CN112359137A - 一种可视化病毒核酸rna检测所用的rt-lamp扩增体系及应用 - Google Patents

一种可视化病毒核酸rna检测所用的rt-lamp扩增体系及应用 Download PDF

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Abstract

本申请属于核酸检测技术领域，具体公开一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT‑LAMP扩增体系及应用，所述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT‑LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成；其用于病毒核酸RNA可视化检测时所用的CRISPR体系由Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA、RNA酶抑制剂和ssDNA荧光猝灭探针等组成，可视化病毒核酸RNA检测所用的RT‑LAMP扩增体系：CRISPR体系的体积比为0.1‑5.0:1。整个检测过程可在30至45min内完成，检测结果的准确性和可靠性，适用于核酸的现场、快速、高灵敏检测。

Description

一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系及应用
技术领域
本申请属于核酸检测的技术领域，尤其涉及一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系及其在病毒核酸RNA检测中的应用，特别是在新冠病毒核酸RNA检测中的应用。
背景技术
CRISPR技术是新兴的核酸检测技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速的特点，与核酸扩增相结合可实现快速、高灵敏检测。一些学者将CRISPR技术和PCR或RPA扩增相结合，但是面临两步法开盖操作、长的一体化孵育时间、检测信号低等问题。
环介导恒温扩增(LAMP)可在短时间内特异性产生大量扩增子，结合CRISPR反应，可在短时间内实现对核酸的高灵敏检测。但是现有的LAMP和CRISPR结合的检测方法操作复杂且面临严重的开盖污染问题。
此外，对于RNA的检测，通常需要额外的反转录步骤，使得操作步骤更加复杂且耗时长久。因此，开发简便、快速、高灵敏、防污染的核酸检测方法具有重大意义。
由病毒或细菌引起的呼吸道病毒感染是全球人类最常见的疾病之一，而由新兴病毒引起的疾病则是造成新型感染的疾病。新冠病毒具有超长潜伏期，并且可通过无症状感染者传播。如何尽快找到可能的感染者并进行隔离，是新冠病毒快速检测面临的重要挑战。
对新冠病毒的检测方法，最主要分为核酸和蛋白水平的检测。蛋白水平的检测需要人体对病毒的免疫反应产生抗体，不适用于对病毒感染初期的快速检测。核酸水平的检测针对病毒核酸，通过扩增对病毒靶标进行百万倍放大，可实现快速、高灵敏的病毒检测。实时荧光定量PCR(qPCR)是病毒核酸检测的“金标准”，但需要较为昂贵的仪器设备和较复杂的操作技术，不适用于新冠病毒的现场快速筛查。恒温扩增方法操作简便且避免了对非便携仪器的使用，但是其扩增灵敏度和特异性有待提高(如重组聚合酶扩增(RPA)和切口酶扩增(NEAR))。
因此，开发针对病毒核酸的快速、高灵敏检测方法，适用于对病毒RNA的快速筛查，在临床和现场检测中具有非常重要的意义。
发明内容
第一方面，为了解决病毒核酸RNA的快速筛查，本申请提供一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，采用如下技术方案：
一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成；
所述模板为对现场取样样本进行病毒核酸RNA提取和纯化得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液，模板的用量按模板：RT-LAMP扩增体系总体积的体积比为2.5-50：100的比例计算；
上述的病毒核酸RNA提取和纯化，即采用核酸RNA提取试剂盒、热解法或碱裂解法对现场取样样本进行病毒核酸RNA提取和纯化；
所述的引物组是根据待检测的特定的病毒核酸RNA的测序结果，同时按照LAMP引物设计原则设计(具体见文献Notomi et al.,Nucleic Acids Res.28(12),63.)的4-6条特异性引物组合而成；
所述的4-6条特异性引物为上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环部引物和下游环部引物6条特异性引物中的至少上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物和下游内部引物4条；
所述的引物组中各特异性引物在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中的用量，其中上游外部引物、下游外部引物的浓度均为0.2μmol/L，上游内部引物、下游内部引物的浓度均为1.6μmol/L，上游环部引物、下游环部引物的浓度均为0.4μmol/L；
所述的反应液为RT-LAMP扩增液，反应液的用量为可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积的一半；
本申请的实施例中仅以新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA为例进行说明，但是并不限制对其他病毒核酸RNA的特异性RT-LAMP扩增体系的引物组的设计和CRISPR体系的向导RNA (即crRNA)序列的设计；
本申请中以新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA为例设计的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中的引物组至少包括上游外部引物F3(以下简称F3)、下游外部引物 B3(以下简称B3)、上游内部引物FIP(以下简称FIP)、下游内部引物BIP(以下简称 BIP)、上游环部引物LF(以下简称LF)和下游环部引物LB(以下简称LB)6条特异性引物中的4条，如为F3、B3、FIP和BIP；
或是包括6条特异性引物中的5条，如为F3、B3、FIP、BIP和LF；或为F3、B3、FIP、 BIP和LB；
或是包括6条特异性引物，如为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB；
上述的F3的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，FIP的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，LF的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，LB的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示；
所述的反应液为RT-LAMP扩增液，本申请中RT-LAMP扩增液优选为NEB公司生产的E1700L型号产品。
通过采用上述的技术方案，在病毒核酸RNA可视化检测中的应用时，由于可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系可以实现对病毒核酸RNA的一体化检测并且检测结果肉眼可见，实现了防止扩增子污染，可视化、高灵敏地检测RNA、并且检测所用的设备简单、操作方便。
第二方面，本申请提供上述一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，采用如下技术方案：
将可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系控制温度为62-68℃，优选为63-65℃使样本中的待检测病毒核酸RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应20-60min，优选为30-45min，扩增反应完成后与CRISPR体系混匀进行扩增子触发的进行旁系切割反应1min-60min，优选为1min-30min，更优选为3min-10min，然后置于紫外灯或蓝光灯下观察结果，当紫外灯或蓝光灯下显示的有荧光产生时，样本中的待检测病毒核酸RNA的检测结果为阳性，当显示的无荧光时，样本中的待检测病毒核酸 RNA检测结果为阴性；
上述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测应用时，可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系的用量，按可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系：CRISPR体系的体积比为0.1-5.0:1，优选为0.25-3.0:1，更优选为2-3:1或0.5-1.0:1；
上述的CRISPR体系的体积优选为20μL；
所述CRISPR体系由Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针和NEB buffer 2.1离子缓冲液和去离子水组成；
上述CRISPR体系中的Cas12a酶或Cas12b酶的作用是当Cas12a酶或Cas12b酶被可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中的以标准的待检测病毒核酸RNA或样本中的待检测病毒核酸RNA为模板扩增后所得的病毒核酸RNA扩增子激活后，发挥其旁系切割作用对ssDNA荧光猝灭探针进行切割，从而使得荧光基团ssDNA远离猝灭基团而恢复荧光发光，从而实现可视化检测及对检测灵敏度的提高；
向导RNA的作用是识别并与可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系反应完成后所得的以标准的待检测病毒核酸RNA或样本中的待检测病毒核酸RNA为模板的特异性扩增子互补配对，从而实现标准的待检测病毒核酸RNA或样本中的待检测病毒核酸RNA 的特异性检测；
RNA酶抑制剂的作用是抑制上述标准的待检测病毒核酸RNA、样本中的待检测病毒核酸RNA和CRISPR体系中向导RNA的降解；
所述的CRISPR体系中的向导RNA(即crRNA)序列是根据特定的待检测病毒RNA的测序结果进行设计的，其设计依据是按照检测双链核酸时，双链核酸的PAM序列TTTN或 UUUN后有20-24个碱基与crRNA序列互补配对的原则进行设计的，本申请中仅以新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA为例进行说明，但是并不限制对其他病毒核酸RNA检测所用的 CRISPR体系中的向导RNA(即crRNA)序列的设计，本申请中以新冠病毒SARS-CoV-2 核酸RNA为例的向导RNA即crRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No:7所示；
所述的ssDNA荧光猝灭探针，其碱基序列如下：
5’6-FAM-TTATT-3’BHQ；
所述CRISPR体系中各组分的用量如下：
以20μL的CRISPR体系计算，Cas12a酶或Cas12b酶的工作浓度为0.05-1μmol/L、向导RNA的工作浓度为0.05-10μmol/L、RNA酶抑制剂的工作浓度为0.08-1U/μL、RNA酶抑制剂的工作浓度优选为0.08-0.32U/μL、ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.1-2μmol/L、 2-8μL的NEB buffer 2.1离子缓冲液，余量为去离子水；
上述的工作浓度是指将CRISPR体系和可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP体系混匀后，混合体系中CRISPR体系中各组分的浓度。
通过采用上述的技术方案，在病毒核酸RNA可视化检测中的应用时，由于可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系可以实现对病毒核酸RNA的一体化检测并且检测结果肉眼可见，从而实现了防止扩增子污染，可视化、高灵敏地检测 RNA、并且检测所用的设备简单、操作方便。
第三方面，本申请提供一种含有上述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，采用如下技术方案：
一种含有上述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，除含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系外，还包括CRISPR体系和具有分隔功能又互相联通的反应器；
所述CRISPR体系由Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针、NEB buffer 2.1离子缓冲液和去离子水组成；
所述CRISPR体系中各组份的用量，以20μL的CRISPR体系计算，Cas12a酶或Cas12b酶的工作浓度为0.05-1μmol/L、向导RNA的工作浓度为0.05-10μmol/L、RNA酶抑制剂的工作浓度为0.08-1U/μL、RNA酶抑制剂的工作浓度优选为0.08-0.32U/μL ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.1-2μmol/L、2-8μL的NEB buffer 2.1离子缓冲液的用量，余量为去离子水；
可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系的用量，按可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系：CRISPR体系的体积比为0.1-5.0:1，优选为 0.25-3.0:1，更优选为2-3:1或0.5-1.0:1；
所述的具有分隔功能的反应器为单反应管、双联通管、微流控芯片或其他。
上述的含有上述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒的最小检测限为5拷贝每反应，其检测的灵敏度高，灵敏度验证所用的模板为1μL的含有不同拷贝数的标准的待检测病毒核酸RNA的RNase-free去离子水溶液，本申请实施例中仅以新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA为例进行说明；
其中1μL的含有5x107个拷贝数的标准的待检测病毒核酸RNA的去离子水溶液通过如下步骤的方法制备而成：
首先将上海生工合成的含有标准病毒的质粒作为模板进行PCR扩增，然后采用胶回收试剂盒提取纯化PCR扩增子，然后将PCR扩增子作为模板采用T7转录试剂盒进行转录得到病毒核酸RNA，然后采用DNase I酶去除体系中的DNA，最后采用RNAXP磁珠纯化得到病毒核酸RNA；
将纯化得到的病毒核酸RNA在NanoDrop ND-1000上测得浓度为14.99ng/μL，扩增子长度为517nt，根据公式RNA拷贝数＝RNA浓度(ngμl-1)×6.02×1023×10-9(345×碱基数)-1：计算得到病毒核酸RNA的拷贝数，经过计算得到病毒RNA的储存浓度为5x1010拷贝数/μ L。
本申请中的上述的试剂盒灵敏度验证模板还包括将1μL的每微升含有5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、5x102个拷贝数、 50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的标准的待检测病毒核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
上述每微升含有不同拷贝数的标准的待检测病毒核酸RNA的RNase-free去离子水溶液可以采用RNase-free去离子水对储存浓度为5x1010拷贝数/μL的病毒核酸RNA进行十倍梯度稀释，得到上述不同模板，检测现场测试时具体根据情况进行配置。
第四方面，本申请提供一种利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，采用如下技术方案：
上述的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，具体包括如下步骤：
(1)、含有样本中的待检测病毒核酸RNA的离子水溶液的制备
取人血样、海鲜产品样或污水样，得到含待检测病毒的样本，然后采用核酸提取试剂盒按照试剂盒操作说明进行病毒核酸RNA的提取和纯化，得到含有样本中的待检测病毒核酸RNA 的溶液；
所述的核酸提取试剂盒为市售或核酸提取试剂盒采用碱裂解、热裂解等快速核酸提取方法进行替代；
(2)、采用移液枪等移液设备取步骤(1)中得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板，加入到含有引物组、反应液的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中，然后以去离子水溶液定容并混匀，得到可视化病毒核酸RNA检测所用的RT- LAMP扩增体系；
上述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中，模板的用量按模板：可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积的体积比为2.5-50：100的比例计算；引物组中各引物的用量，按可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中，上游外部引物、下游外部引物的浓度均为0.2μmol/L，上游内部引物或下游内部引物的浓度均为 1.6μmol/L，上游环部引物、下游环部引物的浓度均为0.4μmol/L进行计算；反应液的加入量为可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积一半；
所述反应液为RT-LAMP扩增液，所述的RT-LAMP扩增液优选为NEB公司生产的E1700L 型号产品；
(3)、CRISPR体系的配制
将Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针、NEB buffer 2.1离子缓冲液混合，以去离子水溶液定容至所需的容积，得到CRISPR体系；
(4)、将步骤(2)所得的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和步骤(3)的CRISPR体系装入具有分隔功能又互相联通的反应器中，控制温度为62-68℃，优选为63-65℃使样本中的待检测病毒RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应25-60min，优选为30-45min，更优选为40min；
上述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系装入具有分隔功能又互相联通的反应器后用矿物油进行油封；
上述油封的目的是避免可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系蒸发和反应时产生的热蒸汽对CRISPR体系中Cas酶造成热失活，油封体积以完全覆盖住可视化病毒核酸 RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系为宜，本申请中在可视化病毒核酸RNA检测所用的 RT-LAMP扩增体系为5-80μL时，油封选为25-80μL，所述的矿物油为液体石蜡；
(5)、将步骤(4)扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系与CRISPR体系混匀，进行扩增子触发的Cas12a酶或Cas12b酶进行旁系切割反应1min- 60min，优选为1min-30min，更优选为3min-10min，然后将反应器中的反应液在激发波长为320-470nm的紫外灯或蓝光灯下观察结果，当紫外灯或蓝光灯下显示的单反应管内有荧光产生时，样本中的待检测病毒核酸RNA的检测结果为阳性，当显示的单反应管内保持无荧光时，样本中的待检测病毒核酸RNA检测结果为阴性。
通过采用上述技术方案，即利用含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒实现了可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP体系和CRISPR体系在同一容器中进行一体化反应，检测耗时短、同时避免开盖污染问题对检查结果带来的不确定性影响，且操作简便、便于携带、适用于现场核酸的快速、高灵敏需求检测的使用。
进一步，通过采用上述技术方案，即利用含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行检测，特别是在新冠病毒核酸RNA检测中的应用，使病毒核酸RNA检测可在30至45min内完成，检测结果准确、可靠。
综上所述，本申请具有以下有益技术效果：
本申请的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在可视化病毒核酸RNA检测中的应用，由于采用了RT-LAMP反应和CRISPR反应一体化结合进行特异性、可视化检测RNA，将反转录、扩增、酶切和可视化检测在同一反应器中进行，即采用了与现有相关的的技术不同的技术方案，大大简化了检测操作，其最小检测限为5拷贝每反应，因此适用于对现场微含量样品的检测。
进一步，本申请的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，由于采用的反应器为单反应管或联通管，扩增反应和酶切反应在一个容器中完成，同时由于一体化反应和较快的反转录、扩增、酶切割速率，因此整个检测过程可在30-60min内完成，因此该试剂盒具有操作简便，检测所需时间短，可以快速得到检测结果。同时由于扩增反应完成后的RT-LAMP扩增体系与CRISPR体系混合后进行反应所得的反应液在激发波长为320nm-470nm的紫外光或蓝光下可肉眼观察是否产生荧光来判定检测结果为阳性或阴性，因此其应用于病毒核酸RNA的检测，检测结果可直接用肉眼观察。
进一步，利用含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测时，由于采用单反应管或联通管类反应器，使得扩增反应和酶切反应在一个容器中就可以完成，且操作简便，便于便携，整个检测过程避免了开盖污染问题，从而保证了检测结果的准确性和可靠性，适用于核酸的高灵敏检测。
附图说明
图1为实施例1中利用含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA进行可视化检测的原理图；
图2a、实施例1中CRISPR体系、含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系及油封在单反应管中的装填位置结构示意图；
图2b、单反应管管盖内的CRISPR体系和扩增反应完成后的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系混匀后所得的混匀后的体系和油封在单反应管中的位置结构示意图；
图2c、实施例1中含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系反应后与CRISPR体系混匀进行反应所得的反应液采用紫外光激发所得的荧光可视化结果示意图；
图3为实施例1中所述的双联通管结构示意图；
图4为实施例1中在CRISPR体系固定，以1μL的每微升含有5x107个拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液为模板的可视化病毒核酸RNA 检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积分别为5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μ L和相应的阴性对照样品，新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测结果的照片示意图；
图5为实施例2的对照实施例采用QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒对16个实施例2中病人的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA样品在LightCycler 480荧光系统上读取每个循环的实时荧光结果示意图；
图6、实施例3中在CRISPR体系固定，分别以1μL的每微升含有5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、5x102个拷贝数、50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和相应的阴性对照样品，新冠病毒SARS-CoV-2RNA可视化检测的灵敏度验证的结果示意图；
图7、实施例4中，由F3、B3、FIP和BIP 4条特异性引物组成的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP体系的引物组，同时以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板和相应的阴性对照样品，新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的荧光结果拍照示意图；
图8、实施例5中，由F3、B3、FIP、BIP和LF 5条特异性引物组成或由F3，B3，FIP， BIP，LB5条特异性引物组成，同时以1μL的每微升含有5×102拷贝数的新冠病毒SARS- CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的 RT-LAMP扩增体系和相应的阴性对照样品对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的荧光结果拍照示意图；
图9、实施例6中利用含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的荧光结果拍照示意图；
图10、实施例7中利用含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例并结合附图对本申请进行进一步阐述，但并不限制本申请。
本申请各实施例中所用的原料及试剂的规格及生产厂家信息除下述特殊说明之外，其他均为市售：
Figure RE-GDA0002887732900000091
Figure RE-GDA0002887732900000101
上表中NEB buffer 2.1离子缓冲体系，按每升计算，含有500mmol NaCl，100mmolTris- HCl，100mmol MgCl2，1μg BSA(pH7.9@25℃)和余量的RNase-free去离子水组成。
本申请各实施例中所述的反应液为RT-LAMP扩增液，所述的RT-LAMP扩增液均为NEB公司生产的E1700L型号产品。
实施例1
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系为7组，7组可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的总体积分别为5μL、10μL、20μL、 30μL、40μL、60μL、80μL；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为1.2μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为2μmol/L的ssDNA 荧光猝灭探针、4μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足；
其中所述的Cas12a酶为EnGen Lba Cas12a；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中的模板包括试剂盒灵敏度验证模板和阴性对照模板；
所述的试剂盒灵敏度验证模板为1μL的每微升含有5x107个拷贝数的标准的待检测病毒核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
本实施例中的标准的待检测病毒核酸RNA为标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA；
所述的阴性对照模板为1μL的RNase-free去离子水；
所述的引物组由F3、B3、FIP、BIP、LF和LB 6种引物组成，所述的引物组中各引物的浓度如下：F3和B3均为0.2μmol/L，FIP和BIP均为1.6μmol/L，LF和LB均为0.4μ mol/L；
上述5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、60μL、80μL的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中模板、引物组、反应液和去离子水的量情况见下表：
Figure RE-GDA0002887732900000111
Figure RE-GDA0002887732900000121
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA进行可视化检测，其检测原理如图1所示，即将可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系反应和CRISPR反应集成到同一反应管中，可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系置于单反应管的管底并用液体石蜡进行油封，CRISPR体系置于单反应管的盖子上，待可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP 扩增体系进行扩增反应完成后将CRISPR体系与其混合进行反应，这时CRISPR体系中的 crRNA会与可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系扩增反应完成后所得的待检测病毒RNA扩增子的一条链进行互补配对并激活Cas12a酶，被激活的Cas12a酶发挥旁系切割作用对CRISPR体系中的ssDNA荧光猝灭探针进行切割，最后在激发波长为320- 470nm的蓝光作用下，被切割的ssDNA荧光猝灭探针的荧光基团发出明亮的荧光，从而根据最终的反应体系是否会产生荧光，判定检测结果为阳性或阴性样本，产生荧光，即为阳性样本；不产生荧光，即为阴性样本。
利用上述的含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的灵敏度进行验证，具体包括如下步骤：
(1)、含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液的制备，其制备过程及过程控制参数如下：
首先将生工合成的病毒质粒作为模板进行PCR扩增，然后采用胶回收试剂盒提取纯化PCR 扩增子，然后将PCR扩增子作为模板采用T7转录试剂盒进行转录得到病毒RNA，然后采用DNase I酶去除体系中的DNA，最后采用RNAXP磁珠纯化得到病毒RNA作为阳性对照，将纯化得到的病毒RNA在NanoDrop ND-1000上测得浓度为14.99ng/μL，扩增子长度为517nt，根据公式RNA拷贝数＝RNA浓度(ng.μL-1)×6.02×1023×10-9×(345×碱基数)-1，计算得到病毒RNA的拷贝数(Wang et al.,Chem.Commun.2018,54(9):1105- 1108)，经过计算得到病毒RNA的储存浓度为5x1010拷贝数/μL，采用RNase-free去离子水对储存浓度的RNA进行十倍梯度稀释，得到每微升含有5x107拷贝数的标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
(2)、采用移液枪等移液设备分别取6个1μL的步骤(1)中得到的每微升含有5x107拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板，分别加入到仅含有引物组、反应液的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中，然后分别用RNase-free去离子水定容至5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL，即得到总体积分别为5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL的含有标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系；
上述总体积分别为5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL的含有标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中引物组的浓度如下：F3和B3的浓度均为0.2μmol/L，FIP和BIP的浓度均为1.6μmol/L，LF和LB 的浓度均为0.4μmol/L；
上述总体积分别为5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL的含有标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中反应液的量分别为各对应的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的总体积的一半，即分别为2.5μL、5μL、10μL、20μL、 30μL、40μL；
可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的阴性对照样本的制备：
上述总体积分别为5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL的含有标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的阴性对照样本，除模板为阴性对照模板即为去离子水外，其他如引物组、反应液均与上述各个对应体积下的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT- LAMP扩增体系相同，余量为去离子水；
(3)、CRISPR体系的配制
将Cas12a酶、向导RNA即crRNA、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针、NEB buffer 2.1离子缓冲液混匀，最后余量以去离子水补足，得到CRISPR体系；
(4)、在12个单反应管中，首先分别在每个单反应管的管盖内部加入20μL的CRISPR体系，然后分别将步骤(2)所得的6个5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP 扩增体系，和6个5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、60μL、80μL的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的阴性对照样本依次置于上述12个单反应管的管底，然后将加入单反应管的管底的6个含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和6个阴性对照样本分别采用25uL矿物油进行油封，然后盖上管盖，将12个单反应管均控制温度为65℃进行扩增反应40min，以使含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸 RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应；
所用的矿物油为液体石蜡；
上述12个单反应管中CRISPR体系、含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系及油封在单反应管中的装填位置结构示意图如图2a所示，图2a中1为含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，2为油封，3为CRISPR体系；
(5)、步骤(4)扩增反应完成后，通过离心使每个单反应管管盖内的CRISPR体系和反应管管底的扩增反应完成后的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系进行混匀，混匀后所得混匀后体系控制温度为37℃进行反应10min，以使扩增反应完成后的含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中得到的扩增子触发的Cas12a酶进行旁系切割反应，反应完成后将12个单反应管置于紫外灯下分别观察结果，并拍照记录；
上述混匀所得的混匀后的体系和油封在单反应管中的位置结构示意图如图2b所示，其中2 为油封、4为混匀后的体系；
当紫外灯下显示管内有荧光产生(可被肉眼区分)，检测结果为阳性，当显示管内保持无荧光(不可被肉眼观区分)时，检测结果为阴性；上述的阳性/阴性对照结果示意图如图2c所示，其中“+”表示的是阳性，“-”表示的是阴性；
上述的紫外灯也可以用蓝光灯替代，当蓝光灯下显示管内有荧光产生(可被肉眼区分)时，检测结果为阳性，当显示管内保持无荧光(不可被肉眼区分)时，检测结果为阴性。
上述实施例中所用的单反应管还可以采用其他具有分隔功能又互相联通的容器中进行，比如双联管，所述的双联管结构示意图如图3a、图3b、图3c所示，即只要是一体联通的，管的形式可以不定，如2个联通的锥管、2个联通的方管，2个锥管或方管之间间隔一定的距离，或相互靠近，原则是方便2个联通的管中的最终的液体可以相通并最终混匀就好。
上述拍照记录结果如图4所示，从图4中可以看出，当CRISPR体系的体积为20μ L、可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系即含有标准的新冠病毒SARS- CoV-2核酸RNA的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的体积在5-60μL 范围内时，管内产生了肉眼可区分的荧光，由此表明了20μL CRISPR体系和5μL-60μL 可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系组成的含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒均可实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA样品的可视化检测。
实施例2
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系同实施例1的60μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，只是将其中模板即1μL含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液替换成20μL含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液的模板。
所述的CRISPR体系同实施例1的20μL CRISPR体系。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病人实际样本的SARS-CoV-2核酸RNA样品可视化检测的有效性验证，步骤如下：
(1)、含有样本中的待检测病毒核酸RNA(所述的待检测的样本病毒核酸RNA即为待检测的病人的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA实际样本)的溶液的制备取人血样或采用咽拭子从病人口中擦拭取样，然后采用病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司货号DP430的试剂盒)进行提取和纯化，得到含有样本中的待检测病毒核酸 RNA的溶液；
(2)、60μL以步骤(1)所得的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的配制
采用移液枪等移液设备取20μL步骤(1)中得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板，加入到含有引物组和反应液的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP 扩增体系中；
上述60μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中，引物组中的特异性引物F3和B3的浓度均为0.2μmol/L，FIP和BIP的浓度均为1.6μmol/L，LF和LB的浓度均为0.4μmol/L；反应液的量为30μL，即为可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积的一半，余量以去离子水补足；
将模板、引物组、反应液和去离子水混合均匀，得到60μL含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系；
阴性对照样本的制备：
上述阴性对照样本，除模板为阴性对照模板即为去离子水为，其他如引物组组成及用量、反应液的用量均与上述含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的可视化病毒核酸 RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系相同，余量为去离子水；
(3)、CRISPR体系的配制
同实施例1，得到CRISPR体系；
(4)、取2个单反应管，首先分别在单反应管的管盖内部加入20μL的CRISPR体系，然后将步骤(2)所得的60μL以含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和60μL阴性对照样本依次置于上述2个单反应管的管底并分别采用矿物油进行油封，然后盖上管盖，将2个单反应管均控制温度为 65℃进行扩增反应40min，以使含有样本中的待检测病毒核酸RNA在可视化病毒核酸RNA 检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应；
上述油封的目的是避免可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系蒸发和反应时产生的热蒸汽对CRISPR体系中Cas酶造成热失活，油封体积以完全覆盖住可视化病毒核酸 RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系为宜，本实施例中上述油封所用的矿物油的量均为25μL；
所述的矿物油为液体石蜡；
(5)、步骤(4)扩增反应完成后，通过离心使每个单反应管管盖内的CRISPR体系和反应管管底的扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系进行混匀，混匀后所得混匀后体系控制温度为37℃进行反应10min，反应完成后将2个单反应管置于紫外灯下分别观察结果，并拍照记录；
结果显示，含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的单反应管，当紫外光激发显示管内有荧光产生(荧光可被肉眼区分)，表明检测结果为阳性；而阴性对照样本显示无荧光产生(荧光无法被肉眼区分)，表明检测结果为阴性。
上述结果表明，利用本申请的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病人实际样本的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA样品可视化检测是有效的。
实施例2的对照实施例
取16个实施例2中病人的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA样品采用现有的标准的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)新冠病毒核酸检测方法进行检测，步骤如下：
采用QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒对实施例2中病人实际样本的SARS-CoV-2核酸RNA样品进行检测，具体如下：
采用的RT-PCR引物为Cov-F和Cov-R，所述的Cov-F: ATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGG，其碱基序列如SEQ ID No:8，所述的 Cov-R:GAAGGACATAAGATGATAGCCCTTTCCACAAAAA其碱基序列如SEQ ID No:9；采用的RT-PCR扩增体系为：1×QIAGEN OneStep RT-PCRBuffer(Mg2+plus),dNTP各400 μM，引物各0.6μM，2μL QIAGEN OneStep RT-PCR酶混液,1×EvaGreen核酸染料， 20μL从病人样本中提取纯化得到的RNA模板，RNase-free去离子水补足至50μL；
RT-PCR扩增程序为：50℃孵育30min用于将RNA模板反转录成DNA，95℃孵育15 min用于HotStarTaq DNA聚合酶的热启动，随后进行45个循环，你每个循环包括94℃变性30s，60退火30s，72℃延伸1min。将配好的RT-PCR反应液置于离心管中，在 LightCycler 480荧光系统上读取每个循环的实时荧光，结果如图5所示，图5中循环数表示 PCR扩增循环个数，图5中的1、2、3……16分别表示对16个阳性临床样本的检测。
上述采用QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒对临床样本的RT-PCR实时荧光曲线显示为阳性的样本，而实施例2中通过本申请的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒进行检测也均可观察到明显的荧光，说明基于一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒的检测结果与标准的RT-PCR检测结果一致，由此表明，本申请的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA进行可视化检测的方法是准确的。
综上所述，本申请的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA进行可视化检测的检测的检测，由于采用单反应管或联通管，使得扩增反应和酶反应在一个容器中进行，因此操作简便，且整个检测过程可在30至45min内完成，并且避免了开盖污染问题，从而保证了检测的快速、高效、无污染、检测结果可靠。即利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA进行可视化检测的方法，适用于现场核酸的快速、精准检查。
实施例3
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，所述的RT-LAMP扩增体系为8组，8组RT-LAMP扩增体系的体积均为40μ L，其中的引物组和反应液的含量同实施例1的40μL RT-LAMP扩增体系；只是每组可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的模板不同，分别为1μL的每微升含有 5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、5x102个拷贝数、50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
所述的CRISPR体系同实施例1的20μL CRISPR体系。
上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA样品可视化检测的灵敏度的验证，步骤如下：
(1)、含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液的制备同实施例1的步骤(1)，得到每微升含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA为5X107拷贝数的RNase-free去离子水溶液；
上述的所得的每微升含有5X107拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase- free去离子水溶液用RNase-free去离子水依次稀释10倍后分别得到的每微升含5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、5x102个拷贝数、 50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的8组含有标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA 的RNase-free去离子水溶液；
(2)、采用移液枪等移液设备分别取1μL步骤(1)中得到的8组每微升分别含5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、5x102个拷贝数、50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的 RNase-free去离子水溶液作为模板，分别加入到8组含有引物组、反应液的可视化病毒核酸 RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中；
上述的8组含有引物组、反应液的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系最终总体积均为40μL，其中每组引物组中的F3和B3的浓度均为0.2μmol/L，FIP和BIP的浓度均为1.6μmol/L，LF和LB的浓度均为0.4μmol/L；其中每组反应液的量均为可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积一半，余量分别均以去离子水定容至40 μL；
上述每组模板、引物组、反应液和去离子水分别混合均匀，即分别得到以1μL的每微升含有对应拷贝数为5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、5x102个拷贝数、50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系；
上述反应液为RT-LAMP扩增液，本申请中优选为NEB公司生产的E1700L型号产品；
阴性对照样本的制备：
上述阴性对照样本，除模板为阴性对照模板即为去离子水为，其他如引物组、反应液均与上述以1μL的每微升含有不同拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free 去离子水溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系相同，余量为去离子水；
(3)、CRISPR体系的配制
同实施例1，得到CRISPR体系；
(4)、取9个单反应管，首先分别在每个单反应管的管盖内部加入20μL的CRISPR体系，然后分别将40μL的步骤(2)所得的分别以1μL的每微升含有拷贝数分别为5x106个拷贝数、5x105个拷贝数、5x104个拷贝数、5x103个拷贝数、5x102个拷贝数、50个拷贝数、5个拷贝数、0.5个拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和1个阴性对照样本依次置于上述9个单反应管的管底并分别采用矿物油进行油封，然后分别盖上单反应管的管盖，将9个单反应管均控制温度为65℃进行扩增反应40min，以使含有标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA在RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应；
上述油封所用的矿物油的量为25μL；
所述的矿物油为液体石蜡；
(5)、步骤(4)扩增反应完成后，通过离心使每个单反应管的管盖内的CRISPR体系和反应管的管底的扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系进行混匀，混匀后所得混匀后体系控制温度为37℃进行反应10min，以使扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中得到的扩增子触发的Cas12a酶进行旁系切割反应，反应完成后将9个单反应管置于紫外灯下分别观察结果，并拍照记录；
最终拍照记录结果如图6所示，从图6中可以看出以1μL的每微升含有不低于5拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系样本均呈现出可区分的荧光；而对应以1μL的每微升含有0.5拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本和阴性对照样本均无荧光产生，由此表明了采用一种含有可视化病毒核酸 RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的灵敏度为5拷贝数每反应，说明利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的 RT-LAMP扩增体系的试剂盒对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测的灵敏度可达到单分子水平。
实施例4
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组由F3、B3、FIP和BIP 4条特异性引物组成，引物组含量、反应液用量同实施例1的40μL RT-LAMP扩增体系；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，组成及含量同实施例1。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果并用手机拍照记录，结果如图 7所示，从图7中可以看出，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS- CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，由F3、B3、FIP和BIP 4条特异性引物组成可视化病毒核酸RNA检测所用的 RT-LAMP体系的引物组，同样可以实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测。
实施例5
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组1、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为以1μL的每微升含有5×102拷贝数的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组1由F3、B3、FIP、BIP和LF 5条特异性引物组成，引物组含量、反应液用量同实施例1的40μL RT-LAMP扩增体系；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，组成及含量同实施例1。
上述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中引物组1用引物组2 替代，所述的引物组2由F3，B3，FIP，BIP，LB 5条特异性引物组成。
利用上述的对应引物组分别为引物组1和引物组2的含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，均以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果并用手机拍照记录，结果如图8所示：图8中，从左到右，第一个、第三个管中分别对应引物组1和1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸 RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本和阴性对照样本，第二个和第四个管分别对应含有引物组2和1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸 RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的的样本和阴性对照样本。从图8中可以看出以 1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free 去离子水溶液作为模板、引物组为引物组1或引物组2的样本中均有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中均无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的引物组无论是由F3、 B3、FIP、BIP和LF 5条特异性引物组成的引物组1或是由F3、B3、FIP、BIP和LB 5条特异性引物组成的引物组2，同样都可以实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测。
实施例6
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为1.2μmol/L的向导RNA、8UnitU的RNA酶抑制剂、工作浓度为2μmol/L的ssDNA荧光猝灭探针和8μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果并用手机拍照记录，结果如图 9所示，从图9中可以看出，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
实施例7
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为1.2μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为2μmol/L的ssDNA 荧光猝灭探针和6μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果并用手机拍照记录，结果如图 10所示，从图10中可以看出，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒 SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
实施例8
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为1.2μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为2μmol/L的ssDNA 荧光猝灭探针和2μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述实施例1、实施例6、7、8的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，在CRISPR体系的体积为20μL时，2-10μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系的用量都可以实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测。
实施例9
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为10μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为2μmol/L的ssDNA 荧光猝灭探针和2μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
实施例10
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为0.05μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为0.1μmol/L的 ssDNA荧光猝灭探针和2μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以RNase-free去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以1 μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述实施例1、实施例9、10的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，在CRISPR体系的体积为20μL时，其中向导RNA的工作浓度为0.05-10μmol/L都可以实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测。
实施例11
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.4μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为0.05μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为1.0μmol/L的 ssDNA荧光猝灭探针和2μL的10×NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述实施例1、实施例10、11的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，在CRISPR体系的体积为20μL时，其中ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.1-2μmol/L都可以实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测。
实施例12
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为0.05μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为0.05μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为1.0μmol/L的 ssDNA荧光猝灭探针和2μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以RNase-free去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例1，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以1 μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
实施例13
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为40μL；
模板为1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的40μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系的体积为20μL，其中含有工作浓度为1μmol/L的Cas12a酶、工作浓度为0.05μmol/L的向导RNA、8Unit的RNA酶抑制剂、工作浓度为1.0μmol/L的ssDNA 荧光猝灭探针和2μL的NEB buffer 2.1离子缓冲体系，余量由去离子水补足。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例2，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以1μL的每微升含有5×102拷贝数的标准的新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的RNase-free去离子水溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性对照样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述实施例1、实施例12、13的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，在CRISPR体系的体积为20μL时，其中Cas12a酶的工作浓度为0.05-1μmol/L都可以实现对新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测。
实施例14
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为60μL；
模板为1μL从感染病人咽拭子样本中提取纯化得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA 的溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的60μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系同实施例1的20μL CRISPR体系。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病人新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例2，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以含有从感染病人咽拭子样本中提取纯化得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
实施例15
一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，包括可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系，还包括反应器，所述的反应器为200μL的单反应管；
所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成，总体积为60μL；
模板为10μL从感染病人咽拭子样本中提取纯化得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA 的溶液；
引物组组成及含量、反应液用量同实施例1的60μL可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，余量为去离子水；
所述的CRISPR体系同实施例1的20μL CRISPR体系。
利用上述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病人新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA可视化检测，以去离子水作为阴性对照模板，其他均同实施例2，最终在蓝光灯下观察单反应管内的荧光结果，结果表明，以含有从感染病人咽拭子样本中提取纯化得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板的样本中有明亮的荧光产生并且肉眼可区分，阴性样本中无荧光产生，肉眼无法进行区分。
上述实施例2、实施例14、15的结果表明，一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒中，以1-20μL从病人咽拭子样本中提取纯化得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板都可以实现对病人新冠病毒SARS-CoV-2核酸 RNA可视化检测。
上述具体实施方式只是对本申请的技术方案进行详细解释，本申请并不只仅仅局限于上述实施例，本领域技术人员应该明白，凡是依据上述原理及精神在本申请基础上的改进、替换、都应在本申请的保护范围内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 1
tgtgaagttc ttttcttgtg c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 2
gacttcaaag tttgcagaca 20
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 3
gctatcatct tatgtccttc cctcacataa gtcacatgca agaaga 46
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 4
acactctgac attttagtag cagcgtgact caacaattaa ttagagc 47
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 5
aagattagca gaagctctga tt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 6
gtcagcacct catggtgtag 20
<210> 7
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 7
gaacacggag agagcagcaa gaagcagaag c 31
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 8
atgatatcct ttcacgtctt gacaaagttg agg 33
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 9
gaaggacata agatgatagc cctttccaca aaaa 34

Claims (24)

1.一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，其特征在于所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系由模板、引物组、反应液和去离子水组成；
所述模板为对现场取样样本进行核酸提取得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液，模板的用量按模板：可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积的体积比为2.5-50：100的比例计算；
所述的引物组是根据样本中的待检测的特定的病毒核酸RNA的测序结果，同时按照LAMP引物设计原则设计的特异性引物组合而成；
所述的特异性引物组合为上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环部引物和下游环部引物6条特异性引物中的至少上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物和下游内部引物4条引物；
所述的反应液为RT-LAMP扩增液，反应液的用量为可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系总体积的一半。
2.如权利要求1所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，其特征在于所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中，引物组中各条特异性引物的用量如下：其中上游外部引物、下游外部引物的浓度均为0.2μmol/L，上游内部引物、下游内部引物的浓度均为1.6μmol/L，上游环部引物和下游环部引物的浓度均为0.4μmol/L。
3.如权利要求1所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系，其特征在于所述的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液通过采用如下步骤的方式获得：
取人血样或采用咽拭子从病人口中擦拭取样，然后采用病毒RNA提取试剂盒、热解法或碱裂解法进行RNA提取和纯化，得到含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液。
4.如权利要求1、2或3所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于步骤如下：
将可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系控制温度为62 -68℃使样本中的待检测病毒RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应20-60min，扩增反应完成后与CRISPR体系混匀进行扩增子触发的进行旁系切割反应1-60min，然后置于紫外灯或蓝光灯下观察结果，当紫外灯或蓝光灯下显示有荧光产生时，样本中的待检测病毒核酸RNA的检测结果为阳性，当显示无荧光时，样本中的待检测病毒核酸RNA检测结果为阴性；
所述CRISPR体系由Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针、NEB buffer 2.1离子缓冲液和去离子水组成；
所述的向导RNA是根据待检测样本中的特定病毒RNA的基因组序列进行设计的，其设计依据是按照检测双链核酸时，双链核酸的PAM序列后有20-24个碱基与向导RNA的序列互补配对的原则进行设计。
5.如权利要求4所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于扩增反应控制温度为63 -65℃，时间为30-45min；旁系切割反应时间为3-30min。
6.如权利要求5所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于所述的旁系切割反应时间为5-10min。
7.如权利要求4所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP 扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和CRISPR体系的用量，按可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系： CRISPR体系的体积比为0.1-5.0:1。
8.如权利要求7所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系：CRISPR体系的体积比为0.25-3:1。
9.如权利要求8所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系：CRISPR体系的体积比为0.5-1:1。
10.如权利要求8所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系： CRISPR体系的体积比为2-3:1。
11.如权利要求4所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于所述CRISPR体系为20μL时，CRISPR体系中各个组分的用量，Cas12a酶或Cas12b酶的工作浓度为0.05-1μmol/L、向导RNA的工作浓度为0.05-10μmol/L、RNA酶抑制剂的工作浓度为0.08 -1U/μL、ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.1-2μmol/L、2-8μL 的NEB buffer 2.1离子缓冲液，余量为去离子水；
上述的工作浓度是指可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体用于病毒核酸RNA可视化检测时，CRISPR体系和可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP体系混匀后，所得的混合体系中的CRISPR体系中各个组分的浓度。
12.如权利要求11所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于所述CRISPR体系为20μL时， CRISPR体系中各个组分的用量，Cas12a酶或Cas12b酶的工作浓度为0.1-0.2μmol/L，向导RNA的工作浓度为0.1-1μmol/L，RNA酶抑制剂的工作浓度为0.08-0.32U/μL、ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.5-1μmol/L。
13.如权利要求4所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于所述的病毒核酸RNA为新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA。
14.如权利要求13所述的一种可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系在病毒核酸RNA可视化检测中的应用，其特征在于所述可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中的引物组中，上游外部引物为上游外部引物F3、下游外部引物为下游外部引物B3、上游内部引物为上游内部引物FIP、下游内部引物为下游内部引物BIP、上游环部引物为上游环部引物LF和下游环部引物为下游环部引物LB。
15.一种含有如权利要求1、2或3所述的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，其特征在于还包括CRISPR体系；
其中可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系：CRISPR体系的体积比为0.1-5.0:1；
所述CRISPR体系由Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针、NEB buffer 2.1离子缓冲液和去离子水组成；
所述的向导RNA是根据待检测的特定病毒RNA的测序结果进行设计的，其设计依据是按照检测双链核酸时，双链核酸的PAM序列后有20-24个碱基与向导RNA的序列互补配对的原则进行设计。
16.如权利要求15所述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，其特征在于所述的可视化病毒核酸RNA检测所用RT-LAMP扩增体系中，引物组的用量，其中上游外部引物、下游外部引物的浓度均为0.2μmol/L，上游内部引物、下游内部引物的浓度均为1.6μmol/L，上游环部引物、下游环部引物的浓度均为0.4μmol/L。
17.如权利要求16所述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，其特征在于所述CRISPR体系中各个组分的用量，以CRISPR体系为20μL计算，Cas12a酶或Cas12b酶的工作浓度为0.05-1μmol/L、向导RNA的工作浓度为0.05-10μmol/L、RNA酶抑制剂的工作浓度为0.08-1U/μL、ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.1-2μmol/L、2-8μL 的NEB buffer 2.1离子缓冲液，余量为去离子水；
上述的工作浓度是指CRISPR体系和可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP体系混匀后，混合体系中的CRISPR体系中各个组分的浓度。
18.如权利要求17所述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，其特征在于还包括具有分隔功能又互相联通的反应器。
19.如权利要求18所述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒，其特征在于所述的具有分隔功能的反应器为单反应管、双联通管或微流控芯片。
20.利用如权利要求18所述的一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）、含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液的制备
取人血样、海鲜产品样或污水样，然后采用核酸提取试剂盒、热解法或碱裂解法对病毒核酸RNA进行提取和纯化，得到含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液；
(2)、采用移液枪等移液设备取步骤（1）中得到的含有样本中的待检测病毒核酸RNA的溶液作为模板，加入到含有引物组、反应液的RT-LAMP扩增体系中，然后以去离子水溶液定容并混匀，得到可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系；
（3）、CRISPR体系的配制
将Cas12a酶或Cas12b酶、向导RNA 、RNA酶抑制剂、ssDNA荧光猝灭探针、NEB buffer2.1离子缓冲液混合，以去离子水溶液定容至所需的容积，得到CRISPR体系；
（4）、将步骤（2）所得的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系和步骤（3）的CRISPR体系装入具有分隔功能又互相联通的反应器中，控制温度为62 -68℃使样本中的待检测病毒核酸RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应25-60min；
（5）、步骤(4)扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系与CRISPR体系混匀，以进行扩增子触发的Cas12a酶或Cas12b酶进行旁系切割反应1min-60min，然后置于紫外灯或蓝光灯下观察结果，当紫外灯或蓝光灯下显示的具有分隔功能又互相联通的反应器内有荧光产生时，样本中的待检测病毒核酸RNA的检测结果为阳性，当显示的具有分隔功能又互相联通的反应器内保持无荧光时，样本中的待检测病毒核酸RNA检测结果为阴性。
21.如权利要求20所述的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，其特征在于步骤（3）所述的CRISPR体系为20μL，步骤（2）可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的体积为5-60μL。
22.如权利要求21所述的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，其特征在于：
步骤（4）中，控制温度为63-65℃使样本中的待检测病毒RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应30-45min；
步骤（5）中，CRISPR体系和扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系混匀后控制温度为37℃进行扩增子触发的Cas12a酶或Cas12b酶进行旁系切割反应1min-30min。
23.如权利要求22所述的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，其特征在于；
步骤（4）中，控制温度为65℃使样本中的待检测病毒RNA在可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系中进行扩增反应40min；
步骤（5）中，CRISPR体系和扩增反应完成后的可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系混匀后控制温度为37℃进行扩增子触发的Cas12a酶或Cas12b酶进行旁系切割反应10min。
24.如权利要求20所述的利用一种含有可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系的试剂盒对病毒核酸RNA进行可视化检测的方法，其特征在于步骤（4）中可视化病毒核酸RNA检测所用的RT-LAMP扩增体系装入具有分隔功能又互相联通的反应器后用矿物油密封，所述的矿物油为液体石蜡，其用量为25-80µL。
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