CN111378724A - 一种rna放大检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种RNA放大检测方法及检测试剂盒，属于生物技术方法领域。检测方法包括RNA试样制备，向RNA试样中加入核酸提取液进行核酸提取获得待测样品RNA，向待测样品RNA中分步加入第一步反应液、酶液和第二步反应液等步骤，即可定量或定性检测待测样品RNA，还公开了用于RNA定量和定性检测的RNA放大检测试剂盒。本发明提供的方法和试剂盒具有体系兼容性好、扩增效率高、检测灵敏度高、准确度高、检测速度快的优点，适用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域中的核酸检验。

Description

一种RNA放大检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术方法领域，具体涉及一种RNA放大检测方法及检测试剂盒。
背景技术
RNA包括mRNA、miRNA、rRNA、tRNA，都参与了基因表达、基因调控和代谢调控等。有着生命活动的生物内都会有大量的RNA，因此，RNA也是活体细胞、细菌等的标志。RNA在细胞、细菌等生命体内的拷贝数远高于DNA的拷贝数，且某些RNA具有高度保守性可以作为物种鉴定标识物，因此RNA可用于物种的鉴别诊断，提高检测灵敏度。另外随着生命科学的发展，发现大量的RNA参与疾病的发生、发展及调控，因此RNA又成为新的疾病诊断、疗效监测及预测的分子标识。
RNA具有稳定性差，易降解的普遍特点，部分小RNA还具有片段短，样本制备难度大的缺点，导致RNA检测很困难。为解决这些难题，近年来已经建立了多种RNA检测方法。
Northern Blots是最早建立的RNA检测方法。其主要原理是利用标记的寡核苷酸探针与结合在硝酸纤维素膜上的目标RNA互补杂交，然后显影检测。这种方法一直被认为是标准方法，但是存在费时费力、灵敏度低，样品量大、效率低等缺点。
逆转录-定量PCR(RT-qPCR)是目前检测低表达水平RNA的主要方法之一。该方法首先将RNA反转录成相应的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR。但由于RNA易降解的特点，仍存在提取纯化RNA过程复杂，操作要求高，灵敏度低，繁琐耗时长的问题，限制了其临床应用。现有技术中已经建立的多种RNA检测方法均存在诸多缺陷。并且，当病原体存在多种亚型或者是需要同时联检多种相关病原体时，使用现有技术方法存在一个反应系统中多对引物会对体系产生抑制作用，影响扩增效率等问题，制约了检测效率的提高，因此这种复杂的体系的灵敏度往往很难提高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种RNA放大检测方法，包括以下步骤：
1)将含有待测样品RNA、引物、探针、荧光探针和相关聚合酶的反应物混合为反应混合物；
2)将反应混合物置于密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，定量或定性检测待测样品RNA。
上述反应混合物包含以下组分：
a.待测样品RNA；
b.第一引物：所述第一引物的序列包含启动子序列和共同引物序列，其中所述共同引物序列为与所述待测样品RNA非同源的序列；可选的，所述启动子序列为T7启动子序列，所述T7启动子序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:33所示；可选的，所述第一引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示；
c.探针A：所述探针A的3’端序列为与待测样品RNA特异性结合的序列，5’端序列为所述第一引物的序列；
d.探针B：作为第二引物，其序列与所述待测样品RNA序列一致；
e.荧光探针，用于与所述恒温放大反应产物结合；
f.逆转录酶；和
g.识别所述启动子序列的RNA聚合酶；
优选的，还包含：
h.含有特异性捕获探针的固相支持物，所述特异性捕获探针用于捕获待测样品RNA。
上述待测样品RNA的获得方法包括以下步骤：
11)RNA试样制备；
12)向所述RNA试样中添加核酸提取液，混匀后进行提取，获得待测样品RNA；其中所述核酸提取液包含探针A和含有特异性捕获探针的固相支持物，所述探针A用于与所述待测样品RNA特异性结合，以引入第一引物序列；
具体地，步骤12)中所述固相支持物为磁性颗粒，所述提取的流程具体为：
121)向所述RNA试样中添加所述核酸提取液，混匀后在55-95℃下孵育8-12min，室温静置至提取液混合物恢复到室温，磁力架上吸磁至少1min，弃上清；
122)加入洗涤液(HEPES 10mM，NaCl 50mM，1％SDS，EDTA 5mM)重悬磁性颗粒，磁力架上吸磁1-3min，弃上清；
123)重复步骤122)，获得待测样品RNA。
上述的RNA放大检测方法中，步骤1)中所述反应混合物的获得方法具体包括以下步骤：
T1)第一步反应混合：向所述待测样品RNA中加入第一步反应液和酶液进行反应，获得第一步反应产物，其中所述第一步反应液包含第二引物，所述酶液中含有逆转录酶和识别所述启动子序列的RNA聚合酶；优选第一步反应条件为：37-45℃下反应3-10min；
T2)第二步反应混合：向所述第一步反应产物中加入第二步反应液，获得反应混合物，其中所述第二步反应液包含第一引物和荧光探针。
上述的RNA放大检测方法中，步骤2)中所述恒温放大反应的条件为：37-45℃下反应20-60min。
上述第一步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl2，0.1-10mM NTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第二引物；所述第二步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl2，0.1-10mM NTPS，0.1-10mMdNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第一引物，0.01-2μM荧光探针；所述酶液的组分为：100-9000U逆转录酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％TritonX-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油；优选地，所述第一步反应液、酶液与所述第二步反应液的用量体积比为(2-3)：(1-2)：(2-3)。
上述荧光探针选自以下任意一种：分子信标、荧光共振、蝎子探针、荧光放大和分子火炬。
上述待测样品RNA为miRNA或非miRNA，其中所述非miRNA包括mRNA、rRNA和tRNA。
本发明另一方面还提供一种RNA放大检测试剂盒，其包含上述的RNA放大检测方法中述及的b-g组分。
上述的RNA放大检测试剂盒还包含上述的RNA放大检测方法中述及的试剂；各组分与试剂形成的溶液形式包括有：
核酸提取液：其包含探针A和上述RNA放大检测方法中述及的h组分即含有特异性捕获探针的固相支持物；
第一步反应液：其包含第二引物；
酶液：其包含逆转录酶和识别所述启动子序列的RNA聚合酶；和
第二步反应液：其包含第一引物和荧光探针。
上述RNA放大检测试剂盒中，第一步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mMKCl，10-50mM MgCl2，0.1-10mM NTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第二引物；第二步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl2，0.1-10mMNTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第一引物，0.01-2μM荧光探针；酶液的组分为：100-9000U逆转录酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％TritonX-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油。
上述的RNA放大检测方法或上述的RNA放大检测试剂盒在临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测中的核酸检测中的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案的RNA放大检测方法采用逆转录酶和RNA聚合酶与分子信标(Molecular Beacon)、荧光共振(iFret，Fret)，蝎子探针(Scorpionprobe)、荧光放大(Amplifluor)或分子火炬技术(Molecular Torch)等荧光检测技术相结合，将待测RNA样品、两种引物、逆转录酶、RNA聚合酶以及一种或组合荧光探针分步和/或混合共同反应，并在核酸恒温放大的同时，实现对核酸样本的同步定性或定量检测。其基本原理参见图1所示，探针A先识别待测RNA的3’端，在逆转录酶作用下反转录成RNA/DNA杂合链，并引入了第一引物的序列(含有启动子序列)。逆转录酶同时水解杂合链上的RNA，此时探针B(含有第二引物)识别新合成链上的序列，在逆转录酶作用下，合成双链DNA，并引入了第二引物位点。RNA聚合酶识别引入的第一引物的启动子序列，转录出包含有待测样品RNA、第一引物和第二引物序列的RNA。第一引物、第二引物以新转录出来的RNA为模板进行恒温同步放大，扩增出更多的待测样品RNA的负链，在反应体系中存在的与待测样品RNA负链互补的荧光探针，随着待测样品RNA的负链的增加，与之杂交互补的荧光探针的数量也不断增加，用检测仪同步检测反映体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对待测样品RNA进行定量或定性检测。具体地，其反应过程参见图2所示，在核酸提取过程中加入探针A，探针A的3’端可与待测样品RNA杂交，探针A的5’端为第一引物的序列，该第一引物的序列包含启动子序列和共同引物序列；同时，待测样品RNA的5’端被含有特异捕获序列(捕获探针)的固相支持物结合捕获，通过洗涤，去除过多的探针A和其他杂质，从而获得待测样品RNA。接下来的扩增反应分为两个步。第一步：含有第二引物的第一步反应液和酶液等相关反应原料加入，在逆转录酶作用下，探针A结合的预扩增体开始延伸，形成一条含有待测样品RNA序列和探针A序列的cDNA，接着此cDNA链上的RNA链在逆转录酶的RNaseH作用下水解成新链，加入的第二引物以新链为模板进行延伸，生成含有探针A序列的双链DNA。此双链DNA含有新引入的与待测样品RNA非同源的共同引物序列和启动子序列，也就是第一引物的序列。RNA聚合酶识别启动子，转录出含有待测样品RNA和共同引物序列的转录子。第二引物再以转录出来的转录子为模板，合成含有待测样品RNA和共同引物序列的cDNA，该cDNA是没有启动子序列的。同样的，该cDNA上的RNA链也被逆转录酶的RNaseH作用下水解，获得单链cDNA(第一产物)，该单链cDNA含有待测样品RNA的负链和共同引物序列。由于此时反应体系中没有第一引物，所以第一步反应到此停止。第二步：向第一步反应体系中加入第一引物和荧光探针，第一引物识别第一步反应体系中的单链cDNA(即第一产物)上的共同引物序列，在逆转录酶作用下延伸，生成含有启动子的DNA双链，在RNA聚合酶作用下，转录出含有待测样品RNA的RNA转录子(第二产物)，这些RNA转录子被特异性荧光探针识别，并发出荧光信号。同时第二引物以RNA转录子(即第二产物)为模板进行下一轮的模板(即第一产物)合成。用检测仪(可以选用ABI7000、7300、7500、7700、7900系列，StratagenMPX3000系列或BaradiQ系列、全自动核酸检测分析系统(AutoSAT))同步检测反映体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对待测RNA样品进行定量或定性检测。基于以上原理，本发明还提供了可以针对不同的待测样品RNA设计的RNA放大检测，满足不同待测样品RNA检测的需要。与现有技术相比，本发明提供的RNA放大检测方法具有以下有益效果：
1)通过引入扩增效率很高的共同引物序列，并使用两步法的扩增反应，不仅大大减少体系内组分的相互影响，提高了检测灵敏度，并且针对存在多对引物的复杂反应体系，本发明在第二步反应中仅使用一条含有共同引物序列的第一引物，因此大大减少多对引物对体系的干扰，还避免了多对引物之间的交叉反应，大大提高了体系的扩增检测效率，因此本发明的方法更加适用于低含量RNA的检测，并且检测准确度高，成本低；
2)本发明的方法无需提纯RNA，因此耗时更短，效率更高；
3)检测对象为RNA，只有活的细胞才有RNA，因此本发明提供的方法可以用于检测活的病原体；
4)最后的扩增产物为RNA，容易降解；
5)由于本发明提供的方法在两步反应过程中均采用封闭式恒温扩增，各自过程无需打开盖子，因而避免了扩增产物的污染。
6)快速检测：在第二步的反应中，将RNA的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降温循环，因而所需时间大大降低。
综上所述，本发明提供的检测方法具有反应体系扩增效率高、检测灵敏度高、检测速度快、准确度高的优点，适用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域中的核酸检验，适合大面积推广和应用。
附图说明
图1为本发明的RNA放大检测方法的原理图；
图2为本发明的RNA放大检测方法的反应过程图；
图3为检测百日咳ptxA的对照组结果；
图4为检测百日咳ptxA的试验组结果；
图5为多重扩增检测HPV18、45、39、68、59亚型的对照组结果；
图6为多重扩增检测HPV18、45、39、68、59亚型的试验组结果。
具体实施方式
针对现有技术中存在的RNA检测方法存在的诸多缺陷，本发明采用的RNA放大检测方法，利用一条具有共同序列的引物，结合逆转录酶、RNA聚合酶以及荧光标记探针，实现对RNA的高效扩增和快速检测，其检测灵敏度高且该方法为恒温扩增检测，更加容易实现自动化检测，适用于大范围推广与应用。
以下结合具体实施方式和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物和荧光探针用已有技术合成。
本发明提及的样品RNA的提取采用特异性磁珠捕获提取的方法。本申请提供的方法可用于对miRNA和非miRNA进行检测，其中非miRNA包括rRNA、tRNA、mRNA等。样品可以为临床检验样品(如用于在产检时检测B族链球菌、皮肤感染时检测金黄色葡萄球菌等的检测)、血液样品、动植物组织样品、食品样品(如用于检测大肠埃希菌、沙门氏菌、志贺氏菌等常见的食品致病微生物)及环境监测样品(如用于检测粪便污染的粪大肠菌群、粪链球菌等)等。
以下试剂以及聚合酶可用于本发明：
Tris、TritonX-100、KCl、MgCl2、NTPS、dNTPs、EDTA、DTT、甘油、DMSO、逆转录酶和RNA聚合酶等，其中：
第一步反应液的组分为：50mM Tris，35mM KCl，20mM MgCl2，4mM NTPS，1mMdNTPs，10％(V/V)甘油，5％(V/V)DMSO，0.3μM第二引物(与待测样品RNA序列一致)；
第二步反应液的组分为：50mM Tris，35mM KCl，20mM MgCl2，4mM NTPS，1mMdNTPs，10％(V/V)甘油，5％(V/V)DMSO，0.3μM第一引物(包含共同引物序列和T7启动子序列)，0.2μM荧光探针(可与扩增产物RNA互补结合)；其中第一引物的核苷酸序列为：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA(SEQ ID NO:33)+(Xn)-3’(其中下划线部分为T7启动子序列，(Xn)为与模板RNA不同源的人工合成序列，作为共同引物序列，共同引物序列一般长度在15-40bp，含有共同引物序列的引物需要满足一般引物设计的要求，例如自身不存在连续4个以上互补碱基，3’端无二级结构；两条引物间同源性≤6个碱基；G-C含量保持在40％-60％)；
酶液为：2000U逆转录酶(例如MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶，美国RD BioSciences公司)，2000U T7 RNA聚合酶(美国RD BioSciences公司)，20mM Tris，0.5％(V/V)TritonX-100，30mM KCl，0.1mM EDTA，0.3mM DTT，25％(V/V)甘油。
实施例1：miRNA的检测
1.1、miRNA的提取
1.2、反应体系
第一阶段反应混合物的组分：50mM Tris，35mM KCl，20mM MgCl2，4mM NTPS，1mMdNTPs，10％(V/V)甘油，5％(V/V)DMSO，0.5Μm第一引物(3’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACA-5’(SEQ ID NO:1))，0.5μM第二引物(3’-ATACACATATAAGAAATTGGAG-5’(SEQ ID NO:2))，0.5μM探针A，0.5μM探针B，0.5μM分子信标。
第二阶段反应混合物的组分：2000U MMLV反转录酶(美国RDBioSciences公司)，2000U T7 RNA聚合酶(美国RDBioSciences公司)，20mM Tris，0.5％(V/V)Triton X-100，30mM KCl，0.1mM EDTA，0.3mM DTT，25％(V/V)甘油。
1.3、检测
先将除反应酶外的第一阶段反应混合物充分混合，再将50μl第一阶段反应混合物加入到200ul的PCR反应管(平行做四管)中，然后加入提取的待测样品miRNA充分混合，在60℃(55-90℃均可)下温育5min(2-30min均可)后，再在42℃(42-55℃下)下温育5min(2-30min)，在此过程中加入10ul第二阶段反应混合物，由此开始在42℃(42-55℃均可)下继续温育60min(30-120min均可)，用上海宏石实时荧光定量PCR(Slan)仪同步检测，荧光信号每隔1分钟收集一次，记录荧光信号的变化量。
1.4、结果
荧光信号的检测结果表明本发明的方法可用于miRNA的扩增与定性或定量的同步检测。并且该方法具有污染低、反应过程温度恒定、检测灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点。
实施例2：非miRNA的检测
参考实施例1的操作，对非miRNA，包括rRNA、tRNA、mRNA进行检测，结果表明本发明的方法可用于对非miRNA的扩增与定性或定量的同步检测。并且该方法具有污染低、反应过程温度恒定、检测灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点。
实施例3：检测百日咳ptxA
3.1、RNA提取
该实施例中采用百日咳杆菌Cs菌株(中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号CMCC58003)细菌培养物进行提取待测RNA，获得RNA待测样本，对该RNA待测样本进行稀释获得RNA样本浓度分别为105、104、103、102copies/反应的RNA试样。
配制核酸提取液，其中对照组的核酸提取液包含含有特异性捕获探针5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGAATACGCGATGCTTTC-3’(SEQ ID NO:3)的poly T修饰磁珠(固相支持物)；试验组的核酸提取液包含探针A和含有特异性捕获探针(SEQ ID NO:3)的固相支持物(如上所述)，其中探针A的3’端序列为与待测RNA特异性结合的序列，5’端为第一引物序列，即探针A的核苷酸序列为：
Figure BDA0002342219110000081
CCTTCGCGATGTGTAGG-3’(SEQ ID NO：4，其中下划线部分为第一引物序列，第一引物序列中双下划线斜体部分为T7启动子序列，单下划线部分为共同引物序列)。
分别取对照组和试验组核酸提取液200μl，分别加入250μl的RNA试样(样本浓度分别为105、104、103、102copies/反应)，混匀后进行提取，提取流程为：60℃10min，室温静置10min，磁力架上吸磁2min，弃上清；加入1ml洗涤液(HEPES 10mM，NaCl 50mM，1％SDS，EDTA5mM)重悬，磁力架上吸磁2min，弃上清；加入1ml洗涤液重悬，磁力架上吸磁2min，弃上清。分别获得对照组和试验组待测样品RNA。
3.2、对照组检测扩增：向对照组待测样品RNA中加入扩增检测液30μL(50mM Tris，35mM KCl，20mM MgCl2，4mM NTPS，1mM dNTPs，10％(V/V)甘油，5％(V/V)DMSO，0.2μM T7-1引物、0.2μM第二引物、0.2μM荧光探针)，60℃预热10min，42℃恒温5min，加入酶液10μL，放入实时荧光PCR仪，42℃反应40min，进行实时扩增检测。其中T7-1引物序列：AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATACGGACCTTCGCGATGTGTAGG-3’(SEQ ID NO:5，其中斜体部分为T7启动子序列)，第二引物序列：5’-GCAGGGTAACGCGGGTCT-3’(SEQ ID NO:6)，荧光探针序列：5’FAM-CGGAGGTATTCCAACGCTCGCTCCG-Dabcyl 3’(SEQ ID NO:7)。
3.3试验组扩增检测：
向试验组待测样品RNA中加入45μl第一步反应液组分和25μl酶液，其中第二引物序列为5’-GCAGGGTAACGCGGGTCT-3’(SEQ ID NO:6，与模板RNA序列一致的引物)，在42℃下反应5min。然后加入35μl第二步反应液(含第一引物(即T7启动子序列和共同引物序列)5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACA-3’(SEQ ID NO:1)+荧光探针(SEQ ID NO:7))，42℃反应40min，用实时荧光定量PCR仪同时进行实时扩增检测。
结果如图3和图4所示，其中图3示出了对照组的实时荧光检测结果，图4示出了试验组的实时荧光检测结果，其中1-4分别表示模板浓度为105、104、103、102copies/反应的扩增曲线，5为阴性对照；由图3和图4示出的结果可知，试验组检测核酸的灵敏度可达102copies/反应，对照组仅能达到103copies/反应，可见试验组的检测灵敏度显著高于对照组的检测灵敏度。对照组为普通的RNA恒温扩增方法，该检测结果表明该实施例所使用的方法比常规检测方法的灵敏度显著提高1个数量级。
实施例4：多重扩增检测HPV的多个亚型
在该实施例中同时对HPV18、45、39、68、59亚型进行多重检测，具体包括以下步骤：
4.1、制备RNA试样
该实施例分别用体外转录的HPV18、45、39、68、59的E6&E7 mRNA作为待检RNA样本，稀释RNA样本浓度至1000拷贝/mL，作为RNA试样。
配制核酸提取液，其中对照组的核酸提取液包括含有每个亚型的特异性捕获探针的poly T修饰磁珠(固相支持物)和每个亚型的特异性T7-1引物，其中针对HPV18、45、39、68、59的特异性捕获探针分别为：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAATCTTTAAATGCAAATTCAAATACCTC-3’(HPV18，SEQ ID NO:8)；
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATAAATCACTAAATGCAAATTCATATACCTC-3’(HPV45，SEQ ID NO:9)；
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAATCTTTAAAAGCAAATTGATATACCTC-3’(HPV39，SEQ ID NO:10)；
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGTCATTAAAAGCAAATTCAAATACCTC-3’(HPV68，SEQ ID NO:11)；
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGTCACCAAAGGCAAATTCATATACCTC-3’(HPV59，SEQ ID NO:12)；
针对HPV18、45、39、68、59亚型的特异性T7-1引物为与各亚型待测样品RNA特异性结合的T7引物，具体核苷酸序列为：
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACACAAAGGACAGGGTGTTCAG-3’(HPV18，SEQ IDNO:13)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAATCCTAGTGAGTCCAT-3’(HPV45，SEQ ID NO:14)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACACACAAAGGACAAGGTGCTCAA-3’(HPV39，SEQ IDNO:15)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGCTGCTGTAAGGCTCGCAA-3’(HPV68，SEQ IDNO:16)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATAAACAGCAGTTCTAGCTTCCGC-3’(HPV59，SEQ IDNO:17)。
试验组的核酸提取液包括含有针对每个亚型的特异性捕获探针(针对各个亚型的特异性捕获探针的核苷酸序列如上SEQ ID NO:8-12所述)的poly T修饰磁珠(固相支持物)和针对每个亚型的特异性探针A(以下SEQ ID NO:18-22所示)，其中探针A的3’端可与待测RNA的5’端或靠近5’端处杂交，5’端为第一引物序列，即探针A的核苷酸序列为可与待测RNA的5’端或靠近5’端处杂交的序列+第一引物序列(共同引物序列+T7启动子序列)，其中试验组中针对不同亚型的探针A的具体核苷酸序列如下所：
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACACACAAAGGACAGGGTGTTCAG-3’(其中下划线为第一引物序列，HPV18，SEQ ID NO:18)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACACAAATCCTAGTGAGTCCAT-3’(其中下划线为第一引物序列，HPV45，SEQ ID NO:19)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACACACACAAAGGACAAGGTGCTCAA-3’(其中下划线为第一引物序列，HPV39，SEQ ID NO:20)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACACAGCTGCTGTAAGGCTCGCAA-3’(其中下划线为第一引物序列，HPV68，SEQ ID NO:21)；
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTCATGTTGTTTGTCTATTGTACATAAACAGCAGTTCTAGCTTCCGC-3’(其中下划线为第一引物序列，HPV59，SEQ ID NO:22)。
分别取对照组和试验组核酸提取液200μl，分别加入250μl的RNA试样(浓度为1000拷贝/mL)，混匀后进行提取，提取流程为：60℃10min，室温静置10min，磁力架上吸磁2min，弃上清；加入1ml洗涤液重悬，磁力架上吸磁2min，弃上清；加入1ml洗涤液重悬，磁力架上吸磁2min，弃上清。分别获得对照组和试验组待测样品RNA。
4.2、分别向对照组和试验组待测样品RNA中加入40μl第一步反应液组分和25μl酶液，其中针对不同亚型的第二引物序列为以下SEQ ID NO:23-27所示，在42℃下反应5min。
5’-GTCACACAATGTTGTGTATG-3’(HPV18，SEQ ID NO:23)；
5’-TGTGTGTGTGTGTTGTAAGT-3’(HPV45，SEQ ID NO:24)；
5’-CCGACGAGCCGAACCACAGC-3’(HPV39，SEQ ID NO:25)；
5’-CTTACAATGAAATACAGCCG-3’(HPV68，SEQ ID NO:26)；
5’-TGTATGTCACGAGCAATTA-3’(HPV59，SEQ ID NO:27)；
2.3、对照组：加入35μl第二步对照反应液(含针对不同亚型HPV的特异性T7引物(SEQ ID NO:13-17)+荧光探针(以下SEQ ID NO:28-32所示))，其中荧光探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有DABCYL荧光淬灭基团，针对HPV18、45、39、68、59亚型的荧光探针分别为：
5’-CCAGGAGCUCAGCAGACGACCUUCGAGCAUCCUGG-3’(HPV18，SEQ ID NO:28)；
5’-CCUGGUAGUAGAAGCCUCACGGGAUACUCUCCAGG-3’(HPV45，SEQ ID NO:29)；
5’-CCGAGCUCGGCAGAGGACCUUAGAACACUCGG-3’(HPV39，SEQ ID NO:30)；
5’-CCAGGAACCUCGCAAGACGGAUUGCGCCUGG-3’(HPV68，SEQ ID NO:31)；
5’-GCGUCGCGGGAGAACCUGCGGAAGC-3’(HPV59，SEQ ID NO:32)。
随后42℃反应40min，用实时荧光定量PCR仪同时进行多重实时检测；试验组：加入35μl第二步反应液(含第一引物(即共同引物序列(针对不同亚型使用同一共同引物序列)和T7启动子序列，SEQ ID NO:1)+荧光探针(SEQ ID NO:28-32))，随后42℃反应40min，用实时荧光定量PCR仪同时进行多重实时检测。
图5和图6分别示出了对照组和试验组对HPV18、45、39、68、59亚型的多重实时荧光检测结果，其中扩增曲线1-6依次代表HPV18、45、39、68、59和阴性对照。可见在相同RNA试样浓度的条件下(1000拷贝/mL)，对照组采用的方法仅能够检测出HPV18和HPV59两种亚型，不能检测出另外三种HPV亚型；而试验组采用的本发明的方法能够全部检测出5种HPV亚型。可见对照组采用的方法中在一个体系中存在多对引物时，会对体系产生较大的抑制，灵敏度会大大降低，进而导致可能不能检测出其中的一种或几种待测物质；而本发明采用含有共同引物序列的引物的方法，在第二步反应体系中，只需要一个第一引物就可以检测出全部的待测物质，并且具有较高的相对荧光强度，因此该实施例提供的方法具有较高的检测灵敏度和检测范围。
综上实施例结果表明，本发明提供的方法具有体系兼容性强，检测灵敏度高、检测速度快的优点，适用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域中的核酸检验，适合大面积推广和应用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海仁度生物科技有限公司
<120> 一种RNA放大检测方法及检测试剂盒
<150> 201811611790.1
<151> 2018-12-27
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtaca 55
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atacacatat aagaaattgg ag 22
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacgaatacg cgatgctttc 50
<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtacatacgg 60
accttcgcga tgtgtagg 78
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatttaatac gactcactat agggagatac ggaccttcgc gatgtgtagg 50
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagggtaac gcgggtct 18
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggaggtatt ccaacgctcg ctccg 25
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taaatcttta aatgcaaatt caaatacctc 60
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atataaatca ctaaatgcaa attcatatac 60
ctc 63
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taaatcttta aaagcaaatt gatatacctc 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taagtcatta aaagcaaatt caaatacctc 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taagtcacca aaggcaaatt catatacctc 60
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatttaatac gactcactat agggagacac aaaggacagg gtgttcag 48
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aatttaatac gactcactat agggagacaa atcctagtga gtccat 46
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatttaatac gactcactat agggagacac acaaaggaca aggtgctcaa 50
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aatttaatac gactcactat agggagacag ctgctgtaag gctcgcaa 48
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatttaatac gactcactat agggagataa acagcagttc tagcttccgc 50
<210> 18
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtacacacaa 60
aggacagggt gttcag 76
<210> 19
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtacacaaat 60
cctagtgagt ccat 74
<210> 20
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtacacacac 60
aaaggacaag gtgctcaa 78
<210> 21
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtacacagct 60
gctgtaaggc tcgcaa 76
<210> 22
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtcatgttg tttgtctatt gtacataaac 60
agcagttcta gcttccgc 78
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtcacacaat gttgtgtatg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtgtgtgtg tgttgtaagt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccgacgagcc gaaccacagc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttacaatga aatacagccg 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtatgtcac gagcaatta 19
<210> 28
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccaggagcuc agcagacgac cuucgagcau ccugg 35
<210> 29
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccugguagua gaagcctcac gggauacucu ccagg 35
<210> 30
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccgagcucgg cagaggaccu uagaacacuc gg 32
<210> 31
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccaggaaccu cgcaagacgg auugcgccug g 31
<210> 32
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcgucgcggg agaaccugcg gaagc 25
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aatttaatac gactcactat agggaga 27

Claims (10)

1.一种RNA放大检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将含有待测样品RNA、引物、探针、荧光探针和相关聚合酶的反应物混合为反应混合物；
2)将反应混合物置于密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，定量或定性检测待测样品RNA。
2.根据权利要求1所述的RNA放大检测方法，其特征在于：所述反应混合物包含以下组分：
a.待测样品RNA；
b.第一引物：所述第一引物的序列包含启动子序列和共同引物序列，其中所述共同引物序列为与所述待测样品RNA非同源的序列；可选的，所述启动子序列为T7启动子序列；可选的，所述第一引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示；
c.探针A：所述探针A的3’端序列为与待测样品RNA特异性结合的序列，5’端序列为所述第一引物的序列；
d.探针B：作为第二引物，其序列与所述待测样品RNA序列一致；
e.荧光探针，用于与所述恒温放大反应产物结合；
f.逆转录酶；和
g.识别所述启动子序列的RNA聚合酶；
优选的，还包含：
h.含有特异性捕获探针的固相支持物，所述特异性捕获探针用于捕获待测样品RNA。
3.根据权利要求2所述的RNA放大检测方法，其特征在于，所述待测样品RNA的获得方法包括以下步骤：
11)RNA试样制备；
12)向所述RNA试样中添加核酸提取液，混匀后进行提取，获得待测样品RNA；其中所述核酸提取液包含探针A和含有特异性捕获探针的固相支持物，所述探针A用于与所述待测样品RNA特异性结合，以引入第一引物序列；
具体地，步骤12)中所述固相支持物为磁性颗粒，所述提取的流程具体为：
121)向所述RNA试样中添加所述核酸提取液，混匀后在55-95℃下孵育8-12min，室温静置至提取液混合物恢复到室温，磁力架上吸磁至少1min，弃上清；
122)加入洗涤液(HEPES 10mM，NaCl 50mM，1％SDS，EDTA 5mM)重悬磁性颗粒，磁力架上吸磁1-3min，弃上清；
123)重复步骤122)，获得待测样品RNA。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，步骤1)中所述反应混合物的获得方法具体包括以下步骤：
T1)第一步反应混合：向所述待测样品RNA中加入第一步反应液和酶液进行反应，获得第一步反应产物，其中所述第一步反应液包含第二引物，所述酶液中含有逆转录酶和识别所述启动子序列的RNA聚合酶；优选第一步反应条件为：37-45℃下反应3-10min；
T2)第二步反应混合：向所述第一步反应产物中加入第二步反应液，获得反应混合物，其中所述第二步反应液包含第一引物和荧光探针。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，步骤2)中所述恒温放大反应的条件为：37-45℃下反应20-60min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，所述第一步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl2，0.1-10mM NTPS，0.1-10mMdNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第二引物；
所述第二步反应液的组分为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl2，0.1-10mMNTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.01-2μM第一引物，0.01-2μM荧光探针；
所述酶液的组分为：100-9000U逆转录酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％TritonX-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油；
优选地，所述第一步反应液、酶液与所述第二步反应液的用量体积比为(2-3)：(1-2)：(2-3)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，所述荧光探针选自以下任意一种：分子信标、荧光共振、蝎子探针、荧光放大和分子火炬。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的RNA放大检测方法，其特征在于，所述待测样品RNA为miRNA或非miRNA，其中所述非miRNA包括mRNA、rRNA和tRNA。
9.一种RNA放大检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2中述及的b-g组分。
10.根据权利要求9所述的RNA放大检测试剂盒，其特征在于，还包含权利要求1-8中任一项所述的RNA放大检测方法中述及的试剂；各组分与试剂形成的溶液形式包括有：
核酸提取液：其包含探针A和权利要求2中述及的h组分即含有特异性捕获探针的固相支持物；
第一步反应液：其包含第二引物；
酶液：其包含逆转录酶和识别所述启动子序列的RNA聚合酶；和
第二步反应液：其包含第一引物和荧光探针。
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