JPH1175880A - オリゴヌクレオチドの標識法およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、任意の塩基配列を有する５’側の配
列とアデニン−チミンもしくはウラシル、又はグアニン
−シトシンの組合せからなるオリゴヌクレオチドの３’
側を標識する方法およびその利用法を提供する。 【構成】任意の塩基配列を有する５’側の配列と（ＸＹ
ｍ）ｎで表される繰り返し配列を有する３’側の配列
（ここで、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウラシ
ル、又はグアニン−シトシンの組合せからなり、ｎは１
以上の整数を表す）とからなるオリゴヌクレオチドの
３’側に、前記繰り返し配列を構成するヌクレオチドの
標識体をＤＮＡポリメラーゼで付加することからなる該
オリゴヌクレオチドの標識法及び該方法によって得られ
る標識オリゴヌクレオチド並びに該標識法及び該標識オ
リゴヌクレオチドを用いる特定遺伝子の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は合成オリゴヌクレオ
チドの標識方法に関する。更に詳細には、５’側に任意
の塩基配列及び３’末端に（ＸＹ）ｎで表される繰り返
し配列（ここで、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウ
ラシル、又はグアニン−シトシンの組合せからなり、ｎ
は塩基の個数を表す）を有するオリゴヌクレオチドに、
ラジオアイソトープ（ＲＩ）で標識又は標識化合物で修
飾したヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで付加伸長さ
せることからなる該オリゴヌクレオチドの標識法および
その利用に関する。

【０００２】

【従来技術】合成オリゴヌクレオチドは近年分子生物学
のあらゆる分野に応用されている。特に標識した合成オ
リゴヌクレオチドは、ある特定の配列をもった遺伝子を
検出する際に最も簡便に調製できるプローブとして汎用
されている。プローブを用いた遺伝子の検出感度は、一
義的にはプローブに取り込まれた個々の標識化合物が発
するシグナルの強さ及び標識化合物の数によって決ま
る。したがって、生体内あるいは細胞内に微量に存在す
る特定遺伝子を検出するには高感度のプローブを効率よ
く作用させる必要がある。

【０００３】ＲＩは標識化合物として最も強いシグナル
を示すが、「放射線を発生するために特別な設備を必要
とする」あるいは「有効期間が短い」等の理由により汎
用性に欠ける。非ＲＩの標識化合物として、フルオレセ
イン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）やローダミン（Ｒｈｏ
ｄａｍｉｎｅ）といった蛍光を発する標識化合物（Ｄｉ
ｒｋｓら（１９９１） Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．
１９４， ３１０−３１５）、抗体と反応するビオチ
ン（Ｂｉｏｔｉｎ）を介した酵素学的発色系の標識化合
物（Ｌａｎｇｅｒら（１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８， ６６３
３−６６３７）等が挙げられるが、これらのシグナルは
ＲＩ程強くない。近年、シグナル強度がＲＩに匹敵する
非ＲＩの標識化合物としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が
注目を浴びている（Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９０）Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔ．１８３−１９４）。

【０００４】従来、合成オリゴヌクレオチドの標識に
は、酵素や色素などの標識化合物又はＲＩ標識されたア
ミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを化学合成する際
に化学修飾する方法（Ｐｉｅｌｅｓｓら（１９９０）
Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １８， ４３５
５−４３６０）、デオキシヌクレオチド・トリフォスフ
ェート（ｄＮＴＰ）もしくはジデオキシヌクレオチド・
トリフォスフェート（ｄｄＮＴＰ）の標識体をターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄ
Ｔ）の酵素反応によってオリゴヌクレオチドの３’末端
に付加するテイリング法（Ｓｃｈｍｉｚら（１９９１）
Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９２， ２２２−
２３１）及び光化学反応でビオチンを共有結合させるフ
ォトビオチン法（Ｆｏｒｓｔｅｒら（１９８５） Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３， ７４５−７
６１）等が使用されてきた。

【０００５】一般に、テイリング法を用いた場合の検出
感度は、取り込まれる標識分子の数に依存する。例え
ば、ＴｄＴは、平均的して数十塩基の長さのテイル
（尾）を付加する（Ｓｃｈｍｉｔｚら（１９９１） Ａ
ｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９２， ２２２−２３
１）。この方法により得られるオリゴプローブを用いて
ノーザンブロットハイブリダイゼーション又はサザンブ
ロットハイブリダイゼーションを行った場合には、標的
ＤＮＡあるいはＲＮＡを１ｐｇまで検出することができ
る。

【０００６】さらに微量のものを検出する場合には、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉら （１
９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８７−４９
１）が使用される。ＰＣＲ法は、微量に存在する標的遺
伝子の遺伝子断片を１組以上のプライマーを用いて増幅
させ、この増幅した遺伝子断片を検出することによって
標的遺伝子の存在を明らかにする方法である。したがっ
て、組織などに存在する微量の標的遺伝子を検出するに
は非常に有効な方法と言える。しがしながら、この方法
では遊離した遺伝子断片を検出するために、例えば、プ
ローブを組織に直接作用させるノーザンブロットハイブ
リダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンとは異なり、標的遺伝子の局在を明らかにすること
はできない。また、ＰＣＲ法に関しては、増幅させる遺
伝子の部位によっては増幅効率が低く高感度を得られな
い場合があることや特定のＲＮＡの存在をＰＣＲ法で証
明するには逆転写反応を要し間接的な証明しかできない
等、問題点が指摘される。

【０００７】前述したように、非ＲＩで標識したプロー
ブを用いて目的遺伝子を高感度に検出するには、多量に
標識化合物をオリゴヌクレオチドに取り込ませる必要が
ある。しかしながら、このようなプローブを使用したと
きには、ハイブリダイゼーションにあずかる配列部位の
割合が小さくなり、立体障害を起こすためにハイブリダ
イゼーション効率が落ちるという問題を生じることがあ
る。特にイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ｉ
ｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）による組
織内の特定の遺伝子を検出する際には、プローブが組織
の中へ浸透していかなければならないために、プローブ
のサイズは極めて重要である。

【０００８】また、従来の酵素反応を用いたオリゴヌク
レオチドの標識法は、非特異反応が高くイン・サイチュ
・ハイブリダイゼーションには適さない。すなわち、オ
リゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、例えば、
ＴｄＴを用いて標識化合物が結合したｄＮＴＰ又はｄｄ
ＮＴＰをオリゴヌクレオチドの５’又は３’側に付加し
ようとすれば、この酵素は３塩基以上の核酸に非特異的
にｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰを付加する活性を持っている
ために、組織又は細胞内に存在する目的以外の核酸断片
をも標識してしまい、その結果、非特異反応が生じるこ
とになる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】このように従来の方法
は、予め標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして
用いる方法であるために、感度を高めるための標識化合
物の取り込み量とハイブリダイゼーションの反応性との
間に矛盾がある。特に、イン・サイチュ・ハイブリダイ
ゼーションにおいては反応性の低下が問題となる。

【００１０】本発明は、５’側に検出しようとする遺伝
子に対し相補的なオリゴヌクレオチドを有し、３’側に
（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹは
アデニン−チミンもしくはウラシル、又はグアニン−シ
トシンの組合せからなり、ｎは１以上の整数を表す）を
有するオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及び
ＲＩで標識又は標識化合物で修飾したヌクレオチドを用
いて鋳型非依存的に標識する方法を提供することを目的
としている。

【００１１】また、本発明の他の目的は、上記のオリゴ
ヌクレオチドを標識する方法を利用し、組織、細胞又は
ウイルス等の特定遺伝子の検出方法を提供することにあ
る。

【００１２】本発明の更に他の目的は、上記方法により
標識した標識オリゴヌクレオチド、及び該標識オリゴヌ
クレオチドを用いて、組織、細胞又はウイルス等の特定
遺伝子の検出方法を提供することにある。

【００１３】本発明の更に他の目的は、上記の方法によ
り標識した標識オリゴヌクレオチドをプライマーとし、
ＰＣＲ法により特定遺伝子を検出するためのプローブの
作製方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、テルムス・
アクアテイクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼが、ＡＴの繰り返し配列
からなるオリゴマーを短時間で伸長させる酵素活性を有
することを発見し、更に、５’側にｐＵＣ１９プラスミ
ドの一部の塩基配列を有し、３’側に該繰り返し配列を
有するオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼ及び
ジゴキシゲニン標識したデオキシウラシル・トリフォス
フェート（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）を含む混液中、一定温度
で反応させることにより、該オリゴヌクレオチドの３’
側に標識ＡＵの繰り返し配列からなる長鎖が付加される
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】従って、本発明は、ｐＵＣ１９の一部の塩
基配列及びＡＴの繰り返し配列を有するオリゴヌクレオ
チドをＤＩＧ−ｄＵＴＰで標識する方法及び該方法によ
って得られる標識オリゴヌクレオチドを包含する。

【００１６】また、本発明は、上記方法及び標識オリゴ
ヌクレオチドを用いて、組織、細胞又はウイルス等に導
入されたｐＵＣ１９又は外来遺伝子を含むｐＵＣ１９を
検出することによる、特定遺伝子を検出する方法を包含
する。

【００１７】また、本発明は、５’側に任意の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを用いることによる、該配
列に対し相補的な配列を有する遺伝子を検出する方法を
包含する。

【００１８】又、本発明は、上記方法により得られる標
識オリゴヌクレオチドをプライマーとし、ＰＣＲ法によ
り、特定遺伝子を検出するためのプローブを作製する方
法を包含する。以下に、本発明について更に詳述する。

【００１９】本発明の方法及び標識オリゴヌクレオチド
は、５’側に任意の塩基配列を有し、３’側に（ＸＹ）
ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニン
−チミンもしくはウラシル、又はグアニン−シトシンの
組合せからなり、ｎは１以上の整数を表す）を有するオ
リゴヌクレオチド、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠
損したＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドの標識体に
より特徴づけられる。

【００２０】本発明を構成するオリゴヌクレオチドは、
化学的合成法、例えば、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、同装置のプロ
トコールに従った方法によって合成される。得られたオ
リゴヌクレオチドの脱保護とレジンからの切り出しは、
アンモニウム法により実施される。脱保護レジンから切
り出された粗オリゴヌクレオチドの精製は、核酸を精製
する際に通常使用される方法、例えば、電気泳動法、液
体クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を適宜選択
して行うことができる。

【００２１】また、オリゴヌクレオチドは、サムブルッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らが述べている一般的な遺伝子
のクローニング法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃ
ｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎ．Ｙ．，１９８９）又はＰＣＲなどの遺伝子組換え技
術により調製することが出来る。

【００２２】標的遺伝子と特異的に結合させるためのオ
リゴヌクレオチドの５’側配列は、特異的にハイブリダ
イズする長さであればどのような鎖長でも良い。好まし
くは、５’側の塩基が１５個以上であるオリゴヌクレオ
チドが使用される。

【００２３】（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここ
で、ＸとＹはアデニン−チミンもしくはウラシル、又は
グアニン−シトシンの組合せからなり、ｎは塩基の個数
を表す）は、少なくとも４塩基以上を必要とする。好ま
しくは、５〜２０塩基、更に好ましくは、２０塩基以上
を有するオリゴヌクレオチドが使用される。

【００２４】本発明のオリゴヌクレオチドを標識する方
法は、サザーンブロットハイブリダイゼーション、ノー
ザンブロットハイブリダイゼーション、ドットブロット
ハイブイリダイゼーション及びイン・サイチュ・ハイブ
リダイゼーション等において標的遺伝子を検出する際に
使用される。

【００２５】すなわち、本発明の方法は、標的遺伝子と
５’側に該標的遺伝子に対し相補的な塩基配列及び３’
側にＡＴ又はＡＵの繰り返し配列を有するオリゴヌクレ
オチドとを常法に従ってハイブリダイズした後、ヌクレ
オチド標識体及びＤＮＡポリメラーゼ存在下で、該ハイ
ブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末側に、標識
したＡＴ又はＡＵの繰り返し配列を伸長させることによ
って標的遺伝子を検出する方法の中で使用される。

【００２６】また、本発明の方法により得られる標識オ
リゴヌクレオチドは、プローブとして従来の方法と同様
に特定遺伝子を検出するのに利用される。

【００２７】ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス・サーモ
フィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ），サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、及びフィロコッカス
・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕ
ｓ）等由来の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠損した
ＤＮＡポリメラーゼから選択されるが、好ましくは、テ
ルムス・サーモフィルス由来の該ＤＮＡポリメラーゼが
使用される。

【００２８】標識ヌクレオチドとしては、32Ｐ，3Ｈ，3
5Ｓ等から選択されるラジオアイソトープで標識又はフ
ルオレセイン，ローダミン，テキサスレッド等から選択
される標識化合物で修飾したヌクレオチドが使用され
る。好ましくは、ジゴキシゲニン標識したヌクレオチド
が使用される。

【００２９】ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの
３’側がＡＴの繰り返し配列である場合は、標識Ａ及び
Ｔ又はＵが使用され、ＧＣの繰り返し配列の場合は、標
識Ｇ及びＣが使用される。

【００３０】ＤＮＡポリメラーゼ反応は、３０〜７５℃
の一定温度で行われる。好ましくは、５０〜７０℃の一
定温度で行われる。また、通常のＰＣＲにおいて使用さ
れるアニーリング温度５５℃と伸長反応温度７２℃で反
復処理を行うことによっても伸長反応を行うことが出来
る。標識した繰り返し配列の鎖長は、標的遺伝子の量又
は使用する反応系に応じ、適宜、反応時間を調節するこ
とにより変えることが出来る。

【００３１】

【発明の効果】本発明によると、オリゴヌクレオチドの
３’側を標識する方法及び標識オリゴヌクレオチド並び
に該標識法及び標識ヌクレオチドを利用することによ
り、特定遺伝子を検出する方法が提供される。

【００３２】例えば、本発明のオリゴヌクレオチド標識
法によると、オリゴプローブの標識化合物の取り込み量
は一般的に使用されているＴｄＴに比べて数倍から数十
倍優れており、それに伴いノーザンブロットハイブリダ
イゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ン法による遺伝子検出感度を従来法に比べて数倍から数
十倍上げることが可能である。

【００３３】また、本発明の方法によれば、イン・サイ
チュ・ハイブリダイゼーションにおいて組織の中でオリ
ゴプローブの標識を行えるので、プローブの組織浸透性
を妨げることなく、該プローブを標的遺伝子に結合させ
た後、高感度に標識することが可能である。イン・サイ
チュ・ポリメラーゼ・連鎖反応（ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣ
Ｒ）法と比較した場合、一定温度で反応が行えるため、
特殊な装置は必要としない。また鋳型非依存的にオリゴ
プローブの標識を行えるため、標的遺伝子にオリゴプラ
イマーをアニールさせた後、鋳型依存的に標識化合物を
取り込ませるＰｒｉｍｅｄ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
社）と異なり、プライマーの設計によって標識効率が変
わることはない。特定の配列を有するＲＮＡの存在を明
らかにする場合にも、オリゴプローブは直接ＲＮＡに結
合できるため、逆転写反応を必要としない。本発明の方
法は標的遺伝子とオリゴプローブは結合したままなので
組織内の遺伝子の局在を調べるのに適している。以下、
実施例に従い、本発明を更に詳細に説明する。

【００３４】

【実施例】実施例１；ＡＴ繰り返し配列が自己伸張することの証明 オリゴヌクレオチドがセルフプライミングによって伸張
することを配列表の配列番号１から３に記載のオリゴヌ
クレオチドを用いて調べた。配列番号：１に記載のオリ
ゴヌクレオチド（１ｐｍｏｌｅ/μｌ）５μｌ又は配列
番号：２及び３に記載のオリゴヌクレオチド（各１ｐｍ
ｏｌｅ/μｌ）各５μｌの計１０μｌに、ｄＡＴＰ及び
ｄＴＴＰ（各２ｐｍｏｌｅ／μｌ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ社）の混合液５μｌ、テルムス・アクアティクス
由来のＤＮＡポリメラーゼであるＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ社）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ， ＳｔｏｆｆｅｌＦｒａｇｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ社）、テルムス・サーモフィルス由来の
ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）、ΔＴｔｈ ＤＮＡ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）、サーモコッカ
ス・リトラリス由来であるＶｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢ
Ｓ社）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ-） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ
社）のいずれかを各２．５ユニット（Ｕ）及びそれぞれ
の酵素に添付の１０ｘ緩衝液５μｌを加えた反応液に水
を加えて全量を５０μｌにした後３０℃、３０分間反応
させた。反応産物は２％アガロースゲルで電気泳動した
後、エチジウムブロマイド染色によってオリゴヌクレオ
チドの長さを調べた（図２）。配列番号：２及び３の混
合ではプライマーは伸張せず、配列番号：１ではプライ
マーは伸張したことからプライマー同士がアニーリン
グ、伸張、フレームシフトを起こして伸張するのでな
く、セルフプライミングによって伸張することが明らか
になった。

【００３５】実施例２：オリゴヌクレオチドへのＡＴ繰
り返し配列の付加 オリゴヌクレオチドプローブのＡＴ繰り返し配列の付加
反応（テイリング反応）をオリゴヌクレオチドの濃度を
変えて調べた。使用したオリゴヌクレオチドは配列表の
配列番号：４に記載の塩基配列を有する。１０ｐｍｏｌ
ｅ／μｌの該オリゴヌクレオチドを蒸留水で１０倍希釈
列を作製し、これら各５μｌに、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）
各０．２ｍＭと２．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．０）及び５０ｍＭ 塩化カリ
ウムの混液に溶解したテルムス・アクアティクス由来の
ＤＮＡポリメラーゼであるＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）２．５Ｕを含む反
応溶液４５μｌを加えた全５０μｌを６５℃、６時間反
応させた。反応産物は２％アガロースゲルで電気泳動し
た後、エチジウムブロマイド染色によってオリゴヌクレ
オチドの濃度差によるテイリング効率を調べた（図
３）。オリゴヌクレオチドのテイリング効率はオリゴヌ
クレオチド濃度が薄いほど良く、５０ｐｍｏｌｅ／５０
μｌで約２，０００塩基、５ｐｍｏｌｅ／５０μｌで約
１０，０００塩基以上のＡＴ繰り返し配列が付加され
た。

【００３６】実施例３：テイリング反応の経時的変化 オリゴヌクレオチドプローブのテイリング反応を経時的
に調べた。オリゴヌクレオチドは実施例２と同じものを
使用した。１０ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴヌクレオチド
５μｌに上記の反応溶液４５μｌを加えた全５０μｌを
６５℃で任意の時間反応させた後サンプリングし、電気
泳動を行うまでの間、室温で保存した。反応産物は２％
アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイ
ド染色によってオリゴヌクレオチドの長さを調べた（図
４）。オリゴヌクレオチドの長さは反応後３０分で５０
０塩基の鎖長に達した。

【００３７】実施例４：Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及
びＴｄＴのテイリング効率の比較 オリゴヌクレオチドプローブのテイリング効率をＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼとＴｄＴとで比較した。オリゴヌ
クレオチドは実施例２と同じものを使用した。標識化合
物にはＤＩＧを使用し、テイリング効率はＤＩＧ核酸検
出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
社）を用い、そのプロトコールに従って調べた。 Ｔａ
ｑ ＤＮＡ ポリメラーゼの場合、５０ｐｍｏｌｅ オ
リゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１９ｍ
Ｍ ｄＴＴＰ、０．０１ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、２．
５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ，Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ を含む５０μ
ｌを６５℃で３０分間反応させた。

【００３８】ＴｄＴの場合、５０ｐｍｏｌｅオリゴヌク
レオチド、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１９ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、０．０１ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、２ｍＭ 塩化
コバルト、１００ｍＭ カコジル酸カリウム（ｐＨ
７）、０．２ｍＭ ＤＴＴに溶解した１５Ｕ ＴｄＴ
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を含む５０μｌを３７℃で９
０分間反応させた。反応産物は１０倍希釈列を作製後、
その５μｌをドットブロットし、ＤＩＧ標識されたオリ
ゴヌクレオチドを検出した。その結果を図５に示す。テ
イリング効率はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた方
がＴｄＴを用いたよりも１０倍以上高かった。

【００３９】実施例５：ハイブリダイゼーション後のオ
リゴヌクレオチドの標識 オリゴヌクレオチドと標的遺伝子とのハイブリダイゼー
ション後、ＤＩＧ標識し、標識されたオリゴヌクレオチ
ドの検出感度を調べた。使用したオリゴヌクレオチドは
実施例１と同じものであり、標的遺伝子としてプラスミ
ドｐＵＣ１９を使用した。標識オリゴヌクレオチドの検
出はＤＩＧ核酸検出キットを用い、そのプロトコールに
従って行った。プラスミドｐＵＣ１９はアルカリ変性に
よって一本鎖にしてからメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にドットブロットした。プ
レハイブリダイゼーションを４０℃、６０分間行った
後、１０ｐｍｏｌｅ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含む
ハイブリダイゼーション溶液で４０℃、一晩ハイブリダ
イゼーションを行った。４０℃に保った２×ＳＳＣ，
０．１％ ＳＤＳ溶液で２回、４０℃に保った０．１×
ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳ溶液で２回メンブレンを洗っ
た後Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅバッファー
で平衡化した。続いて１００μＭ ｄＡＴＰ、９５μＭ
ｄＴＴＰ、５μＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、２．５Ｕ Ａ
ｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｓ
ｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、２．５ｍＭ 塩化マ
グネシウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）及び
５０ｍＭ 塩化カリウムを含む１ｍｌの反応溶液中で６
５℃、３時間反応させた。

【００４０】実施例６：マウス白血病ウイルスＲＮＡの
検出における従来法と本発明法の比較 マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を感染させた線維芽細
胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞及び非感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞
からＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社）を用い
てＲＮＡを抽出した。感染細胞から抽出したＲＮＡは、
ＤＮＡ及びＲＮＡ分解酵素を含まない滅菌蒸留水で３倍
希釈列を作製し、非感染細胞から抽出したＲＮＡと共に
１％ホルムアルデヒド変性ゲルで１００ボルト、３時間
泳動した。泳動後ゲルのＲＮＡは、一般に行われるノー
ザンブロッティング法により、室温、一晩、陽荷電ナイ
ロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）
に転写した。ＤＩＧイージーハイブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で６５℃、３時間プレハイ
ブリダイズ後，配列番号：５に示す塩基配列からなる３
ｐｍｏｌｅ／ｍｌの５‘末端ジゴキシゲニン標識したオ
リゴプローブを含むＤＩＧイージーバイブで６５℃、一
晩ハイブリダイズした。フィルターの洗浄を、２ｘＳＳ
Ｃで６５℃、５分間を２回、０．１ｘＳＳＣで６５℃、
１５分間を２回行った。フィルターの一片は洗浄後室温
で風乾し、一片は△Ｔｔｈ反応緩衝液（１０ｍＭトリス
塩酸、ｐＨ８．９，１．５ｍＭ塩化マグネシウム、８０
ｍＭ塩化カリウム、０．１％デオキシコール酸ナトリウ
ム、０．１％トリトンＸ−１００、０．５ｍｇ／ｍｌウ
シ血清アルブミン；ＴＯＹＯＢＯ社）で６５℃、１５分
間平衡化した。伸長反応は５０Ｕ／ｍｌ △Ｔｔｈポリ
メラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社），０．２ｍＭｄＡＴＰ及び
ｄＴＴＰ、０．０１ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含む△Ｔｔｈ反
応緩衝液で６０℃、３時間浸漬することにより行った。
反応終了後、フィルターの洗浄を、２ｘＳＳＣで６５
℃、５分間を２回、ＰＢＳで６５℃、５分間を１回行っ
た。洗浄後のフィルターは前述の風乾したフィルターと
共にＤＩＧ洗浄緩衝液（１００ｍＭマレイン酸，１５０
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．３％ツイーン２
０；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で１
分間平衡化し、ブロッキング液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）に室温、６０分間軽度に振とう
しながら浸漬した。次に、１５０ｍＵ／ｍｌのアルカリ
フォスファーターゼ標識抗ＤＩＧ Ｆａｂフラグメント
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含む
ブロッキング液に室温３０分間浸漬した。フィルターの
洗浄をＤＩＧ洗浄緩衝液で室温１５分間を２回行い、検
出バッファー（１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．５，１
００ｍＭ塩化ナトリウム；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社）で平衡化した。ＤＩＧ標識核酸検出キ
ット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を
用いて検出した。

【００４１】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TATATATATA TATATATA 18 配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AAAAAAAAAA AAAAAAAA 18 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTT 18 配列番号：４ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT CCTCTAGAGT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT 60 配列番号：５ 配列の長さ：６５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGCTGGAGCA GAGGTATGGT TGGAGTAGGT ACCCAGGACG GCAACATATA TATATATATA 60 TATAT 65

【図面の簡単な説明】

【図１】オリゴヌクレオチドのテイリング反応を模式的
に示す図。オリゴヌクレオチドはＡＴ繰り返し配列の部
分で自己アニーリングし、続いてＤＮＡポリメラーゼに
よってｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ（ｄＵＴＰ）の付加が行わ
れる。この付加によってオリゴヌクレオチドのＡＴ繰り
返し配列の部分は伸長した後解離し、以降自己アニーリ
ングと伸長、解離を繰り返すことを示す。

【図２】オリゴヌクレオチドがセルフプライミングで伸
長することを示す写真。

【図３】オリゴヌクレオチドの濃度とテイリング効率と
の関係を示す写真。

【図４】付加されるテイルの長さと反応時間との関係を
示す写真。

【図５】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｄＴのオリ
ゴヌクレオチドへの標識効率を示す写真。

【図６】オリゴヌクレオチドの５’末端にジゴキシゲニ
ンを標識する従来の標識法と本発明の標識法によりマウ
ス白血病ウイルスＲＮＡを検出した結果を示す写真。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】３’末側に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し
   配列（ここで、ＸとＹはアデニンとチミンもしくはウラ
   シル、又はグアニンとシトシンの組合せからなり、ｎは
   １以上の整数を表す）を有するオリゴヌクレオチドを標
   識する方法であって、前記繰り返し配列を構成するヌク
   レオチドの標識体及び5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を
   欠損したＤＮＡポリメラーゼを用いて前記繰り返し配列
   を付加伸長させることを特徴とする前記方法。
2. 【請求項２】ｎが２以上、３〜１０又は３以上のいずれ
   かの繰り返し配列を有するオリゴヌクレオチドであるこ
   とを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】ＤＮＡポリメラーゼが、テルムス・アクア
   ティクス（Thermusaquaticus）、テルムス・サーモフィ
   ルス（Thermus thermophilus）、サーモコッカス・リト
   ラリス（Thermococcus litoralis）及びピロコッカス・
   フリオサス（Pyrococcus furiosus）よりなる群から選
   ばれる微生物由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特
   徴とする請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】標識体が、ラジオアイソトープで標識又は
   標識化合物で修飾されたヌクレオチドであることを特徴
   とする請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】標識化合物がジゴキシゲニン、フルオレセ
   イン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（Ｒｈｏ
   ｄａｍｉｎｅ）及びアビジン（Ａｖｉｄｉｎ）・ビオチ
   ン（Ｂｉｏｔｉｎ）よりなる群から選ばれる標識化合物
   であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】付加伸長させる反応を、３０〜７５℃又は
   ５０〜７０℃の一定温度で行うことを特徴とする請求項
   １に記載の方法。
7. 【請求項７】付加伸長させる反応を、５５℃及び７２℃
   の反復処理する工程で行うことを特徴とする請求項１に
   記載の方法。
8. 【請求項８】請求項１ないし７のいずれかに記載の方法
   によって得られる標識オリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】標的遺伝子と、該標的遺伝子に対し相補的
   な塩基配列及びその塩基配列の３’末側に（ＸＹ）ｎで
   表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニン−チ
   ミンもしくはウラシル、又はグアニン−シトシンの組合
   せからなり、ｎは１以上の整数を表す）を有するオリゴ
   ヌクレオチドとをハイブリダイズさせた後、請求項１な
   いし７のいずれかに記載の方法により該オリゴヌクレオ
   チドを標識することを特徴とする該標的遺伝子の検出方
   法。
10. 【請求項１０】標的遺伝子と、該標的遺伝子に対し相補
    的な塩基配列を有する請求項８に記載の標識オリゴヌク
    レオチドとをハイブリダイズさせることを特徴とする該
    標的遺伝子の検出方法。
11. 【請求項１１】請求項８に記載の標識オリゴヌクレオチ
    ドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を行うこと
    を特徴とするプローブの調製法。
12. 【請求項１２】請求項１１に記載の調製法により得られ
    るプローブ。