JPH04131099A - 標的核酸の増幅方法、検出方法およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は標的核酸の増幅方法、検出方法およびこれらの
方法を実施するためのキットに関する。

この発明は特に塩基配列が既知である核酸を、その初期
に存在する量に比較して、より大量に生成させる方法に
関する。該核酸は単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋
な状態であっても、混合物の一成分であってもよい。

本発明の方法およびそのためのキットを用いることによ
り遺伝病、癌、感染症等の診断を行うことが容易となる
。

（従来の技術） 近年、核酸ハイブリダイゼーションによる核酸の検出が
遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な手段とし
て汎用されるようになってきた。

標的とする塩基配列（標的核酸）は、検出対象となる核
酸のほんの僅かな部分であることが多く、放射性同位体
で末端を標識したオリゴヌクレオチドプローブや非放射
性標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた場合、感度
上の問題等により、その核酸の検出が困難である場合が
ある。そのために、プローブ検出システムの感度を向上
させるための努力が多くなされている（Ｗ０８７１０３
６２２など）。

また、感度向上の手段として、検出しようとする核酸を
ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法（特開昭６１
−２７４６９７号公報等）が公表されている。しかしこ
の方法では、核酸のアニール、変性を繰り返すための加
熱、冷却操作を頻繁に行う必要があり、特別の機器を用
いるか、または煩雑な労力を要する。また、該方法では
、プライマーとして二つのオリゴヌクレオチドを用いる
が、これらが非特異的にアニールした場合でもＲＮＡポ
リメラーゼによる増幅が起こる場合があり、プライマー
の特異性が厳しく要求されている。

またＤＮＡリガーゼを用いる増幅法も公開されている（
ｈｏ８９／１２６９６、特開平２−２９３４号公報等）
。

しかし、この方法ではＤＮＡリガーゼの平滑末端連結反
応（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）による非
特異的増幅が起こる。これを回避する方法として、３組
以上のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法が公開
されている（Ｗ０８９／１２６９６）が、プローブの数
が多く、コスト高となることが問題である。

さらにＤＮＡリガーゼとＤＮＡポリメラーゼを組み合わ
せた方法が公開されている（Ｗ０９０１０１０６９）。

しかし、この方法でも２組４本以上のオリゴヌクレオチ
ドを用いる必要があり、コストが高くなるという問題が
ある。

また、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡよりＲＮＡが
生成されることは周知であり、ＲＮＡポリメラーゼを用
いて核酸の増幅を行う方法も公開されている（Ｗ０８９
１０１０５０）。しかしながら、この方法ではＲＮＡポ
リメラーゼによる転写増幅のみでは、充分な増幅が困難
である。したがって、生成したＲＮＡに再度、逆転写酵
素を作用させ、ＤＮＡを生成させる操作を実施している
。−船釣に逆転写酵素によるＤＮＡへの転写は、ＤＮＡ
ポリメラーゼによるＤＮＡ複製に比べて、読み取り間違
いを生じ易いという欠点がある。

一方、検出しようとする核酸にプローブをノ＼イブリダ
イズしたプローブのみを増幅する方法（ＢＩＯ／ＴＥＣ
）ＩＮＯＬＯＧＹνｏ１．６．１１９７．１９８８）　
　も知られている。

しかし、この方法では、非特異的反応により結合したプ
ローブも増幅され、ブランク値の上昇をきたすという問
題がある。

Ｊ、Ｇａｕｇａｔｚらは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製
する場合、ｃＤＮＡがヘアピン構造をとり、さらにヘア
ピンを開裂すると同時に二重鎖を作って、複製を行うこ
とを示した（Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏ、、９５，６７９
．１９８２）。しかし、この方法では、ｍ　ＲＮ　Ａに
対する特殊な手法であって、汎用性がない特異的な増幅
ができないなど、標的核酸を特異的に増幅、検出するこ
とが困難である。

（発明が解決しよとする課題） 本発明の目的は、標的核酸を簡便に増幅さる方法、およ
び非特異的なブランク値の上昇を伴うことのない、すな
わち検出の際に感度不足の少ない核酸の検出法を提供す
ることである。

また本発明の他の目的は、当該標的核酸の増幅方法およ
び検出方法に使用するキットを提供することである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、これらの課題を解決すべく、種々鋭意検
討の結果、標的核酸とアニールする少なくとも２個以上
のオリゴヌクレオチド′の１個に、５”末端から３゛末
端に向かって、少なくとも、核酸中に含まれる標的核酸
の一部に相補的な塩基配列、Ａ＃ｊｉ、リンカ−および
Ｂ鎖が順次配列され、該Ａ鎖と該Ｂ鎖が互いに相補的で
ヘアピン構造を形成する第一オリゴヌクレオチドを使用
することによって、上記課題が解決されることを見出し
、本発明に到った。

即ち、本発明は次の要旨を有するものである。

（１）下記（ア）および（イ）のオリゴヌクレオチドを
使用して、下記操作（ａ）　（ｂ）　（ｃ）および（ｄ
）および／又は（ｅ）を順次行うことを特徴とする標的
核酸の増幅方法。

（ア）５゛末端から３゛末端に向かって、少なくとも、
核酸中に含まれる標的核酸の一部に相補的な塩基配列、
Ａ鎖、リンカ−およびＢ鎖が順次配列され、該Ａ鎖と該
Ｂ鎖とが互いに相補的でヘアピン構造を形成する第一オ
リゴヌクレオチド；（イ）前記標的核酸の他の一部に相
補的な塩基配列を有する１個のオリゴヌクレオチド、又
は各々が該標的核酸の他の一部とアニールした際に連結
するように設計された２個以上のオリゴヌクレオチドで
ある第二オリゴヌクレオチド；（但し、第一オリゴヌク
レオチド及び第二オリゴヌクレオチドは、各々に相補的
な標的核酸とアニールした後に、連結され得る。） 崖圭コ搬−第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌク
レオチドを標的核酸にアニールさせる；盪甫■煩−第一
オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを連結
させ、第二オリゴヌクレオチドが２個以上のオリゴヌク
レオチドである場合には、該２個以上のオリゴヌクレオ
チド同士を連結さセる； １作ムし　操作（ｂ）で連結された連結オリゴヌクレオ
チドのヘアピン構造の３゛末端から５゛側を鋳型として
伸長し、連結伸長オリゴヌクレオチドを得る； 藷目１工０−　連結伸長オリゴヌクレオチドを変性して
単鎖とし、該単鎖を鋳型として第一オリゴヌクレオチド
または第二オリゴヌクレオチドをプライマーとして反応
させ、該第一オリゴヌクレオドまたは第二オリゴヌクレ
オチドを伸長して標的核酸の増幅物を得る； １在圏と　連結伸長オリゴヌクレオチドを変性して単鎖
とし、該単鎖を鋳型として第一オリゴヌクレオチドおよ
び第二オリゴヌクレオチドを反応させた後、該第一オリ
ゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを連結して標
的核酸の増幅物を得る： （２）操作（ｄ）および／又は操作（ｅ）を少なくとも
２回繰り返すことを特徴とする標的核酸の増幅方法。

（３）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチド、前記（イ
）のオリゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉｉ）　
Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素および
（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオチドを含む標的核酸を
増幅するためのキット。

（４）前記（イ）における第二オリゴヌクレオチドとし
て、５”末端側にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモー
ター領域を有するオリゴヌクレオチドを用いて、前記操
作（ａ）　（ｂ）および（ｃ）を実施するか、または前
記操作（ａ）　（ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／ま
たは（ｅ）を実施するか、または前記操作　（ａ）　（
ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／又は（ｅ）を行い、
操作（ｄ）および／又は操作（ｅ）を少なくとも２回繰
り返した後、ＲＮＡポリメラーゼにより連結伸長オリゴ
ヌクレオチドまたは標的核酸の増幅物がらＲＮＡ転写物
を得ることを特徴とする標的核酸の増幅方法。

（５）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチドおよび前記
（イ）のオリゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉｆ
）ＤＮＡポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素、（ｉｉ
ｉ）デオキシリボヌクレオチド、（ｉｖ）リボヌクレオ
チドおよび（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼを含む標的核酸を
増幅するためのキット。

（６）前記（ア）における第一オリゴヌクレオチドおよ
び／又は前記（イ）における第二オリゴヌクレオチドと
して、標識したオリゴヌクレオチドを用い、前記操作（
ａ）　（ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／又は（ｅ）
を実施するか、または前記操作（ａ）　（ｂ）（ｃ）お
よび（ｄ）および／又は（ｅ）を行い、操作（ｄ）およ
び／又は操作（ｅ）を少なくとも２回繰り返した後、該
標識を測定することにより、標的核酸を検出することを
特徴とする標的核酸の検出方法。

（７）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチドおよび前記
（イ）のオリゴヌクレオチドであって、（ア）における
第一オリゴヌクレオチドおよび／又は（イ）における第
二オリゴヌクレオチドを標識したオリゴヌクレオチド、
（ｉ）連結酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／
又は逆転写酵素および（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオ
チドを含む標的核酸を検出するためのキット。

（８）前記（イ）における第二オリゴヌクレオチドとし
て、５′末端側にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモー
ター領域を有する第二オリゴヌクレオチドを用い、前記
操作（ａ）　（ｂ）および（ｃ）を実施するか、または
前記操作（ａ）　（ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／
または（ｅ）を実施するか、または前記操作（ａ）　（
ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／または（ｅ）を行い
、操作（ｄ）および／または（ｅ）を少なくとも２回繰
り返した後、ＲＮＡポリメラーゼにより連結伸長オリゴ
ヌクレオチドまたは標的核酸の増幅物からＲＮＡ転写物
を得、該ＲＮＡ転写物を測定することにより、標的核酸
を検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。

（９）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチドおよび５”
末端側にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター領域
を有する前記（イ）の第二オリゴヌクレオチド、（ｉ）
連結酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／または
逆転写酵素、（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオチド、（
ｉｖ）リボヌクレオチドおよび（ｖ）ＤＮＡポリメラー
ゼを含む標的核酸を検出するだめのキット。

本発明の第一オリゴヌクレオチドは、５゛末端から３”
末端に向かって、少なくとも、核酸中に含まれる標的核
酸の一部に相補的な塩基配列、Ａ鎖、リンカ−およびＢ
鎖が順次配列され、Ａ鎖とＢ鎖とが互いに相補的であり
、Ａ鎖とＢ鎖がアニールした場合、Ａ鎖、Ｂ鎖およびリ
ンカ−がヘアピン構造を形成する（第一図参照）。

標的核酸の一部に相補的塩基配列は、少なくとも６個、
好ましくは１０〜５０個のヌクレオチドであればよい。

−船釣にオリゴヌクレオチドの特異性を保持するには、
２０ヌクレオチド以上の長さを必要とするといわれてい
るが、本発明では約１０個のヌクレオチド程度であって
も特異的な増幅が可能である。

Ａ鎖およびＢ鎖は、互いに相補的にヘアピン構造を形成
するものであればよい。その長さは少なくとも、６個、
好ましくは１０〜３０個のヌクレオチドであればよい。

リンカ−はヘアピン構造を保持することが可能であれば
、長さ、構造等に特に制限はない。−船釣に４〜１００
個のヌクレオチド、好ましくは４〜２０個のヌクレオチ
ドである。

本発明の第一オリゴヌクレオチドにおいて、Ａ鎖とＢ鎖
の二重の領域と、標的核酸の一部とアニールする塩基配
列との間に、所望によりスペーサーを設けることも可能
である。このスペーサーは一般的に１〜１００個、好ま
しくは１〜２０個のヌクレオチドであばよい。

本発明の第二オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸の他
の一部に相補的な塩基配列を有する１個のオリゴヌクレ
オチド、又は各々が該標的核酸の他の一部とアニールし
た際に連結するように設計された２個以上のオリゴヌク
レオチドである。但し、第一オリゴヌクレオチドおよび
第二オリゴヌクレオチドは、各々に相補的な標的核酸と
アニルした後に連結され得るものである。

本発明では、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチ
ド部分（第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌク
レオチド）は、６〜１００ヌクレオチド、好ましくは１
０〜６０ヌクレオチドの長さが使用される。

第二オリゴヌクレオチドの５゛末端部分にＲＮＡポリメ
ラーゼのアンチプロモーター領域を結合することも可能
である。このＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター
領域をもった第二オリゴヌクレオチドを用いた場合、連
結反応後のＤＮＡポリメラーゼ反応により伸長されたオ
リゴヌクレオチド部分に新たにＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター領域が生成される。このプロモータ一部分に
通したＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチド（Ａ
ＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰなど）を作用させれば、
連結伸長オリゴヌクレオチドに対応したＲＮＡ転写物を
得ることができる。その際、第一オリゴヌクレオチドの
配列中にＲＮＡポリメラーゼの転写終結シグナルを挿入
する、又はリンカ一部分の一重鎖を８１ヌクレアーゼで
切断する等により、ＲＮＡポリメラーゼの転写を一定の
配列で終わらせ、ＲＮＡの長さを一定にすることで、生
産物を効率よ←生成させることができる。

これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機、例えば
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｃ、、のＤ
ＮＡ合成機３９１型を用いて、ホスホアミダイト法によ
り合成することができる。該方法以外にも、リン酸トリ
エステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法
等、如何なる方法で合成してもよい。また、生物学的起
源、例えば制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化物か
ら単離してもよい。

第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチド
の５′末端には、リン酸基を付加しておくことが好まし
い。リン酸基の付加は、例えばＡＴＰの存在下でＴ４ポ
リヌクレオチド・キナーゼによって行うことができる。

本発明の標的核酸の増幅方法は、上記第一オリゴヌクレ
オチドおよび第二オリゴヌクレオチドを用いて、下記の
操作（ａ）　（ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／又は
操作（ｅ）を順次行う。

また操作（ｄ）および／又は操作（ｅ）を少なくとも２
回繰り返して行ってもよい。

本発明の増幅原理を図によって説明する（第２図参照）
。図中、（１）は標的核酸、（２）は第一オリゴヌクレ
オチド、（３）は第二オリゴヌクレオチド、（４）は連
結オリゴヌクレオチド、（５）は連結伸長オリゴヌクレ
オチドを示す。

操上」搬−第一オリゴヌクレオチド（２）および第二オ
リゴヌクレオチド（３）を標的核酸（１）に同時に、あ
るいは別々にアニールさせる（第２図（ａ）参照）。

標的核酸が二重鎖の場合には、前もって加熱、アルカリ
処理、酸処理等により変性して一重鎖としておく。加熱
変性は、例えば８０〜１０５°Ｃで１〜２０分間処理す
ることで実施する。アルカリ処理は、例えば０．２〜１
規定ＮａＯＨの存在下で、１〜３０分間処理し、等量の
ＭＣＩで中和して行う。酸処理は、例えば０．０１〜１
規定ＨＣＩの存在下で１〜３０分間処理し、ＮａＯＨで
中和して行う。他の方法としては、酵素的に鎖分解を行
うこともできる。

アニールは、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴ
ヌクレオチドについて最大のアニール選択性をもたらす
ように、選択された温度において行う。−船釣には、標
的核酸と第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌク
レオチドが、特異的に結合し、かつミスマツチによる非
特異的結合が最小となるように、昇温させて行う。通常
は、３０〜７０°Ｃ付近にでアニールさせる。

本発明では、第一オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一
部に相補的な塩基配列を有し、第二オリゴヌクレオチド
は、該標的核酸の他の一部に相補的な配列を有する。し
たがって、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌ
クレオチドは、それぞれ単独では標的核酸の全部とアニ
ールすることはできない。しかし、第一オリゴヌクレオ
チドおよび第二オリゴヌクレオチドにより、標的核酸の
全部とアニールすることができる。通常は、第一オリゴ
ヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドにより、標
的核酸の特定の一部とアニールすることが可能であれば
、本発明の目的は達成される。

豫生何　　第一オリゴヌクレオチド（２）の５゛末端と
第二オリゴヌクレオチド（３）の３゛末端とを、さらに
第二オリゴヌクレオチド（３）が２個以上のオリゴヌク
レオチドである場合には、各々のオリゴヌクレオチド同
士を同様に連結させる（第２図（ｂ）参照）。

複数のオリゴヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチドお
よび第二オリゴヌクレオチド、第二オリゴヌクレオチド
が２個以上のオリゴヌクレオチドからなる場合には、各
々オリゴヌクレオチド）が隣接している場合、これらを
連結するには、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガー
ゼ、大腸菌（Ｅ。

ｃｏ目）ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｅｓ
ｏ　ｈＨｕｓ　ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素を使用する
ことが好ましい。

複数のオリゴヌクレオチドが互いに隣接していない場合
、ＤＮＡポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素によりギ
ャップを埋めた後、ＤＮＡリガーゼにより連結すること
ができる。この場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペアのみ、
又はＣ−Ｇペアのみで構成されるように各オリゴヌクレ
オチドを設計しておけば、添加するオリゴヌクレオチド
をそれぞれＡ、ＴまたはＣ１Ｇのみとすることができ、
ミスマツチによりアニールしたオリゴヌクレオチドが間
違って伸長されることを防ぐことができる。

連結酵素を使用する連結方法については、特開昭６３−
２２１９７号公報および−０９０−０１０６９等に開示
される方法を行うことができる。

本発明では、ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチド
の連結は、２個のオリゴヌクレオチドが隣接しているこ
とが必須条件である。したがって、各々のオリゴヌクレ
オチドは特異性が低くても、両者が隣接していなければ
、ＤＮＡリガーゼが作用せず、本発明の目的が達成され
ない。

１立（６）操作（ｂ）により連結された連結オリゴヌク
レオチドの、第一オリゴヌクレオチドのヘアピン構造部
分の３′末端を、５゛側を鋳型として伸長する（第２図
（Ｃ）参照）。

該操作（Ｃ）は、例えばデオキシリボヌクレオチド（ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）およびＤＮＡ
ポリメラーゼ（例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡＩ
Ａポリメラーゼ１、フレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏ
ｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）　、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメ
ラーゼ、Ｔｈｅｒ＊ｕｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｖｕし旦肛柱執旦匹ＤＮＡポリ
メラーゼ等、又は逆転写酵素を添加し、連結オリゴヌク
レオチドの５゛側を鋳型にして伸長反応を行うことによ
り行う。上記方法は、例えばジャーナル・オフ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）　　５６，３４１−３６
１，１９７１に記載される。

１庄烈　連結伸長オリゴヌクレオチド（５）を鋳型とし
て、第一オリゴヌクレオチドおよび／又は第二オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして反応させ、該第一オリゴ
ヌクレオチドおよび／又は第二オリゴヌクレオチドを伸
長する（第２図（ｄ）参［）。

該操作（ｄ）は、操作（Ｃ）で得られた連結伸長オリゴ
ヌクレオチドの二重鎖を変性させて単鎖とし、第一オリ
ゴヌクレオチドおよび／又は第二オリゴヌクレオチドを
プライマーとしてアニールした後、操作（Ｃ）と同様な
反応を行い、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴ
ヌクレオチドの伸長生成物を得る。

該操作（ｄ）において、変性は前記標的核酸の変性と同
様な方法により実施できるが、特に加熱による変性が好
ましい。また連結伸長オリゴヌクレオチドへのプライマ
ーのアニールおよび伸長は、第一オリゴヌクレオチドを
プライマーとした場合であっても、第二オリゴヌクレオ
チドをプライマーとした場合であっても、連結伸長オリ
ゴヌクレオチドの第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴ
ヌクレオチドの連結部分を越えて伸長することになり、
同じ結果を得ることができる。

ｉ［伸長オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチド
とはリンカ一部分が相同であり、初めはアニールしない
が、伸長生成を繰り返した場合、第二オリゴヌクレオチ
ドをプライマーとした伸長生成物とは正しくアニールし
、同様な伸長生成が生じる。またリンカ一部分をイノシ
ン残基で構成してもよい。

操作部に使用する連結伸長オリゴヌクレオチドは、操作
（Ｃ）で得られた連結伸長オリゴヌクレオチドの他に、
操作（ｄ）および／又は操作（ｅ）にて生成した標的核
酸の増幅物であってもよい。

操作（６）連結伸長オリゴヌクレオチド（５）を鋳型と
して、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチ
ドを連結する（第２図（ｅ）参照）。

この操作（ｅ）は、操作（ｃ）で得られた連結伸長オリ
ゴヌクレオチド′の二重鎖を変性させて単鎖とし、第一
オリゴヌクレオチドおよび／又は第二オリゴヌクレオチ
ドをアニールした後、操作（ｂ）と同様の反応を行い、
該第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチ
ドを連結する。

この操作（ｅ）においては、変性は前記標的核酸の変性
と同様の方法を実施できるが、加熱による変性が好まし
い。

連結伸長オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチド
とは、リンカ一部分が相同であり、正しくアニールしな
い。そこでリンカ一部分に比べ、Ａ鎖、Ｂ鎖が長く、ス
トリンジエンシーを少し下げてアニールさせることも可
能である。しかし、リンカ一部分をインシン残基で構成
することで、アニールを可能とする。また、操作（ｄ）
と組み合わせることにより、リンカ一部分の相補鎖を伸
長させ、これを鋳型として第一オリゴヌクレオチドおよ
び第二オリゴヌクレオチドを連結させることにより特異
的反応が達成される。

操作（ｄ）および／又は（ｅ）を繰り返すことにより、
効率よく増幅することができる。ここで、本発明では鋳
型となる連結オリゴヌクレオチドは、数十〜数百ヌクレ
オチドと短いために、繰り返し操作を短時間で実施でき
る。すなわちアニールとＤＮＡポリメラーゼ反応を同時
又は加温上昇時に実施できるので、加熱変性段階とＤＮ
Ａポリメラーゼ反応段階の２ステツプ／サイクルで繰り
返し操作を行うことができる。

第二オリゴヌクレオチドの５゛末端分にＲＮＡポリメラ
ーゼのアンチプロモーター領域を結合させておくことに
より、更に増幅効率を高めることができる。

このＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター領域をも
った第二オリゴヌクレオチドを用いた場合、連結反応の
ＤＮＡポリメラーゼ反応により、連結伸長オリゴヌクレ
オチド（５）の３゛末端側に新たにＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター領域が生成される。このプロモータ一部
分に通したＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチド
（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰＵＴＰ）を作用させると、連
結伸長オリゴヌクレオチドに対応したＲＮＡ転写物を得
ることができる。

本発明に用いるプロモーターは特に制限がないが、Ｔ７
プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター
など一般に知られているもので充分である。用いるＲＮ
Ａポリメラーゼは、それぞれプロモーターに適した酵素
を選択する。

これらは、例えばＪ、Ｐ、ｌ’ｌｉｌｌｉｇａｎらの文
献（Ｎｕｃ］ｅ４ｃ＾ｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５
８７８３，１９８７）に記載される技術および条件を用
いることができる。

この際、第一オリゴヌクレオチドの配列中にＲＮＡポリ
メラーゼの転写終結シグナルを挿入する、リンカ一部分
の一重鎖を５１ヌクレアーゼで切断する等により、ＲＮ
Ａポリメラーゼ産物をより効率よ←生成させることがで
きる。リンカ一部分の一重鎖を３１ヌクレアーゼで切断
する場合、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ、　１９
８９）に開示の方法を用いればよい。

これにより伸長生成物はリンカ一部分を失い、ＲＮＡプ
ロモーターをもつ完全なＲＮＡ転写を行えば、効率よく
転写物を得ることができる。

さらに、このＲＮＡ転写物をもう一度、標的核酸として
操作（ａ）　（ｂ）　（ｃ）および（ｄ）および／又は
（ｅ）を実施することにより、増幅効率を高めることが
できる。

本発明では、標的核酸と同じ（相補または相同の）塩基
配列をもった連結伸長オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ
転写物を多量に得ることができる。

さらに、この連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又は
ＲＮＡ転写物を測定すれば、標的核酸の存在の有無を測
定することができる。

すなわち本発明の標的核酸の検出法では、連結オリゴヌ
クレオチドと相補的な塩基配列が標的核酸中に存在しな
い場合、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌク
レオチドは標的核酸とアニールせず、また例えアニール
しても第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレ
オチドが隣接して連結するような位置に存在しない場合
には、連結オリゴヌクレオチドは生成されない。したが
って、連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又は連結伸
長オリゴヌクレオチドからのＲＮＡ転写物も生成されな
い。このような第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌ
クレオチドとの連結オリゴヌクレオチドからの伸長生成
物および／又はＲＮＡ転写物の生成の有無が標的核酸の
有無を示す。

本発明では、連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又は
ＲＮＡ転写物の検出を一般的な検出法にて行う。例えば
電気泳動により一定の長さの連結伸長オリゴヌクレオチ
ドおよび／又はＲＮＡ転写物を測定する方法、ＤＮＡポ
リメラーゼによる伸長生成やＲＮＡポリメラーゼによる
転写の際に、添加するモノヌクレオチドとして、例えば
３２Ｐなどの標識物を用いて、その放射活性を測定する
方法、第一オリゴヌクレオチドおよび／又は第二オリゴ
ヌクレオチドに予め標識をつけておく方法、標識核酸プ
ローブを用いて検出する方法などがある。

第一オリゴヌクレオチドおよび／又は第二オリゴヌクレ
オチドに予め標識をつけておく方法では、放射性同位元
素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ハプテン等
の公知の標識のうち、オリゴヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションや連結反応などに影響のない物質を用いる
ことが好ましい。

これらの手法としては、連結反応における標識として特
開平２−２９３４号公報、伸長反応における標識として
特開平１−２５２３００号公報に開示される方法などが
ある。これらの検出は一般的な手法による。

標識核酸プローブを用いる方法では、標識物として放射
性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ハ
プテン等を使用する。核酸ブローフとしては、第一オリ
ゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの連結部分を
含有する領域、２個以上のオリゴヌクレオチドからなる
第二オリゴヌクレオチ（のオリ、ゴヌクレオチド同士の
連結部分を含有する領域の塩基配列と同じ（相補または
相同の）配列をもつように設計する。標識核酸プローブ
と、連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又はＲＮＡ転
写物、又は連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又はＲ
ＮＡ転写物および標的核酸の両者とをハイブリダイズさ
せ、標識核酸プローブを検出する。この場合、標識プロ
ーブは新たに生成した配列に対してハイブリダイズする
ように設計されているので、既に存在している第一オリ
ゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドの影響を
受けることなく、連結オリゴヌクレオチドにより新たに
生成した連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又はＲＮ
Ａ転写物を、標的核酸とともに効率よく検出することが
できる。したがって、連結伸長オリゴヌクレオチドおよ
び／又はＲＮＡ転写物を第一オリゴヌクレオチドおよび
第二オリゴヌクレオチドから分離して測定する必要がな
い。

本発明の標的核酸を増幅するためのキットは、前記（ア
）の第一オリゴヌクレオチド、前記（イ）のオリゴヌク
レオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラー
ゼおよび／又は逆転写酵素および（ｉｉｉ）デオキシリ
ボヌクレオチドを含む。

また　本発明の標的核酸を増幅するためのキットは、前
記（ア）の第一オリゴヌクレオチド、前記（イ）のオリ
ゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉｉ）　Ｄ　Ｎ　
Ａポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素、（ｉｉｉ）デ
オキシリボヌクレオチド、（ｉｖ）リボヌクレオチドお
よび（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼを含む。

さらに本発明の標的核酸を検出するキットは、（ア）の
第一オリゴヌクレオチドおよび前記（イ）のオリゴヌク
レオチドであって、゛（ア）における第一オリゴヌクレ
オチドおよび／又は（イ）における第二オリゴヌクレオ
チドを標識したオリゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、
（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素お
よび（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオチドを含む。

また、本発明の標的核酸を検出するキットは、前記（ア
）の第一オリゴヌクレオチドおよび５′末端側にＲＮＡ
ポリメラーゼのアンチプロモーター領域を有する（イ）
の第二オリゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉ　ｉ
）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼおよび／または逆転写酵素
、（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオチド、（ｉｖ）リボ
ヌクレオチドおよび（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼを含む。

（発明の効果） 本発明の標的核酸の増幅方法では、２種のオリゴヌクレ
オチドが標的核酸にアニールして連結された場合にのみ
増幅反応が行われる。したがってオリゴヌクレオチドの
塩基配列による特異性と２種のオリゴヌクレオチドが連
結される条件を満たす特異性の２つの特異性が要求され
、それだけ非特異的反応が抑制される。すなわち核酸の
特定の配列のみを増幅することが可能である。

また連結反応は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼや耐熱性ＤＮ
Ａリガーゼを用いて、反応液の温度を変化させるだけで
反応が進行し、簡便に増幅を行うことができる。

さらに第二オリゴヌクレオチドの５°末端にＲＮＡポリ
メラーゼのアンチプロモーターを結合させることにより
、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長および／又はリガーゼ
による連結反応の後、ポリメラーゼにより更にＲＮＡ転
写を実施することで、より効率のよい増幅を行うことが
できる。

また、本発明の増幅法はプローブを増幅する方法ではな
く、ミスマツチや非特異的ハイブリダイゼーションによ
り残存したプローブの増幅がなく、Ｓ　／　Ｎ　（Ｓｉ
ｇｎａｌ／Ｎｏ１ｓｅ）比を増加させることができる。

さらに本発明では比較的短いオリゴヌクレオチドを用い
て、標的核酸にハイブリダイズさせることが可能である
から、反応時間が短い等の多くの利点を有している。

本発明の標的核酸の検出法においては、本発明の増幅法
で増幅した連結伸長オリゴヌクレオチドおよび／又はＲ
ＮＡ転写物を検出することにより、標的核酸を容易に測
定することができる。その際、所望により連結伸長オリ
ゴヌクレオチドおよび／又はＲＮＡ転写物と標的核酸と
を区別することなく、両者を共に測定することもできる
。

（実施例） 以下、本発明の実施例および比較例を示すことにより、
本発明を説明する。本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。

参考例１ オリゴヌクレオチドの人 Ａ３１社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイド法にて下記配列の各種オリゴヌクレオチド
を合成した。

手法はへＢ１社マニュアルに従い、０．２μＨスケール
で実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護基は、ア
ンモニア水で５５°Ｃ−夜実施した。精製はファルシア
社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した。なお、合成し
たオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で５゛末
端にリン酸基を結合させた。

オリゴヌクレオチド　　　５〜２０ｐ＋ｗｏｌｅｓ１０
Ｘ突出末端用エンドキナーゼ緩衝液　１０μ！１ｍＭ　
ＡＴＰまたは［７−”Ｐ］ＡＴＰ（１０＋＋＋ｃｉ／ｍ
ｌ）　ｌμＩＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ　　　　
１０単位水を加えて全量を１００　μ！とじて、３７°
Ｃで１時間反応させた。

ここで１０×突出末端用エンドキナーゼ緩衝液とは、０
．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、　ＬＭ　Ｍ
ｇＣｈ、　０．１Ｍ　２メルカプトエタノールを含む。

（１）ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチド；（第
一オリゴヌクレオチド■） 該オリゴヌクレオチドはリンカ−で連結されたヘアピン
構造領域、スペーサー、腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒ
ｍｏｓｔａｂｌｅ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｈｅｍｏｌｙｃｉｎ
）の９４番目から１１１番目のヌクレオチド配列に相補
的な配列からなっている。また５′末端にリン酸基が結
合している（６４餠ｅｒ）　；以下余白 ５’−ＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧＧＣＡＧＧ−（・は水素結
合を示す） （２）腸炎ビブリオＴＤ）Ｉ遺伝子の１１２番目から１
３３番目のヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオ
チド（２２餠ｅｒ）； （第二オリゴヌクレオチド■） ５″−ＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＴＣ
−３’（３１ｍ炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の１１２番目か
ら１３３番目のヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオ
チド（２２請ｅｒ）　； 但し、５゛末端のリン酸基はｔｚｐで標識されている。

（標識第二オリゴヌクレオチド■） ５’　−ＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＴ
Ｃ−３”（４）ｍ灸ビブリオＴＤＨ遺伝子の１０３番目
から１２６番目の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプ
ローブ（２４餠ｅｒ）　； 必要により５゛末端のリン酸基は、３２Ｐで標識されて
いる。

（第三オリゴヌクレオチド■） ５’　−ＡＡＡＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣ
ＧＧＧ−３’（５）リンカ−で連結された腸炎ビブリオ
ＴＤＨ遺伝子の１３４番目から１５８番目のヌクレオチ
ド配列に相補的な領域、スペーサー、Ｔ７　ＲＮＡポリ
メラーゼのアンチプロモーター配列からなっているオリ
ゴヌクレオチド（４２■ｅｒ）　；また５”末端にリン
酸基が結合している。

（第四オリゴヌクレオチド■） ５’　−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−ＧＣＴ
ＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣ−３’ 実施例１ を　−るためのキ　ト （ア）参考例１の第一オリゴヌクレオチド■（イ）参考
例１の第二オリゴヌクレオチド■（つ）Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼ ７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ （１）リガーゼ用反応液 丁ｒｉｓ−ＭＣＩ　　（ｐＨ７，６） ｇＣ１ｚ ジチオスレイトール ＡＴＰ ポリメラーゼ反応液 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ Ｃｌ ＭｇＣ１□ 牛血清アルブミン コール酸ナトリウム ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）
６６＋＋Ｍ ６．６ｍ１ １０順門 ６６μｈ （オ）　Ｔｔｈ　ＤＮＡ １０蒙Ｈ ２Ｏ０＋＋＋Ｍ ２．１網Ｈ １，２５ｍｇ／ｍ１ ０．２５χ ０．５霜Ｈ ＴＤＨ産生性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製し加熱変性したゲノム核酸１μｇと上記第一オリゴヌ
クレオチド■０．１ｎｍｏｌと第二オリゴヌクレオチド
■０．５ｎｍｏｌとを１０μｌの上記リガーゼ用反応液
に加えた。９４°Ｃに５分間保った後、４５℃に１０分
間保温し、アニールさせた。

崖甫ｌ匍− 次にＴ４　ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、３７°Ｃで１
時間反応させ、第一オリゴヌクレオチド■と第二オリゴ
ヌクレオチドを連結させた。

崖」ゴ邊− １０μ！の上記液に水５０μ！および上記７ｔｈポリメ
ラ一ゼ反応液４０ｕｌを加え、９５°Ｃで５分間の加熱
変性の後、７ｔｈポリメラ一ゼ３単位を加え、操作（ｂ
）で得た連結オリゴヌクレオチドを鋳型として、伸長反
応および増幅反応を実施した。

１■ｉ不Ｌｙ条作 変性　　　　　　　　　　９４℃、６０秒アニールおよ
びＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ反応５０°Ｃ１３０秒 サイクル数　　　　　　　３０回 崖カゴ■− 操作（ｃ）で得た増幅物をポリアクリルアミドゲルで電
気泳動し、エチレンブロマイド染色により合成されたＤ
ＮＡを確認した。その結果は１３１ｍｅｒ付近にバンド
が見られた。これは第一オリゴヌクレオチド■と第二オ
リゴヌクレオチド■が連結、伸長され、増幅が起こり２
本鎖の増幅物が生成したことを示していた。

実施例２ を　　　るためのキ　ト （ア）参考例１の第一オリゴヌクレオチド■（イ）参考
例１の第二オリゴヌクレオチド■（つ）　Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼ ７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ （１）参考例１のオリゴヌクレオチドプローブ■（オ）
リガーゼ用反応液 ６６ｍＭ　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）６
．６ｍＭ　　　ＭｇＣｌ。

１０ｍＭ　　　　ジチオスレイトール ６６μＭ　　　ＡＴＰ （力）　７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ反応液１０ｓ＋Ｍ
　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ２００ｍＭ　　　　ＭＣＩ ２、１ｍＭ　　　　ＭｇＣｌ□ １．２５＋ｇ／ｓ＋１　　牛血清アルブミン０．２５χ
　　　コール酸ナトリウム ０．５ｍＭ　　　　　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、　　　の　　−　　′ 上記（ア）（イ）（つ）（オ）および（力）の試薬を用
いて、実施例１の操作（ａ）から操作（ｃ）までと同様
の操作を行った。

盪立旦と 操作（ｃ）で得られた連結伸長オリゴヌクレオチドを希
釈して、各々５０μｌをナイロン膜、Ｇｅｎｅ　５ｃｒ
ｅｅｎ　ｐｌｕｓ（ｄｕ　Ｐｏｎｔ社製）にドツトプロ
ットした。

また対象としてＴＤＨ産生性腸炎ビブリオの培養菌体か
ら分離、部分精製し加熱変性したゲノム核酸を変性させ
、５０μ！をドツトプロットした。ナイロン膜を５ＸＳ
ＳＣ，５Ｘゾーンハート液、１＊Ｍ　ＥＤＴＡ。

１０μｌの煮沸したサケ精液ＤＮＡ　（平均５００塩基
）を含む液１００μ！中で６０℃、１時間プレハイブリ
ダイズした後、上記液に（１）のオリゴヌクレオチドプ
ローブ■を加え、６０℃、１時間ハイブリダイズした。

６０°Ｃの６　Ｘ　ＳＳＣ中でナイロン膜を充分洗浄し
た後、乾燥させた。次いでＸ線フィルム（ＮｅｗＡＩＦ
　ＲＸ冨士写真工業製）を密着させ、−８０°Ｃで一昼
夜感光させた。フィルムの感度から連結伸長オリゴヌク
レオチド量を定量したところ、対照のＴＤＨ産生性腸炎
ビブリオのゲノム核酸に比べて、約１０．０００倍の放
射活性が認められた。

実施例３ を　−するためのキット （ア）参考例１の第一オリゴヌクレオチド■（イ）参考
例１の第二オリゴヌクレオチド■（つ）　Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼ ７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ （１）参考例１の第四オリゴヌクレオチド■（力）　Ｔ
７　ＤＮＡポリメラーゼ （＋）　ＡＴＰ、　ＣＴＰ、　ＧＴＰ、　ＬＩＴＰオヨ
び７　”Ｐ−ＡＴＰ（り）リガーゼ用反応液 ６６ｍＭ　　　　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７
，６）６、６ｍＭ　　　ＭｇＣ１ｚ １０ｍＭ　　　　ジチオスレイトール ６６μＭ　　　ＡＴＰ （ケ）　７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ反応液１０ｍＭ　
　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ Ｃｌ ＭｇＣｌ。

１．２５ｍｇ／＠ｌ　　牛血清アルブミン０．２５Ｋ　
　　　コール酸ナトリウム０．５ｍＭ　　　　　　ｄＮ
ＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）・の 上記第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｓｏｌと第二オ
リゴヌクレオチド■０．Ｉｎ＊ｏｌおよび第四オリゴヌ
クレオチド■０．５ｎｓｏｌとを用い、実施例１と同様
の方法で、第一オリゴヌクレオチド■、第二オリゴヌク
レオチド■および第四オリゴヌクレオチド■を連結させ
た。

この連結オリゴヌクレオチドを鋳型として、実施例１と
同様な方法で、７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼにより伸長
反応および増幅反応を実施した。

この反応液に７７１？ＮＡポリメラーゼおよび各］ｍＭ
ＡＴＰ、　ＣＴＰ、　ＧＴＰ、　ＵＴＰオよびｒ　３ｚ
Ｐ−ＡＴＰ２０　ｕ　Ｃｉを加えＲＮＡポリメラーゼ反
応を行って、ＲＮＡ転写物を得た。

ＴＤ）Ｉ産生性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、２０
０＋＋＋Ｍ ２．１ｓＭ 部分精製し、加熱変性したゲノム核酸１μｌと共に、１
０μｌのりガーゼ用反応液に加えた。９４°Ｃに５分間
保った後、４５℃に１０分間保温し、アニールさせた。

次いでポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラ
ジオフラフィーにより、合成されたＲＮＡ転写物を確認
した。その結果は７Ｏｖａｅｒ付近にバンドが見られた
。これは第一オリゴヌクレオチド■と第二オリゴヌクレ
オチド■および第四オリゴヌクレオチド■が連結、伸長
され、増幅の後、さらにＲＮＡポリメラーゼ反応により
ＲＮＡ転写物が生成したことを示しでいた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、第一オリゴヌクレオチドの構造を示す。 第２図は、本発明の増幅原理を模式的に示す。 第３図は、実施例１において増幅されたオリゴヌクレオ
チドの電気泳動パターンを示す。 第４図は、実施例２におけるドツトプロットの検出結果
を示す。 第２図 ｐｒｏｄｕｃｔ ｇｅｎｏｍ　ＤＮＡ 第３１２１ １４＠ ・・曇・ ・ １０’　　　１０１

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記（ア）および（イ）のオリゴヌクレオチドを
   使用して、下記操作（ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）お
   よび／又は（ｅ）を順次行うことを特徴とする標的核酸
   の増幅方法 （ア）５’末端から３’末端に向かって、少なくとも、
   核酸中に含まれる標的核酸の一部に相補的な塩基配列、
   Ａ鎖、リンカーおよびＢ鎖が順次配列され、該Ａ鎖と該
   Ｂ鎖とが互いに相補的でヘアピン構造を形成する第一オ
   リゴヌクレオチド；（イ）前記標的核酸の他の一部に相
   補的な塩基配列を有する１個のオリゴヌクレオチド、又
   は各々が該標的核酸の他の一部とアニールした際に連結
   するように設計された２個以上のオリゴヌクレオチドで
   ある第二オリゴヌクレオチド； （但し、第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレ
   オチドは、各々に相補的な標的核酸とアニールした後に
   、連結され得る。） ￥操作（ａ）￥第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴ
   ヌクレオチドを標的核酸にアニールさせる；￥操作（ｂ
   ）￥第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチド
   とを連結させ、第二オリゴヌクレオチドが２個以上のオ
   リゴヌクレオチドである場合には、該２個以上のオリゴ
   ヌクレオチド同士を連結させる； ￥操作（ｃ）￥操作（ｂ）で連結された連結オリゴヌク
   レオチドのヘアピン構造の３’末端から５’側を鋳型と
   して伸長し、連結伸長オリゴヌクレオチドを得る； ￥操作（ｄ）￥連結伸長オリゴヌクレオチドを変性して
   単鎖とし、該単鎖を鋳型として第一オリゴヌクレオチド
   または第二オリゴヌクレオチドをプライマーとして反応
   させ、該第一オリゴヌクレオドまたは第二オリゴヌクレ
   オチドを伸長して標的核酸の増幅物を得る； ￥操作（ｅ）￥連結伸長オリゴヌクレオチドを変性して
   単鎖とし、該単鎖を鋳型として第一オリゴヌクレオチド
   および第二オリゴヌクレオチドを反応させた後、該第一
   オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを連結し
   て標的核酸の増幅物を得る；
2. （２）操作（ｄ）および／又は操作（ｅ）を少なくとも
   ２回繰り返すことを特徴とする請求項（１）記載の標的
   核酸の増幅方法。
3. （３）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチド、前記（イ
   ）のオリゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉｉ）Ｄ
   ＮＡポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素および（ｉｉ
   ｉ）デオキシリボヌクレオチドを含む標的核酸を増幅す
   るためのキット。
4. （４）前記（イ）における第二オリゴヌクレオチドとし
   て、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモー
   ター領域を有するオリゴヌクレオチドを用いて、前記操
   作（ａ）（ｂ）および（ｃ）を実施するか、または前記
   操作（ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）および／または（
   ｅ）を実施するか、または前記操作（ａ）（ｂ）（ｃ）
   および（ｄ）および／又は（ｅ）を行い、操作（ｄ）お
   よび／又は操作（ｅ）を少なくとも２回繰り返した後、
   ＲＮＡポリメラーゼにより連結伸長オリゴヌクレオチド
   または標的核酸の増幅物からＲＮＡ転写物を得ることを
   特徴とする標的核酸の増幅方法。
5. （５）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチドおよび前記
   （イ）のオリゴヌクレオチド、（ｉ）連結酵素、（ｉｉ
   ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／又は逆転写酵素、（ｉｉ
   ｉ）デオキシリボヌクレオチド、（ｉｖ）リボヌクレオ
   チドおよび（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼを含む標的核酸を
   増幅するためのキット。
6. （６）前記（ア）における第一オリゴヌクレオチドおよ
   び／又は前記（イ）における第二オリゴヌクレオチドと
   して、標識したオリゴヌクレオチドを用い、前記操作（
   ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）および／又は（ｅ）を実
   施するか、または前記操作（ａ）（ｂ）（ｃ）および（
   ｄ）および／又は（ｅ）を行い、操作（ｄ）および／又
   は操作（ｅ）を少なくとも２回繰り返した後、該標識を
   測定することにより、標的核酸を検出することを特徴と
   する標的核酸の検出方法。
7. （７）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチドおよび前記
   （イ）のオリゴヌクレオチドであって、（ア）における
   第一オリゴヌクレオチドおよび／又は（イ）における第
   二オリゴヌクレオチドを標識したオリゴヌクレオチド、
   （ｉ）連結酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／
   又は逆転写酵素および（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオ
   チドを含む標的核酸を検出するためのキット。
8. （８）前記（イ）における第二オリゴヌクレオチドとし
   て、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモー
   ター領域を有する第二オリゴヌクレオチドを用い、前記
   操作（ａ）（ｂ）および（ｃ）を実施するか、または前
   記操作（ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）および／または
   （ｅ）を実施するか、または前記操作（ａ）（ｂ）（ｃ
   ）および（ｄ）および／または（ｅ）を行い、操作（ｄ
   ）および／または（ｅ）を少なくとも２回繰り返した後
   、ＲＮＡポリメラーゼにより連結伸長オリゴヌクレオチ
   ドまたは標的核酸の増幅物からＲＮＡ転写物を得、該Ｒ
   ＮＡ転写物を測定することにより、標的核酸を検出する
   ことを特徴とする標的核酸の検出方法。
9. （９）前記（ア）の第一オリゴヌクレオチドおよび５’
   末端側にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター領域
   を有する前記（イ）の第二オリゴヌクレオチド、（ｉ）
   連結酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび／または
   逆転写酵素、（ｉｉｉ）デオキシリボヌクレオチド、（
   ｉｖ）リボヌクレオチドおよび（ｖ）ＤＮＡポリメラー
   ゼを含む標的核酸を検出するためのキット。