JP2008544756A - 標的核酸配列を解析するための方法およびキット - Google Patents

Abstract

本発明は、核酸処理反応で協調して検出可能なシグナルを産生するオリゴヌクレオチドを用いて、標的核酸配列の存在を決定するための方法を開示する。幾つかの態様において、本方法はまた、標的核酸配列の定量を容易にする。本発明はさらに、本発明の方法の実施するために用いることができるキットを開示する。

Description

発明の分野
本発明は一般に、標的核酸配列を解析するための方法に関する。より特に、本発明は、核酸処理反応で協調して検出可能なシグナルを産生するオリゴヌクレオチドを用いて、標的核酸配列の存在を決定するための解析法に関する。幾つかの態様において、本方法は標的核酸配列の定量を容易にする。本発明はさらに、本発明の方法の実施において用いることができるキットに関する。

発明の背景
核酸分子は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドと一般に称されるその他の短い核酸分子へのハイブリダイゼーションを検出する系を用いることによって解析してもよい。核酸分子は、それらの配列によって、およびそれらのサブ配列の幾つかによって区別することができるので、ならびに核酸分子は、相補的である、オリゴヌクレオチドなどの、配列と特異的に結合することができるので、これが可能である。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は最も感度のよい核酸解析系の一つである。オリゴヌクレオチドと相補的標的核酸配列の間のハイブリダイゼーションが、DNAポリメラーゼがポリメリゼーションを開始する部位を形成し、そこからその後、それが標的核酸鋳型を複製して、標的核酸に相補的な新たなDNA鎖を産生する。DNAは、元の鎖のみならず、新たな鎖の連続的複製によっても増幅される。PCRプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅された産物DNAに取り込まれ、その後、増幅産物されたDNAが同定される。一般に、ゲル電気泳動によってそれらを分離し、および化学物質でそれらを染色した後に、PCR産物を視覚によって検出する。あるいは、ゲル電気泳動がない場合、色素を2本鎖PCR産物に優先的に結合させることによって、定量的にかまたは半定量的にかのいずれかで、PCR産物を検出することができる。

リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ライゲーション依存性のPCR、鎖置換増幅、分岐DNAシグナル増幅、ローリングサークル増幅、転写を介する増幅、核酸配列に基づく増幅、およびハイブリダイゼーションシグナル増幅を含む、幾つかのその他の核酸解析法も存在する。

しかしながら、数多くの核酸解析法の存在にもかかわらず、2つまたはそれより多くの異なる核酸標的を区別しまたは同時に定量することができる方法はほとんど開発されていない。通常、多数の異なる核酸標的を同時に解析するよう設計された方法は、信頼できずかつ感度が低い。結果として、複数の核酸標的を同時に解析することができる、すなわち、多重化された、ごく少数の核酸解析法が、現在の医学的、獣医学的、または農学的診断で日常的に使用されている（Yang et al., 2004, Lancet. Infectious Diseases 4：337-48; Broude et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98：206-211；Chamberlain et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 11141- 11156；Edwards et al., 1994, PCR Methods Appl. 3：S65-S75；Hacia et al., 1998, Genome Res. 8：1245-1258；Li et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24：538-539；Stuven et al., 1996, Pharmacogenetics 6：417-421；van Orsouw et al., 1998, Genomics 52：27-36）。

したがって、1つの標的核酸配列を解析することが可能であるだけでなく、複数の標的核酸を同時に解析することも可能である感度の良い方法、すなわち多重化解析を開発することが極めて望ましいと考えられる。

発明の概要
したがって、ある局面において、本発明は、被検試料中の標的核酸配列を解析するための方法を提供する。これらの方法は通常、以下の工程を含む：
‐反応容器中で以下を混合する工程：
（1）標的核酸配列にハイブリダイズしない（例えば、固定化されまたは溶液中で遊離している）捕捉オリゴヌクレオチド；
（2）検出可能なシグナルを提供しかつ捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするシグナリングオリゴヌクレオチド；
（3）以下を含む少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド：
（a）標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする第1の標的化配列；および
（b）以下より選択される配列にハイブリダイズする捕捉可能な配列：
（i）捕捉オリゴヌクレオチド；または
（ii）シグナリングオリゴヌクレオチド
（4）以下より選択される配列にハイブリダイズする第2の標的化配列を含む少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチド：
（a）第1の標的化配列がハイブリダイズするサブ配列とは異なる、標的核酸配列のサブ配列；または
（b）標的核酸配列の相補鎖のサブ配列、または
（c）少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド；ならびに
（5）核酸を含む被検試料；
‐標的核酸配列が被検試料中に存在する場合に反応産物を形成するように反応容器の内容物を核酸処理反応に供する工程であって、このように形成された反応産物が、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断し、それによってシグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを可能にする、少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチドを含む第1鎖ならびに少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチドを含む第2鎖、またはその伸長産物を含む、工程；ならびに
‐被検試料中の標的核酸配列の存在または量を示すシグナリングオリゴヌクレオチドからの検出可能なシグナルを検出する工程。

幾つかの態様において、核酸処理反応は、ポリメリゼーション依存性の核酸処理反応であり、その例証的な例として、以下の工程が含まれる：
（a）標的核酸配列にキメラオリゴヌクレオチドの標的化配列をハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、標的核酸配列がキメラオリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオチドを越えて3'から5'方向に伸長し、標的核酸配列の非ハイブリッド部分を規定する、工程；
（b）標的核酸配列の非ハイブリッド部分を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第1のハイブリッドのキメラオリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物および標的核酸配列を含む第1の2重鎖を形成する工程；
（c）第1の2重鎖を変性させて、第1の伸長産物から標的核酸配列を遊離させる工程；
（d）協調オリゴヌクレオチドを第1の伸長産物とハイブリダイズさせて、第2のハイブリッドを形成する工程であって、第1の伸長産物が、協調オリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオチドを越えて3'から5'方向に伸長し、第1の伸長産物の非ハイブリッド部分を規定する、工程；ならびに
（e）第1の伸長産物を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第2のハイブリッドの協調オリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物および第1の伸長産物に相補的である第2の伸長産物を含む反応産物を形成する工程。

好適には、工程a）〜e）を1回または複数回、通常約1から約100回、通例として約10から約50回、およびより通例として約20から約40回繰り返す。幾つかの態様において、ポリメリゼーション薬剤は、（任意で熱安定性である）プライマー依存性のDNAポリメラーゼであり、その例証的な例として、ピロコックス フリオシス（Pyrococcus furiosis）（Pfu）DNAポリメラーゼ、ピロコックス属GB-D（Psp）DNAポリメラーゼ、ピロコックス ウォエセイ（Pyrococcus woesei）（Pwo）DNAポリメラーゼ、テルムス アクアティクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ、テルムス ブロキアヌス（Thermus brocianus）（Tbr）DNAポリメラーゼ、テルムス フラヴス（Thermus flavus）（Tfl）DNAポリメラーゼ、テルモコックス リトラリス（Thermococcus litoralis）（TliまたはVent）DNAポリメラーゼ、テルモトガ マリティマ（Thermotoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ、およびテルムス テルモフィルス（Thermus thermophilus）（Tth）DNAポリメラーゼ、ならびにその誘導体が含まれる。

幾つかの態様において、工程b）におけるポリメリゼーション薬剤は、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）、およびテルムス テルモフィルス（Tth）DNAポリメラーゼ、ならびにその誘導体などの、しかしこれらに限定されない、プライマー依存性の逆転写酵素である。

幾つかの態様において、工程e）におけるポリメリゼーション薬剤は、好適に熱安定性である、DNAポリメラーゼである。

その他の態様において、ポリメリゼーション依存性の核酸処理反応には、以下の工程が含まれる：
i）環状化可能な第1の協調オリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、第1の協調オリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的である、工程；
ii）第1の協調オリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接して位置する、工程、
iii）第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で第1の協調オリゴヌクレオチドの第1および第2の標的化配列を連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1の協調オリゴヌクレオチドの第1および第2の標的化配列を含むライゲーション産物を環状化した形態で形成する工程、
iv）第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程、
v）キメラオリゴヌクレオチドをライゲーション産物とハイブリダイズさせて、第3のハイブリッドを形成する工程；
vi）ライゲーション産物を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第3のハイブリッドのキメラオリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物を形成する工程、
vii）第2の協調オリゴヌクレオチドを第1の伸長産物にハイブリダイズさせて、第4のハイブリッドを形成する工程、ならびに
viii）第1の伸長産物を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤（例えば、Φ29 DNAポリメラーゼなどの、しかしこれに限定されない、プライマー依存性のDNAポリメラーゼ）およびヌクレオチド前駆体の存在下で第4のハイブリッドの第2の協調オリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物および第1の伸長産物に相補的である第2の伸長産物を含む反応産物を形成する工程。

その他の態様において、核酸処理反応はリガーゼ依存性の核酸処理反応であり、その例証的な例として、以下の工程が含まれる：
1、キメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、キメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的である、工程；
2、第1の協調オリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接して位置する、工程；
3、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下でキメラオリゴヌクレオチドを第1の協調オリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびにキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調オリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成する工程；
4、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程；ならびに
5、第2の協調オリゴヌクレオチドをライゲーション産物のキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調配列部分にハイブリダイズさせて、反応産物を形成する工程。

その他の例証的な例において、リガーゼ依存性の核酸処理反応には、以下の工程が含まれる：
a、第1のキメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、第1のキメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的であり、かつ捕捉可能な配列の5'ヌクレオチドが連結可能でない、工程；
b、第2のキメラオリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接しており；捕捉可能な配列の5'ヌクレオチドが連結可能でない、工程；
c、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で第1のキメラオリゴヌクレオチドを第2のキメラオリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1のキメラオリゴヌクレオチドおよび第2のキメラオリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成する工程；
d、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程；ならびに
e、協調オリゴヌクレオチドをライゲーション産物の第1および第2のキメラオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて、反応産物を形成する工程。

さらにその他の例証的な例において、リガーゼ依存性の核酸処理反応には、以下の工程が含まれる：
i、第1のキメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、第1のキメラオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である捕捉可能な配列を含み、かつ第1のキメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドに相補的である、工程；
ii、第2のキメラオリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接しており；第1のキメラオリゴヌクレオチドがシグナリングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である捕捉可能な配列を含む、工程；
iii、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で第1のキメラオリゴヌクレオチドを第2のキメラオリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1のキメラオリゴヌクレオチドおよび第2のキメラオリゴヌクレオチドの両方を含む反応産物を形成する工程；ならびに
iv、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸から反応産物を遊離させる工程。

幾つかの態様において、工程1〜5またはa〜eまたはi〜ivを1回または複数回、通常約1から約100回、通例として約10から約50回、およびより通例として約20から約40回繰り返す。

好適には、ライゲーション薬剤は、T4 DNAリガーゼ、大腸菌（Escherichia coli）DNAリガーゼ、およびテルムス フィリフォルミス（Tfi）DNAリガーゼ、ならびにその誘導体より選択される。

別の局面において、本発明は、以下を含むキットを提供する：
（1）標的核酸配列にハイブリダイズしない（例えば、固定化されまたは溶液中で遊離している）捕捉オリゴヌクレオチド；
（2）検出可能なシグナルを提供しかつ捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするシグナリングオリゴヌクレオチド；
（3）以下を含む少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド：
（a）標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする第1の標的化配列；および
（b）以下より選択される配列にハイブリダイズする捕捉可能な配列
（i）捕捉オリゴヌクレオチド；または
（ii）シグナリングオリゴヌクレオチド
（4）以下より選択される配列にハイブリダイズする第2の標的化配列を含む少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチド：
（a）第1の標的化配列がハイブリダイズするサブ配列とは異なる、標的核酸配列のサブ配列；または
（b）標的核酸配列の相補鎖のサブ配列、または
（c）少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド。

幾つかの態様において、本キットは、（5）1つまたは複数のポリメリゼーションおよび／またはライゲーション薬剤をさらに含む。

幾つかの態様において、構成要素（1）〜（5）の任意の1つまたはそれより多く（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ）は、凍結乾燥された形態である。好適には、構成要素（1）〜（5）の任意の2つまたはそれより多く（例えば、2つ、3つ、4つ、または5つ）は、混合物の形態である。あるいは、それらは別々の入れ物の中にあってもよい。

幾つかの態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは固体表面（例えば、微粒子もしくはビーズ、ナノワイアー、診断ストリップ、または反応容器の表面）に固定化されている。

幾つかの態様において、2つまたはそれより多くの捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドアレイの形態で固定化されている。

配列の簡単な説明

発明の詳細な説明
1、定義
他に特に定義しない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の専門家によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様のまたは同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を次のように定義する。

冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多く（すなわち、少なくとも1つ）を指すよう、本明細書において使用される。例として、「1つの要素」は、1つの要素または1つより多くの要素を意味する。

「約」によって、参照数量、参照レベル、参照値、参照数、参照頻度、参照パーセンテージ、参照次元、参照サイズ、参照量、参照重量、または参照長さに対して30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1％と同じ程度だけ変化する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、次元、サイズ、量、重量、または長さが意味される。

「増幅」または「核酸増幅」または「増幅反応」という用語は、特定の標的核酸配列の多くのポリヌクレオチドコピーを産生する生化学的反応を指す。標的核酸配列が1本鎖である場合には、相補的配列が反応で産生されてもよい。幾つかの態様において、反応は、ポリメラーゼを用いて核酸配列をコピーする、ヘリカーゼ依存性の増幅（HDA）、転写を介する増幅（TMA）、鎖置換増幅（SDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ローリングサークル増幅（RCA）、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）などのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または同様の反応である。1本鎖形態の標的核酸配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを通じて形成された2本鎖領域が、反応をプライミングする（開始する）ために必要とされる。その他の態様において、「増幅」または「核酸増幅」または「増幅反応」という用語は、リガーゼ連鎖反応（LCR）などの、2つのオリゴヌクレオチドまたは2つのオリゴヌクレオチドサブ配列を共有結合的に連結するリガーゼまたは同様の酵素を用いた生化学的反応を指す。リガーゼ酵素は、それらが標的核酸配列の隣接部位でハイブリダイズする場合、2つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドサブ配列を連結する。あるいは、2つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドサブ配列が1つまたは複数の核酸残基離れている部位でハイブリダイズする場合、すなわち、それらが隣接していない場合、2本鎖領域間の1本鎖領域がポリメラーゼを用いて2本鎖領域に変換され、その後リガーゼ酵素が隣接オリゴヌクレオチドを連結し、連続的な2本鎖領域を形成する。

「捕捉可能な配列」という用語は、別の核酸配列とハイブリダイズすることが可能である核酸配列を指す。幾つかの態様において、捕捉可能な配列は、例証的な例において支持体（例えば、固体表面）に固定化されまたは溶液中で遊離している捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。

「捕捉オリゴヌクレオチドアレイ」という用語は、固体表面上の離れた既知の場所で固定化された複数の捕捉オリゴヌクレオチドを意味する。反応容器または診断ストリップの表面に関して、捕捉オリゴヌクレオチドは、2次元の空間的に位置が指定されたアレイ、例えば2×2アレイに配置されていてもよい。あるいは、捕捉オリゴヌクレオチドは、2次元の平面シートが巻かれて3次元の管状立体配置になっている管状アレイに配置されていてもよい。その他の態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、任意の都合の良いトポロジーの2次元または3次元の反応容器の内側または外側の表面に配置されている。核酸アレイは当技術分野において公知であり、および多くの方法で分類することができ；秩序のあるアレイ（例えば、離れた部位での化学反応を分離する能力）、およびランダムなアレイの両方が含まれる。秩序のあるアレイには、フォトリソグラフィー技術（Affymetrix GeneChip（商標））、スポッティング技術（Synteniおよびその他）、印刷技術（Hewlett PackardおよびRosetta）、3次元の「ゲルパッド」アレイなどを用いて作製したアレイが含まれるが、これらに限定されない。また、液体アレイ、すなわち、フローサイトメトリーなどの3次元のアレイ法を用いてもよい。フローサイトメトリーを用いる場合、捕捉オリゴヌクレオチドをマイクロスフェアなどの支持体に好適に固定化する。

幾つかの態様において、秩序のあるアレイには、既知の場所に核酸を含むアレイが含まれる。すなわち、本明細書において記載される捕捉可能な配列または捕捉オリゴヌクレオチドは、基板上の既知の場所に固定化されている。「既知」の場所によって、既知でありまたは既知であった部位が意味される。

「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、天然では通例生じない様式で位置付けられまたは連結された少なくとも2つの核酸配列または部分を含むオリゴヌクレオチドを指すよう、本明細書において使用される。

「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連付けられたヌクレオチドの配列を指す。例えば、配列「A-G-T-C」は、配列「T-C-A-G」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基のうちの幾つかだけが塩基対合規則に従って一致する。そのようなものとして、相補性は完璧である必要はなく；第1の配列と第2の配列の間のハイブリダイゼーションに干渉すると考えられる任意の数の塩基対不一致があってもよい。しかしながら、最低にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが生じることができないほど突然変異の数が多い場合、配列は相補的な配列ではない。したがって、「実質的に相補的」によって、第1の配列が、選択された反応条件下でハイブリダイズするのに十分に第2の配列に相補的であるということが意味される。特異性を達成するために十分な相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの関係は、当技術分野において周知である。それゆえ、本発明の解析法のいずれかにおいて実質的に相補的な配列を用いることができる。そのような配列は、例えば、完璧に相補的であることができ、またはハイブリダイゼーション条件が標的配列と非標的核酸の間の識別を可能にするのに十分である限り、1つから多数の不一致を含むことができる。したがって、実質的に相補的な配列は、パーセント同一性において、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75、またはそれ未満の範囲に及ぶことができる。あるいは、核酸間の「完全な」または「全体的な」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を有する。

本明細書を通じて、文脈上他に特に必要とされない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、または「含む（comprising）」という語は、述べられた工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の含有を意味するが、任意のその他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の排除を意味するものではないことが理解されると考えられる。

「ハイブリダイゼーション」は、DNA-DNA、DNA-RNA、またはDNA-PNAハイブリッドを産生するための相補的なヌクレオチド配列の対合を示すよう、本明細書において使用される。相補的な塩基配列とは、塩基対合規則によって関連付けられる配列である。DNAに関して、AはTと対合しおよびCはGと対合する。RNAに関して、UはAと対合しおよびCはGと対合する。また、イノシン（I）という塩基が用いられてもよい。イノシンは、（安定性の減少する順に）CまたはAまたはGまたはTとの塩基対を形成することができる。この点について、本明細書において使用される場合の「一致」および「不一致」という用語は、相補的な核酸鎖における対合したヌクレオチドのハイブリダイゼーション潜在能力を指す。上述の古典的A-TおよびG-C塩基対のような、一致したヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。不一致は、効率的にはハイブリダイズしないヌクレオチドのその他の組み合わせである。

「単離された」によって、通例そのネイティブな状態においてそれを伴う構成要素が実質的にまたは本質的にない材料が意味される。例えば、「単離されたオリゴヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、天然の状態においてそれと隣り合う配列から純化された、オリゴヌクレオチド、例えば、通例本断片に隣接している配列から取り除かれたDNA断片を指す。

本明細書において使用される場合の「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合を介して連結された複数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、もしくはその関連する構造変異体もしくは合成類似体）から構成されるポリマー（またはその関連する構造変異体もしくは合成類似体）を指す。したがって、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、ヌクレオチドおよびそれらの間の連結が天然であるヌクレオチドポリマーを指すが、本用語はまた、ペプチド核酸（PNA）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、2-O-メチルリボ核酸、およびそれらと同様のものを含むが、これらに制限されない、様々な類似体をその範囲内に含むということが理解されると考えられる。分子の正確なサイズは、特定の用途に応じて変化してもよい。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが幾分短く、通常約10〜30ヌクレオチドであるが、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語が典型的には大きいオリゴヌクレオチドに使用されるものの、本用語は任意の長さの分子を指すことができる。

本明細書において使用される場合の「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」という用語は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA、またはPNAを指定する。本用語は、典型的には長さ30ヌクレオチドを上回るオリゴヌクレオチドを指す。

「プライマー」によって、DNAまたはRNAの鎖と対合した時に、好適な重合薬剤の存在下でプライマー伸長産物の合成を開始することが可能であるオリゴヌクレオチドが意味される。プライマーは、増幅における最大限の効率のために、典型的には1本鎖であるが、代わりに2本鎖であってもよい。プライマーは、ポリメリゼーション薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするように十分に長くなければならない。プライマーの長さは、用途、利用されるべき温度、鋳型反応条件、その他の試薬、およびプライマーの源を含む、多くの要因に依存する。例えば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には15〜35またはそれより多くのヌクレオチドを含むが、それはより少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーは、約200ヌクレオチドから数キロ塩基またはそれを上回るような、大きいポリヌクレオチドであることができる。プライマーは、それにハイブリダイズし、および合成の開始のための部位としての役割を果たすように設計されている鋳型上の配列に「実質的に相補的」であるように選択されてもよい。「実質的に相補的」によって、プライマーが、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分に相補的であるということが意味される。好適には、プライマーは、それにハイブリダイズするように設計されている鋳型との不一致を含まないが、このことは必須ではない。例えば、プライマー配列の残りが鋳型に相補的であるようにして、非相補的ヌクレオチドをプライマーの5'末端に付着してもよい。あるいは、プライマー配列がそれとハイブリダイズする鋳型の配列との十分な相補性を有し、およびそれによってプライマーの伸長産物の合成のための鋳型を形成するならば、非相補的ヌクレオチドまたは一続きの非相補的ヌクレオチドをプライマー中に散在させることができる。

2つまたはそれより多くの核酸配列間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」が含まれる。「参照配列」とは、長さが少なくとも10モノマー単位、すなわち、ヌクレオチドであるが、多くの場合15〜20、しばしば少なくとも25モノマー単位、すなわち、ヌクレオチドである。2つの核酸配列は各々、（1）2つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なヌクレオチド配列のほんの一部）、および（2）2つの核酸配列間で異なっている配列を含み得るので、2つ（またはそれより多くの）核酸配列間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」の全体にわたる核酸配列の配列を比較し、配列類似性のある局所領域を同定および比較することによって行なう。「比較ウィンドウ」とは、2つの配列を最適にアラインした後で、配列を同じ数の連続した位置の参照配列と比較する、少なくとも50の連続した位置、通例として約50〜約100、より通例として約100〜約150の概念的断片を指す。比較ウィンドウは、2つの配列の最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約20％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピュータによる実行によって、または選択された様々な方法のいずれかによって作成された検討および最良アラインメントによって（すなわち、比較ウィンドウの全体にわたる最高のパーセンテージ相同性を結果的にもたらすことによって）、比較ウィンドウをアラインするための配列の最適アラインメントを行なってもよい。また、例えばAltschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25：3389によって開示されたようなBLASTファミリーのプログラムを参照してもよい。配列解析の詳細な議論は、Ausubel et al.,「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons社, 1994-1998, 第15章の第19.3部に見出すことができる。

「反応容器」という用語は、本発明の方法を実行する入れ物を指す。反応容器は、標準的な分子生物学的反応での使用に好適な任意の容器であってもよく、およびそれゆえに、そのような使用に好適である材料から構築されていると考えられる。そのような材料は、天然もしくは合成であってもよく、または天然および合成の材料の組み合わせから形成されていてもよい。反応容器を構築することができる例証的な材料には、プラスチック（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、およびポリプロピレン）、ガラス、ならびにそれらと同様のものが含まれる。特に好ましい本発明の反応容器には、従来のPCRチューブおよびマイクロプレート、例えば96ウェルマイクロプレートが含まれる。本発明の幾つかの態様において、捕捉オリゴヌクレオチドを反応容器の内部表面に固定化する。これらの態様において、シグナリングオリゴヌクレオチドの捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを反応容器の外側から検出することができるように、反応容器を透明な材料で好適に構築する。特定の態様において、反応容器は、実質的に平面である表面をそれが有するという点で特徴付けられる。あるいは、反応容器は、2次元の平面シートが巻かれて3次元の管状立体配置になっている実質的に管状である表面をそれが有するという点で特徴付けられてもよい。そのような立体配置を用いて、捕捉オリゴヌクレオチドのより大きい表面面積を、例えば「フロースルー」セル中に固定化することができると考えられる。その他の態様において、反応容器は微小流体素子である。

「配列同一性」および「同一性」という用語は、比較のウィンドウの全体にわたってヌクレオチド 対 ヌクレオチド原則またはアミノ酸 対 アミノ酸原則に基づいて核酸配列が同一である程度を指すよう、本明細書において互換的に使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、2つの最適にアラインされた配列を比較のウィンドウの全体にわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）が両方の配列に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を産出し、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、および結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出することによって算出される。本発明の目的のために、「配列同一性」は、ソフトウェアを添付した参照マニュアルで使用されるような標準的なデフォルトを用いて、DNASISコンピュータプログラム（ウィンドウズ用の第2.5版；日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社, South San Francisco, California, USA）によって算出された「一致パーセンテージ」を意味することが理解されると考えられる。

本明細書において使用される場合の「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーションの間の、温度およびイオン強度条件、ならびにある種の有機溶媒の存在または不在を指す。ストリンジェンシーが高ければ高いほど、ハイブリダイズした核酸配列間の相補性の程度は高いと考えられる。

本明細書において使用される場合の「ストリンジェントな条件」とは、実質的に相補的でありまたは高い割合の相補的な塩基を有し、好ましくは厳密な相補性を有するポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのみがハイブリダイズし、ならびに、幾つかの態様において、増幅産物を産出すると考えられる温度およびイオン強度条件を指す。必要とされるストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列依存性でかつハイブリダイゼーションの間に存在する様々な構成要素に依存し、およびヌクレオチド類似体を用いた場合、大いに変化する。ストリンジェントな条件は当業者に周知である。通常、ハイブリダイゼーション反応でプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドについて、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定の配列についての算出された熱融解点（Tm）よりも約10〜20℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50％が相補的プローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびpHでの）温度である。Tm計算は当業者に周知である。w、x、y、zがそれぞれ配列中の塩基G、C、A、Tの数であり、かつ[Na+]が塩濃度である、式Tm＝4(wG＋xC)＋2(yA＋zT)−16.6^*log10(0.050)＋16.6^*log10([Na+])を用いることによって、14塩基残基長未満のオリゴヌクレオチドについて、Tmが最もうまく計算される。13塩基残基よりも長いオリゴヌクレオチドについては、Breslauerら（1986, Proc. Nat. Acad. Sci. 83：3746-50）によって記載されたような最近隣式によるが、Sugimotoら（1996, Nucl. Acids Res. 24：4501-4505）によって発表された値を用いて、Tmが算出される。RNA熱力学特性についての値は、Xiaら（1998, Biochemistry 37：14719-14735）から採用することができる。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは少なくとも中間のストリンジェンシー条件下で、およびより好ましくは高ストリンジェンシー条件下で標的配列にハイブリダイズするということが理解されると考えられる。本明細書における、プローブハイブリダイゼーション反応についての低ストリンジェンシー条件に対する言及は、少なくとも約1％ v/vから少なくとも約15％ v/vまでのホルムアミドならびに42℃でのハイブリダイゼーション用の少なくとも約1Mから少なくとも約2Mまでの塩、および42℃での洗浄用の少なくとも約1Mから少なくとも約2Mまでの塩を含み、および包含する。低ストリンジェンシー条件にはまた、65℃でのハイブリダイゼーション用の1％ウシ血清アルブミン（BSA）、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）、7％ SDS、および室温での洗浄用の（i）2×SSC、0.1％ SDS；または（ii）0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、5％ SDSが含まれてもよい。プローブハイブリダイゼーション反応についての中間のストリンジェンシー条件は、少なくとも約16％ v/vから少なくとも約30％ v/vまでのホルムアミドならびに42℃でのハイブリダイゼーション用の少なくとも約0.5Mから少なくとも約0.9Mまでの塩、および42℃での洗浄用の少なくとも約0.5Mから少なくとも約0.9Mまでの塩を含み、および包含する。中間のストリンジェンシー条件にはまた、65℃でのハイブリダイゼーション用の1％ウシ血清アルブミン（BSA）、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）、7％ SDS、および42℃での洗浄用の（i）2×SSC、0.1％ SDS；または（ii）0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、5％ SDSが含まれてもよい。プローブハイブリダイゼーション反応についての高ストリンジェンシー条件は、少なくとも約31％ v/vから少なくとも約50％ v/vまでのホルムアミドならびに42℃でのハイブリダイゼーション用の少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mまでの塩、および42℃での洗浄用の少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mまでの塩を含み、および包含する。高ストリンジェンシー条件にはまた、65℃でのハイブリダイゼーション用の1％ BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）、7％ SDS、および65℃を上回る温度での洗浄用の（i）0.2×SSC、0.1％ SDS；または（ii）0.5％ BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、1％ SDSが含まれてもよい。プローブハイブリダイゼーション反応についてのその他のストリンジェンシー条件は当技術分野において周知である。当業者は、様々な要因を操作してハイブリダイゼーションの特異性を最適化することができるということを認識すると考えられる。最後の洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確保する働きをすることができる。詳細な例については、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（前記）、2.10.1〜2.10.16ページ、およびMOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL（Sambrook, et al., 編）（Cold Spring Harbor Press 1989）、第1.101節〜第1.104節を参照されたい。

「標的核酸配列」という語句は、関心対象の任意の核酸配列を指す。それは、遺伝子全体であってもよく、またはその一部であってもよい。そのようなものとして、標的核酸配列は、ヌクレオチド挿入、欠失、および単一ヌクレオチド多型（SNP）などの、しかしこれらに限定されない、遺伝子突然変異を含む遺伝子の一部であってもよい。標的核酸配列はまた、遺伝子全体、またはその一部によってコードされる核酸であってもよい。それゆえ、本発明によって企図される標的核酸配列には、DNA、cDNA、RNA、mRNA、およびcRNAが含まれる。標的核酸配列はまた、天然のまたは合成の核酸分子であってもよい。

2、標的核酸配列を解析するための方法
本発明は、標的核酸配列を解析する、例えば、標的核酸配列の存在または量を決定するための方法を提供する。本方法は、標的核酸配列に存在下で、核酸処理反応で協調して検出可能なシグナルを産生する複数のオリゴヌクレオチドを用いる。複数のオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる：
（1）任意で固体表面に固定化されかつ標的核酸配列にハイブリダイズしない捕捉オリゴヌクレオチド；
（2）検出可能なシグナルを提供しかつ捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするシグナリングオリゴヌクレオチド；
（3）以下を含む、幾つかの態様においてプライマーとして機能することができる、少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド：
（a）標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする第1の標的化配列；および
（b）以下より選択される配列にハイブリダイズする捕捉可能な配列：
（i）捕捉オリゴヌクレオチド；または
（ii）シグナリングオリゴヌクレオチド；ならびに
（4）以下より選択される配列にハイブリダイズする第2の標的化配列を含む、幾つかの態様においてプライマーとして機能することができる、少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチド：
（a）第1の標的化配列がハイブリダイズするサブ配列とは異なる、標的核酸配列のサブ配列；または
（b）標的核酸配列の相補鎖のサブ配列、または
（c）少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド。

本発明の核酸処理反応は、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断し、それによってシグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしかつ標的の存在または量を伝達するのを可能にする、少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチドを含む第1鎖ならびに少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチドを含む第2鎖を含む反応産物、またはその伸長産物を結果的にもたらす。標的核酸配列が存在しない場合には、核酸処理反応が生じ、それによってキメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列が捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしかつシグナリングを遮断することができない。

3、核酸処理反応
上記のような反応産物の発生を結果的にもたらす任意の核酸処理反応を本発明の方法に従って用いてもよい。例証的な核酸処理反応には、核酸増幅が含まれる。核酸増幅のための代表的な方法は、当技術分野において周知であり、ならびにPCR（例えば、Saiki et al., 1985, Science, 230：1350-1354；Mullis et al., 1987, Methods Enzymol 155：335-350参照）、鎖置換増幅（SDAおよび多重SDA（MSDA）；例えば、米国特許第5,422,252号およびLittle et al参照）、ローリングサークル増幅（RCA；例えば、Liu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc 118：1587-1594ならびに米国特許第5,854,033号および米国特許第6,642,034号参照）、核酸配列に基づく増幅（NASBA；例えば、Sooknanan et al., 1994, Biotechniques 17：1077-1080参照）、リガーゼ連鎖反応（LCR；例えば、国際公開公報第89/09835号参照）、ならびにQβレプリカーゼ増幅（例えば、Tyagi et al., 1996, 前記, 参照）を含むが、これらに限定されない。また、Syvanen Anne-Christine（2001, 前記）によって概説されたように、これらの技術に対する様々な変形を利用してもよい。本方法において、異なる増幅反応の特色の任意の有用な組み合わせを用いて本方法の感度および／または特異性を増大させてもよい。

幾つかの態様において、本発明の核酸処理反応は、ポリメラーゼ依存性の核酸増幅に基づく。この種の例証的な増幅はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であり、この反応では、その相補体から分離された場合に、個々のオリゴヌクレオチド対の一方のオリゴヌクレオチドから合成された伸長産物が、対の他方のオリゴヌクレオチドの伸長産物の合成のための鋳型として働くことができる。通常、熱安定性でプライマー依存性のポリメラーゼを利用するが、当業者により公知であると考えられるように、ポリメラーゼの選択は通常、用いられる特定のPCR法に依存する。

図2で示した例のような、この種の例証的な例において、キメラオリゴヌクレオチドの標的化配列と標的核酸配列の間で第1のハイブリッドを形成する。その後、プライマー依存性のDNAポリメラーゼまたはプライマー依存性の逆転写酵素であり得る、ポリメリゼーション薬剤で標的化配列を伸長する。そのような酵素は、オリゴヌクレオチドプライマーの3'末端ヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列の5'末端ヌクレオチドの間の完璧に一致した対合を含むハイブリッドについて選択的か、またはそのような対合が完璧に対合するものであろうとなかろうと、非選択的かのいずれかで、ヌクレオシド3リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド3リン酸；dNTP）をハイブリッドの標的化配列の伸長に取り込むという効果を有する。この点について、例えば、真核生物のプライマー依存性のDNAポリメラーゼおよびトリ骨髄腫ウイルス（AMV）逆転写酵素などの幾つかの酵素は、3'エラー修正活性を有さず（エキソヌクレアーゼ^-（exo^-））、およびそれゆえにオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端ヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列の5'末端ヌクレオチドの間の完璧な一致を含むハイブリッドに結合しているオリゴヌクレオチドのみを伸長させると考えられるということが周知である。あるいは、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片を含む原核生物起源のプライマー依存性のDNAポリメラーゼなどの、その他のポリメリゼーション薬剤は、エラー修正活性を有し（エキソヌクレアーゼ⁺（exo⁺））、およびそれゆえにこの選択性を示さないが、そのようなエラー修正活性がないそのような酵素の改変物が商業的供給者から入手可能である。しかしながら、通常オリゴヌクレオチド伸長のために3'exo^- ポリメリゼーション薬剤を利用することが望ましい。PCRに基づく核酸処理反応に従って利用され得る好適なポリメリゼーション薬剤は、当業者に周知であると考えられる。さらなるDNAポリメラーゼを添加する必要なくPCRの反復サイクリングを可能にするために、DNAポリメラーゼは好適には熱安定性であり、ならびにピロコックス フリオシス（Pfu）DNAポリメラーゼ、ピロコックス属GB-D（Psp）DNAポリメラーゼ、ピロコックス ウォエセイ（Pwo）DNAポリメラーゼ、テルムス アクアティクス（Taq）DNAポリメラーゼ、テルムス ブロキアヌス（Tbr）DNAポリメラーゼ、テルムス フラヴス（Tfl）DNAポリメラーゼ、テルモコックス リトラリス（TliまたはVent）DNAポリメラーゼ、テルモトガ マリティマ（Tma）DNAポリメラーゼ、およびテルムス テルモフィルス（Tth）DNAポリメラーゼ、ならびにその誘導体を含むが、これらに限定されない。本発明に従って使用され得る好適な逆転写酵素には、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）、およびテルムス テルモフィルス（Tth）DNAポリメラーゼ、ならびにその誘導体が含まれるが、これらに限定されない。ポリメリゼーション薬剤を選択する際のその他の要因として、被検試料中の核酸がDNAであるか、またはRNAであるかということが含まれる（すなわち、典型的には、逆転写酵素のみがデオキシヌクレオシド3リン酸をRNA鋳型上の伸長産物中に効率的に取り込むと考えられる）。

標的核酸配列を鋳型として用いた、キメラオリゴヌクレオチドの標的化配列の伸長によって、第1の伸長産物および標的核酸配列を含む2重鎖が結果的にもたらされる。その後、協調オリゴヌクレオチドが第1の伸長産物にハイブリダイズし、それによって第2のハイブリッドを形成することができるように、第1の伸長産物を変性によって標的核酸配列から分離する。次に、第1の伸長産物を鋳型として用いて、上記のように、協調オリゴヌクレオチドを伸長させる。第1の伸長産物はキメラオリゴヌクレオチドを含むので、この段階で形成される第2の2重鎖は、第1の伸長産物ならびに第1の伸長産物に相補的であり、およびそれゆえに、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列に相補的である第2の伸長産物を含む。この第2の2重鎖は、本発明に従う反応産物に相当する。捕捉可能な配列に相補的である配列は、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断するよう働き、それによってシグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを可能にする、「遮断」配列である。

その他の態様において、ポリメラーゼ依存性の増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーの環状核酸分子へのハイブリダイゼーションによって、ライゲーション、すなわち環状化が可能になり、およびDNAポリメラーゼ、典型的には鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼが、環状核酸分子を鋳型として用いて第1の伸長産物を合成することが可能になる、ローリングサークル増幅（RCA）を含む。通常、伸長産物は、鋳型環状核酸分子に相補的な配列の多重反復を含む長い核酸分子である。相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、第1の伸長産物はその後、PCRに関して、さらなる伸長産物の合成のための鋳型として働くことができ、それによって、元の鋳型環状核酸分子の増幅を可能にする。

図3で示した例のような、この種の例証的な例において、協調オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションと同時に環状化するように、協調オリゴヌクレオチドと標的核酸配列の間で第1のハイブリッドを形成する。協調オリゴヌクレオチドは、（以下でより詳細に記載された）リガーゼ酵素によって協調オリゴヌクレオチドの5'および3'末端のライゲーションを触媒することができるように、連結可能な末端（図3で示したE₁'およびE₂'）を有する。捕捉可能な配列（B'）を含む、キメラオリゴヌクレオチドは、環状化した協調オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、および鎖置換ポリメラーゼによって触媒される第1の伸長産物の産生をプライミングする。環状プローブのライゲーションが生じたならば、第1の伸長産物の領域に相補的である、別の協調オリゴヌクレオチド（F'）が添加され、および第2の伸長産物の発生をプライミングする。第2の伸長産物は、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列に部分的に相補的である。捕捉可能な配列に相補的である第2の伸長産物中の配列は、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断し、それによってシグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを可能にする、「遮断」配列である。

本発明によって企図されるようなRCAに好適なDNAポリメラーゼは、好適には、鎖置換と呼ばれる、鋳型鎖に相補的な鎖を置換することが可能であり、および5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く。鎖置換は、複数コピーの連結された協調オリゴヌクレオチドの合成を結果的にもたらすのに必要である。5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性は、存在するならば、合成された鎖の破壊を結果的にもたらし得る。開示された方法での使用のためのDNAポリメラーゼが極めて前進性であるということも望ましい。開示された方法での使用のためのDNAポリメラーゼの好適性は、ローリングサークル複製を実行するその能力を評価することによって簡単に決定することができる。例示的なローリングサークルDNAポリメラーゼには、バクテリオファージΦ29 DNAポリメラーゼ（米国特許第5,198,543号および第5,001,050号）、ファージM2 DNAポリメラーゼ（Matsumoto et al., Gene 84：247（1989））、ファージΦPRD1 DNAポリメラーゼ（Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：8287（1987））、VENT. RTM. DNAポリメラーゼ（Kong et al., J. Biol. Chem. 268：1965-1975（1993））、DNAポリメラーゼIのクレノー断片（Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45：623-627（1974））、T5 DNAポリメラーゼ（Chatterjee et al., Gene 97：13-19（1991））、PRD1 DNAポリメラーゼ（Zhu and Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219：267-276（1994））、ならびにT4 DNAポリメラーゼホロ酵素（Kaboord and Benkovic, Curr. Biol. 5：149-157（1995））が含まれる。特定の態様において、Φ29 DNAポリメラーゼを利用する。

ヘリカーゼなどの、鎖置換因子の使用を通じて、鎖置換を容易にすることができる。DNAポリメラーゼが、そのような因子の非存在下でローリングサークル複製を行なわないとしても、鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を行なうことができる任意のDNAポリメラーゼが開示された方法での使用に好適であると考えられる。RCAにおいて有用な鎖置換因子には、BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Tsurumi et al., J. Virology 67：7648-7653（1993））、アデノウイルスDNA結合タンパク質（Zijderveld and van der Vliet, J. Virology 68：1158-1164（1994））、ヘルペス単純ウイルスタンパク質ICP8（Boehmer and Lehman, J. Virology 67：711-715（1993）；Skaliter and Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：10665-10669（1994））、1本鎖DNA結合タンパク質（SSB；Rigler and Romano, J. Biol. Chem. 270：8910-8919（1995））、および仔ウシ胸腺ヘリカーゼ（Siegel et al., J. Biol. Chem. 267：13629-13635（1992））が含まれるが、これらに制限されない。

その他の態様において、核酸処理反応は、リガーゼ依存性の核酸増幅に基づく。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、特に、米国特許第4,883,750号に記載されている。リガーゼ依存性の反応の一例は、一方のオリゴヌクレオチドが第1の標的配列にハイブリダイズし、およびもう一方のオリゴヌクレオチドが第1の標的配列に隣接している第2の標的配列にハイブリダイズする、リガーゼ連鎖反応（LCR）である。オリゴヌクレオチドのハイブリダイズした対は、両方のオリゴヌクレオチドを含むライゲーション産物を産生するライゲーションのための基質として働く。必要とされる場合には、その後、例えば変性によって、ライゲーション産物を標的配列から外し、標的配列からのさらなるライゲーション産物の産生を可能にし、それによって標的核酸に相補的である連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を結果的にもたらすことができる。

図4に示した例のような、この種の例証的な例において、キメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズすることによって第1のハイブリッドを形成し、キメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドは第1のサブ配列の5'ヌクレオチドに相補的である。その後、第1の協調オリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズすることによって第2のハイブリッドを形成し、第2のサブ配列は第1のサブ配列に隣接して位置している。その後、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下でキメラオリゴヌクレオチドを第1の協調オリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびにキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調オリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成させる。これらの態様で利用し得る、好適なライゲーション薬剤は、当業者に周知であり、ならびにT4 DNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ、およびテルムス フィリフォルミス（Tfi）DNAリガーゼ、ならびにその誘導体を含むが、これらに限定されない。ある種の態様において、ライゲーション薬剤は熱安定性である。ライゲーション後、第2の協調オリゴヌクレオチドが、ライゲーション産物のキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調配列部分にハイブリダイズして反応産物を形成するように、変性によって標的核酸配列からライゲーション産物を分離する。第2の協調オリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断するように働き、それによってシグナリンオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを可能にする、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列に相補的である遮断領域、すなわち、遮断配列を有する。典型的には、第1の協調オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドに連結していない場合、すなわち、標的核酸配列が存在しない場合、第2の協調オリゴヌクレオチドの遮断領域は捕捉可能な配列にハイブリダイズしない、または相対的に低い親和性でしかハイブリダイズしないと考えられる。当業者には周知であると考えられるが、第1の協調オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドに連結している場合にのみ、遮断領域の捕捉可能な配列への実質的なハイブリダイゼーションが生じるように、（i）第2の協調オリゴヌクレオチドの遮断領域のサイズおよび／もしくは（ii）キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列に対する遮断領域の相補性を調整することによって；または（iii）遮断配列に隣接する非相補的な配列の挿入によって、これが可能である。

第1のライゲーション産物に多少なりとも相補的であるように遮断配列に隣接する非相補的な配列の塩基組成を調整することによって、検出系の感度を以下の様式で改変することができる。第1のライゲーション産物に対して相補性がより大きいように非相補的な配列（図4におけるB₂とE₂の間のセグメント）を調整する（または「調節する」）場合、それによって検出系の感度が増大される（すなわち、それがより低い濃度の標的配列を検出することができるようにする）と考えられるが、その一方、第1のライゲーション産物に対して相補性がさらにより少ないようにそれを調整する（または「調節する」）場合、検出系はより感度が低くなると考えられる。このように、調節可能で非相補的な介在配列を用いて、処理反応の感度を改変することができる。

LCRの使用の別の例証的な例は図5Aで示され、および第1のキメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列（E₁'- B₁'）を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程を含み、第1のキメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドは第1のサブ配列の5'ヌクレオチドに相補的であり、かつ捕捉可能な配列の5'ヌクレオチド（第1のキメラオリゴヌクレオチドの部分である捕捉可能な配列）は連結可能でない。この後に、第2のハイブリッドを形成するための、標的核酸配列の第2のサブ配列への第2のキメラオリゴヌクレオチドの第2の標的化配列（E_２'-B_２'）のハイブリダイゼーションが続き（ここで、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接している）；捕捉可能な配列の3'ヌクレオチド（第2のキメラオリゴヌクレオチドの部分である捕捉可能な配列）は連結可能でない。第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で、第1のキメラオリゴヌクレオチドを第2のキメラオリゴヌクレオチドと連結して、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1のキメラオリゴヌクレオチドおよび第2のキメラオリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成する。この態様において利用し得る、好適なライゲーション薬剤は当業者に周知であり、ならびにT4 DNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ、およびテルムス フィリフォルミス（Tfi）DNAリガーゼ、ならびにその誘導体を含むが、これらに限定されない。幾つかの態様において、ライゲーション薬剤は熱安定性である。その後、第1の2重鎖を変性させて標的核酸からライゲーション産物を遊離させる。このように、ライゲーション産物は、捕捉オリゴヌクレオチド（図5AのB）にハイブリダイズするよう利用可能であり、それによってシグナリングオリゴヌクレオチド（図5AのB”）の結合を競合する。この例において、シグナルの量は、所定の範囲にわたって、出発標的配列の数量と反比例すると考えられる。この例の改変において、第1のキメラプローブ（E1'-B1'）および第2のキメラプローブ（E2'-B2'）がハイブリダイズする標的配列間に「ギャップ」がある（図5B）。ハイブリダイゼーション後、リガーゼ酵素によって触媒されるライゲーション工程の前に、ポリメラーゼを用いてE1'とE2'の間のギャップを充填する。あるいは、ハイブリダイゼーションの間、標的（E）中のギャップ配列に相補的であるギャップ充填オリゴヌクレオチドが添加され、およびそれがライゲーション反応に関与する。

LCRの使用の別の例証的な例は図6Aで示され、および第1のキメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列（E）の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程を含み、第1のキメラオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である捕捉可能な配列（B₃'）を含み、かつ第1のキメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドは第1のサブ配列の5'ヌクレオチドに相補的である。第2のキメラオリゴヌクレオチドの第2の標的化配列（E_２'-B₄'）を、標的核酸配列（E）の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成し（ここで、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接している）；第2のキメラオリゴヌクレオチドは、シグナリングオリゴヌクレオチド（B”）にハイブリダイズすることが可能である捕捉可能な配列（B₄'）を含む。第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で、第1のキメラオリゴヌクレオチドを第2のキメラオリゴヌクレオチドと連結して、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1のキメラオリゴヌクレオチドおよび第2のキメラオリゴヌクレオチドの両方を含む反応産物を形成する。第1の2重鎖を変性させて標的核酸から反応産物を遊離させる。基板上の捕捉オリゴヌクレオチドおよびラテックスビーズ、コロイド金、酵素、量子ドット、またはシグナル増幅技術（SAT；例えば、米国特許第5,902,724号）などの、しかしこれらに限定されない、検出可能な部分を含むシグナリングオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって反応産物を検出する。この後者の例において、シグナルの量は、所定の範囲にわたって、最初の試料中の標的配列の数量に比例すると考えられえる。関連する態様（図6B）は、E1'およびE2'に相補的な領域の間のギャップ配列を充填するポリメラーゼの存在または酵素により触媒されるライゲーションを可能にする好適なリン酸化末端のある連結可能なギャップ充填オリゴヌクレオチドの使用を必要とする。

また、本発明のリガーゼ依存性の態様に従って産生されたライゲーション産物をRCAによって環状化および増幅してもよい。

本発明の核酸処理反応は、本アッセイに含まれ得る様々なその他の試薬を含んでもよい。これらには、最適なハイブリダイゼーション、鎖合成、および検出を容易にし、かつ非特異的なまたはバックグラウンドの相互作用を低下させるために使用し得る、塩、緩衝剤、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬剤などのような、他の状況では本アッセイの効率を改善する試薬を、試料調製方法および標的の純度に応じて、用いてもよい。

4、オリゴヌクレオチド
本発明の捕捉オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列が被検試料中に存在するか否かによって、シグナリングオリゴヌクレオチドまたはキメラオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしまたはシグナリングオリゴヌクレオチドまたはキメラオリゴヌクレオチドを「捕捉する」。幾つかの態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは固体表面に固定化されているが、その他において、それは溶液中で遊離している。

捕捉オリゴヌクレオチドが固体表面に固定化されている態様において、表面は、紙、セルロース、ならびに酢酸セルロースおよびニトロセルロースのようなセルロース誘導体などのセルロース材料；ガラスまたはガラス繊維；自然布または合成布；プラスチック；ナイロン；アガロース、シリカゲル、デキストラン、およびゼラチンなどの多孔性ゲル；多孔性繊維マトリックス；セファデックス架橋デキストラン鎖などの澱粉に基づく材料；セラミック材料；ラテックス；塩化ポリビニルおよびポリアミドのフィルム；ポリスチレン；ポリカーボネート；ならびに塩化ポリビニル-シリカの組み合わせ、ならびにそれらと同様のものを含むが、これらに限定されない、自然材料、合成材料、または合成により改変された天然材料で構成されることができる。

幾つかの態様において、固体表面は、処理反応を行なう反応容器の表面を形成する。その他の態様において、固体表面はまた、反応容器の中に挿入しおよびシグナル検出のための処理反応の完了後に取り除く診断ストリップの表面であってもよい。さらにその他の態様において、固体表面は、同定を容易にするように任意でタグが付けられている、微粒子またはビーズの表面である。その他の態様において、表面は、電解効果トランジスタとして好適に立体配置され、かつナノワイアー表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドへの核酸配列（例えば、捕捉可能な配列）の結合またはハイブリダイゼーションと同時に伝導性を変化させる、半導体のナノワイアーである（例えば、Cui et al., 2001, Science 293：1289-1292；Hahm and Lieber, 2004, Nano Lett. 4：51-54；Chen et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：4984-4989；Chen et al., 2004, J. Am. Chem. Soc. 126：1563-1568、およびPatolsky et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101：14017-14022参照）。

任意の好適な技術を用いて、捕捉オリゴヌクレオチドを固体表面に固定化してもよい。例えば、Holstromら（1993, Anal. Biochem. 209：278-283）は、ビオチンのアビジンおよびストレプトアビジンに対する親和性を活用し、およびビオチン化核酸分子をアビジン／ストレプトアビジンコーティングした支持体に固定化している。利用し得る別の方法は、ポリ-L-LysまたはポリL-Lys、Pheによるポリスチレンまたはガラス固相のプレコーティング、それに続く二官能性架橋試薬を用いたアミノ修飾オリゴヌクレオチドまたはスルフヒドリル修飾オリゴヌクレオチドのいずれかの共有結合的付着を伴う（Running et al., 1990, Biotechniques 8：276-277；Newton et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21：1155-1162）。Kawaiら（1993, Anal Biochem. 209：63-69）は、短いオリゴヌクレオチドプローブを連結して、ファージミドベクターへのそのクローニングの前に多量体を形成させる代わりの方法を記載している。その後、オリゴヌクレオチドをポリスチレンプレート上に固定化し、および254nmでのUV照射によって固定する。また、短い、5'-リン酸化オリゴヌクレオチドプライマーの化学修飾したポリスチレンプレート（Covalink（商標）プレート, Nunc）への直接的な共有結合的付着についての方法を参照してもよい（Rasmussen et al., 1991, Anal. Biochem. 198：138-142）。また、それぞれストレプトアビジンコーティングしたシリコンウエハースおよびヨードアセトアミドコーティングしたシリコンウエハースへのビオチン化オリゴヌクレオチドおよびスルフヒドリル化オリゴヌクレオチドの固定化を開示しているO'Connell-Maloneyら（1996, TIBTECH 14：401-407）による論文を考慮してもよい。また、アミノ修飾オリゴヌクレオチドも、イソチオシアネートコーティングしたガラス（Guo et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22：5456-5465）およびシラン-エポキシドコーティングしたウエハース（Eggers et al, 1994, BioTechniques 17：516-5240）に固定化されている。前述の方法は、オリゴヌクレオチドプライマーの基板への合成後付着に言及している。あるいは、例えば、MaskosおよびSouthernの方法（1992, Nucleic Acids Res., 20 1679-1684）またはFodorらの方法（前記）を利用して、オリゴヌクレオチドプライマーをインサイチューで合成してもよい。

当業者は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、捕捉オリゴヌクレオチドを固体表面に固定化することができることを認識していると考えられる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドを固体表面に吸着し、またはあるいは固体表面に共有結合している、スペーサー分子に共有結合してもよい。スペーサー分子は、ラテックス微粒子、ウシ血清アルブミン（BSA）などのタンパク質、またはデキストランもしくはポリ-（エチレングリコール）などのポリマーを含んでもよい。あるいは、スペーサー分子は、例えば、オリゴ-dTなどの、ホモポリヌクレオチド尾部を含んでもよい。

シグナリングオリゴヌクレオチドを捕捉する事象でシグナリングオリゴヌクレオチドの検出を容易にする任意の配置で捕捉オリゴヌクレオチドを固体表面に配置してもよい。ある種の態様において、捕捉オリゴヌクレオチドアレイの形態で捕捉オリゴヌクレオチドを固体表面に配置する。アレイ上の特定の場所に特定の標的に対応する捕捉オリゴヌクレオチドを固定化することによって、多重化された反応の結果の検出を容易にすることができる。捕捉オリゴヌクレオチドを微粒子またはビーズに固定化する態様において、反応で用いられる微粒子またはビーズの総数の特定の割合に特定の標的に対応する捕捉オリゴヌクレオチドを固定化することによって、多重化された反応の結果の検出を容易にすることができると考えられる。

典型的には、本発明に従う捕捉オリゴヌクレオチドは、標的特異的ではなく、むしろ本明細書において定義されたようなキメラオリゴヌクレオチドまたはシグナリングオリゴヌクレオチドの中に含まれる個々の（好ましくは）人工的で捕捉可能な配列に特異的であり、および「汎用アレイ」としてのそれらの使用を可能にする。すなわち、同じまたは限定された組の捕捉オリゴヌクレオチドを含む（固相アレイまたは液相アレイのいずれかの）アレイ。「液相アレイ」によって、例えば、フローサイトメトリーによる解析用の溶液中のアレイが意味される。幾つかの態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、汎用表面；すなわち、任意の用途において作製および使用することができる限定された組の捕捉オリゴヌクレオチドを含む、標準的アレイの形態にある。標的配列の存在下で捕捉オリゴヌクレオチドに結合する、実質的に相補的なシグナリングオリゴヌクレオチドと共に、そのような汎用アレイを用いる。エンドユーザーは、当業者によって正しく理解されると考えられるような、通常より単純でかつより費用のかからない、任意の所望の標的化配列を含む異なるキメラオリゴヌクレオチドを設計するだけで、本アレイをカスタマイズすることができる。幾つかの態様において、異なったかつ通例人工的な捕捉オリゴヌクレオチドのアレイを作製する；すなわち、捕捉オリゴヌクレオチドは、既知の標的配列に対する相補性を有さない。その後、本アレイの捕捉オリゴヌクレオチドに実質的に相補的である捕捉可能な配列をキメラオリゴヌクレオチドの中に組み入れることができる。

本発明のシグナリングオリゴヌクレオチドは、被検試料中に標的核酸配列が存在する場合、捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、および被検試料中の標的核酸配列の存在を示す検出可能なシグナルを少なくとも部分的に提供する。そのようなものとして、シグナリングオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドと関連するシグナリング試薬とハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドの配列を含む。

シグナリングオリゴヌクレオチドは、以下を含むそれと関連するシグナリング試薬を有してもよい：（1）シグナリングオリゴヌクレオチドへのシグナリング試薬の直接的な付着；（2）シグナリングオリゴヌクレオチドへのシグナリング試薬の間接的な付着；（すなわち、後でシグナリングオリゴヌクレオチドに結合する2次的媒介物へのシグナリング試薬の付着）；および（3）シグナリングオリゴヌクレオチドのその後の反応産物への付着。好適には、シグナリング試薬をシグナリングオリゴヌクレオチドに直接的に付着させる。シグナリング試薬を、クロモゲン、触媒、酵素、フルオロフォア、発光分子、化学発光分子、ユーロピウム（Eu³⁴）などのランタニドイオン、放射性同位元素、および直接的な視覚によるシグナリング試薬より選択してもよい。直接的な視覚によるシグナリング試薬の場合、コロイド金属粒子または非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、シグナル産生物質を含むリポソーム、デンドリマー（もしくはSATなどのデンドリマー様のもしくは連接した核酸構造）、またはその他の小胞、およびそれらと同様のものを利用してもよい。シグナリング試薬としての使用に好適な多数の酵素は、米国特許第4,366,241号、米国特許第4,843,000号、および米国特許第4,849,338号に開示されている。本発明において有用な好適な酵素シグナリング試薬には、アルカリホスファターゼ、セウヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、およびそれらと同様のものが含まれる。酵素シグナリング試薬を単独でまたは溶液中にある第2の酵素と組み合わせて用いてもよい。あるいは、本発明に従う好適なシグナリング試薬として使用し得る、フルオロフォアには、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ルシファーイエロー、またはR-フィコエリスリンが含まれるが、これらに限定されない。シグナリング試薬の間接的な付着（2）の場合、ビオチン、ジゴキシゲニン、ストレプトアビジン、および様々なタンパク質抗原などの試薬が連結するものとして働き、ならびに検出可能なシグナルの産生のための2次的媒介物の存在を必要とするということも正しく理解されると考えられる。ビオチンについて、2次的媒介物はストレプトアビジン酵素コンジュゲートを含んでもよい。抗原シグナリング試薬について、2次的媒介物は抗体-酵素コンジュゲートを含んでもよい。

捕捉オリゴヌクレオチドが溶液中で遊離しているある種の態様において、捕捉オリゴヌクレオチドはシグナル検出系の一方の部分を含み、およびシグナリングオリゴヌクレオチドはシグナル検出系の他方の部分を含み、個々の部分が協調して被検試料中の標的核酸配列の存在を示す第1のシグナルまたは標的配列の不在を示す第2のシグナルを提供する。例証的な例において、シグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした時に、受容体および供与体フルオロフォアが蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を誘導するのに十分に密に近接するように、捕捉オリゴヌクレオチドは受容体フルオロフォアを含み、およびシグナリングオリゴヌクレオチドは供与体フルオロフォアを含む。FRETの検出は被検試料中の標的核酸配列の存在を伝達すると考えられ、一方、FRETの不在は被検試料中のその配列の不在を伝達すると考えられる。当業者には公知であると考えられるが、2つの方法：蛍光または消光のうちの少なくとも1つでFRETを検出することができる。蛍光では、蛍光検出器を受容体フルオロフォアの放出スペクトルに設定し、ならびにシグナリングオリゴヌクレオチドの捕捉オリゴヌクレオチドへの結合を供与体から受容体へのエネルギー移動および受容体からのシグナルによって示す。消光では、検出器を供与体フルオロフォアの放出スペクトルに設定し、ならびにシグナリングオリゴヌクレオチドの捕捉オリゴヌクレオチドへの結合を供与体から受容体へのエネルギー移動および供与体からの放出の消光によって示す。

本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする第1の標的化配列および捕捉オリゴヌクレオチドまたはシグナリングオリゴヌクレオチドより選択される配列にハイブリダイズする捕捉可能な配列を含む。上記のように、標的核酸配列が存在しない場合、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列は捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、およびシグナリングを遮断する。幾つかの態様において、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列は、捕捉オリゴヌクレオチドに優先的にハイブリダイズする。これは、キメラオリゴヌクレオチドがシグナリングオリゴヌクレオチドよりも相対的に高い濃度で存在している結果であってもよく、またはそれがシグナリングオリゴヌクレオチドよりも高い親和性で捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように、キメラオリゴヌクレオチドが改変されていてもよい。

典型的には、捕捉可能な配列は、通常標的配列に生来のものではなく、すなわち外来性であり、しかし標的化配列に付加または付着される核酸である。この文脈において、「標的配列」は1次試料標的配列を含むことができ、または本明細書において概説した反応物もしくは反応の産物などの派生的標的であることができ；したがって例えば、標的配列は、PCR産物、第1のライゲーションプローブ、またはOLA反応における連結されたプローブなどであることができるということに留意すべきである。捕捉可能な配列は、キメラオリゴヌクレオチドを一意的に同定するものとして働き、およびしたがって標的配列を同定するものとして働く。一般に、お互いならびに標的配列および（例えば、ゲノムDNA内の配列に対して）標的配列の外側にあるより大きい核酸配列上の配列を含む、反応混合物のその他の構成要素の両方との交差ハイブリダイゼーションを最小限にするよう、捕捉可能な配列および例えば、アレイ上の対応する捕捉オリゴヌクレオチドの組を開発する。幾つかの捕捉可能な配列または「アダプター」配列は、米国特許出願公報第20030096239号で概説されている。例示的な捕捉可能配列は、以下の基準を満たす配列である。それらは、ゲノム、好ましくはヒトゲノム中に見出されず、およびそれらはヘアピンループなどの、望ましくない構造を有さない。

さらに、当業者によって正しく理解されると考えられるが、系の立体配置に応じて、3'末端もしくは5'末端のいずれかで、または内部位置で、捕捉可能な配列をキメラオリゴヌクレオチドの中に組み入れることができる。

当業者によって正しく理解されると考えられるが、捕捉可能な配列の長さは、結合の所望の「強度」および所望の異なる捕捉可能な配列の数によって、変わると考えられる。幾つかの態様において、捕捉可能な配列は通常、長さ約6〜約500塩基対、通例として約8〜約100、およびより通例として約10〜約25の範囲に及ぶ。

幾つかの態様において、捕捉可能な配列は、標的化配列が結合する標的配列を一意的に同定する。すなわち、捕捉可能な配列はそれ自体を標的配列に結合させる必要はないが、本系は、捕捉可能な配列の存在を検出することによって標的配列の同定を可能にする。したがって、捕捉可能な配列の検出はその後、標的配列の存在を支持するものとして働く。

標的核酸配列の好適なサブ配列を同定するための方法およびアルゴリズムは、分子生物学の分野で経験のある者には周知であり、かつ広く用いられている。本方法には、配列アラインメント法（Gotoh O. Multiple sequence alignment：algorithms and applications. Adv Biophys. 1999；36：159-206. Lecompte O, Thompson JD, Plewniak F, Thierry J, Poch O./Multiple alignment of complete sequences（MACS）in the post-genomic era. Gene. 2001 May 30；270(1-2)：17-30）、ドットマトリックス法、ならびに基本局所アラインメント配列ツールおよびFASTAプログラムなどのデータベース検索法（Pearson WR. Flexible sequence similarity searching with FASTA3 program package. Methods Mol Biol. 2000；132：185-219；Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J.（1990）「Basic local alignment search tool.」 J. Mol. Biol. 215：403-410）が含まれる。標的核酸配列のサブ配列は、核酸配列のファミリーで保存されている領域であってもよく、またはそれは特定の標的核酸配列に特有である領域であってもよい。

標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする標的化配列を設計するための方法も周知であり、かつ広く用いられている。この点について、
Dieffenbach et al., 1995 PCR Primer: A Laboratory Manual, CSHL press, Cold Spring Harbor, USA; Erlich, 1989, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York; Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to

を参照することができる。

一般に、標的化配列は、標的核酸配列のサブ配列に実質的に相補的である。例えば、標的核酸配列のサブ配列がA-G-T-A-C-T-Gである場合、相補的な標的化配列はT-C-A-T-G-A-Cであるように作製されると考えられる。標的核酸配列のサブ配列の特性およびそれらの相補体は、標的化配列の設計を最適化するように計算および使用される。考慮される特性には、（塩基残基での）オリゴヌクレオチド長、T_m、および自己ハイブリダイゼーションの傾向が含まれるが、これらに限定されない。特性を推定するためのアルゴリズムは当業者に周知であり、かつ広く使用されている。

を参照することができる。

本発明の協調オリゴヌクレオチドは、第1の標的化配列がハイブリダイズするサブ配列とは異なる、標的核酸配列のサブ配列；もしくは標的核酸配列の相補鎖のサブ配列、または少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチドより選択される配列のハイブリダイズする第2の標的化配列を含む。協調オリゴヌクレオチドは、核酸処理反応においておよび標的核酸配列の存在下で、キメラオリゴヌクレオチドと協調し、反応産物を形成する。本発明の文脈において、反応産物は、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断し、それによってシグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを可能にする、少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチドを含む第1鎖ならびに少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチドを含む第2鎖、またはその伸長産物を含む。

例えば、Narangら（1979, Methods Enzymol. 68：90）による論文および米国特許第4,356,270号に記載されたようなホスホトリエステル法などの、任意の好適な方法を用いて、本発明に従う使用のためのオリゴヌクレオチドを作製してもよい。あるいは、そのような調製のために、Brownら（1979, Methods Enzymol. 68：109）に記載されたようなホスホトリエステル法を用いてもよい。また、上の方法の自動化された態様を用いてもよい。例えば、あるそのような自動化された態様において、ジエチルホスホロアミダイトを出発材料として用い、およびBeaucageら（1981, Tetrahedron Letters 22：1859-1862）によって記載されたように合成してもよい。また、改変した固体支持体にオリゴヌクレオチドを合成するための方法に言及している、米国特許第4,458,066号および第4,500,707号を参照してもよい。（プラスミドまたはファージDNAの制限エンドヌクレアーゼ消化物の変性鎖などの）生物学的源から単離されたオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。幾つかの態様において、米国特許第5,424,186号（Fodorら）に開示された方法に従ってオリゴヌクレオチドを合成する。この方法は、リソグラフ技術を用いて基盤表面の正確に既知の場所に複数の異なるオリゴヌクレオチドを合成する。あるいは、Antson et al., 2000, Nucleic Acid Research 28(12)：e58によって記載された方法のようなPCRに基づく方法を用いて、オリゴヌクレオチドを作製してもよい。これらのPCRに基づく方法は、典型的には100より多いヌクレオチドの、より長いオリゴヌクレオチドを作製するのに特に好適である。

オリゴヌクレオチドを互いに、または、DNAもしくはRNAを含む標的核酸にハイブリダイズするための好適な条件下で、本発明の方法に従う核酸ハイブリダイゼーションを行なう。この点について、例えば、NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH（Homes and Higgins, 編）（IRL press, Washington D. C., 1985）を参照してもよい。一般に、ハイブリダイゼーションが起こるか否かは、核酸の長さ、pH、温度、1価および2価の陽イオンの濃度、核酸のハイブリッド形成領域におけるGおよびCヌクレオチドの割合、溶剤の粘性、ならびに変性剤のあり得る存在によって影響される。そのような変わり易い要素は、ハイブリダイゼーションに必要とされる時間にも影響する。それゆえ、好ましい条件は、特定の用途に依存すると考えられる。しかしながら、過度の実験を伴わず、そのような実験条件を日常的に決定することができる。

ある種の態様において、本発明の方法において高識別ハイブリダイゼーション条件を用いる。例えば、1つの内部塩基対不一致を含む類似のオリゴヌクレオチドプローブと比較して標的配列に完全に一致しかつ完全に相同である11〜17塩基長のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを区別する条件を記載しているWallaceら（1979, Nucl. Acids Res. 6：3543）を参照してもよい。また、ハイブリッドの融解点が、そのGC含有量と無関係に、単にオリゴヌクレオチドプローブの長さに依存する3M塩化テトラメチルアンモニウムを用いた11〜20塩基長のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについての条件を記載しているWoodら（1985, Proc. Natl. Acid. Sci. USA 82：1585）を参照してもよい。さらに、Drmanacら（前記）は、6〜10ヌクレオチド長のオリゴマーのストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件を記載し、およびロックされた核酸などのヌクレオチド類似体を用いることによって最も容易に、類似の条件を得てもよい（Christensen et al., 2001 Biochem J 354：481-4）。

通常、等張性安定化薬剤、変性薬剤、および／または再生促進剤などの、ハイブリダイゼーション最適化薬剤を任意で含むハイブリダイゼーション緩衝剤の存在下でハイブリダイゼーション反応を行なうことができる。等張性安定化薬剤の例として、ベタインおよび低級テトラアルキルアンモニウム塩が含まれるが、これらに制限されない。変性薬剤は、2本鎖核酸中の塩基間の水素結合または核酸分子の水和に干渉することによって、2本鎖核酸分子の融解温度を低下させる組成物である。変性薬剤には、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド、酢酸テトラエチル、尿素、グアニジウムイソチオシアネート、グリセロール、およびカオトロピック塩が含まれるが、これらに制限されない。ハイブリダイゼーション促進剤には、不均一核リボヌクレオタンパク質（hnRP）A1ならびに臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）および臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（DTAB）などの陽イオン性界面活性剤、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、1本鎖結合タンパク質（SSB）、ファージT4遺伝子32タンパク質、ならびに酢酸アンモニウムおよびエタノールの混合物が含まれる。

また、本発明のヌクレオチド配列が2つの鎖（例えば、ゲノムDNA）を含み、またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび／もしくは伸長を排除し得る2次構造（例えば、RNA）を有する場合、別々の工程としてかまたは伸長したプライマー分子の合成と同時にかのいずれかで、核酸配列の鎖を分離することが望ましいということが正しく理解されると考えられる。物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性法によって、この鎖分離を完遂することができる。ポリヌクレオチド配列の鎖を分離するある物理的方法は、それが実質的に完全に（＞99％）変性するまで核酸配列を熱する工程を伴う。典型的な熱変性は、約1〜10分の範囲に及ぶ時間の約80℃〜105℃の範囲に及ぶ温度を伴ってもよい。また、ヘリカーゼとして公知の酵素の部類またはヘリカーゼ活性を有し、かつリボATP（rATP）の存在下でDNAを変性させることが公知である、RecAという酵素によって、鎖分離を誘導してもよい。ヘリカーゼによって核酸の鎖を分離するための好適な反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berling（1978, CSH-Quantitative Biology 43 63）によって記載され、およびRecAを用いるための技術は、Radding（1982, Ann. Rev. Genetics 16 405-437）において概説されている。あるいは、電気的変性を用いて、例えば、低電圧電気を被検試料の全体に適用することによる（参照により本明細書に組み入れられる、Purvis et al., 1996, 4th World Congress on Biosensors, Bangkok. p 39, Elsevier Advanced Technology, Oxford）、または希釈した酸（例えば、7.5〜10分間の0.25M HCl）で被検試料を処置することによる（Meinkoth and Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138 267-284）、ポリヌクレオチド配列の変性をもたらしてもよい。

5、検出
シグナリング試薬の性質に応じて、視覚による検討によってまたは計器による手段によって、本発明のシグナリングオリゴヌクレオチドから検出可能なシグナルを検出することを実行してもよい。光によって蛍光標識を放射させ、および蛍光光度計で蛍光を検出することによって；分光光度計を用いて検出することができると考えられる色素を産生する酵素系を提供することによって；または反射率計を用いた色素粒子もしくは着色したコロイド金属もしくは非金属粒子の検出によって；放射性標識もしくは化学発光分子を用いる場合には、放射線測定器もしくはオートラジオグラフィーを利用することによって、シグナルを計器で検出してもよい。したがって、標識に付随した光を検出または走査するために検出手段を適合させてもよく、その光には蛍光、発光、焦点ビームまたはレーザー光が含まれてもよい。そのような場合、電荷結合素子（CCD）またはフォトセルを用いて、アレイ中の各場所由来の捕捉オリゴヌクレオチド／シグナリングオリゴヌクレオチドハイブリッドからの光の放出を走査し、およびデータをデジタルコンピュータに直接記録することができる。あるいは、捕捉オリゴヌクレオチドが微粒子またはビーズに固定化されている場合、蛍光活性化細胞選別（FACS）技術を用いて、シグナリング試薬を検出してもよい。場合によって、計器によるシグナルの検出が必要でなくてもよい。例えば、本明細書において記載されたような、アレイ形式に関連付けられたコロイド金属粒子または酵素的に生成される色の斑点を用いて、アレイの視覚による検査によって、アレイ上のパターンの解釈が可能になると考えられる。

また、幾つかの態様において、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている固体表面をパターン認識装置およびソフトウェアに関連付けて、例えばアレイからのシグナルのパターンを普通語（plain language）の遺伝子プロファイルに変換してもよい。ある種の態様において、「チップ読み取り機」を用いて、アレイ上のシグナリング試薬から発生したシグナルの検出を行なう。「チップ読み取り機」によって用いられることができる検出系は、例えばPirrungら（米国特許第5,143,854号）によって記載されている。チップ読み取り機はまた、典型的には、特定のアレイ位置または特色のシグナルが真陽性であるのか、または事によると偽シグナルであるのかということを決定するための幾つかのシグナル処理を組み入れていると考えられる。例示的なチップ読み取り機は、例えばFodorら（米国特許第5,925,525号）によって記載されている。

特定の態様において、本発明の検出可能なシグナルは、標的核酸配列の存在を示すだけでなく、捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたシグナリングオリゴヌクレオチドの量次第で、標的核酸配列の量も示す。この点について、既知の濃度を有する標準核酸試料を参照するなどの、しかしこれに限定されない、当業者に公知の任意の方法によって、標的核酸配列の定量化を行なってもよい。

また、陽性および陰性対照の含有によって、本発明の検出可能なシグナルの解釈を手助けしてもよい。当業者は好適な対照を容易に確認することができると考えられる。陽性対照は、被検試料中に存在すると考えられる配列、例えばβ-アクチン配列に特異的である第1のサブ配列を有するキメラオリゴヌクレオチドを含んでもよい。陰性対照は、第1の標的特異的サブ配列を欠き、または標的核酸配列に実質的にハイブリダイズしない標的特異的なサブ配列を有するキメラオリゴヌクレオチドを含んでもよい。

6、被検試料
本発明に従って使用され得る、好適な被検試料は、任意の生物から得られる1本鎖もしくは2本鎖核酸、またはそのコピーの抽出物を含む。ウイルス、真菌、細菌、植物、および動物に由来する溶解物、細胞、組織、またはその他の材料などの、しかしこれらに限定されない、生物由来の任意の源から抽出物を得てもよい。

SDS、浸透圧ショック、超音波破壊、グアニジウムイソチオシアネート、およびリゾチームによる処置によってもたらされる溶解を含むが、これらに限定されない、細胞溶解工程の後で、DNAまたはRNAなどの、核酸の試料抽出物を調製してもよい。本明細書に従って使用され得る、好適なDNAには、ゲノムDNAまたはcDNAが含まれる。例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（Ausubel, et al., 編）（John Wiley & Sons, 社. 1995）およびMOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL（Sambrook, et al., 編）（Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されたような数多くの一般に用いられるプロトコルのいずれか1つによって、そのようなDNAを調製してもよい。例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（前記）, MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL（前記）、ならびにChomczynskiおよびSacchi（1987, Anal. Biochem. 162：156）に記載されたような任意の好適なプロトコルによって、RNAの試料抽出物を調製してもよい。

当業者によって正しく理解されると考えられるが、試料抽出物は、（ほとんど全ての生物の、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液を含むが、これらに限定されない）体液；（空気、農業、水、および土壌試料を含むが、これらに限定されない）環境試料；生物兵器用薬剤試料；研究試料；精製ゲノムDNA、RNA、タンパク質などのような、精製試料；生試料（細菌、ウイルス、ゲノムDNAなど）を含むが、これらに限定されない、任意の数の物を含んでもよい。試料は、一緒に混ぜた異なる源由来の2つまたはそれより多くの試料などの、試料の組み合わせを含むこともできる。当業者によって正しく理解されると考えられるが、ほとんど全ての実験操作が試料になされていてもよい。

7、反応形式
チューブ、マイクロウェル、ウエハース（すなわち、チップ）、および微小流体素子を含む任意の好適な反応容器の中で、本発明の解析法を実行してもよい。幾つかの態様において、捕捉オリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオチド、協調オリゴヌクレオチド、シグナリングオリゴヌクレオチド、反応緩衝剤、酵素、シグナリング試薬、およびヌクレオチド前駆体のうちの少なくとも1つで容器を製作しまたは前もって製造する。好適には、反応構成要素は、本発明の解析法を実施するために予め最適化した量で、溶液形態または凍結乾燥された形態のいずれかで、1つまたは複数の反応容器に含まれる。この種の例証的な例において、本アッセイを実施するために、エンドユーザーは単に、核酸試料、核酸処理酵素、キメラオリゴヌクレオチド、および協調オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つをそのような反応容器に添加する。

幾つかの態様において、反応容器を熱制御可能な環境、例えば、サーマルサイクラー、インキュベーターなどに置き、本発明の解析法の様々な工程を行なう。その他の態様において、反応容器は、これらの解析法での使用のための1つまたは複数の操作を行なうことが可能である。これらの操作には：混合；濾過；核酸抽出；核酸精製；結合；溶出；ハイブリダイゼーションのための、核酸処理反応（例えば、PCT、LCR、OLA、RCRなど）を実施するための、および核酸ハイブリッドの変性のための熱制御；ならびにシグナリングオリゴヌクレオチドの検出が含まれるが、これらに限定されない。この種の例証的な装置は、例えば米国特許出願公報第2002/0115200号、第2002/0173032号、第2003/0008286号および第2005/0142565号に開示されている。

8、キット
本発明の方法に従う被検試料中の標的核酸配列を解析するために必要とされる必須の構成要素を全て、キットの中に一緒にまとめてもよい。キットは任意で、シグナリング試薬、陽性および陰性対照、希釈緩衝剤、ならびにそれらと同様のものを可視化するための適切な構成要素を含んでもよい。また、核酸を核酸処理反応に供するのに好適な構成要素が含まれてもよい。これらの構成要素には、（利用される核酸処理反応技術に応じて）Taqポリメラーゼ、逆転写酵素、DNAリガーゼなどの、しかしこれらに限定されない、様々なポリメラーゼ、ヌクレオチド前駆体、および緩衝剤溶液が含まれる。そのようなキットはまた、個々の構成要素のための別々の入れ物を含んでもよい。幾つかの態様において、キットは本発明の方法を行なうための取扱説明書を含む。

特定の態様において、本発明のキットは、例えば第7節で記載されたような、好適には凍結乾燥された形態の、それに固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有し、かつ予め調製された試薬の混合物を含む反応容器を含む。

本発明が容易に理解されかつ実際に実行され得るように、以下の非限定的な実施例によって、特定の好ましい態様をこれから記載する。

実施例
実施例1
インフルエンザAポリメラーゼ遺伝子断片PB2のRT-PCR検出
プライマー設計：
インフルエンザAウイルスのPB2断片の一部を増幅するよう、RT-PCRプライマーを設計する。多数の異なるウイルス由来のポリメラーゼ遺伝子を増幅することができるように、多数の位置でイノシンまたは混合塩基を用いる。PCRプライマーの5'末端が捕捉可能な配列または「タグ」を含みさえすれば、プライマーのうちの1つはキメラであった。この実施例において用いられる捕捉可能な配列は、

（［SEQ ID NO：1］、図2でB'と標識されている）であり、かつ設計が米国特許第6,027,884号によって記載されている配列のうちの1つである。標的配列（インフルエンザAウイルス）に見出されない任意のその他の捕捉可能な配列を用いてもよい。

キメラインフルエンザフォワードプライマーCh-PB2(1)Fは、配列

を含んだ。インフルエンザリバースプライマーPB2(2)Rは、配列5'-AGT AT(T/C) CTC AT(T/C) CC(T/A) GAN CC-3'［SEQ ID NO：3］を含んだ。これらのプライマーから生成される産物の期待されるサイズは、およそ1010bpである。しかしながら、これは、PB2コード配列の長さが分離株間でわずかに変わり得るので、どのウイルスが関心対象の試料中に存在するかによって変わってもよい（図1）。

試料由来RNAの抽出：
製造元の取扱説明書に従うことによってQIAGEN RNA easy抽出キットを用いて試料（例えば、羊水または臨床試料）からウイルスRNAを抽出した。QIAGEN抽出プロトコルでの使用の前に、600μLのグアニジウム変性剤および6μLの2-メルカプトエタノールの添加によって、100μLの試料を不活化した。抽出したRNAを50μlのRnアーゼが含まれていない水（QIAGEN）の中で再懸濁した。2μLの再懸濁したRNAをRT-PCR反応で用いた。

定量：
およそ100ピコモルの捕捉オリゴヌクレオチド（図2でBと標識されている）

をサーマルサイクリングマシンでの使用に好適な形状である96ウェルプレートのウェル、またはチューブのストリップの上に結合させる。5'修飾基（例えば、アミノ基と捕捉オリゴヌクレオチドの5'末端の間に(CH2)6「スペーサー」配列（または同様のもの）があるアミノ基）を用いることによって、捕捉オリゴヌクレオチドの基板への結合を達成してもよい。あるいは、非共有結合的ではあるが、非常に高い親和性でストレプトアビジンをコーティングしたプレートに結合することができる5'ビオチン部分を捕捉オリゴヌクレオチドの一方の末端に取り込ませる。

検出部分（例えば、ラテックスビーズ）にコンジュゲートされた配列

（［SEQ ID NO：1］、図2でB”と標識されている）シグナリングオリゴヌクレオチドを設計し、捕捉オリゴヌクレオチドをプレコーティングしたマイクロウェルプレートの各ウェルに添加する。固定化した捕捉オリゴヌクレオチドの質量とほぼ等しい質量でシグナリングオリゴヌクレオチドを添加する。添加されるべき捕捉オリゴヌクレオチドの正確な質量は、各アッセイおよび試薬の各バッチについて滴定によって実験的に決定すべきである。

定量用の標準：
PB2遺伝子の986bp断片をプラスミドPCR TOPO2.1（Invitrogen）にクローン化した。このプラスミド（本明細書において「対照プラスミド」と称される）は、フォワードプライマーCh-PB2(1)FおよびリバースプライマーPB2(2)Rのウイルス配列相補的部分に相補的な配列を有する。対照プラスミドを連続希釈で本アッセイにおける定量標準としておよびRT-PCR反応用の試薬対照として用いることができる。ウェル当たり0〜10,000ピコモルの範囲のプラスミドの連続希釈を定量および試薬対照として用いてもよい。ウェル当たりおよそ100ピコモルの捕捉プライマーを固定化する場合、定量標準用の濃度範囲は、標準の各濃度について2通りのウェルで、ウェル当たり0、3、10、30、100、300、1000、3000、および10,000ピコモルを含むウェル当たり0〜10ナノモルの範囲であるべきである。

RT-PCR反応：
1、cDNA合成の後すぐにPCR増幅が続くように、サーマルサイクラーを以下のようにプラグラミングした：
cDNA合成：
1サイクル：46℃で30分間プラス60℃で10分間
変性：
1サイクル：94℃で2分間
PCR増幅：
以下からなる8サイクルのステップダウンPCR：
94℃での15秒の変性
連続的な「ステップダウンサイクル」の各々における56℃、54℃、52℃、50℃、48℃、46℃、44℃、42℃での30秒のアニーリング
68℃での75秒の伸長
その後に以下が続く：
36サイクル：94℃で15秒間（変性）
40℃で30秒間（アニール）
68℃で75秒間（伸長）
最終伸長（任意）：
1サイクル：68℃で5分間
2、（その壁に予め結合した捕捉オリゴヌクレオチドを有する）0.2mLの、ヌクレアーゼを含まない、壁の薄いPCRチューブに以下を氷上で添加する：
2×反応混合液25μL
鋳型RNA 2μLまたは（定量標準としての）連続希釈の対照プラスミド（2μL）
センスプライマーCh-PB2(1)F 2μL（160 pmole）
アンチセンスプライマー 2μL（160 pmole）
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix（In vitrogen） 2μL
2μLのシグナリングオリゴヌクレオチド（100 pmoleまたは滴定で予め決定されたその他の量）
RNアーゼを含まない水を50μLまで
3、穏やかに混合し、および全ての構成要素が増幅チューブの底にあることを確実にするよう手短に遠心分離する。上記のようにプログラミングした予め熱したサーマルサイクラーに反応プレートまたはチューブを置く。
4、反応が進むにつれて、キメラインフルエンザフォワードプライマー

は2本鎖PCR産物に取り込まれ、かつそれが固定化された捕捉オリゴヌクレオチド

とシグナリングオリゴヌクレオチドの間の結合を競合することができないように隔離される。

したがって、各PCRサイクルの「アニーリング」段階での結合したシグナリングオリゴヌクレオチドの量は、反応が進むにつれて増加する。

標準曲線を産生するために、未知のものを含むチューブ／ウェルにおけるシグナルの強度を連続希釈したプラスミド標準を加えたチューブ／ウェルにおけるシグナルの強度と比較する。標準曲線との比較によって、試料中の標的ウイルス配列の濃度を算出することができる。

標準曲線を作成するために一連の別々のチューブ／ウェルを用いることが必須であるわけではない。後者の場合、標準RNAまたはプラスミドのみを検出するキメラプライマーおよびシグナリングオリゴヌクレオチド対を用いて、未知試料と同じ反応チューブ中で公知の量の配列に無関係な標準RNAまたはプラスミドを同時増幅することができる「内部標準」を用いることができる。その後、未知試料によって発生したシグナルの量を同じチューブ中の内部標準RNAまたはプラスミドによって発生したシグナルと比較することができる。

シグナルの強度の測定をPCR反応の全てのサイクルの最後に行なうことができると考えられ、またはPCR反応の各サイクルで読み取り装置によってチェックすることができると考えられる。

別の態様において、鋳型RNA以外の全ての成分と共に、シグナリングオリゴヌクレオチドを反応チューブの中に（例えばフリーズドライによって）代わりに予め組み入れてもよい。反応混合液を水の添加によって再構成することができる。

実施例2
「終点」検出
この実施例は、増幅工程と分かれている「終点」検出工程を利用する。検出試薬およびシグナリング試薬は、実施例1で記載したようにウェル当たりおよそ100ピコモルの固定化された捕捉オリゴヌクレオチドと共に96ウェルプレート中に存在する。捕捉可能なキメラRT-PCRプライマーは、実施例1で与えられたような

である。シグナリングオリゴヌクレオチドは実施例1と同様であるが、ビオチン化され、および（これは各々の異なる解析物について滴定されると考えられるが）捕捉オリゴヌクレオチドとほぼ等モル量で検出ウェル中に存在する。RT-PCRプライマーは実施例1で用いられたものと同一である。

RT-PCR反応を実施例1と同様に実行するが、RT-PCRの間に捕捉オリゴヌクレオチドおよびシグナリングオリゴヌクレオチドを含めない。連続希釈したプラスミド対照を定量標準として含める。RT-PCR反応の終了直後に、反応産物を94℃で5分間熱し、その後ウェットアイス中で急冷し、および検出プレートに移す。

PCR反応が進むにつれて、キメラで捕捉可能なPCRプライマーは2本鎖産物に取り込まれ、かつシグナリングオリゴヌクレオチドへの結合について捕捉オリゴヌクレオチドとあまり効率的に競合しない。PCR産物の量が反応の最後により多く存在すればするほど、シグナリングオリゴヌクレオチドの結合についての競合がより少ない。

37℃で20分後、検出プレートをウェル当たり300μLの1×SSC pH 7.2中で3回洗浄し、その後ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲート（Roche カタログ番号1089153）をPBS/0.1％ Tween/0.5％ BSA中で1：10,000の希釈でウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートし、その後PBS/Tween中で3回洗浄する。逆さまにすることによって水気を切り、その後基質を各ウェルにそれぞれ添加する。その後、100mM酢酸ナトリウム／クエン酸、pH 4.9中の0.42mM TMB（Roche カタログ番号11484281001）、0.004％ H2O2（v/v）を添加する。2M H₂SO₄で反応を停止させる。形成された産物は、最初は青く、停止した後、黄色でかつ水に溶ける。参照波長650nmに対して450nmでELISAプレート読み取り機により吸収を測定する。

実施例3
リガーゼ依存性の反応
この例証的な実施例で用いるDNAは、インフルエンザA PB2遺伝子断片のコード領域の2本鎖DNAコピーを含む対照プラスミドDNAである。このプラスミドにおいて、PB2遺伝子の986bp断片はプラスミドPCR TOPO2.1（Invitrogen）に挿入されている。

キメラライゲーションオリゴヌクレオチド配列：
コドン627（またはインフルエンザAにおけるPB2の配列中の等しい数的位置の位置）を含むインフルエンザAの領域に相補的であるよう、連結可能なオリゴヌクレオチドを設計する。

（［SEQ ID NO：5］、図4でB'-E1'と標識されている）。

（［SEQ ID NO：6］、図4でE2'と標識されている）。上流キメラライゲーションオリゴヌクレオチドで用いられる捕捉可能な配列は、実施例1で用いられる配列と同じである。

例示的な目的のために、熱安定性のDNAリガーゼを用いて、上で標識と記載された標準プラスミドDNAを用いてリガーゼ依存性の反応を実行する。対照プラスミド中のインフルエンザAのPB2断片（上記）の一部を増幅および検出するための過程を以下のように実行する（Belgrader et al., 1995, Genetic Identity Conference Proceedings, Sixth International Symposium on Human Identificationからの改変されたプロトコル）。

50mM Tris/HCl pH 8.5、50mM KCl、10mM MgCl₂、1mM NAD⁺、10mM DTT、LCRオリゴヌクレオチドセット（50pmolの各プライマー、Ch-PB2U、およびPB2D）、ならびに10ユニットのTaq DNAリガーゼを含む20μLのLCR混合液中で5μLアリコートのプラスミドを希釈する。変性するための1サイクルの95℃、2分間、その後、変性するための20〜25サイクルの95℃、30秒間、および連結するための65℃、4分間について、サーマルサイクリングを実施する。

リガーゼを介する反応工程のための反応容器は、第2の、特別に設計された協調オリゴヌクレオチド（図4でB2-E2と標識されている）を伴う検出系を組み入れている。

検出系のために、およそ50ピコモルの捕捉オリゴヌクレオチド

（［SEQ ID NO：4］、図4でBと標識されている）をサーマルサイクリングマシンでの使用に好適な形状である96ウェルプレートのウェル、またはチューブのストリップの上に結合させる。5'修飾基（例えば、アミノ基と捕捉オリゴヌクレオチドの5'末端の間に(CH₂)₆「スペーサー」配列（または同様のもの）があるアミノ基）を用いることによって、捕捉オリゴヌクレオチドの基板への結合を達成してもよい。あるいは、非共有結合的ではあるが、非常に高い親和性でストレプトアビジンをコーティングしたプレートに結合することができる5'ビオチン部分を捕捉オリゴヌクレオチドの一方の末端に取り込ませる。このリガーゼを介する態様における捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例1で用いられた捕捉オリゴヌクレオチドと同じ配列を有するということに留意されたい。配列は、キメラライゲーションオリゴヌクレオチドChPB2Uの非インフルエンザ配列相補的部分に相補的である。

検出部分（例えば、ラテックスビーズ）にコンジュゲートされた配列

を含むシグナリングオリゴヌクレオチドを設計し、捕捉オリゴヌクレオチド

をプレコーティングしたマイクロウェルプレートの各ウェルに添加する。固定化した捕捉オリゴヌクレオチドの質量とほぼ等しい質量でシグナリングオリゴヌクレオチドを添加する。添加されるべき捕捉オリゴヌクレオチドの正確な質量は、各アッセイおよび試薬の各バッチについて滴定によって実験的に決定すべきである。

リガーゼを介する反応は以下の工程を含む：
1、95℃で2分間、標的プラスミドDNAを変性させる工程。
2、キメラオリゴヌクレオチド（Ch-PB2U）の第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、キメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的である、工程。
3、第1の協調オリゴヌクレオチド（PB2D）の第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接して位置する、工程。
4、Taq DNAリガーゼという酵素を用いて第1のサブ配列の5’ヌクレオチドの存在下でキメラオリゴヌクレオチドを第1の協調オリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびにキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調オリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成する工程。
5、95℃で30秒間、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程。
6、第2の特別に設計された協調オリゴヌクレオチド（図4におけるB2-E2）をライゲーション産物のキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調配列部分にハイブリダイズさせて、反応産物を形成する工程。第2の特別に設計された協調オリゴヌクレオチドは、リガーゼを介するサイクリング過程の最後に添加してもよく、または過程の始めから反応混合液に存在していてもよい。
7、上で形成された反応産物は、第2の協調オリゴヌクレオチド（図4でB2-E2と標識されている）の中に含まれている遮断オリゴヌクレオチド配列の隔離を結果的にもたらす。遮断配列の隔離によって、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにシグナリングオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることおよび標的配列の量と量的に関連する（ラテックスマイクロビーズの局所的濃度によって）結果として生じるシグナルの発生が可能になる。

発生したシグナルを、既知の出発濃度の対照プラスミドの連続希釈からリガーゼを介する検出過程によって発生した標準曲線と比較し、および未知試料の出発濃度を概算することができる。

実施例4
ローリングサークル増幅反応
この実施例は、コドン627を含むインフルエンザのPB2遺伝子断片の領域の検出および定量を記載する。この実施例において、PB2遺伝子断片の986bp DNAインサートがあるプラスミドPCR-TOPO2.1（Invitrogen）を標的として用いる。最初のライゲーションおよびRCA工程のためのプロトコルは、米国特許第5,854,033号に記載されている。

1、各々の希釈で1ナノグラム〜300ナノグラムの範囲に及ぶ幾つかの連続希釈プラスミドを別々のプラスチックチューブ中で4分間97℃で熱変性させ、および5'および3'末端がそれぞれライゲーションオリゴヌクレオチドCH-PB2UおよびPB2Dの標的特異的部分と同一である5'リン酸化開環プローブの存在下、ライゲーション条件下でインキュベートする。以下の配列

を有する95ヌクレオチドの開環協調オリゴヌクレオチドを用いる。T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）は、10mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.20M NaCl、10mM MgCl₂、2mM ATPからなる緩衝剤中にμL当たり5ユニットの濃度で反応混合液中に存在する。開環プローブの濃度は80nMである。全反応容量は40マイクロリットルである。25分間37℃で、ライゲーションを実行する。

2、25μLを各チューブから採取し、および50mM Tris-HCl（pH 7.5）、10mM MgCl₂、1mM DTT、各400μMのdTTP、dATP、dGTP、dCTPからなる、0.2μMの濃度で、以下の配列

を有するキメラで42塩基のローリングサークル複製プライマーも含む、等容量の緩衝剤と混合する。この配列の領域は、RT-PCR用に実施例1で用いられた捕捉可能な配列と同一の捕捉可能な配列であるということに留意されたい。異なる領域は、開環協調オリゴヌクレオチド［SEQ ID NO：7］に相補的である。

3、Φ29 DNAポリメラーゼ（50μL当たり160ng）を添加し、および反応混合物を30分間30℃でインキュベートする。

4、上の反応物に、新たに合成される鎖に相補的である、別の協調オリゴヌクレオチド、すなわち、リバースプライマーを添加する。このプライマーの濃度は0.2μMであり、かつ配列は

である。反応をさらに30分間30℃で継続させ、および環状化した協調オリゴヌクレオチドに最初に相補的であった配列に逆相補的であり、かつSEQ ID NO：8の領域に相補的な（遮断配列として作用する）配列を含むと考えられる第2鎖を合成する。

5、各反応チューブは、SEQ ID NO：8（上記）の領域に相補的である固定化された捕捉オリゴヌクレオチド［SEQ ID NO：4］および実施例1で用いられたシグナリングオリゴヌクレオチドと同一のシグナリングオリゴヌクレオチドを含む。第2鎖の合成が工程4で進むにつれて、遮断配列が合成され、かつこの配列はSEQ ID NO：8の領域を隔離し、それが固定化された捕捉オリゴヌクレオチド配列［SEQ ID NO：4］とシグナリングオリゴヌクレオチドの間の結合をあまり競合することができないようにする。第2鎖の産物の量が蓄積するにつれて、結合したシグナリングオリゴヌクレオチドの量が増加すると考えられる。発生するシグナルの量は、出発反応に添加されたプラスミドの量に比例する。

6、RCAの別の実施例において、検出工程を反応の完了時に行ない、かつ各反応の25μL試料をマイクロウェルプレート中の別々の検出ウェルに移すことを除き、手順は先の実施例と同一である。検出ウェルは、100ピコモルの捕捉オリゴヌクレオチドでプレコーティングされ、およびビオチンにコンジュゲートされたシグナリングオリゴヌクレオチド（100ピコモル）を含む。その後、（実施例2で上記されたものと同じ方法を用いて）ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Roche カタログ番号1089153）および基質TMBを用いて、結合したシグナリングオリゴヌクレオチドの濃度を検出する。

実施例5
「終点」検出II
この実施例は、終点検出工程の別の態様を示す。検出試薬およびシグナリング試薬は、実施例1で記載されたようなウェル当たりおよそ.01ピコモルの固定化された捕捉オリゴヌクレオチドと共に96ウェルプレート中に存在する。捕捉可能なキメラRT-PCRプライマーは、

である。（これは各々の異なる分析物について滴定されると考えられるものの）シグナリングオリゴヌクレオチドは、実施例1と同様であるが、FAM標識されかつ捕捉オリゴヌクレオチドとほぼ等モル量で検出ウェル中に存在する。PCRプライマーは以下の段落「０１３４」の表中にリストアップされている通りである（PCR-TAGプライマーおよびPB2(2)リバースプライマー）。

PCR反応を実施例1と同様に実行したが、標的として200ピコグラムのcDNAで出発し、かつ最初のRT（逆転写）工程を省略した。PCRの間、捕捉オリゴヌクレオチドおよびシグナリングオリゴヌクレオチドを含めずに、反応を実行した。PCR反応の完了と同時に、以下の段落「０１３４」〜「０１４２」で記載されたように、反応産物を処理する。

PCR反応が進むにつれて、キメラで捕捉可能なPCRプライマー（PCR-TAGプライマー）が2本鎖産物に取り込まれ、かつシグナリングオリゴヌクレオチドへの結合について捕捉オリゴヌクレオチドとあまり効率的に競合しない。PCR産物の量が反応の最後により多く存在すればするほど、シグナリングオリゴヌクレオチドの結合についての競合がより少ない。

H7N7インフルエンザA cDNAの検出のための特定の反応条件は以下の通りである：

PCR増幅（35サイクル）の後、PCR産物を1/2に希釈する。

以下の混合物を調製する：

100μLの反応混合物をストレプトアビジンプレート上の各ウェルに移し、および37℃で40分間インキュベートする。

混合物をプレートから捨て去り、およびPBSで4回洗浄する。

抗体希釈剤（150mM Tris-Hcl、100mM NaCl、2％ V/V FBS（胎仔ウシ血清））中で1：1,000に希釈された100μL（15mユニット）のペルオキシダーゼコンジュゲート抗FAM抗体をストレプトアビジンプレートの各ウェルに添加し、および37℃で40分間インキュベートする。

混合物をプレートから捨て去り、およびPBSで4回洗浄する。

100μLのBMブルー（Roche）基質をストレプトアビジンプレートの各ウェルに添加し、および室温で5分間インキュベートする。

100μLのH₂SO₄をストレプトアビジンプレートの各ウェルに添加し、および室温で10分間インキュベートする。

450nmでの吸収を測定する。

図7で示した、この解析の結果により、本アッセイが、終点検出工程を用いて、バックグラウンドに対する良好なシグナル 対 ノイズで、H7N7インフルエンザA cDNAを感度良く検出することができることが示されている。

図8は、上記のアッセイにおけるPCR-TAGプライマーの最適量を決定するための滴定実験の結果を示している。これらの結果により、PCR-TAGプライマーの最適量は、50μL中におよそ0.5pmolであることが示されている。この方法を用いて増幅されたPCR産物は、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって決定された場合、予想されたサイズを有した（図9参照）。

本明細書において引用されたあらゆる特許、特許出願、および公報の開示は、完全な形で参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書における任意の参照の引用は、そのような参照が本出願にとっての「先行技術」として利用可能であるという承認と解釈されるべきではない。

本明細書の全体を通じて、本目的は、本発明を任意の1つの態様または特定の特色の収集物に限定することなく、本発明の好ましい態様を記載することである。それゆえ、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の態様において様々な修正および変更をなすことができるということを正しく理解すると考えられる。そのような修正および変更は全て、付随する特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。

オーストラリアインフルエンザA分離株H5N3(+)、H5N3、Hl1N6、H7N7、H12N9、H7N7、H4N4、H6N5、およびH9N2のPB2遺伝子断片からのRT-PCRによって発生した産物を示すアガロースゲルの写真表示。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた本発明の方法のある態様の概略図。（図2A）固定化捕捉オリゴヌクレオチド（B）；（図2B）シグナリング試薬（C）を含むシグナリングオリゴヌクレオチド（B”）；（図2C）捕捉可能配列（B'）および標的配列（E'）を含むキメラオリゴヌクレオチドおよび協調オリゴヌクレオチド（F'）；（図2D）標的核酸配列（E）；（図2E）第1の伸長産物を含むキメラオリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列のハイブリッド（F）；（図2F）キメラオリゴヌクレオチドならびに伸長産物を含む標的核酸配列および第2の伸長産物を含む協調オリゴヌクレオチドのハイブリッド（G）；（図2G）固定化捕捉オリゴヌクレオチドおよびシグナリング試薬を含むシグナリングオリゴヌクレオチドのハイブリッド（すなわち、陽性シグナル）；（図2H）固定化捕捉オリゴヌクレオチドおよびキメラオリゴヌクレオチド（すなわち、陰性シグナル）。 ローリングサークル増幅（RCA）を用いた本発明の方法のある態様の概略図。 ライゲーション連鎖反応（LCR）を用いた本発明の方法のある態様の概略図。 ライゲーション連鎖反応（LCR）を用いた本発明の方法のある態様の概略図。 ライゲーション連鎖反応（LCR）を用いた本発明の方法のある態様の概略図。 終点検出を用いたH7N7インフルエンザA cDNAの解析を示すグラフ表示。50μL中に0.5 pmoleのPCR-TAGプライマーを用いた、35サイクルのPCRの後、450nmで吸収を測定した。 終点検出工程を用いる、本発明の方法のある態様におけるPCR-TAGプライマーの最適量を決定するための滴定実験の結果を示すグラフ表示。35サイクルのPCR増幅後、450nmで試料の吸収を測定した。より暗い点はPCR標的が存在する場合の吸収を示し、およびより明るい点はバックグラウンド吸収を示す。 PCR-TAGプライマーの最適量を決定するための、図8で参照された同じアッセイに従って増幅されたPCR産物のアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色を示す写真表示。各々の場合において、リバースプライマーをPCR-TAGプライマーの4倍の量で用いた。陰性対照は、出発鋳型を含まず、および全体のPCR反応容量は50μLであった。レーンの数字は以下を表す：M、ハイパーラダーII；（1）1 pmoleのPCR-TAGプライマーおよびH7N7鋳型を用いたPCR産物；（2）0.5 pmoleのPCR-TAGプライマーおよびH7N7鋳型を用いたPCR産物；（3）0.25 pmoleのPCR-TAGプライマーおよびH7N7鋳型を用いたPCR産物；（4）1 pmoleのPCR-TAGプライマーおよび陰性対照を用いたPCR産物；（5）0.5 pmoleのPCR-TAGプライマーおよび陰性対照を用いたPCR産物；ならびに（6）0.25 pmoleのPCR-TAGプライマーおよび陰性対照を用いたPCR産物。

Claims (27)

1. 被検試料中の標的核酸配列を解析するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
   ‐反応容器中で以下を混合する工程：
   （1）標的核酸配列にハイブリダイズしない（例えば、固定化されまたは溶液中で遊離している）捕捉オリゴヌクレオチド；
   （2）検出可能なシグナルを提供しかつ捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするシグナリングオリゴヌクレオチド；
   （3）以下を含む少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド：
   （a）標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする第1の標的化配列；および
   （b）以下より選択される配列にハイブリダイズする捕捉可能な配列
   （i）捕捉オリゴヌクレオチド；または
   （ii）シグナリングオリゴヌクレオチド
   （4）以下より選択される配列にハイブリダイズする第2の標的化配列を含む少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチド：
   （a）第1の標的化配列がハイブリダイズするサブ配列とは異なる、標的核酸配列のサブ配列；または
   （b）標的核酸配列の相補鎖のサブ配列、または
   （c）少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド；ならびに
   （5）核酸を含む被検試料；
   ‐標的核酸配列が被検試料中に存在する場合に反応産物を形成するように反応容器の内容物を核酸処理反応に供する工程であって、このように形成された反応産物が、キメラオリゴヌクレオチドの捕捉可能な配列の、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを遮断し、それによってシグナリングオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを可能にする、少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチドを含む第1鎖ならびに少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチドを含む第2鎖、またはその伸長産物を含む、工程；ならびに
   ‐被検試料中の標的核酸配列の存在または量を示すシグナリングオリゴヌクレオチドからの検出可能なシグナルを検出する工程。
2. 核酸処理反応がポリメリゼーション依存性の核酸処理反応である、請求項1記載の方法。
3. 以下の工程を含む、請求項1記載の方法：
   （a）標的核酸配列にキメラオリゴヌクレオチドの標的化配列をハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、標的核酸配列がキメラオリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオチドを越えて3'から5'方向に伸長し、標的核酸配列の非ハイブリッド部分を規定する、工程；
   （b）標的核酸配列の非ハイブリッド部分を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第1のハイブリッドのキメラオリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物および標的核酸配列を含む第1の2重鎖を形成する工程；
   （c）第1の2重鎖を変性させて第1の伸長産物から標的核酸配列を遊離させる工程；
   （d）協調オリゴヌクレオチドを第1の伸長産物とハイブリダイズさせて、第2のハイブリッドを形成する工程であって、第1の伸長産物が、協調オリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオチドを越えて3'から5'方向に伸長し、第1の伸長産物の非ハイブリッド部分を規定する、工程；ならびに
   （e）第1の伸長産物を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第2のハイブリッドの協調オリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物、および第1の伸長産物に相補的である第2の伸長産物を含む反応産物を形成する工程。
4. 工程a）〜e）を1回または複数回繰り返す、請求項3記載の方法。
5. ポリメリゼーション薬剤がプライマー依存性のDNAポリメラーゼである、請求項3記載の方法。
6. 工程b）におけるポリメリゼーション薬剤がプライマー依存性の逆転写酵素である、請求項3記載の方法。
7. ポリメリゼーション依存性の核酸処理反応が以下の工程を含む、請求項1記載の方法：
   i）環状化可能な第1の協調オリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、第1の協調オリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的である、工程；
   ii）第1の協調オリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列と隣接して位置する、工程、
   iii）第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で第1の協調オリゴヌクレオチドの第1および第2の標的化配列を連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1の協調オリゴヌクレオチドの第1および第2の標的化配列を含むライゲーション産物を環状化形態で形成する工程、
   iv）第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程、
   v）キメラオリゴヌクレオチドをライゲーション産物とハイブリダイズさせて、第3のハイブリッドを形成する工程；
   vi）ライゲーション産物を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第3のハイブリッドのキメラオリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物を形成する工程、
   vii）第2の協調オリゴヌクレオチドを第1の伸長産物にハイブリダイズさせて、第4のハイブリッドを形成する工程、ならびに
   viii）第1の伸長産物を鋳型として用いてポリメリゼーション薬剤およびヌクレオチド前駆体の存在下で第4のハイブリッドの第2の協調オリゴヌクレオチドを伸長させて、第1の伸長産物、および第1の伸長産物に相補的である第2の伸長産物を含む反応産物を形成する工程。
8. 核酸処理反応がリガーゼ依存性の核酸処理反応である、請求項1記載の方法。
9. 以下の工程を含む、請求項3記載の方法：
   1、キメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、キメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的である、工程；
   2、第1の協調オリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接して位置する、工程；
   3、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下でキメラオリゴヌクレオチドを第1の協調オリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびにキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調オリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成する工程；
   4、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程；ならびに
   5、第2の協調オリゴヌクレオチドをライゲーション産物のキメラオリゴヌクレオチドおよび第1の協調配列部分にハイブリダイズさせて、反応産物を形成する工程。
10. 以下の工程を含む、請求項3記載の方法：
    a、第1のキメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、第1のキメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的であり、かつ捕捉可能な配列の5'ヌクレオチドが連結可能でない、工程；
    b、第2のキメラオリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接しており；捕捉可能な配列の5'ヌクレオチドが連結可能でない、工程；
    c、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で第1のキメラオリゴヌクレオチドを第2のキメラオリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1のキメラオリゴヌクレオチドおよび第2のキメラオリゴヌクレオチドの両方を含むライゲーション産物を形成する工程；
    d、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸からライゲーション産物を遊離させる工程；ならびに
    e、協調オリゴヌクレオチドをライゲーション産物の第1および第2のキメラオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて、反応産物を形成する工程。
11. 以下の工程を含む、請求項3記載の方法：
    i、第1のキメラオリゴヌクレオチドの第1の標的化配列を標的核酸配列の第1のサブ配列にハイブリダイズさせて第1のハイブリッドを形成する工程であって、第1のキメラオリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である捕捉可能な配列を含み、かつ第1のキメラオリゴヌクレオチドの3'ヌクレオチドが第1のサブ配列の5'ヌクレオチドと相補的である、工程；
    ii、第2のキメラオリゴヌクレオチドの第2の標的化配列を標的核酸配列の第2のサブ配列にハイブリダイズさせて第2のハイブリッドを形成する工程であって、第2のサブ配列が第1のサブ配列に隣接しており；第1のキメラオリゴヌクレオチドがシグナリングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である捕捉可能な配列を含む、工程；
    iii、第1のサブ配列の5'ヌクレオチドおよびライゲーション薬剤の存在下で第1のキメラオリゴヌクレオチドを第2のキメラオリゴヌクレオチドと連結し、標的核酸配列の第1および第2のサブ配列を含む第1の2重鎖ならびに第1のキメラオリゴヌクレオチドおよび第2のキメラオリゴヌクレオチドの両方を含む反応産物を形成する、工程；ならびに
    iv、第1の2重鎖を変性させて、標的核酸から反応産物を遊離させる工程。
12. 工程1〜5、またはa〜e、またはi〜ivを1回または複数回繰り返す、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
13. 以下を含むキット：
    （1）標的核酸配列にハイブリダイズしない（例えば、固定化されまたは溶液中で遊離している）捕捉オリゴヌクレオチド；
    （2）検出可能なシグナルを提供しかつ捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするシグナリングオリゴヌクレオチド；
    （3）以下を含む少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド：
    （a）標的核酸配列のサブ配列にハイブリダイズする第1の標的化配列；および
    （b）以下より選択される配列にハイブリダイズする捕捉可能な配列
    （i）捕捉オリゴヌクレオチド；または
    （ii）シグナリングオリゴヌクレオチド
    （4）以下より選択される配列にハイブリダイズする第2の標的化配列を含む少なくとも1つの協調オリゴヌクレオチド：
    （a）第1の標的化配列がハイブリダイズするサブ配列とは異なる、標的核酸配列のサブ配列；または
    （b）標的核酸配列の相補鎖のサブ配列、または
    （c）少なくとも1つのキメラオリゴヌクレオチド。
14. （5）1つまたは複数のポリメリゼーションおよび／またはライゲーション薬剤をさらに含む、請求項13記載のキット。
15. 構成要素（1）〜（5）の任意の1つまたはそれより多くが凍結乾燥された形態である、請求項13または14記載のキット。
16. 構成要素（1）〜（5）の任意の2つまたはそれより多くが混合物の形態である、請求項13または14記載のキット。
17. 構成要素（1）〜（5）の任意の2つまたはそれより多くが別々の入れ物の中にある、請求項13または14記載のキット。
18. 捕捉オリゴヌクレオチドが固体表面に固定化されている、請求項13記載のキット。
19. 捕捉オリゴヌクレオチドが微粒子またはビーズの表面に固定化されている、請求項13記載のキット。
20. 捕捉オリゴヌクレオチドがナノワイアーの表面に固定化されている、請求項13記載のキット。
21. 捕捉オリゴヌクレオチドが反応容器の表面に固定化されている、請求項13記載のキット。
22. 複数の捕捉オリゴヌクレオチドが捕捉オリゴヌクレオチドアレイの形態で固定化されている、請求項13記載のキット。
23. アレイが固相アレイである、請求項22記載のキット。
24. アレイが液相アレイである、請求項22記載のキット。
25. 構成要素（1）〜（5）の任意の1つまたはそれより多くが反応容器の中に提供されている、請求項13記載のキット。
26. 請求項1〜12のいずれか一項記載の方法を実施するために事前に最適化されている構成要素が中に存在する、請求項25記載のキット。
27. 本方法を実施するために、エンドユーザーが、核酸試料、核酸処理酵素、キメラオリゴヌクレオチド、および協調オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つを反応容器に添加する、請求項26記載のキット。

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