CN110628950B

CN110628950B - 一种用于检测ev71病毒的引物组合、试剂盒和psr方法

Info

Publication number: CN110628950B
Application number: CN201910960377.4A
Authority: CN
Inventors: 王静; 张晓龙; 刘威; 慈颖; 张乔; 施琦; 孙筱霞
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: CN110628950A

Abstract

本发明公开了一种用于检测EV71病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法，属于生物检测技术领域。本发明用引物组合对待测样品进行PSR反应，检测PSR反应产物，确定待测样品是否含有EV71病毒。本发明的方法操作简便，反应时间短，灵敏度高，特异性强，且与其他病毒无交叉扩增。

Description

一种用于检测EV71病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测EV71病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法。

背景技术

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，主要通过粪口途径和密切接触传染，多发于三岁以下的婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，重症患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒中最重要的是肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)，可引起严重的中枢神经系统病变，病死率高。

EV71病毒的分离培养烦琐、费力、耗时比较长、不能满足早期诊断要求，因此不太适合用培养法鉴定这种病毒；另一种常规的检测方法为血清学检测，但灵敏度低，易产生假阳性结果；核酸检测方面主要以RT-PCR为主，但该方法对仪器要求较高，不利于在小型医院与现场检测环境下推广。

因此，提供一种EV71病毒的检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于检测EV71病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法，操作简单，灵敏度高，特异性强。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测EV71病毒的引物组合，具体引物序列如下：

EV71-Ft2：5’-AGTCGTCGAACCTCACGACCGAGATAGCGTGAGCAGAGCC-3’；SEQ ID NO.4；

EV71-Bt2：5’-CCAGCACTCCAAGCTGCTGAAAGAACACAGCGTGTCTCAA-3’；SEQ ID NO.5；

EV71-IF：5’-GCGCTGGTAGAGCTTGAGTG-3’；SEQ ID NO.6；

EV71-IB：5’-GGAGCATCATCAAATGCTAGTGACG-3’；SEQ ID NO.7。

进一步，含有上述引物组合的试剂盒。

进一步，所述试剂盒还包括双指示系统和阳性对照。

进一步，所述双指示系统包括显色液和/或荧光染料；所述显色液包括0.08mM甲酚红和0.02mM苯酚红；所述荧光染料为SYBR Green I或EveGreen。

进一步，一种用于检测EV71病毒的PSR方法，包括如下步骤：用上述的引物组合对待测样品进行PSR反应，检测PSR反应产物，确定待测样品是否含有EV71病毒。

进一步，所述PSR反应体系如下：12.5μl的2×RM，2.0μl DNA模板和1.0μl Bst DNA聚合酶，1.0μl AMV逆转录酶，引物的EV71-Ft2、EV71-Bt2各1.6μM，EV71-IF、EV71-IB各0.8μM，并用水补齐25μl。

进一步，所述PSR反应条件为61-67℃，40-60min。

进一步，所述检测PSR反应产物确定待测样品是否含有EV71病毒的方法为：若能扩增，则待测样品含有EV71病毒；若不能扩增，则待测样品不含有EV71病毒。

进一步，所述检测PSR反应产物确定待测样品是否含有EV71病毒的方法为a、b或c：

a、浊度法：浊度仪检测所述待测样品PSR反应产物浊度变化曲线，若所述待测样品PSR反应产物浊度变化曲线呈上升状态，则所述待测样品为EV71病毒，若所述待测样品PSR反应产物浊度变化曲线不呈上升状态，则所述待测样品不为EV71病毒；

将上述PSR反应体系中的各物质混合于0.2ml的反应管，于LA-320c实时浊度仪中，反应条件为：65℃，60min；随着反应的进行，阳性反应管中会因产生的白色沉淀副产物而变浑浊，浊度仪可检测其650nm的吸光值变化，据此可对反应进行实时监测，每隔6s测定反应管的浊度，并生成反应曲线；各反应均以双蒸水设置阴性对照。

在PSR反应过程中发生的反应如下：

(DNA)_n-1+dNTP→(DNA)n+P₂O₇ ^4-

P₂O₇ ^4-+2Mg²⁺-→Mg₂ P₂O₇↓(焦磷酸镁，为白色沉淀)

b、显色法：所述PSR反应中加有显色液，观察所述待测样品PSR反应产物的颜色，若所述待测样品PSR反应产物为黄色，则所述待测样品为EV71病毒，若所述待测样品PSR反应产物为红色，则所述待测样品不为EV71病毒；

当脱氧核糖核苷酸分子在DNA聚合酶作用下，与新合成的DNA双链相结合，同时会产生一个氢离子，氢离子会伴随着PSR反应逐渐增加，从而使得反应体系的pH值降低，通过pH值的改变来实现显色。发生阳性反应则显示黄色，因为反应溶液中氢离子的浓度升高；发生阴性对照的pH值不变，溶液颜色不变保持红色。

c.荧光法：所述PSR反应中加有荧光染料，在荧光定量仪中进行扩增反应：若在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰阳性反应的，为阳性；在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现，为阴性；结果判定标准：在阳性对照发生阳性反应且阴性对照发生阴性反应的前提下，待测样品在反应阶段出现S型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰，并与阳性对照单一峰位置接近，此时待测样品判断为阳性，否则为阴性。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于检测EV71病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法，操作简便，反应时间短，灵敏度高，能检测到0.24pg/μl，特异性强，且与CoxA16病毒之间无交叉扩增。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明EV71病毒的VP1基因的Blast结果；

图2附图为本发明利用浊度法进行EV71病毒最佳PSR引物筛选；

图3附图为本发明利用荧光法进行EV71病毒最佳PSR引物筛选；

其中，1，EV71-1；2，EV71-2；3-8为空白对照；

图4附图为本发明EV71病毒敏感性评价-浊度法；

其中，1，240.0ng/μl；2，24.0ng/μl；3，2.4ng/μl；4，240.0pg/μl；5，24.0pg/μl；6，2.4pg/μl；7，0.24pg/μl；8，纯水；

图5附图为本发明EV71病毒的敏感性评价-显色法；

其中，1，纯水；2，240.0ng/μl；3，24.0ng/μl；4，2.4ng/μl；5，240.0pg/μl；6，24.0pg/μl；7，2.4pg/μl；8，0.24pg/μl；

图6附图为本发明EV71病毒检测特异性评价-浊度法；

其中，1，人全血基因组1；2，人全血基因组2；3，人全血基因组3；4，人全血基因组4；5，CVA16-VP1基因构建菌DNA；6，EV71-VP1基因构建菌DNA；7，粪便基因组样本1；8，粪便基因组样本2；9，粪便基因组样本3；10，粪便基因组样本4；

图7附图为本发明EV71病毒检测特异性评价-荧光法；

其中，1，人全血基因组1；2，人全血基因组2；3，人全血基因组3；4，人全血基因组4；5，CVA16-VP1基因构建菌DNA；6，粪便基因组样本1；7，EV71-VP1基因构建菌DNA；8，粪便基因组样本2；

图8附图为本发明EV71病毒检测特异性评价-荧光法；

其中，1，粪便基因组样本3；2，粪便基因组样本4；

图9附图为本发明EV71病毒检测特异性评价-显色法；

其中，1，EV71-VP1基因构建菌DNA；2，人全血基因组1；3，人全血基因组2；4，人全血基因组3；5，人全血基因组4；6，CVA16-VP1基因构建菌DNA；7，粪便基因组样本1；8，粪便基因组样本2；9，粪便基因组样本3；10，粪便基因组样本4。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

反应混合液(ReactionMixture，2×RM)的配制

(1)20×RM pre的配制：取2.64g硫酸铵，1.49g氯化钾，3.95g七水硫酸镁，2.0ml吐温20于100ml容量瓶中，充分溶解，用1％KOH溶液调节pH至8.0，最后定容到100ml，4℃保存。

(2)甜菜碱溶液(0.375g/ml)配制：取7.5g甜菜碱于20ml容量瓶中，充分溶解并定容到20ml，4℃保存。

(3)2×RM的配制：PSR的反应缓冲液应避免反复冻融，故一般配成2ml的小体系；吸取200μl的20×RM pre于2ml离心管中，加入53.33μl的Tris-HCl溶液(1.5M，pH8.8)，1.0ml甜菜碱溶液(0.375g/ml)，加入746.67μl去离子水补齐2ml，于-20℃保存。

实施例1EV71病毒的PSR引物设计

从GenBank数据库(No.KC866700.1)上下载EV71病毒的VP1基因，并选取其中较保守的一段序列，全长如下：

GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCAAGCTCTACCAGCGCCCACAGGCCAGAATACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAGATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCACACAGCACAGCTG；SEQ ID NO.1。

将上述序列上传至Blast网站进行序列对比，结果表明该序列对肠道病毒71型具有良好的特异性，见图1，可用于设计EV71病毒的特异PSR引物。

针对VP1基因序列设计两套PSR引物，共享一对加速引物，引物名称及序列如表1所示。

表1针对VP1基因序列设计的PSR引物

实施例2EV71-VP1基因人工质粒的构建及DNA模板的制备

将EV71-VP1基因序列(229bp)人工连接至pUC57-simple质粒，并导入大肠杆菌感受态中，获得阳性克隆，本克隆过程由北京华大基因完成。

将阳性克隆用无菌涂布棒挑取少量穿刺菌于5ml的LB液体培养基中，于37℃培养20h后取出，用细菌基因组提取试剂盒(天根)提取总核酸，用NanoDrop 1000测得核酸浓度为EV71-VP1基因构建菌240.0ng/μl。

实施例3EV71病毒的PSR检测

PSR反应体系采用25μl体系：包括12.5μl的2×RM，2.0μl核酸模板(EV71-VP1基因构建菌提取的总核酸)和1.0μlBstDNA聚合酶，每套引物的Ft、Bt各1.6μM，IF、IB各0.8μM，并用水补齐25μl。

PSR反应程序为65℃，60min。

实施例4引物筛选

将表1中两套引物(EV71-1、EV71-2)按比例混合完成后，作最佳引物筛选，结果如图2-3所示，结果表明第二套引物(EV71-2)先发生了PSR反应，因此EV71-2是EV71病毒的最佳PSR引物。

实施例5敏感性分析

将EV71-VP1基因构建菌DNA做梯度稀释，分别为240.0ng/μl、24.0ng/μl、2.4ng/μl、240.0pg/μl、24.0pg/μl、2.4pg/μl、0.24pg/μl，并用纯水作阴性对照。

浊度法结果如图4所示，用引物EV71-2做EV71病毒敏感性分析时，结果表明在55min内能检测到第7个梯度，即0.24pg/μl，效果良好，同时阴性对照纯水未得到扩增；图5显色法结果与浊度法结果一致。

实施例6特异性分析

取人类全血基因组与粪便基因组样本各4例作为DNA反应模板，这些样本的成分非常复杂，若通过这些样本的考核，则能说明本发明的PSR检测方法特异性良好；同时比较EV71-VP1基因和CVA16-VP1基因是否产生交叉影响。

其中构建CoxA16-VP1基因人工质粒的方法如下：

从GenBank数据库(No.AB634324.1)上下载CoxA16病毒的VP1基因，并选取其中较保守的一段序列，全长如下：

AATGCTAGTGACAAGAATCTCATTGAGACTAGATGTGTGTTGAACCATCACTCCACGCAGGAGACAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCTGGTTTGGTCAGCATCATTACAATGCCCACCACGGGTACACAGAACACAGATGGTTACGTTAATTGGGACATTGACTTGATGGGATATGCTCAGCTGCGGCGGAAATGCGAGTTGTTTACCTACATGCGCTTTGATGCTGAATTCACATTTGTCGTAGCCAAACCCAATGGTGAGCTAGTCCCCCAATTACTGCAGTACATGTATGTCCCACCAGGGGCTCC；SEQ ID NO.8。

将CoxA16-VP1基因序列(314bp)人工连接至pUC57-simple质粒，并导入大肠杆菌感受态中，获得阳性克隆，本克隆过程由北京华大基因完成。

将阳性克隆用无菌涂布棒挑取少量穿刺菌于5ml的LB液体培养基中，于37℃培养20h后取出，用细菌基因组提取试剂盒(天根)提取总核酸，用NanoDrop 1000测得核酸浓度为CoxA16-VP1基因构建菌150.0ng/μl。

特异性检测结果如图6-9所示，用PSR检测EV71病毒时，仅含有EV71-VP1基因的核酸得到PSR扩增，而成分复杂的人全血基因组与人粪便基因组样本均为阴性结果，且EV71病毒和CoxA16病毒之间无交叉扩增，说明PSR对于手足口病EV71病毒检测有着良好的特异性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种用于检测EV71病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 229

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggagataggg tggcagatgt aattgaaagt tccataggag atagcgtgag cagagccctc 60

actcaagctc taccagcgcc cacaggccag aatacacagg tgagcagtca tcgactggat 120

acaggcaagg ttccagcact ccaagctgct gagattggag catcatcaaa tgctagtgac 180

gagagcatga ttgagacacg ctgtgttctt aactcacaca gcacagctg 229

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

acctgtgtat tctggcctgt gggagatagc gtgagcagag cc 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggtgtccggt cttatgtgtc caaagaacac agcgtgtctc aa 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agtcgtcgaa cctcacgacc gagatagcgt gagcagagcc 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccagcactcc aagctgctga aagaacacag cgtgtctcaa 40

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcgctggtag agcttgagtg 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggagcatcat caaatgctag tgacg 25

<210> 8

<211> 314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

aatgctagtg acaagaatct cattgagact agatgtgtgt tgaaccatca ctccacgcag 60

gagacagcca ttgggaattt ctttagccgt gctggtttgg tcagcatcat tacaatgccc 120

accacgggta cacagaacac agatggttac gttaattggg acattgactt gatgggatat 180

gctcagctgc ggcggaaatg cgagttgttt acctacatgc gctttgatgc tgaattcaca 240

tttgtcgtag ccaaacccaa tggtgagcta gtcccccaat tactgcagta catgtatgtc 300

ccaccagggg ctcc 314

Claims

1.引物组合在制备检测EV71病毒的PSR检测试剂中的应用，其特征在于，所述引物组合的引物序列如下：

EV71-Ft2：5’-AGTCGTCGAACCTCACGACCGAGATAGCGTGAGCAGAGCC-3 ’ ； SEQ ID NO.4 ；

EV71-Bt2：5’-CCAGCACTCCAAGCTGCTGAAAGAACACAGCGTGTCTCAA-3 ’； SEQ ID NO.5 ；

EV71-IF：5’-GCGCTGGTAGAGCTTGAGTG-3’；SEQ ID NO.6；

EV71-IB：5’-GGAGCATCATCAAATGCTAGTGACG-3’；SEQ ID NO.7。

2.含有引物组合的试剂盒在制备检测EV71病毒的PSR检测试剂中的应用，其特征在于，所述引物组合的引物序列如下：

EV71-Ft2：5’-AGTCGTCGAACCTCACGACCGAGATAGCGTGAGCAGAGCC-3’；SEQ ID NO.4；

EV71-Bt2：5’-CCAGCACTCCAAGCTGCTGAAAGAACACAGCGTGTCTCAA-3’；SEQ ID NO.5；

EV71-IF：5’-GCGCTGGTAGAGCTTGAGTG-3’；SEQ ID NO.6；

EV71-IB：5’-GGAGCATCATCAAATGCTAGTGACG-3’；SEQ ID NO.7。

3.根据权利要求2所述的含有引物组合的试剂盒在制备检测EV71病毒的PSR检测试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括双指示系统和阳性对照。

4.根据权利要求3所述的含有引物组合的试剂盒在制备检测EV71病毒的PSR检测试剂中的应用，其特征在于，所述双指示系统包括显色液和/或荧光染料；所述显色液包括0.08mM甲酚红和0.02mM苯酚红；所述荧光染料为SYBR Green I或EveGreen。