CN113337637B

CN113337637B - 一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组和试剂盒

Info

Publication number: CN113337637B
Application number: CN202010099653.5A
Authority: CN
Inventors: 林峻
Original assignee: Etta Biotech Co Ltd
Current assignee: Etta Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-02-18
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2040-02-18
Also published as: CN113337637A

Abstract

本发明公开了一种分子检测SARS‑CoV‑2冠状病毒的引物组和试剂盒，所述引物组包括6种引物A1‑A6，其序列如SEQ.ID.NO.1‑6所示。本发明的检测对象，是病毒RNA和人类RNA的混合物，更加吻合临床采集到的标本的实际情况。本发明采用等温扩增的方式进行，无需严格的PCR实验室和昂贵的PCR仪器，成本低，易于在基层和现场操作，便于普及，操作难度小，普通的非本专业人员，经过简单培训即可上手。对于结果的判读，仅需肉眼观察液体是否浑浊（或者采用荧光法、变色法等），非常简易，无需复杂的数据分析或者检测机器。另外，对于RNA的逆转录和PCR扩增，都在一管内同时且等温进行，无需单独先做逆转录，属于一步法检测。

Description

一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组和试剂盒。

背景技术

SARS-CoV-2病毒是一种RNA病毒，对其进行核酸分子检测，传统的做法是需要提取其RNA，然后将RNA逆转录成cDNA，之后使用荧光定量PCR技术，对cDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测。但是该传统做法，需要严格的PCR实验室，以及昂贵的荧光定量PCR仪，对硬件设施要求高，限制了其在基层和现场推广应用，只能在专业的医学检验机构内进行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组和试剂盒，采用该试剂盒，无需PCR仪器设备，无需专业的PCR实验室，可以简易地在恒定温度下，对待测病毒RNA进行扩增和特异性检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组，其由下列6组引物组成：

A1：CTTTCTTTTCCAATGTTACTTGG；

A2：GACTTTAATAACAACATTAGTAGCG；

A3：CATCATTAAATGGTAGGACAGGGTTTTCCATGCTATACATGTCTCTG；

A4：TGCTTCCACTGAGAAGTCTAACAGGACTGGGTCTTCGAATC；

A5：CAAACCTCTTAGTACCATTGGTCC；

A6：TAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTAC。

基于上述引物组的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒，其包括：

引物A1-A6；

待测的RNA 1μL；

高纯水，补至总体积25μL。

所述引物A1、A2、A3、A4、A5、A6的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、 1.6μM、1.6μM、0.4μM、0.4μM。

进一步的，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品：通过人工合成SARS-CoV-2病毒基因组中如SEQ.ID.NO.15所示序列全长DNA，并通过体外转录，制备其RNA，并使用DNA酶消化RNA制备过程中残留的 DNA污染，并使用该序列的特异性引物进行qPCR质检，确认无DNA残留，最后所得的RNA；所述阳性质控品由来自于人类293T细胞的total RNA进行稀释；

所述阴性质控品：来自于人类293T细胞的total RNA。

基于本发明所述试剂盒的的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的检测方法：将试剂盒内各个成分混合，放置于65℃恒温设备(如水浴锅，恒温箱，金属浴，等等)，每隔5分钟观察一次，若样品管由澄清透明的液体变成浑浊液体，表示检出待测病毒核酸。

本发明采用以上技术方案，其优势在于：本发明的检测对象，是病毒RNA 和人类RNA的混合物，更加吻合临床采集到的标本的实际情况。本发明采用等温扩增的方式进行，无需严格的PCR实验室和昂贵的PCR仪器，成本低，易于在基层和现场操作，便于普及，操作难度小，普通的非本专业人员，经过简单培训即可上手。对于结果的判读，仅需肉眼观察液体是否浑浊(或者采用荧光法、变色法等)，非常简易，无需复杂的数据分析或者检测机器。另外，对于RNA 的逆转录和PCR扩增，都在一管内同时且等温进行，无需单独先做逆转录，属于一步法检测。

附图说明

图1为本发明的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

通过序列分析，发现SARS-CoV-2病毒基因组中的以下序列(SEQ.ID.NO.15)，与目前已知的任何序列都没有相似性，是理想的作为SARS-CoV-2病毒核酸分子检测的靶标区域。

通过人工合成该序列全长DNA，并通过体外转录，制备其RNA，并使用 DNA酶消化RNA制备过程中残留的DNA污染，并使用该序列的特异性引物，进行qPCR(只加Taq DNA聚合酶，不加逆转录酶)，检测所得RNA中是否有残留的DNA存在。质检通过的RNA作为后续实验的阳性质控品。

由于临床上采集的人类来源的病毒标本(比如痰液，肺泡灌洗液，等等)，通常都有人类细胞和人类核酸混在一起，不可能是纯病毒标本，因此，要充分考虑混杂的人类RNA对于检测的干扰。申请人采用从293T人类细胞预先提取的 total RNA，将其稀释为100ng/μL的水溶液，然后，用其对病毒RNA阳性质控品进行稀释。

合成以下检测引物：

反应体系：

6种引物(A1-A6)，依据各自的终浓度加入本体系。

待测的RNA 1μL

高纯水，补至总体积25μl。

将上述各个成分混合，放置于65℃水浴锅，每隔5分钟观察一次。查看样品管是否由澄清透明的液体变成浑浊液体。若管内液体变浑浊，表示有检出待测病毒核酸。

如图1所示，65℃水浴前后的管子分别如图1左侧和右侧所示，左侧是澄清透明的管子，右侧是浑浊的管子，表示检测出了病毒。

本发明制备的RNA阳性质控品，在100ng/μL的人类RNA溶液中，稀释成 1.0X10⁷copies/mL、1.0X 10⁶copies/mL、1.0X 10⁵copies/mL、1.0X 10⁴copies/mL、 1.0X10³copies/mL这5种不同浓度梯度的病毒RNA阳性质控品。变浑浊耗时分别为5分钟，5分钟，10分钟，15分钟，25分钟。

对比例：

将上述反应体系中的引物A1—A6(A组)，替换为引物B1—B4(B组)，或者引物C1—C4(C组)，进行对比试验。关于A组有6条引物，而B和C组只有4条引物的说明如下：6条引物的效果是最好的，根据引物设计规则，在待测序列上，能够设计到6条引物的，只有A组；B和C组都只能设计出4条引物。

(1)替换为B组时：

本发明制备的RNA阳性质控品，在100ng/μL的人类293T细胞的total RNA 溶液中，稀释成1.0X 10⁷copies/mL、1.0X 10⁶copies/mL、1.0X 10⁵copies/mL、 1.0X 10⁴copies/mL、1.0X 10³copies/mL这5种不同浓度梯度的病毒RNA阳性质控品。变浑浊耗时分别为15分钟，15分钟，20分钟，30分钟，30分钟后仍然不变浑浊。

(2)替换为引物C组时：

本发明制备的RNA阳性质控品，在100ng/μL的人类293T细胞的total RNA 溶液中，稀释成1.0X 10⁷copies/mL、1.0X 10⁶copies/mL、1.0X 10⁵copies/mL、 1.0X 10⁴copies/mL、1.0X 10³copies/mL这5种不同浓度梯度的病毒RNA阳性质控品。变浑浊耗时分别为25分钟，25分钟，30分钟，30分钟后仍然不变浑浊，30分钟后仍然不变浑浊。

以上对比例说明，采用A组引物的效果最好。

序列表

<110> 福州大学

<120> 一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组和试剂盒

<130> 2020

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctttcttttc caatgttact tgg 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactttaata acaacattag tagcg 25

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catcattaaa tggtaggaca gggttttcca tgctatacat gtctctg 47

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcttccact gagaagtcta acaggactgg gtcttcgaat c 41

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaacctctt agtaccattg gtcc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taagaggctg gatttttggt actac 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggacttgt tcttaccttt c 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttattaacaa taagtaggga ctgg 24

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggacagggt tatcaaacct cttagcaatg ttacttggtt ccatgc 46

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgatggtgt ttattttgct tccacaagta gtaccaaaaa tccagc 46

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtctctggga ccaatggt 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacacccaa aaatggatca 20

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttagacttct cagtggaagc aaaatctaag aggtttgata accctgtc 48

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actactttag attcgaagac ccagtgactt taataacaac attagtagcg 50

<210> 15

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctcagtttt acattcaact caggacttgt tcttaccttt cttttccaat gttacttggt 60

tccatgctat acatgtctct gggaccaatg gtactaagag gtttgataac cctgtcctac 120

catttaatga tggtgtttat tttgcttcca ctgagaagtc taacataata agaggctgga 180

tttttggtac tactttagat tcgaagaccc agtccctact tattgttaat aacgctacta 240

atgttgttat taaagtctgt gaatttcaat tttgtaatga tccatttttg ggtgtttatt 300

accacaaaaa caacaaaagt tggatggaaa gtgagttcag agtttattct agtgcgaata 360

attgcacttt tgaatatgtc tctcagcctt ttcttatgga ccttgaagga aaacagggta 420

atttcaaaaa tcttagggaa tttgtgttta agaatattga tggttatttt aaaatatatt 480

ctaagcacac gcctattaat ttagtgcgtg atctccctca gggtttttcg gctttagaac 540

cattggtaga tttgccaata ggtattaaca tcactaggtt tcaaacttta cttgctttac 600

atagaagtta tttgactcct ggtgattctt cttcaggttg gacagctggt gctgcagctt 660

attatgtggg ttatcttcaa cctaggactt ttctattaaa atataatgaa aatggaacca 720

ttacagatgc tgtagactgt gcacttgacc 750

Claims

1.一种分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的引物组，其特征在于：其由下列6组引物组成：

A1：CTTTCTTTTCCAATGTTACTTGG；

A2：GACTTTAATAACAACATTAGTAGCG；

A3：CATCATTAAATGGTAGGACAGGGTTTTCCATGCTATACATGTCTCTG；

A4：TGCTTCCACTGAGAAGTCTAACAGGACTGGGTCTTCGAATC；

A5：CAAACCTCTTAGTACCATTGGTCC；

A6：TAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTAC。

2.一种基于权利要求1所述引物组的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒，其特征在于：其包括：

Bst DNA聚合酶 0.1U/μL；

10X Bst聚合酶反应缓冲液 2.5μL；

逆转录酶 0.1U/μL；

dNTPs 0.8mM；

引物A1-A6；

待测的RNA 1μL；

高纯水，补至总体积25μL。

3.根据权利要求2所述的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述引物A1、A2、A3、A4、A5、A6的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、1.6μM、1.6μM、0.4μM、0.4μM。

4.根据权利要求2所述的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒，其特征在于：其还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品：通过人工合成SARS-CoV-2病毒基因组中如SEQ.ID.NO.15所示序列全长DNA，并通过体外转录，制备其RNA，并使用DNA酶消化RNA制备过程中残留的DNA污染，并使用该序列的特异性引物进行qPCR质检，确认无DNA残留，最后所得的RNA；

所述阴性质控品：来自于人类293T细胞的total RNA。

5. 根据权利要求4所述的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品由来自于人类293T细胞的total RNA进行稀释。

6.一种基于权利要求2所述试剂盒的非疾病诊断目的的分子检测SARS-CoV-2冠状病毒的检测方法，其特征在于：将试剂盒内各个成分混合，放置于65℃恒温设备，每隔5分钟观察一次，若样品管由澄清透明的液体变成浑浊液体，表示检出待测病毒核酸。