JPH05123171A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定核酸を簡便に増幅する。 【構成】 ５’末端から３’末端に向かって、順次、特
定核酸配列の一部に相同的な塩基配列Ａと該特定核酸配
列の一部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少なくとも
有するオリゴヌクレオチドを試料と反応させ、アニール
したオリゴヌクレオチドをプライマーとして伸長反応さ
せた後、未反応のオリゴヌクレオチドを分解して残った
上記塩基配列をプライマーとしてさらに伸長生成物を合
成させる。 【効果】 非特異的反応が抑制され、特定の配列のみを
増幅することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は試料中に存在する特定の
核酸配列を増幅し、それを検出するための方法に関す
る。本発明は特に与えられた核酸から任意に特定の核酸
配列を初期に存在する量に比較してより大量に生成させ
る方法に関する。該核酸は単鎖でも二重鎖でも良く、比
較的純粋な状態であっても、混合物の一成分であっても
よい。

【従来技術】

【０００２】近年、ハイブリダイゼーションによる核酸
配列の検出は、遺伝病、癌、感染症等の診断のために有
効な手段として汎用されるようになってきた。核酸配列
検出法において、標的とする塩基配列は対象となる核酸
のほんの僅かな部分である場合があり、非放射性標識プ
ローブや末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオ
チドプローブを用いた検出法では、感度上の問題等によ
りその検出が困難である。そのため、プローブ検出シス
テムの感度を向上させるために多くの努力がなされてい
る（W087/03622など）。また、感度向上の手段として、
目的とする特定核酸配列をＤＮＡポリメラーゼにより増
幅させる方法（特開昭61-274697 号公報等；以下「PCR
」 と略すことがある）が開示された。しかしこの方法
では、プライマーのアニール、伸長反応、変性を繰返す
ための加熱、冷却操作を頻繁に行なう必要があり、特別
の機器を用いるか、又は繁雑な労力を要する。また該方
法ではプライマーとして２本のオリゴヌクレオチドを用
いるが、これらが非特異的にアニールした場合でもＤＮ
Ａポリメラーゼによる増幅が起こる場合があり、プライ
マーの特異性が厳しく要求されている。ＤＮＡリガーゼ
を用いる増幅法も開示された（WO89/12696、特開平2-29
34号公報など) 。しかし、この方法ではＤＮＡリガーゼ
が平滑末端を連結する反応(blunt end ligation)により
非特異的増幅が起こる。これの回避法としてWO89/12696
では３組以上のプローブを用いているが、プローブ数が
多くコスト高となってしまう。さらにＤＮＡリガーゼと
ＤＮＡポリメラーゼを組合せた方法が公開されている。
また一つの方法(WO90/01069)では、２組４本以上のオリ
ゴヌクレオチドを用いる必要があり、コストが高くなる
という問題がある。他法（特開平2-268683号公報）で
は、３本のオリゴヌクレオチドを必要とし、そのうちの
２本は数十ヌクレオチドを必要とするのでコストが高く
なる。また、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡよりＲ
ＮＡが生成されることは周知であり、ＲＮＡポリメラー
ゼを用いて核酸配列の増幅を行う方法も開示されている
(WO89/01050)。しかしながら、この方法ではＲＮＡポリ
メラーゼによる転写増幅のみでは充分な増幅は困難であ
る。従って、生成したＲＮＡに再度逆転写酵素を作用さ
せＤＮＡを生成させる操作を実施している。一般的に逆
転写酵素によるＤＮＡへの転写はＤＮＡポリメラーゼに
よるＤＮＡ複製に比べて、読取り間違いを生じ易いとい
う欠点がある。一方、目的とする核酸にプローブをハイ
ブリダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプロー
ブのみを増幅する方法（BIO/TECHNOLOGY, vol.6, 1197,
1988)も知られている。しかしこの方法では非特異反応
により結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇
をきたすという問題がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、目標
とする特定核酸配列を簡便に増幅させる方法を提供する
ことである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、５’末端から
３’末端に向って、順次、特定核酸配列の一部に相同な
塩基配列Ａと、該特定核酸の一部の３’下流に相補的な
塩基配列Ｂを少なくとも有するオリゴヌクレオチドを用
いることによって、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は次の
要旨を有するものである。 （１）試料中に含まれる少なくとも１つの特定核酸配列
の増幅法であって、下記操作を含むことを特徴とする核
酸配列の増幅方法。 （ａ）：５’末端から３’末端に向って、順次、特定核
酸配列の一部に相同な塩基配列Ａと該特定核酸配列の一
部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少なくとも有する
オリゴヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中
の特定核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールさ
せる。 （ｂ）：前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、
伸長反応を行う。 （ｃ）：未反応のオリゴヌクレオチドの、特定核酸配列
の一部に相同な塩基配列部Ａの少なくとも一部を残し、
他の部分を分解する。 （ｄ）：操作（ｂ）で伸長された生成物を変性して、単
鎖分子を生成させる。 （ｅ）：操作（ｄ）から生じた単鎖分子を鋳型とし、操
作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、伸長生成物を合成させる。 （２）上記操作（ａ）〜（ｅ）に加えて、下記操作
（ｆ）又は（ｆ’）を含む。 操作（ｆ）：操作（ｅ）で得られた伸長生成物を変性
し、単鎖分子を生成させ 、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして、伸長生成物の合成を少なくとも１回繰返す。 操作（ｆ’）：操作（ｅ）で得られた伸長生成物に、上
記操作（ａ）〜（ｅ）を少なくとも１回繰り返す。 （３）上記操作（ａ）〜（ｅ）に加えて、下記操作
（ｆ）および（ｇ）を含む。 操作（ｆ）：操作（ｅ）で得られた伸長生成物を変性
し、単鎖分子を生成させ、操作（ｃ）で得られたオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、伸長生成物の合成を
少なくとも１回繰り返す。 操作（ｇ）：操作（ｆ）で得られた増幅産物に上記操作
（ａ）〜（ｅ）あるいは操作（ａ）〜（ｆ）を少なくと
も１回繰り返す。

【０００５】本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端
から３’末端に向って、順次、特定核酸配列の一部に相
同な塩基配列Ａと該特定核酸配列の一部の３’下流に相
補的な塩基配列Ｂを少なくとも有するように設計されて
いる。その構造、長さは特に制限されない。一般的に、
該特定核酸の一部に相同的な塩基配列Ａおよび／又は該
特定核酸の一部に相補的な塩基配列Ｂの長さは、6 〜10
0 ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さ
が使用される。

【０００６】本発明で使用するオリゴヌクレオチドにお
いて、前記特定核酸の一部に相同な塩基配列Ａとその
３’下流相に補的な塩基配列Ｂとの間には、所望により
スペーサーを設けることも可能である。このスペーサー
は一般的に１〜100 個、好ましくは１〜20個のヌクレオ
チドであればよい。このオリゴヌクレオチドは、例えば
ＡＢＩ社（Applied BiosystemsInc.)のＤＮＡシンセサ
イザー391 型を用いて、ホスホアミダイト法により合成
できる。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネー
ト法、チオホスファイト法等いかなる方法で合成しても
よい。また、生物学的起源から、例えば制限エンドヌク
レアーゼ消化物から単離してもよい。

【０００７】次の本発明を図を用いて説明する。図１は
本発明の原理を模式的に示す。尚、図中１は特定核酸配
列、２はオリゴヌクレオチドを示す。該オリゴヌクレオ
チドは特定核酸配列の一部に相同な塩基配列Ａ（5'末端
側）および特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列Ｂ
（3'末端側) を有する。塩基配列Ａと塩基配列Ｂの間に
はスペーサーが含まれている。操作（ａ）： 特定核酸配列にオリゴヌクレオチドをアニ
ールさせる。特定核酸配列が二重鎖の場合は加熱、アル
カリ処理、酸処理などにより変性して１本鎖としてお
く。加熱変性は例えば８０〜１０５℃で１〜５分間処理
することで実施できる。アルカリ処理は例えば、0.2 〜
１規定の苛性ソーダ存在下で１〜３０分処理し、等量の
塩酸で中和して用いることができる。酸処理は例えば0.
01〜１規定の塩酸存在下で１〜３０分処理し苛性ソーダ
で中和して用いることができる。他の方法として酵素的
に鎖分解を行なうこともできる。アニールはオリゴヌク
レオチドに、好ましくは最大のアニール選択性をもたら
すように選択された温度において行われる。一般的には
特定核酸配列とオリゴヌクレオチドが特異的に結合し、
且つミスマッチによる非特異的結合が最小となるように
昇温させて行われる。通常は３０〜７０℃付近でアニー
ルさせるが、特に制限はない。

【０００８】操作（ｂ）：上記オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして、核酸ポリメラーゼを用いて核酸合成反
応を行う。当該操作は、例えばｄＮＰＴ(dATP,dCTP,dGT
P,dTTPの４種のデオキシリボヌクレオチド) およびＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えば大腸菌（E.coli）ＤＮＡ１Ａポ
リメラーゼ、クレノウフラグメント(Klenow fragment)
、T4ＤＮＡポリメラーゼ、T7ＤＮＡポリメラーゼ、The
rmus aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus thermop
hilusＤＮＡポリメラーゼなど、又は逆転写酵素を用い
て、特定核酸を鋳型にして伸長反応を行わせることによ
って行われる。上記方法は例えばジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Journal ofMolecular Biol
ogy, 56, 341-361, 1971）に記載されている。操作（ｃ）： 上記伸長反応において反応しなかった未反
応のオリゴヌクレオチドは、該特定核酸配列の一部に相
同な塩基配列部Ａを少なくとも一部残し、他の部分を分
解する。当該操作はエキソヌクレアーゼＩＩＩ、Bal31
ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼまたは制限酵素などを
用いて行う。残された塩基配列は上記特定核酸に相同性
を有する塩基配列Ａと同一であることが望ましいが、該
配列Ａに包含される配列を有していればよい。また必要
により、当該操作を補助するために、オリゴヌクレオチ
ドの特定核酸配列の一部に相同な塩基配列部Ａをホスホ
ロチオエート型オリゴヌクレオチドとしておく方法、ま
たはオリゴヌクレオチドに、該オリゴヌクレオチドの塩
基配列ＡおよびＢに相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを添加して２本鎖としておく方法もある。操作（ｄ） ：操作（ｂ）で得られた伸長生成物を変性さ
せて単鎖とする。該操作において、変性は前記特定核酸
配列の変性と同様な方法により実施できるが、特に加熱
による変性が好ましい。操作（ｅ）： 操作（ｄ）で得られた単鎖である伸長生成
物を鋳型とし、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして、核酸合成反応を行なう。本発明
では、上記操作（ａ）〜（ｅ）を行うことにより１つの
核酸を２つに増幅させることができる。本発明では上記
操作（ａ）〜（ｅ）に加えて、さらに操作（ｆ）または
（ｆ’）を行う。操作（ｆ）： 操作（ｅ）で得られた伸長生成物を変性し
て、単鎖分子を生成させ、操作（ｃ）で得られたオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、伸長生成物の合成を
繰返す。操作（ｆ’）： 操作（ｅ）で得られた伸長生成物に、上
記操作（ａ）〜（ｅ）を少なくとも１回繰返す。該操作
により、核酸の特定の配列を簡便に大量に得ることがで
きる。また本発明では上記操作（ａ）〜（ｆ）に加え
て、操作（ｇ）を行う。操作（ｇ）： 操作（ｆ）で得られた増幅物に上記操作
（ａ）〜（ｅ）あるいは操作（ａ）〜（ｆ）を少なくと
も１回繰り返す。すなわち上記操作（ｅ）の生成物およ
び／又は操作（ｆ）を繰返して得られた増幅産物を、試
料核酸として操作（ａ）〜（ｅ）または（ａ）〜（ｆ）
を少なくとも１回繰り返し行なうことにより、より大量
の増幅物を得ることができる。またこの時、オリゴヌク
レオチドを第１回の操作（ａ）で使用したオリゴヌクレ
オチドと異なるオリゴヌクレオチドに換えて行なうこと
により、より特異性の高い特定核酸配列の増幅物が得ら
れる。

【０００９】

【発明の効果】本発明の核酸増幅法によれば、オリゴヌ
クレオチドが５’末端から３’末端に向かって、順次、
特定核酸配列の一部に相同な塩基配列Ａおよび該特定核
酸塩基配列の一部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少
なくとも有することにより、試料中の特定核酸配列にオ
リゴヌクレオチドの該塩基配列部Ｂがアニールし、次い
で伸長反応が行われる。特定核酸の塩基配列Ａに相補的
な塩基配列Ａ’が形成される。次いで、未反応のオリゴ
ヌクレオチドを該特定核酸の一部に相同な塩基配列部Ａ
を少なくとも一部残し、他の部分を分解してプライマー
とする。このプライマーを伸長生成物中の塩基配列Ａ’
にアニールさせて伸長反応を繰り返し行い、増幅反応が
行われる。すなわち、試料と混合して反応させるオリゴ
ヌクレオチドを１種しか用いないので、非特異反応が抑
制される。さらに、操作（ａ）〜（ｅ）を繰り返し行う
操作においては、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオ
チド１種をプライマーとして用いるため、操作（ａ）お
よび／又は操作（ｅ）で仮にミスハイブリダイゼーショ
ンをした場合でも、非特異物の顕著な増幅が行なわれな
いので、高いＳ／Ｎ（Signal/Noise）比が得られる。さ
らに、本発明の核酸増幅法は、プローブを使用する従来
の増幅方法に比して、ミスマッチや非特異的ハイブリダ
イゼーションにより残存したプローブの増幅がなく、Ｓ
／Ｎ比を増加させることができる。

【００１０】

【実施例】以下に、本発明を具体的に説明することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。 （参考例１） 各種オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー391 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種
合成した。 １）第１オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
腸炎ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct Haemolysin)
遺伝子の 483番目から 504番目のヌクレオチド配列と相
補的な配列、スペーサーおよび腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝
子の52番目から74番目のヌクレオチド配列と相同な配列
を有する（配列表１）。 ２）第２オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチド
は、第１オリゴヌクレオチドの19番目から50番目に相補
的な配列を有する（配列表２）。また、３’末端にアミ
ノ基が結合している。手法はＡＢＩ社マニュアルに従
い、0.2 μM スケールで実施した。各種オリゴヌクレオ
チドの脱保護はアンモニア水で55℃で一夜実施した。精
製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施し
た。

【００１１】（実施例１） 特定核酸の増幅方法 操作（ａ） 参考例１の第１オリゴヌクレオチド４０pmol、ＴＤＨ産
性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノ
ム核酸１ngおよび100pgとを共に50μl の反応液に加え
た。94℃に５分間保った後、Tth ＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡製）４単位加え、94℃に１分間保った後、60℃
に２分間保温し、アニールさせた。 反応液 10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (pH8.9) 1.5mM ＭｇＣｌ₂ 80mM ＫＣｌ 500μg/ml ＢＳＡ 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 2mM ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＴＴＰ 操作（ｂ） 75℃で１分30秒間保温し伸長反応を行なった。 操作（ｃ） 37℃に温度を下げ、エキソヌクレーゼＩＩＩを 340単位
加え５分間保温し、操作（ｂ）で未反応のオリゴヌクレ
オチドの一部を分解した。 操作（ｄ） 94℃２分間の保温の後、下記のサイクルにより増幅を行
なった。 変性 94 ℃, 60秒 アニール 60 ℃, 120 秒 伸長反応 75 ℃, 90秒 サイクル数 30 回 操作（ｅ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたＤＮＡを確認した（図
２）。結果は480mer付近にＤＮＡが合成されていた。こ
れは、第１オリゴヌクレオチドが伸長し、未反応の第１
オリゴヌクレオチドが分解されて、特定核酸配列の一部
と相同な配列が残ってプライマーとして作用し、伸長生
成物を鋳型としてＤＮＡ分子が合成されたことを示して
いる。

【００１２】（実施例２） 特定核酸の増幅方法 操作（ａ） 参考例１のオリゴヌクレオチド40pmol、ＴＤＨ産性腸炎
ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸
１ngおよび 100pgとを共に50μl の反応液に加えた。94
℃に５分間保った後、Tth ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡
製）４単位加え、94℃に１分間保った後、60℃に２分間
保温し、アニールさせた。 反応液 10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.9) 1.5mM ＭｇＣｌ₂ 80mM ＫＣｌ 500μg/ml ＢＳＡ 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 2mM ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＴＴＰ 操作（ｂ） 75℃で１分30秒間保温し伸長反応を行なった。 操作（ｃ） 第２オリゴヌクレオチドを40pmol加え、75℃で１分間保
温した後、60℃で２分間保温し、未反応の第１オリゴヌ
クレオチドにアニールさせた。 操作（ｄ） 37℃に温度を下げ、エキソヌクレアーゼＩＩＩを 340単
位加え５分間保温し、操作（ｂ）で未反応のオリゴヌク
レオチドの一部を分解した。 操作（ｅ） 94℃２分間の保温の後、下記のサイクルにより増幅を行
なった。 変性 94 ℃, 60秒 アニール 60 ℃, 120 秒 伸長反応 75 ℃, 90秒 サイクル数 30 回 操作（ｆ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたＤＮＡを確認した（図
２）。結果は480mer付近にＤＮＡが合成されていた。こ
れは、第１オリゴヌクレオチドが伸長した後、未反応の
第１オリゴヌクレオチドが特定核酸配列の一部と相同な
塩基配列を残し、他の部分が分解され、その結果、プラ
イマーとして作用し、伸長生成物を鋳型としてＤＮＡ分
子が合成されたことを示している。

【配列表】

【００１３】配列番号：1 配列の長さ：50 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct H
aemolysin)遺伝子の483 番目から504 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する。 存在位置：23..27 他の特徴：スペーサー 存在位置：27..50 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ(Thermostable Direct H
aemolysin)遺伝子の52番目から74番目のヌクレオチド配
列と相同な配列を有する。 配列 ACTACCACTC TCATATGCTT CTAAAAAGCT GCATTCAAAA CATCTGCTTT 50

【００１４】配列番号：2 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..32 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：第一オリゴヌクレオチドの19番目から50番目
のヌクレオチド配列と相補的な配列を有する。 配列 AAAGCAGATG TTTTGAATGC AGCTTTTTAG AA 22

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の原理を模式的に示した図である。図
中、１は特定核酸、２はオリゴヌクレオチドを示す。

【図２】実施例１において合成されたＤＮＡの電気泳動
パターンを示す。レーン１はマーカー、２、３、４はそ
れぞれ実施例２の核酸試料１ng、100pg 、０g に対応し
ている。

【図３】実施例２において合成されたＤＮＡの電気泳動
パターンを示す。レーン１はマーカー、２、３、４はそ
れぞれ実施例２の核酸試料１ng、100pg 、０g に対応し
ている。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中に含まれる少なくとも１つの特定
   核酸配列の増幅法であって、下記操作を含むことを特徴
   とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：５’末端から３’末端に向って、順次、特
   定核酸配列の一部に相同な塩基配列Ａと該特定核酸配列
   の一部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少なくとも有
   するオリゴヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試
   料中の特定核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニー
   ルさせる。 操作（ｂ）：アニールした前記オリゴヌクレオチドをプ
   ライマーとして、伸長反応を行う。 操作（ｃ）：未反応のオリゴヌクレオチドの、特定核酸
   配列の一部に相同な塩基配列部Ａの少なくとも一部を残
   し、他の部分を分解する。 操作（ｄ）：操作（ｂ）で伸長された生成物を変性し
   て、単鎖分子を生成させる。 操作（ｅ）：操作（ｄ）から生じた単鎖分子を鋳型と
   し、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチドをプライ
   マーとして用い、伸長生成物を合成させる。
2. 【請求項２】 試料中に含まれる少なくとも１つの特定
   核酸配列の増幅法であって、下記工程を含むことを特徴
   とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：５’末端から３’末端に向って、順次、特
   定核酸配列の一部に相同な塩基配列Ａと該特定核酸配列
   の一部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少なくとも有
   するオリゴヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試
   料中の特定核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニー
   ルさせる。 操作（ｂ）：アニールした前記オリゴヌクレオチドをプ
   ライマーとして、伸長反応を行う。 操作（ｃ）：未反応のオリゴヌクレオチドの、特定核酸
   配列の一部に相同な塩基配列部Ａの少なくとも一部を残
   し、他の部分を分解する。 操作（ｄ）：操作（ｂ）で伸長された生成物を変性し
   て、単鎖分子を生成させる。 操作（ｅ）：操作（ｄ）から生じた単鎖分子を鋳型と
   し、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチドをプライ
   マーとして用い、伸長生成物を合成させる。および 操作（ｆ）：操作（ｅ）で得られた伸長生成物を変性
   し、単鎖分子を生成させ、操作（ｃ）で得られたオリゴ
   ヌクレオチドをプライマーとして、伸長生成物の合成を
   少なくとも１回繰返す。
3. 【請求項３】 試料中に含まれる少なくとも１つの特定
   核酸配列の増幅法であって、下記操作を含むことを特徴
   とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：５’末端から３’末端に向って、順次、特
   定核酸配列の一部に相同な塩基配列Ａと該特定核酸配列
   の一部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少なくとも有
   するオリゴヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試
   料中の特定核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニー
   ルさせる。 操作（ｂ）：前記オリゴヌクレオチドをプライマーとし
   て、伸長反応を行う。 操作（ｃ）：未反応のオリゴヌクレオチドの、特定核酸
   配列の一部に相同な塩基配列部Ａの少なくとも一部を残
   し、他の部分を分解する。 操作（ｄ）：操作（ｂ）で伸長された生成物を変性し
   て、単鎖分子を生成させる。 操作（ｅ）：操作（ｄ）から生じた単鎖分子を鋳型と
   し、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチドをプライ
   マーとして用い、伸長生成物を合成させる。 操作（ｆ’）：操作（ｅ）で得られた伸長生成物に、上
   記操作（ａ）〜（ｅ）を少なくとも１回繰返す。
4. 【請求項４】 試料中に含まれる少なくとも１つの特定
   核酸配列の増幅法であって、下記工程を含むことを特徴
   とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：５’末端から３’末端に向って、順次特定
   核酸配列の一部に相同な塩基配列Ａと該特定核酸配列の
   一部の３’下流に相補的な塩基配列Ｂを少なくとも有す
   るオリゴヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料
   中の特定核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニール
   させる。 操作（ｂ）：上記オリゴヌクレオチドをプライマーとし
   て、伸長反応させる。 操作（ｃ）：未反応のオリゴヌクレオチドの、特定核酸
   配列の一部に相同な塩基配列部Ａを少なくとも一部残
   し、他の部分を分解する。 操作（ｄ）：操作（ｂ）で伸長された生成物を変性し
   て、単鎖分子を生成させる。 操作（ｅ）：操作（ｄ）から生じた単鎖分子を鋳型と
   し、操作（ｃ）で得られたオリゴヌクレオチドをプライ
   マーとして用い、伸長生成物を合成させる。 操作（ｆ）：操作（ｅ）で得られた伸長生成物を変性
   し、単鎖分子を生成させ、操作（ｃ）で得られたオリゴ
   ヌクレオチドをプライマーとして、伸長生成物の合成を
   少なくとも１回繰返す。および 操作（ｇ）：操作（ｆ）で得られた増幅産物に上記操作
   （ａ）〜（ｅ）あるいは操作（ａ）〜（ｆ）を少なくと
   も１回繰返す。
5. 【請求項５】 操作（ｆ）で使用されるオリゴヌクレオ
   チドが第１回の操作（ａ）で使用されたオリゴヌクレオ
   チドと異なることを特徴とする請求項３の核酸配列の増
   幅方法。
6. 【請求項６】 操作（ｇ）で使用されるオリゴヌクレオ
   チドが第１回の操作（ａ）で使用されたオリゴヌクレオ
   チドと異なることを特徴とする請求項４の核酸配列の増
   幅方法。