CN113481284A - 一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法，基于恒温扩增的快速反应，比色读取结果。该试剂盒包括如下组分：LAMP比色缓冲液、dNTPs、Bst2.0DNA聚合酶和逆转录酶。本试剂盒采用LAMP恒温扩增技术，应用于不同核酸的检测只需改变LAMP扩增引物的设计。本发明实现了将核酸特异性扩增反应的结果转化为人眼可观察的颜色变化，具有快速检测、特异性强、灵敏度高、可视化等特点。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术和分子诊断等领域，具体地，是一种基于恒温扩增的快速可视化核酸检测试剂盒和检测方法。
背景技术
随着新冠疫情的流行，世界各地核酸检测量剧增。传统的核酸检测方法是采用PCR扩增技术，扩增目标核酸，读取荧光信号。由于需要升降温的循环，PCR扩增流程繁琐、耗时长。同时，升降温的控制对检测设备提出了更高要求，而荧光信号的读取引入了较为复杂的光路。因此，利用PCR技术进行核酸检测往往设备笨重、便携性差，难以满足现场快速检测的需求。要满足病毒及病原菌核酸的快速便携检测需求，仍需要探索更为简便的检测方法。
LAMP是一种等温扩增技术，在固定温度下即可完成核酸扩增反应，对温控的要求大大降低。另外，LAMP采用2～3对特异性引物，只有这些引物都与待测核酸匹配才能启动扩增反应，大大提高了扩增的特异性。基于以上原因，LAMP越来越多地被用在核酸检测领域。在这些应用中，主流的核酸检测方法仍然是加入荧光染料与DNA双链结合。由于DNA扩增后荧光加强，因此可以根据荧光强度的变化判断是否存在目标DNA。
发明内容
本发明主要目的在于提供了一种恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法，将核酸检测的结果转化为人眼可直接观察的溶液颜色变化。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，包含LAMP比色缓冲液、dNTPs、Bst2.0DNA聚合酶和逆转录酶。
优选的，所述LAMP比色缓冲液包括20mM(NH4)2SO4、100mMKCl、16mMMgSO4、0.2％Tween-20、1mMKOH和5mM酚红染料。
优选的，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP各5mM。
优选的，所述Bst2.0 DNA聚合酶浓度等于或大于8U/μL。
优选的，所述逆转录酶浓度为8U/μL，当核酸检测对象为RNA时额外加入使用。
一种基于恒温扩增的比色核酸检测方法，使用所述基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，利用环介导等温扩增技术(LAMP)特异性扩增目标核酸，再利用pH敏感染料将核酸扩增引起的pH变化转化为溶液由红到黄颜色的改变。
优选的，所述核酸检测方法的反应体系如下：
优选的，所述LAMP扩增引物可根据需检测的核酸自行设计，其中各引物浓度如下：
FIP/BIP primers 16mM
F3/B3 primers 2mM
Loop F/B primers 4mM。
所述逆转录酶只在待测样本是RNA时加入。
所述核酸检测方法包括如下步骤：
(1)依次将12.5μLLAMP比色缓冲液、7μLdNTPs、2.5μL根据目标核酸设计的LAMP扩增引物加入反应管；
(2)在反应管内加入1μLBst2.0 DNA聚合酶，如果待测样本是RNA，再加入1μL逆转录酶；
(3)在反应管内加入2μL待测样本溶液，充分混匀后65℃恒温加热30min。
(4)反应结束后观察反应管内溶液颜色，若溶液变黄，说明待测样本中含有目标核酸；若溶液保持红色，说明待测样本中不含目标核酸。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明基于LAMP等温扩增技术，提供了一种恒温扩增的比色核酸检测试剂盒及检测方法，实现了将核酸检测的结果转化为人眼可直接观察的溶液颜色变化。该核酸检测技术不需要额外的光路系统，具有操作简单、成本低、反应快、灵敏度高的优点，可在30分钟内得到检测结果，具有操作简单、成本低、灵敏度高的优点，可有效满足临床、疫病等快速检测的需求。
附图说明
图1为新冠病毒质粒阴性和阳性样本反应前的图片(左边阴性样本，右边阳性样本)；
图2为使用本发明实施例的新冠病毒质粒阴性和阳性样本反应后的图片(左边阴性样本，右边阳性样本)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明详细说明。
在一些实施例中，一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，包含LAMP比色缓冲液、dNTPs、Bst2.0 DNA聚合酶和逆转录酶。应理解，针对不同的检测目标，可采用不同的引物序列。
在一些优选的实施例中，所述LAMP比色缓冲液包括20mM(NH4)2SO4、100mMKCl、16mMMgSO4、0.2％Tween-20、1mMKOH和5mM酚红染料。
在一些优选的实施例中，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP各5mM。
在一些优选的实施例中，所述Bst2.0 DNA聚合酶浓度为8U/μL，适当提高浓度可加快扩增反应。
在一些优选的实施例中，所述逆转录酶浓度为8U/μL，当核酸检测对象为RNA时额外加入使用。
在一些实施例中，一种基于恒温扩增的比色核酸检测方法，采用等温扩增比色核酸检测试剂盒，利用环介导等温扩增技术(LAMP)特异性扩增目标核酸，再利用pH敏感染料将核酸扩增引起的pH变化转化为溶液由红到黄颜色的改变。
在一些优选的实施例中，所述核酸检测方法的反应体系如下：
在不同实施例中，所述LAMP扩增引物可根据需检测的核酸自行设计，其中引物参考浓度如下：
FIP/BIP primers 16mM
F3/B3 primers 2mM
Loop F/B primers 4mM
以上给出三对引物的参考浓度。后文将给出针对构建的新冠质粒设计的引物具体实例。
在一些优选的实施例中，所述逆转录酶只在待测样本是RNA时加入。
在一个具体实施例中，所述核酸检测方法包括如下步骤：
(1)依次将12.5μLLAMP比色缓冲液、7μLdNTPs、2.5μL根据目标核酸设计的LAMP扩增引物加入反应管；
(2)在反应管内加入1μLBst2.0 DNA聚合酶，如果待测样本是RNA，再加入1μL逆转录酶；
(3)在反应管内加入2μL待测样本溶液，充分混匀后65℃恒温加热30min。
(4)反应结束后观察反应管内溶液颜色，若溶液变黄，说明待测样本中含有目标核酸；若溶液保持红色，说明待测样本中不含目标核酸。
实例1
采用本发明的比色核酸检测试剂盒，对用新冠病毒序列构建的质粒样本进行比色检测。
所构建的新冠质粒序列如下：
GAATTCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAGGATCC
所构建的LAMP扩增引物序列如下：
F3 TGGACCCCAAAATCAGCG
B3 GCCTTGTCCTCGAGGGAAT
FIPaCCACTGCGTTCTCCATTCTGGTAAATGCACCCCGCATTACG
BIPCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCTTGCCATGTTGAGTGAGA
LFTGAATCTGAGGGTCCACCAAA
LBGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTT
反应体系如下：
比色检测步骤如下：
(1)依次将12.5μLLAMP比色缓冲液、7μLdNTPs和2.5μLLAMP扩增引物加入阴性和阳性样品反应管。
(2)在两个反应管内加入1μLBst2.0 DNA聚合酶，
(3)在两个反应管内加入2μL待测样本溶液，其中阴性样本为纯水，阳性样本为构建的新冠质粒，充分混匀后65℃金属浴恒温加热30min。
(4)反应结束后取出反应管观察管内溶液颜色。
参见图1，反应前阴性和阳性样本的反应体系溶液颜色均为红色。参见图2，反应后，阴性样本溶液保持红色，阳性样本溶液变黄，人眼可直接观察的溶液颜色变化，具有很高的区分度。本例进行核酸检测可在30分钟内得到检测结果，不需要额外的光路系统，操作简单、成本低、灵敏度高。
本发明的试剂盒采用LAMP恒温扩增技术，实现了将核酸特异性扩增反应的结果转化为人眼可观察的颜色变化，具有检测快速、特异性强、灵敏度高、可视化等特点，应用于不同核酸的检测只需改变LAMP扩增引物的设计。
以上结合具体的实施例对本发明做了比较详细的说明，但这些具体的说明不应理解为对本发明的限制。应当理解，本领域普通技术人员在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒和检测方法
<130> 21A100265JYC
<141> 2021-06-30
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> allele
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<223> 构建的新冠质粒序列
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caacgtcggc cccaaggttt acccaataat actgcgtctt ggttcaccgc tctcactcaa 180
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<212> DNA
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<223> 针对构建的新冠质粒序列的B3引物
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<212> DNA
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<223> 针对构建的新冠质粒序列的BIP引物
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<212> DNA
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<223> 针对构建的新冠质粒序列的LB引物
<400> 7
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Claims (10)
1.一种基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含LAMP比色缓冲液、dNTPs、Bst2.0 DNA聚合酶和逆转录酶。
2.根据权利要求1所述的基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP比色缓冲液包括20mM(NH4)2SO4、100mMKCl、16mMMgSO4、0.2％Tween-20、1mMKOH和5mM酚红染料。
3.根据权利要求1或2所述的基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，其特征在于，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP各5mM。
4.根据权利要求1至3任一项所述的基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，其特征在于，所述Bst2.0 DNA聚合酶浓度为8U/μL。
5.根据权利要求1至4任一项所述的基于恒温扩增的比色核酸检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶浓度为等于或大于8U/μL。
6.一种基于恒温扩增的比色核酸检测方法，其特征在于，使用根据权利要求1至5任一项所述的核酸检测试剂盒，利用环介导等温扩增技术(LAMP)特异性扩增目标核酸，再利用pH敏感染料将核酸扩增引起的pH变化转化为溶液由红到黄颜色的改变。
7.根据权利要求6所述的比色核酸检测方法，其特征在于，所述检测方法的反应体系如下：
8.根据权利要求7或8所述的比色核酸检测反应体系，其特征在于，所述LAMP扩增引物根据需检测的核酸来设计，其中引物参考浓度如下：
FIP/BIP primers 16mM
F3/B3 primers 2mM
Loop F/B primers 4mM
9.根据权利要求7所述的比色核酸检测反应体系，其特征在于，所述逆转录酶只在待测样本是RNA时加入。
10.根据权利要求6—7所述的比色核酸检测方法，其特征在于，所述核酸检测方法包括如下步骤：
(1)依次将12.5μLLAMP比色缓冲液、7μLdNTPs、2.5μL根据目标核酸设计的LAMP扩增引物加入反应管。
(2)在反应管内加入1μLBst2.0 DNA聚合酶，如果待测样本是RNA，再加入1μL逆转录酶。
(3)在反应管内加入2μL待测样本溶液，充分混匀后65℃恒温加热30min。
(4)反应结束后观察反应管内溶液颜色，若溶液变黄，说明待测样本中含有目标核酸；若溶液保持红色，说明待测样本中不含目标核酸。
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