CN112501359A

CN112501359A - 一种用于检测新型冠状病毒covid-19的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN112501359A
Application number: CN202110165813.6A
Authority: CN
Inventors: 申冕; 郑实; 赵曼曼; 张清仪; 吴亚会
Original assignee: Wujiang Novoprotein Scientific Inc
Current assignee: Suzhou inshore protein Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2041-02-07
Also published as: CN112501359B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测冠状病毒的引物组及试剂盒，所述引物组包括以下中的一对或多对：外侧引物对：所述外侧引物对包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物F3和如SEQ ID NO:2所示的下游引物B3；内侧引物对：所述内侧引物对包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物FIP和如SEQ ID NO:4所示的下游引物BIP；环引物对：所述环引物对包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物LF和如SEQ ID NO:6所示的下游引物LB。试剂盒包括所述引物组。本发明在一个管中整合了RT‑LAMP和CRISPR，能依据两次颜色变化检测病毒和各种靶标核酸。

Description

一种用于检测新型冠状病毒COVID-19的引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒COVID-19的引物组及试剂盒。

背景技术

靶标核酸的快速检测对于临床诊断与生物技术应用非常重要，特别是体外分子诊断中，随着核酸分子检测市场的快速发展，传统核酸检测技术，如荧光定量PCR作为分子诊断技术的金标准之一，虽然提高了效率和准确性，但很难在这么短的时间内检测到大量样品，也需要专业人员、操作时间长和昂贵的设备来检测，使得即时医疗测试和现场分析变得充满挑战，也对核酸检测技术不断提出新的需求。在这种情况下一种可在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的即时检测(point-of-care testing，POCT)技术不断涌现。目前POCT技术广泛应用于临床检验、慢病监测、灾害医学救援、传染病监测、食品安全等公共卫生领域。

反转录环介导的等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermalamplification, RT-LAMP）反应具有很高的特异性，不依赖于昂贵的专业检测设备，不需要热循环过程，该方法简便易操作、实验流程简单快速，不具备专业技能的一般人员就能在疾病现场进行快速诊断。但这些方法存在一些缺点，包括假阳性率高、容易造成环境气溶胶污染，难以将这些技术用于大流行病如COVID-19的有效POC诊断。

随着簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白的最新进展刺激了CRISPR技术在分子诊断中的发展。CRISPR-Cas系统作为核酸检测工具的一个诱人的特点是它们在识别和切割特定靶标后具有针对单链DNA（ssDNA）或RNA靶标的强大的附带活性，即识别出它们的DNA靶标后，激活的CRISPR-Cas核酸酶会不加区别地裂解附近的单链非靶向核酸；接下来结合核酸扩增，扩增产物将触发CRISPR-Cas核酸酶进行报道分子的侧切裂解，以实现更高的敏感性和高度特异性。尽管这些系统有望开发出有效的诊断程序，但将这些技术用作适合大规模的POC诊断程序仍具有挑战性。

基于RT-LAMP方法和CRISPR的诊断方法的效率和简便性，通过将RT-LAMP与CRISPR结合可在短时间内在单一温度下对目标核酸的几个拷贝进行高特异性诊断。但这也具有局限性，例如两个单独的反应步骤，较长的孵育时间或用于模板检测受限的信号较弱，尤其是当前LAMP-CRISPR结合策略需要克服诸如无上限操作，容易形成气溶胶污染和操作复杂等诸多缺点。这限制了其开展现场快速检测的需求。因此，本领域迫切需要开发一种快速、价格适中、无需设备、敏感、高特异、裸眼可视化的且适用于现场即时诊断靶标核酸的方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒COVID-19的引物组及试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于检测冠状病毒的引物组，所述引物组包括以下中的一对或多对：

1）外侧引物对：所述外侧引物对包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物F3和如SEQID NO:2所示的下游引物B3；

2）内侧引物对：所述内侧引物对包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物FIP和如SEQID NO:4所示的下游引物BIP；

3）环引物对：所述环引物对包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物LF和如SEQ IDNO:6所示的下游引物LB。

本发明还提供一种用于检测冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。

本发明还提供所述引物组在制备新型冠状病毒COVID-19检测产品中的用途。

如上所述，本发明的一种用于检测新型冠状病毒COVID-19的引物组及试剂盒，具有以下有益效果：检测试剂盒在一个反应管中基于RT-LAMP和CRISPR技术两次颜色变化检测病毒和各种靶标核酸，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，大大缩短检测时间，适于即时医疗应用。

附图说明

图1显示为本发明的一管式RT-LAMP-CRISPR双重可视化检测方法的方案示意图，左起第一管显示粉红色，第二管显示黄色，第三管显示粉红色，第四管显示粉红色液体中含有绿色荧光。

图2显示为本发明的RT-LAMP可视化和灵敏度检测结果，不同浓度的RNA样品在不同时间点的实时荧光结果，其中，颜色变为黄色的是阳性样本（10倍梯度稀释）（左起前七管）；颜色为粉红色的为阴性样本（最后一管）。

图3显示为本发明的CRISPR/Cas12a系统可视化检测结果，较弯折的线条为阳性，较平滑的线条为阴性；Ep管中左管为阳性加模板有绿色荧光信号产生，右管为阴性未加模板，无荧光信号产生。

图4显示为本发明的一管式RT-LAMP-CRISPR/Cas12a双重可视化灵敏度检测结果，上排管中，左起前七管显示黄色，最后一管显示粉红色；下排管中，左起前七管显示绿色荧光，最后一管无荧光产生。

图5显示为本发明的一管式RT-LAMP-CRISPR/Cas12a双重可视化样本特异性检测结果，其中1：COVID-19-N基因的重组质粒（2.5×10⁴copy）；2：COVID-19-N基因的假病毒（2.5×10⁴copy）；3：SARS-2003-N基因重组质粒（2.5×10⁵copy）；4：未加模板；上排管中1和2显示黄色，3和4显示粉红色，下排管中1和2显示绿色荧光，3和4无荧光产生。

具体实施方式

本发明首先提供一种用于检测冠状病毒的引物组，所述引物组包括以下中的一对或多对：

在一种实施方式中，所述引物组包括外侧引物对、内侧引物对和环引物对。

在一种实施方式中，所述引物组为用于检测新型冠状病毒COVID-19的引物组。

所述引物组用于RT-LAMP（即逆转录环介导的等温扩增）方法检测新型冠状病毒COVID-19。

对于上述的引物对具有的具体碱基序列而言，只要能够特异性地识别各自的特异性识别区域，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。

将上述的引物对具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上均可。

对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且50个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为49个碱基以下，进一步优选为48个碱基以下，进一步优选为47个碱基以下。

本发明还提供一种用于检测冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组。

在一种实施方式中，所述试剂盒为用于检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒。

在所述试剂盒中，各引物对可以单独包装，也可以将几种引物对融合包装为引物混合物。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组核酸的试剂、RT-LAMP扩增试剂（2×Indicator RT-LAMP Master Mix）。

在一种实施方式中，所述从样品中提取基因组核酸的试剂可以采用现有的试剂。例如细胞组织基因DNA提取试剂盒（厂家：GENEray，货号：GK0122）或快速质粒DNA小量试剂盒（厂家：新景生物，货号：1005250）。

在一种实施方式中，所述RT-LAMP扩增试剂包括DNA聚合酶，逆转录酶，缓冲液，dNTP混合物。

所述DNA聚合酶选自等温DNA聚合酶。例如所述DNA聚合酶可以是BST、Bsm、Phi29DNA Polymerase。

所述逆转录酶可以是MLV，M-MuLV和AMV逆转录酶

所述缓冲液通常可以向体系提供最合适的酶催反应的条件。所述缓冲液只要起到上述作用即可。

所述dNTP混合物通常作为DNA合成中的原料，具体可以包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP，dUTP等。

所述RT-LAMP扩增试剂中还可以包括其他各种核酸扩增所需要的试剂。例如，还可以包括扩增促进剂、固定试剂、镁离子。所述扩增促进剂可以选自Tween 20、甜菜碱、SSB等中的一种或多种的组合。例如，所述固定试剂可以选自(NH₄)₂SO₄、KCl等中的一种或多种的组合。所述镁离子通常可以作为扩增体系中的催化剂，其可以与dNTP形成dNTP-Mg与核酸骨架相互作用、并能影响Polymerase的活性。

所述RT-LAMP扩增试剂中还可以包括指示染料。所述指示染料的作用是可以起到不需要进一步实验，在肉眼或常规仪器下，观察到溶液反应前后发生明显的颜色变化。所述指示染料必须对反应无影响或影响较小，反应前后颜色变化明显，易于分辨。所述指示染料选自酸碱指示染料、荧光染料、金属指示剂等。

在一种实施方式中，所述酸碱指示剂为甲酚红和酚红的混合溶液。

在一种实施方式中，所述RT-LAMP扩增试剂可以是以上各种试剂分别单独包装的多个试剂。

在另一种实施方式中，所述RT-LAMP扩增试剂为DNA聚合酶，逆转录酶，dNTP混合物、扩增促进剂、固定试剂、镁离子等试剂的混合物。在一种实施方式中，RT-LAMP扩增试剂包含20mM (NH₄)₂SO₄、100mM KCl、16mM MgSO₄、0.2% Tween 20、0.05%的甲酚红和酚红溶液、8U DNA Polymerase和0.5U Reverse Transcriptase。所述RT-LAMP扩增试剂可以是商品化试剂，例如WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix（厂家：NEB，货号：M1800S）。

RT-LAMP等温扩增后可以根据试剂颜色变化初步判断结果是否呈阳性。

所述试剂盒还包括水性介质。所述水性介质通常可以用于调节体系中各组分的浓度，通常可以作为稀释溶剂。在一种实施方式中，所述水性介质选自RNase-Free H₂O。

所述试剂盒还包括CRISPR检测试剂，所述CRISPR检测试剂包括Cas12a检测混合物、crRNA、ssDNA报告基因（即非特异性单链DNA荧光报告基因）、水性介质。

在一种实施方式中，所述Cas12a检测混合物包括Tris-HCl、MgCl₂、BSA、Cas12aNuclease、Rnase Inhibitor和PEG-8000。

进一步的，以Cas12a检测混合物的总体积为基准，所述Cas12a检测混合物包括20mM Tris-HCl、12 mM MgCl₂、200 µg/ml BSA、2pmol Cas12a Nuclease、4U RnaseInhibitor和0.1%的PEG-8000。

在一种实施方式中，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在一种实施方式中，所述ssDNA报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括矿物油。

所述矿物油的作用是防止CRISPR检测试剂挥发。

CRISPR/Cas12a介导的检测结果可在蓝光或紫外光下观察反应体系的荧光产生情况，若有荧光产生则结果呈阳性，无荧光产生则结果呈阴性。

本发明还提供一种新型冠状病毒COVID-19的检测方法，所述方法包括以下步骤：

1）将RT-LAMP扩增试剂、引物组、模板和水性介质加入至反应管中；在反应管中的试剂上层加入矿物油；

2）将CRISPR检测试剂加入至反应管的管盖内，轻轻盖上管盖并转移至等温扩增仪中反应并记录颜色变化；

3）等温扩增结束后，将CRISPR检测试剂与等温扩增的体系混合继续反应，并观察有无荧光产生，有荧光产生则结果呈阳性，无荧光产生则结果呈阴性。

本申请中的试剂盒检测新型冠状病毒COVID-19是通过检测新型冠状病毒COVID-19-N基因实现的。

新型冠状病毒的基因组包含11个基因，其中功能较为重要的5个基因分别是：ORF1ab基因、S基因、E基因、M基因、N基因。N基因编码的N蛋白是一种核衣壳碱性磷酸化蛋白(nucleocapsid phosphoprotein)，位于病毒颗粒的核心部分，N蛋白首先是与基因组RNA在胞浆中结合形成螺旋卷曲的核衣壳，并与M、E蛋白相互作用后包裹进入病毒衣壳内，S蛋白在病毒膜出芽成熟时插入，并与M蛋白相用后形成病毒体从囊泡中释放。N蛋白在病毒的包装、复制和蛋白质翻译等过程中起关键作用。作为一种高度保守的抗原蛋白，N蛋白可用于特异性识别患者样本中的病毒靶点抗原，所以N基因和N蛋白常作为冠状病毒的检测诊断工具。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 新冠病毒COVID-19-N基因的RT-LAMP引物设计

根据NCBI上已报道的COVID-19-N基因序列（MT019530），结合对COVID-19的测序结果，利用VECTORNTIalignX进行比对分析，选取基因序列保守区域，利用在线引物设计软件PrimerExplorerV5(https://primerexplorer.jp/e/)设计引物，最后选取以下RT-LAMP检测引物组：

外侧引物对F3和B3：

上游引物F3：5'- GGACCCCAAAATCAGCGAA-3'(SEQ ID NO:1)；

下游引物B3：5'- ATTGGAACGCCTTGTCCTC-3'(SEQ ID NO:2)。

内侧引物对FIP和BIP：

上游引物FIP：

5'- CCACTGCGTTCTCCATTCTGG ATTACGTTTGGTGGACCCTC-3'(SEQ ID NO:3)：

下游引物BIP：

5'- CGGCCCCAAGGTTTACCCAA CCTTGCCATGTTGAGTGAGA-3'(SEQ ID NO:4).

环引物对LF和LB：

上游引物LF：5'-GCGTTACTGCCAGTTGAATCT-3' (SEQ ID NO:5)；

下游引物LB：5'- TACTGCGTCTTGGTTCACCG-3'(SEQ ID NO:6)。

实施例2：RT-LAMP灵敏度检测

RT-LAMP反应体系包括2× Indicator RT-LAMP Master Mix（包含20mM (NH₄)₂SO₄、100mM KCl、16mM MgSO₄、0.2% Tween 20、0.05%的甲酚红和酚红溶液、8U BST2.0 DNAPolymerase和0.5U Reverse Transcriptase） 10μL； 10×primer Mix2μL（包含终浓度分别为1.6μM的FIP和BIP；终浓度分别为0.2μM的F3和B3；终浓度分别为0.4μM的LF和LB）；RNase-FreeWater 7μL和不同浓度梯度的RNA（2.5×10⁷~2.5copy/μL）1μL进行反应。采用金属浴65℃温育40min，温育结束后反应体系的阳性发生明显的可视的颜色变化如图2所示，RT-LAMP可检测RNA浓度低至2.5copy/μL的样本。

实施例3：CRISPR/Cas12a介导的荧光检测

40μL反应体积的CRISPR/Cas12a介导的裂解测定包含20μL 2×Cas12a DetectedMix（20 mM Tris-HCl pH8.0、12 mM MgCl₂、200 µg/ml BSA、2pmol LbaCas12a Nuclease、4U Rnase Inhibitor和0.1%的PEG-8000）、1.2μM crRNA (核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:7，crRNA委托第三方公司合成)、2μM ssDNA报告基因 (核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:8，ssDNA委托第三方公司合成)和20 ng COVID-19的质粒（选取COVID-19基因序列中的N基因序列送金唯智合成DNA序列（见SEQ ID NO:9），将其克隆到pED-T 载体（厂家：Novoprotein，货号：T002）中），再用RNase-FreeWater补充至40μL。在实时荧光定量PCR仪（ABI7500）37℃反应20分钟（每隔1min收集一次荧光），并在紫外灯下拍照。结果如图3所示。

实施例4：一管式RT-LAMP-CRISPR/Cas12a双重可视化灵敏度检测

40μL反应体系如下：将20μL的RT-LAMP反应相关试剂（包括2× Indicator RT-LAMP Master Mix 10μL； 10×primer Mix 2μL；RNase-FreeWater 8μL）添加到0.2 mL PCR管底，反应溶液上覆盖了10μL矿物油，随后将不同浓度梯度的RNA样品加入试管底部，并与RT-LAMP反应试剂混合物混合。接下来将10μL的Cas12a反应溶液包含2×LbaCas12aDetected Mix 20μL、1.2μM crRNA和2μM ssDNA报告基因）添加到管盖内，然后将管轻轻盖上盖子，以防止Cas12a试剂掉入管中。65℃金属浴中保持30分钟，观察颜色变化；随后倒转和轻拂试管在室温下进行Cas12a介导的检测步骤。将Cas12a试剂与RT-LAMP扩增产物混合。并将试管在37℃放置10分钟。然后在蓝光或紫外灯下，观察绿色荧光。结果如图4所示，一管式RT-LAMP-CRISPR/Cas12a双重可视化实验可检测RNA浓度低至2.5copy/μL的样本。

实施例5一管式RT-LAMP-CRISPR/Cas12a双重可视化样本特异性检测

40μL反应体系如下：将20μL的RT-LAMP反应相关试剂{包含2× Indicator RT-LAMP Master Mix 10μL；10×Primer Mix 2μL（其中FIP和BIP 16μM；F3和B3 0.2μM；LF和LB0.4μM）；RNase-free Water 7μL}添加到0.2 mL PCR管底，反应溶液上覆盖10μL矿物油（防止试剂挥发），随后将1μL不同的模板加入试管底部，并与RT-LAMP试剂混合。接下来将CRISPR/Cas12a相关试剂（包含2×LbaCas12a Detected Mix 20μL、1.2μM crRNA和2μMssDNA报告基因）添加到管盖内，然后将管轻轻盖上盖子（防止CRISPR/Cas12a相关试剂掉入管中）。在65℃下反应30分钟，记录颜色变化；随后倒转和轻混试管，将Cas12a相关试剂与RT-LAMP扩增产物混合，并将PCR管置于37℃放置10分钟。在蓝光或紫外灯下观察有无绿色荧光产生。结果如图5所示，一管式RT-LAMP-CRISPR/Cas12a双重可视化实验特异性较强。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司

<120> 一种用于检测新型冠状病毒COVID-19的引物组及试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaccccaaa atcagcgaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attggaacgc cttgtcctc 19

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccactgcgtt ctccattctg gattacgttt ggtggaccct c 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggccccaag gtttacccaa ccttgccatg ttgagtgaga 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgttactgc cagttgaatc t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactgcgtct tggttcaccg 20

<210> 7

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga uccagaaugg agaacgcagu gg 42

<210> 8

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttattatt 8

<210> 9

<211> 1274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcagctgatg tctgataatg gaccccaaaa tcagcgaaat gcaccccgca ttacgtttgg 60

tggaccctca gattcaactg gcagtaacca gaatggagaa cgcagtgggg cgcgatcaaa 120

acaacgtcgg ccccaaggtt tacccaataa tactgcgtct tggttcaccg ctctcactca 180

acatggcaag gaagacctta aattccctcg aggacaaggc gttccaatta acaccaatag 240

cagtccagat gaccaaattg gctactaccg aagagctacc agacgaattc gtggtggtga 300

cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac tacctaggaa ctgggccaga 360

agctggactt ccctatggtg ctaacaaaga cggcatcata tgggttgcaa ctgagggagc 420

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gctacaactt cctcaaggaa caacattgcc aaaaggcttc tacgcagaag ggagcagagg 540

cggcagtcaa gcctcttctc gttcctcatc acgtagtcgc aacagttcaa gaaattcaac 600

tccaggcagc agtaggggaa cttctcctgc tagaatggct ggcaatggcg gtgatgctgc 660

tcttgctttg ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag agcaaaatgt ctggtaaagg 720

ccaacaacaa caaggccaaa ctgtcactaa gaaatctgct gctgaggctt ctaagaagcc 780

tcggcaaaaa cgtactgcca ctaaagcata caatgtaaca caagctttcg gcagacgtgg 840

tccagaacaa acccaaggaa attttgggga ccaggaacta atcagacaag gaactgatta 900

caaacattgg ccgcaaattg cacaatttgc ccccagcgct tcagcgttct tcggaatgtc 960

gcgcattggc atggaagtca caccttcggg aacgtggttg acctacacag gtgccatcaa 1020

attggatgac aaagatccaa atttcaaaga tcaagtcatt ttgctgaata agcatattga 1080

cgcatacaaa acattcccac caacagagcc taaaaaggac aaaaagaaga aggctgatga 1140

aactcaagcc ttaccgcaga gacagaagaa acagcaaact gtgactcttc ttcctgctgc 1200

agatttggat gatttctcca aacaattgca acaatccatg agcagtgctg actcaactca 1260

ggcctaacca agcg 1274

Claims

1.一种用于检测冠状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下中的一对或多对：

1）外侧引物对：所述外侧引物对包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物F3和如SEQ IDNO:2所示的下游引物B3；

2）内侧引物对：所述内侧引物对包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物FIP和如SEQ IDNO:4所示的下游引物BIP；

3）环引物对：所述环引物对包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物LF和如SEQ ID NO:6所示的下游引物LB。

2.一种用于检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组核酸的试剂、RT-LAMP扩增试剂、CRISPR检测试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP扩增试剂包括DNA聚合酶、逆转录酶和dNTP混合物。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP扩增试剂中还包括扩增促进剂、固定试剂、镁离子、指示染料中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR检测试剂包括Cas12a检测混合物、crRNA、ssDNA报告基因和水性介质。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas12a检测混合物包括Tris-HCl、MgCl₂、BSA、Cas12a Nuclease、Rnase Inhibitor和PEG-8000中的一种或几种，和/或，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括矿物油。

9.根据权利要求2-8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为用于检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒。

10.权利要求1所述的引物组在制备新型冠状病毒COVID-19检测产品中的用途。