增反应模式。
实施例4HOPE法检测SARS-CoV-2的灵敏度检测结果(探针法)
反应体系参照实施例1，略作修改，将AF引物浓度改为10μM，同时添加10μM探针，将实施例1中的SARS-CoV-2的RNA模板，以10倍梯度稀释成1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL，以所有稀释倍数的样品分别为模板，每个浓度两个重复，采用本申请的HOPE检测试剂盒进行扩增。64℃1分钟；50个循环，每分钟收集cy5荧光信号。结果图9所示，由图9可以看出，本发明可检出至5copies/反应(由于该浓度下的扩增体系模板采用的是5μL，相当于浓度为1copies/μL的SARS-CoV-2的RNA模板，表2中5*即代表该浓度下模板用量为5μL)，其中300copies/反应(由于每个扩增体系模板是3μL，相当于浓度为100copies/μL的SARS-CoV-2的RNA模板)以上浓度可稳定检出，30和5copies/反应可概率检出。
实施例5HOPE法检测呼吸道合胞病毒A的灵敏度检测结果(探针法)
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)属于肺病毒科(Peneumoviridae)的正肺病毒属(Orthopneumovirus)，是全球幼儿下呼吸道感染的首要原因，2015年，全球共有3310万例RSV病毒引起的急性下呼吸道感染，导致约320万例住院，5岁以下儿童住院死亡59600例。其症状与副流感病毒肺炎、轻症流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎临床上几乎无法区别。临床上主要根据病毒学及血清学检查。
根据RSVA的M基因序列(GenBank:MK816924.1)，HOPE引物设计方案见图10，引物序列如表3所示。将含有目的靶标M基因的质粒(生工生物工程公司合成)经T7体外转录试剂盒(NEB#E2040)进行体外转录，使用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪测定浓度并进行梯度稀释，然后以10倍梯度稀释成1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL，以所有稀释倍数的样品分别为模板，每个浓度两个重复，采用本发明的HOPE法进行扩增，HOPE等温扩增反应体系如表4所示。
表3.RSVA的HOPE引物序列(由上海生工生物有限公司合成)
表4.HOPE等温扩增反应体系如下表所示。
组分 浓度 体积/μL
10x恒温扩增缓冲液 / 2.5
MgSO4 100mM 1
dNTP 100mM 2.5
Bst4.0 8U/μL 1
引物OPF/OPR 25μM 1
引物AR 20μM 1
引物AF/probe 10μM 1
模板 / 3(5*)
无核酸酶水 / 13
HOPE扩增条件：64℃ 1分钟；50个循环。结果图11所示，本发明可检出至5copies/反应(由于该浓度下的扩增体系模板采用的是5μL，相当于浓度为1copies/μL的SARS-CoV-2的RNA模板，表4中5*即代表该浓度下模板用量为5μL)，其中30copies/反应(由于每个扩增体系模板是3μL，相当于浓度为100copies/μL的SARS-CoV-2的RNA模板)以上浓度可稳定检出，5copies/反应可概率检出。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种非诊断与治疗目的的半重叠引物核酸恒温扩增方法或富集靶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用以下两种方法中的任意一种设计引物：
方法一：基于靶序列上自3’至5’端开始依次标记为1a，2a，3a，其对应互补序列标记为1s，2s，3s，根据靶序列及其互补序列设计两条半重叠引物，包括OPF：5’-2a-1s-3’和OPR：5’-2s-3a-3’；其中，1a、2a、3a是靶基因上18～25bp的序列片段；
方法二：基于靶序列上自3’至5’端开始依次标记为1a，4a，2a，5a，3a，其对应互补序列标记为1s，4s，2s，5s，3s，根据靶序列及其互补序列设计两条半重叠引物和加速引物，所述半重叠引物包括OPF:5’-2a-1s-3’和OPR:5’-2s-3a-3’，所述加速引物包括AF：4a和/或AR：5s；其中，1a、2a、3a、4a、5a是靶基因上18～25bp的序列片段；
步骤2：以靶序列的DNA或RNA为模板，以步骤1中方法一或方法二设计的引物作为扩增引物，利用具有链置换作用的DNA聚合酶进行等温扩增反应，富集得到靶基因的扩增产物；
所述扩增反应的模式如下：
上游半重叠引物OPF的1s序列首先与模板1a结合，引物上的2a处于游离状态，具有链置换作用的DNA聚合酶的作用延伸合成带有OPF引物特定序列的互补链；以此链为模板，下游引物OPR，以上一步骤中形成的单链为模板启动合成新链，形成基础结构2a 1s 2s 3s 2a；基础结构通过呈链状，或自身互补配对折叠；正义链的3’端2a区域与互补链的3’端2s区域互补，继续扩增，形成2a 1s 2s 3s 2a 1s 2s 3s 2a产物；之后，这些分子不断通过正义链的2a1s区域，分别与反义连的2s1a或2s区域结合扩增，或者，反义连的2s3a区域，分别与正义链的2a3s或者2a区域结合合成扩增和，放大核酸产物，最终实现指数级的核酸扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法步骤1中还包括根据引物设计探针，相应地所述步骤2中的等温扩增反应还加入了探针。
3.一种用于HOPE恒温扩增反应或富集靶基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中至少包括：靶基因的模板DNA或RNA和具有链置换作用的DNA聚合酶，所述试剂盒中还至少包括了引物和/或探针，或包括记载了引物和/或探针设计方法的载体；所述引物为针对靶基因设计的半重叠引物或半重叠引物与加速引物。
4.权利要求1～2中任意一项所述的方法在检测病毒中的应用，其特征在于，所述应用不以诊断与治疗为目的。例如检测食品中的病毒。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测的方法为凝胶电泳检测法、实时荧光检测的方法或化学显色法。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒包括呼吸道病毒。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述呼吸道病毒包括SARS-CoV-2和呼吸道合胞病毒。
8.一种基于半重叠引物核酸恒温扩增检测病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：恒温扩增缓冲液、MgSO4溶液、dNTP、Bst DNA聚合酶和无核酸酶水，所述试剂盒中还包括引物和/或探针，或者，包括记载了引物和/或探针设计方法的载体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为检测SARS-CoV-2病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括了引物和探针，所述引物为半重叠引物或半重叠引物和加速引物的组合，所述半重叠引物包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物和如SEQ ID NO：2所示的下游引物，所述加速引物包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物和/或如SEQ ID NO：4所示的下游引物。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括了引物和探针，所述引物为半重叠引物或半重叠引物和加速引物的组合，所述半重叠引物包括如SEQ ID NO：6所示的上游引物和如SEQ ID NO：7所示的下游引物，所述加速引物包括如SEQ ID NO：8所示的上游引物和/或如SEQ ID NO：9所示的下游引物。
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