CN114807451A - 一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用 - Google Patents

一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物病毒检测技术领域，具体公开一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用。检测鲤浮肿病毒的引物和探针中，内引物FIP的序列如SEQ ID NO:1，内引物BIP的序列如SEQ ID NO:2，外引物F3的序列如SEQ ID NO:3，外引物B3的序列如SEQ ID NO:4，环引物探针的序列如SEQ IDNO:5。利用本发明的引物和探针，可实现对鲤浮肿病毒的准确检测，避免非特异性扩增导致的假阳性结果的出现，最低检测限可达0.5copies/μL，更有利于鲤浮肿病毒的早期检测，从而避免疾病的扩散，对于水产疫病的防治具有十分重要的意义。

Description

一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用
技术领域
本发明涉及生物病毒检测技术领域，尤其涉及一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用。
背景技术
鲤鱼是全球养殖最广泛的鱼类，鲤浮肿病、锦鲤疱疹病毒病、鲤鱼春病毒血症是目前主要的病毒病，给世界各国养殖业造成了重大经济损失。我国于2016年首次发现鲤浮肿病毒(CEV)，具有爆发强、传染快、死亡率高等特点。2018年全国水产技术推广总站开展的水生动物疫病监测结果显示，鲤浮肿病阳性检出率为12.9％。鲤浮肿病在我国已广泛流行，其爆发后单个池塘累计死亡率高达50-80％，严重影响国内鲤科鱼类养殖行业的健康发展。
目前，国内外对鲤浮肿病毒的检测研究较少，主要CEV的检测方法为荧光PCR法、套式PCR法、琼脂糖电泳法和LAMP法等。但是，现有检测方法仍存在操作复杂、检测时间长、易因非特异性扩增产生假阳性结果等明显缺陷，极大地限制了这些方法在鲤浮肿病毒检测中的应用及推广。因此，发展一种简便、高特异性、避免假阳性检测的高灵敏度鲤浮肿病毒的快速检测方法，对早期防治鲤浮肿病毒具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有鲤浮肿病毒的检测方法存在的假阳性概率高、检测时间长、灵敏度较低等问题，本发明提供一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针及其应用，利用该检测鲤浮肿病毒的引物和探针可在恒温条件下快速检测鲤浮肿病毒，且可完全避免假阳性检测结果的出现，特异性好、灵敏度高，有利于实现对鲤浮肿病毒的早期防治，从而有效预防疾病的扩散，减少养殖户的经济损失。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针，包括：
内引物FIP：5′-GTTCATTCTCAAATGGTTGCAACACTGCCATTACGTAATTAGAATCG-3′(SEQID NO:1)；
内引物BIP：5′-AGTTGATATGCTTTTGCATTTGCAAGAAGCTCTACTTTGTCTCA-3′(SEQ IDNO:2)；
外引物F3：5′-ATGGATTTGCTGCTGGTG-3′(SEQ ID NO:3)；
外引物B3：5′-GCTTCTCAAGATATACATTACACA-3′(SEQ ID NO:4)；
环引物探针LBP：5′-GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT-3′(SEQ ID NO:5)。
相对于现有技术，本发明提供的特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针，可以特异性结合到鲤浮肿病毒的核酸上，准确检测出鲤浮肿病毒，且通过设计一条环引物，并将环引物设计为环引物探针LBP，不但减少了非特异性扩增，避免了假阳性检测结果的出现，还提高了鲤浮肿病毒的检测灵敏度，对鲤浮肿病毒的最低检测限可达0.5copies/μL。本发明提供的引物和探针，与金鱼造血器官坏死病毒、鲤鱼春病毒血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、鲤鱼疱疹病毒1型、鲤鱼疱疹病毒2型、鲤鱼疱疹病毒3型等16种病毒均无交叉扩增反应，特异性显著增强；同时，检测的效率明显提高，在63℃恒温条件下快速扩增，仅需50min就可以达到检测水平，检测时间明显缩短，对鲤浮肿病毒的疫病防控具有重要意义，可有效降低养殖户的经济损失，在水产疫病精准快速检测中具有广阔的应用市场前景。
优选的，所述环引物探针LBP为：FAM-5′-GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT-3′BHQ。
本发明还提供了一种用于特异性检测鲤浮肿病毒的试剂盒，包含上述任一项所述的引物和探针。
优选的，包括预反应液、阳性对照液和阴性对照液，其中，所述预反应液包括基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、Triton X-100、DNA聚合酶、甜菜碱、氯化镁溶液、dTNPs和去离子水。
进一步优选的，所述基础缓冲液为Tris-HCl。
进一步优选的，所述基础缓冲液为pH8.3 Tris-HCl。
进一步优选的，所述DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶和Taq DNApolymerase。
优选的，所述阴性对照液为ddH2O。
优选的，所述阳性对照液的浓度为5×104copies/μL。
需要说明的是，阳性对照液由标准质粒稀释制备得到，标准质粒根据鲤浮肿病毒全基因序列保守区域设计构建，由上海生工合成制备含重组质粒的工程菌，经发酵后参照质粒小提试剂盒(天根生化(北京)有限公司)进行质粒提取，采用超微量紫外可见分光光度计(ND-100C，MIULAB)进行质粒浓度及纯度测定。
本发明还提供利用上述试剂盒检测鲤浮肿病毒的方法，具体操作为：提取鲤浮肿病毒的核酸为模板，用所述试剂盒进行PCR扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为鲤浮肿病毒阳性；若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为鲤浮肿病毒阴性。
优选的，PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：pH8.3 Tris-HCl 20mmol，KCl10mmol，(NH4)2SO4 10mmol，Triton X-100 0.025μL，Bst DNA聚合酶8U，Taq DNApolymerase 2.5U，甜菜碱1mol，MgCl2 8mmol，dNTPs 2.0mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.25μmol，外引物B3 0.25μmol，环引物探针LBP 0.25μmol，去离子水补足至23μL。
上述优选的反应条件可进一步提高鲤浮肿病毒的检测效率。
优选的，PCR扩增的反应温度为62℃-64℃，反应时间为50min-55min。
进一步优选的，PCR扩增的反应温度为63℃，反应时间为50min。
优选的PCR扩增条件，可以提高鲤浮肿病毒的检测效率。
本发明提供的鲤浮肿病毒的检测方法操作简单，通过分析实时荧光定量PCR扩增曲线即可确定检测结果，不必用凝胶电泳方法观察，分析结果简单明确，且有效避免了假阳性检测结果的出现，检出限可达0.5copies/μL，更有利于实现鲤浮肿病毒病的早期检测，实现疾病的早期发现，有效预防疾病的扩散，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中标准品质粒的结构图；
图2是本发明实施例2中鲤浮肿病毒检测方法的特异性测试结果图；
图3是本发明实施例2中鲤浮肿病毒检测方法的敏感性测试结果图；其中，扩增曲线由左至右顺序依次为5×106copies/μL、5×105copies/μL、5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL、50copies/μL、5copies/μL和0.5copies/μL；
图4是本发明实施例2中鲤浮肿病毒检测方法的重复性测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
1.材料与方法
1.1病毒样本与试剂盒
鲤浮肿病毒(CEV)、金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)、鲤鱼春病毒血症病毒(SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、鲤鱼疱疹病毒1型(CyHV-1)、鲤鱼疱疹病毒2型(CyHV-2)、鲤鱼疱疹病毒3型(CyHV-3)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、鳗鲡疱疹病毒(HVA)、斑点叉尾鮰病毒(CCVD)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)、玻勒病毒(BIV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、虾肝肠胞虫(EHP)均由本实验室临床检测分离鉴定后保存。
1.2引物和探针的设计
根据鲤浮肿病毒特异性基因的保守序列(Sequence ID:MF326541.1)设计引物和探针，设计得到的引物序列如下，并由上海生工生化有限公司合成并标记。
内引物FIP：5′-GTTCATTCTCAAATGGTTGCAACACTGCCATTACGTAATTAGAATCG-3′(SEQID NO:1)；
内引物BIP：5′-AGTTGATATGCTTTTGCATTTGCAAGAAGCTCTACTTTGTCTCA-3′(SEQ IDNO:2)；
外引物F3：5′-ATGGATTTGCTGCTGGTG-3′(SEQ ID NO:3)；
外引物B3：5′-GCTTCTCAAGATATACATTACACA-3′(SEQ ID NO:4)；
环引物探针LBP：FAM-5′-GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT-3′BHQ。
1.3.DNA/RNA的提取
按照市售DNA提取试剂盒的使用说明书分别提取鲤浮肿病毒、金鱼造血器官坏死病毒、鲤鱼疱疹病毒1型、鲤鱼疱疹病毒2型、鲤鱼疱疹病毒3型、鳗鲡疱疹病毒、斑点叉尾鮰病毒、大鲵虹彩病毒、对虾白斑综合症病毒的DNA。
按照市售RNA提取试剂盒的使用说明书分别提取鲤鱼春病毒血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、罗非鱼湖病毒、玻勒病毒、虾肝肠胞虫的RNA。
将提取的DNA以及RNA保存于-20℃用于后续试验。
1.4标准品质粒的构建
将鲤浮肿病毒基因组的保守序列(Sequence ID:MF326541.1)重组到PUC57质粒中，得到重组质粒，如图1所示。由上海生工合成制备含重组质粒的工程菌，经发酵后参照质粒小提试剂盒(北京天根生化)进行质粒提取，采用超微量紫外可见分光光度计(ND-100C，MIULAB)进行质粒浓度以及纯度测定，标准品质粒的浓度为5×107copies/μL。
1.5检测鲤浮肿病毒方法的建立
检测鲤浮肿病毒的试剂盒包括预反应液、阳性对照液和阴性对照液，其中，所述预反应液包括基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、Triton X-100、DNA聚合酶、甜菜碱、氯化镁溶液、dTNPs和去离子水。其中，阴性对照为ddH2O，阳性对照液由标准质粒稀释制备得到，浓度为5×104copies/μL。
提取鲤浮肿病毒的核酸为模板，结合上述试剂盒构建PCR扩增反应体系(23μL)：pH8.3 Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO4 10mmol，Triton X-100 0.025μL，Bst DNA聚合酶8U，Taq DNA polymerase 2.5U，甜菜碱1mol，MgCl2 8mmol，dNTPs 2.0mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.25μmol，外引物B3 0.25μmol，环引物探针LBP 0.25μmol，去离子水补足至23μL。
向含有23μL上述反应液的反应管中加入2μL待测核酸模板，进行实时荧光定量PCR扩增检测，于63℃恒温扩增50min，分析扩增结果。
若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为鲤浮肿病毒阳性；若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为鲤浮肿病毒阴性。
实施例2
2.1检测鲤浮肿病毒的特异性试验：
按照市售DNA/RNA提取试剂盒的使用说明书分别提取取鲤浮肿病毒、金鱼造血器官坏死病毒、鲤鱼疱疹病毒1型、鲤鱼疱疹病毒2型、鲤鱼疱疹病毒3型、鳗鲡疱疹病毒、斑点叉尾鮰病毒、大鲵虹彩病毒、对虾白斑综合症病毒的DNA；鲤鱼春病毒血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、罗非鱼湖病毒、玻勒病毒、虾肝肠胞虫的RNA，作为待测样品。
可选择河北三狮生物科技有限公司的ME02B08核酸提取试剂盒提取DNA/RNA。
PCR扩增体系：pH8.3 Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO4 10mmol，TritonX-100 0.025μL，Bst DNA聚合酶8U，Taq DNA polymerase 2.5U，甜菜碱1mol，MgCl2 8mmol，dNTPs 2.0mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.25μmol，外引物B30.25μmol，环引物探针LBP 0.25μmol，去离子水补足至23μL。以ddH2O作为阴性对照，以标准品质粒的稀释液作为阳性对照，浓度为5×104copies/μL。
需要说明的是，若待测样品为RNA病毒，在上述扩增体系中加入8U StartScriptReverse Tarnscriptase即可，其他条件不变。
检测结果如图2所示，从图中可以看出，只有鲤浮肿病毒出现典型的S型扩增曲线，而其他病毒核酸均未出现扩增，证明了本发明提供的鲤浮肿病毒检测体系具有很好的特异性。
2.2检测鲤浮肿病毒的敏感性试验：
将标准品质粒(质粒浓度为5×107copies/μL)，稀释10倍(5×106copies/μL)作为测试的起始浓度。
将5×106copies/μL测试质粒依次进行7个梯度的10倍稀释，稀释至0.5copies/μL，即测试质粒的浓度分别为5×106copies/μL、5×105copies/μL、5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL、50copies/μL、5copies/μL和0.5copies/μL。以上述8个梯度浓度的测试质粒作为模板进行体系性测试，空载PUC57质粒作为阴性对照，检测结果如图3所示。
结果表明，本发明提供的检测鲤浮肿病毒方法的最低检出限浓度为0.5copies/μL(0.286fg/μL)，相关系数R2为0.995，且阴性对照没有非特异性扩增。
2.3检测鲤浮肿病毒方法的重复性验证：
将浓度为5×104copies/μL的测试质粒作为重复性检测样本，测试10个重复，通过本发明建立的鲤浮肿病毒的检测方法进行检测，结果如图4所示。
试验结果表明，重复性检测变异系数Cv值为1.52％，小于3％，表明本发明提供的特异性鲤浮肿病毒的检测方法的重复性较好。
实施例3
临床样本检测：
以水产行业标准SC/T 7229-2019的荧光PCR法为对照方法，对收集的60份鲤鱼样本按照本发明提供的鲤浮肿病毒检测方法进行平行测试，建立的检测准确率为100％(60/60)，灵敏度为100％(19/19)，特异度为100％(41/41)，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003684159710000091
对比例1
按照水产行业标准SC/T 7229-2019中的PCR法和LAMP法与本发明提供的鲤浮肿病毒检测方法进行比较。并且采用不同的提取方法提取同一初期病鲤鱼样本的核酸，比较不同检测方法的稳定性。
核酸提取方法分别采用快速提取法、抽提法、柱提法和磁珠手提法，其中，抽提法采用水产行业标准SC/T 7229-2019中的抽提法，柱提法采用河北三狮生物科技有限公司的DP201 DNA/RNA提取试剂盒(柱提法)，磁珠手提法采用河北三狮生物科技有限公司的DP301核酸提取试剂盒(磁珠法)，快速提取法采用河北三狮生物科技有限公司的ME02B08核酸提取试剂盒。按照不同方法提取的核酸均配制成相同的浓度(0.5ng/μL)。
然后分别采用SC/T 7229-2019中的PCR法和LAMP法与本发明提供的鲤浮肿病毒检测方法对提取的核酸进行实时荧光定量PCR扩增检测，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003684159710000092
Figure BDA0003684159710000101
不同核酸提取方法提取的核酸样本的杂质残留物的种类和含量均不相同，对核酸的特异性扩增影响程度也不一样。通过对比四种核酸提取方法，并通过三种不同检测方法进行荧光定量检测，通过检测结果可以看出，对于初期病鱼样本核酸，由于鲤浮肿病毒含量较低，LAMP法阴性对照与样本检测时间区别不大，无法判断是否为鲤浮肿病毒阳性样本。
本发明提供的特异性鲤浮肿病毒的检测方法对于四种不同核酸提取方法均适用。LAMP法在检测过程中有假阳性问题，PCR法虽然特异性强，但是扩增较慢，Ct值较大。
综上所述，本发明提供的特异性鲤浮肿病毒的检测方法，不但方法简便、快速，且适用性强、特异性好，能够有效改善检测中假阳性问题的出现，更有利于鲤浮肿病毒的早期检测，从而避免疾病的扩散，对于水产疫病的防治具有十分重要的意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针，其特征在于，包括：
内引物FIP：5′-GTTCATTCTCAAATGGTTGCAACACTGCCATTACGTAATTAGAATCG-3′；
内引物BIP：5′-AGTTGATATGCTTTTGCATTTGCAAGAAGCTCTACTTTGTCTCA-3′；
外引物F3：5′-ATGGATTTGCTGCTGGTG-3′；
外引物B3：5′-GCTTCTCAAGATATACATTACACA-3′；
环引物探针LBP：5′-GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT-3′。
2.如权利要求1所述的特异性检测鲤浮肿病毒的引物和探针，其特征在于，所述环引物探针LBP为：FAM-5′-GCAACAACTTGACGAGGGAATGAT-3′BHQ。
3.一种用于特异性检测鲤浮肿病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的引物和探针。
4.如权利要求3所述的用于特异性检测鲤浮肿病毒的试剂盒，其特征在于，包括预反应液、阳性对照液和阴性对照液，其中，所述预反应液包括基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、Triton X-100、DNA聚合酶、甜菜碱、氯化镁溶液、dTNPs和去离子水。
5.如权利要求4所述的用于特异性检测鲤浮肿病毒的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液为ddH2O。
6.如权利要求4所述的用于特异性检测鲤浮肿病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液的浓度为5×104copies/μL。
7.利用权利要求3所述的试剂盒检测鲤浮肿病毒的方法，其特征在于，具体操作为：提取鲤浮肿病毒的核酸为模板，用所述试剂盒进行进行实时荧光定量PCR扩增检测。
8.如权利要求7所述的检测鲤浮肿病毒的方法，其特征在于：PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：pH8.3 Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO410mmol，Triton X-100 0.025μL，Bst DNA聚合酶8U，Taq DNA polymerase 2.5U，甜菜碱1mol，MgCl2 8mmol，dNTPs2.0mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.25μmol，外引物B3 0.25μmol，环引物探针LBP 0.25μmol，去离子水补足至23μL。
9.如权利要求7所述的检测鲤浮肿病毒的方法，其特征在于：PCR扩增的反应温度为62℃-64℃，反应时间为50min-55min。
10.如权利要求9所述的检测鲤浮肿病毒的方法，其特征在于：PCR扩增的反应温度为63℃，反应时间为50min。
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