CN110016500A - 表面探针定量pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表面探针定量PCR方法。具体地,本发明的基于表面探针的定量PCR检测体系包括:(a)一固相载体,所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区,各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸;(b)与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物的信号被淬灭。本发明还提供了相应的检测方法、检测装置和应用。本发明可快速、简便、高效、同时对多种靶序列进行定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域,更具体地涉及一种表面探针定量PCR方法及其应用。
背景技术
在医学、食品、卫生等各种不同领域,常常需要对待测样品进行核酸检测。目前,常用的检测方法包括常规PCR、定量PCR、探针检测、芯片检测、测序等多种技术。
在常规的荧光定量PCR(qPCR)中,在检测体系中存在用于扩增的引物对以及用于检测的探针。其中,在溶液里的探针一侧(或一端)有荧光剂(fluorophore),另一侧(或另一端)有淬灭剂(quencher)。该探针完好的时候,因为淬灭剂和荧光剂距离足够近,淬灭剂就能有效抑制荧光剂,从而没有(或基本没有)荧光信号。当溶液里存在与该探针序列匹配的核酸样本时,那么在样本被PCR扩增的过程中,该探针被扩增酶剪切,于是荧光剂和淬灭剂会互相脱离开来,导致抑制作用减少或消失,从而使得荧光剂产生荧光信号。
然而,目前的荧光定量PCR还存在一些缺点,其中包括:探针因为同时标记荧光剂和淬灭剂,探针合成成本偏高;为了使溶液中的探针被扩增酶剪切,扩增酶需具有5’→3’的核酸外切酶活性,然而某些扩增酶不具有5’→3’的核酸外切酶活性因此不适用于qPCR。更重要的是,因为每一个待测序列需要一种发光光谱可与其它荧光剂区别开来的荧光剂,所以同一个qPCR反应中能同时进行检测的不同种核酸数量受到很大的限制,通常一个qPCR反应只能做到4-5重多重检测。此外,即使能够实现多重qPCR,因为需要同时读取多个不同荧光剂,其对应的光学检测设备设计复杂,造价昂贵。
因此,本领域迫切需要开发一种快速、简便、高效、可同时检测多种靶序列的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种快速、简便、高效、可同时检测多种靶序列的定量检测方法。
在本发明的第一方面,提供了一种基于表面探针的定量PCR检测体系,所述检测体系包括:
(a)一固相载体,所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,其中,n为≥2的正整数,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区;
其中,所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸,所述淬灭引物捕获核酸为单链核酸,并且所述淬灭引物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面,并且所述淬灭引物捕获核酸带有第一可检测标记物,所述的第一可检测标记物选自下组:荧光基团、发光标记物、量子点、或其组合;
(b)与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中所述引物对包括第一引物和第二引物,其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物的5’端或5’侧连接有淬灭基团,
并且,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被淬灭。
在另一优选例中,所述的第一可检测标记物为荧光基团。
在另一优选例中,所述的荧光基团选自下组:发光标记物(luminescent label)
在另一优选例中,所述的淬灭基团选自下组:量子点(quantum dots)。
在另一优选例中,所述的淬灭引物的数量Q1与相应的淬灭引物捕获核酸的数量Q0之比(Q1/Q0)≥2,较佳地≥5,或≥10,更佳地≥100或≥1000(如2-105)。
在另一优选例中,所述的检测体系还包括选自下组的一种或多种组分:
(c)用于PCR扩增的缓冲液或缓冲组分;
(d)用于PCR扩增的聚合酶。
在另一优选例中,所述的聚合酶选自下组:Taq酶、Pfu酶、Pwo酶、vent酶、KOD酶、superfi酶、或其组合。
在另一优选例中,所述的检测体系不含有探针。
在另一优选例中,所述的检测体系含有探针。
在另一优选例中,所述的第一引物和第二引物扩增出的扩增产物的长度为≥100bp,较佳地≥150bp,或≥200bp,更佳地≥250bp,或≥300bp。
在另一优选例中,不同表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是相同或不同的核酸分子。
在另一优选例中,所述的第一核酸包括DNA、RNA、或其组合。
在另一优选例中,所述的第一核酸包括cDNA、mRNA、或基因组DNA。
在另一优选例中,所述的第一核酸的长度为50nt-1×109nt,较佳地100nt-1×108nt,更佳地200nt-1×107nt。
在另一优选例中,所述的淬灭引物捕获核酸的长度为≤150nt,较佳地≤100nt,更佳地≤50nt。
在另一优选例中,所述的淬灭引物的长度为10-35nt,更佳地15–25nt。
在另一优选例中,所述的淬灭引物捕获核酸具有与淬灭引物基本互补或完全互补的捕获区。
在另一优选例中,所述的淬灭引物捕获核酸具有下式I结构:
X0-X1-X2-X3 (I)
式中,
X0为淬灭引物捕获核酸与固相载体连接的连接基团;
X1为无或柔性过渡区,所述柔性过渡区选自下组:长度为1-15nt的柔性过渡核酸片段、长度为1-10nm的柔性过渡聚合物片段、或其组合;
X2为捕获区,其中所述捕获区的序列与所述淬灭引物的序列是基本互补或完全互补的;
X3为无或长度为1-20nt的3’端序列区。
在另一优选例中,所述的第一可检测信号位于X2或X3,较佳地位于X2。
在另一优选例中,X3为无。
在另一优选例中,所述的淬灭引物捕获核酸的3’端或3’侧连接有第一可检测标记物(如荧光基团)。
在另一优选例中,第一引物和第二引物中另一个引物为常规引物、或通用引物。
在另一优选例中,在所述固相载体上,所述表面定量子检测区数量为m,m为≥1的正整数,并且m≤n。
在另一优选例中,n为2-500,较佳地5-250,更佳地9-100或16-96。
在另一优选例中,m为2-500,较佳地5-250,更佳地9-100或16-96。
在另一优选例中,m=n。
在另一优选例中,在至少≥2个(≥4个,更佳地≥8个)的表面定量子检测区采用相同的第一可检测标记物。
在另一优选例中,各表面定量子检测区用于检测不同或相同的靶序列。
在另一优选例中,各表面定量子检测区用于检测不同的靶序列。
在本发明的第二方面,提供了一种进行定量PCR检测的方法,包括步骤:
(a)提供一待检测样品和本发明第一方面所述的基于表面探针的定量PCR检测体系;
(b)在聚合酶存在下,在适合PCR扩增的条件下,用所述的定量PCR检测体系对所述待检测样品进行PCR扩增;
(c)检测所述PCR扩增过程中或扩增后的固相载体上一个或多个表面定量子检测区的第一可检测标记的信号;和
(d)对所检测的第一可检测标记的信号进行分析,从而获得所述待检测样品的定量的检测结果。
在另一优选例中,在步骤(d)中,所述的分析包括将所检测的第一可检测标记的信号与标准曲线进行比较。
在另一优选例中,在步骤(d)中,所述的分析包括将所检测的第一可检测标记的信号与扩增前的检测信号进行比较。
在另一优选例中,所述的进行定量PCR检测为多重PCR检测。
在另一优选例中,各表面定量子检测区的第一可检测标记是相同的。
在另一优选例中,各表面定量子检测区的第一可检测标记是不同的。
在本发明第三方面,提供了一种用于定量PCR检测的试剂盒,包括:
(a)第一容器以及位于所述第一容器中的固相载体,
所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,其中,n为≥2的正整数,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区;
其中,所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸,所述淬灭引物捕获核酸为单链核酸,并且所述淬灭引物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面,并且所述淬灭引物捕获核酸带有第一可检测标记物,所述的第一可检测标记物选自下组:荧光基团、发光标记物(luminescent label)、量子点(quantum dots);
(b)第二容器以及位于所述第二容器中的引物对,所述引物对是与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中所述引物对包括第一引物和第二引物,其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物的5’端或5’侧连接有淬灭基团,
并且,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被淬灭;
(c)任选的第三容器以及位于所述第三容器内的用于PCR扩增的缓冲液或缓冲组分;
(d)任选的第四容器以及位于所述第四容器内的用于PCR扩增的聚合酶;和
(e)任选的说明书,所述说明书记载了进行定量PCR检测的方法。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了现有技术中常规荧光定量PCR的示意图。
图2显示了本发明表面探针定量PCR的示意图。
图3显示了本发明一个实施例中的反应装置,其中上图为俯视图,而下图为沿A-A线的剖视图。图中,101为固相载体(容器的第一部分),其主表面设有至少一个表面子检测区;102为容器的封盖(容器的第二部分),103为粘合剂或者粘合层(容器的第三部分),104为液体进出口的封盖。图4显示了本发明一个实施例中的单色荧光信号读取系统。
图5显示了本发明一个实施例中的检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次开发了一种基于表面探针的定量PCR方法,该方法可以快速、简便地进行定量分析,而且可以并行地同时检测数量众多的靶序列。此外,即使仅使用一种或两种或少数几种种可检测标记物和相应的淬灭基团,也不会影响本发明的检测效果,因此使得制造成本和使用成本都大幅下降。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“引物”指聚合酶链式反应中决定需要扩增的起始和终止位置的人工合成短核酸片段(尤其是DNA片段)。本文中“特异性引物”、“未扩增引物”和“引物”可互换使用。
如本文所用,术语“淬灭引物”或“本发明的淬灭引物”可互换使用,指带有淬灭基团的引物。应理解,一个引物对的任何一个引物(如第一引物或第二引物)或两个引物都可以是淬灭引物。
如本文所用,术语“淬灭引物捕获核酸”、“本发明的淬灭引物捕获核酸”、“表面探针”、“本发明的表面探针”可互换使用,指带有第一可检测标记物(如荧光基团)、用于捕获淬灭引物且被固定于固相载体表面的单链核酸分子。应理解,本发明的淬灭引物捕获核酸与现有技术(如荧光定量PCR)中的处于游离态的探针(其同时带有荧光基团和淬灭基团)是不同的。
如本文所用,术语“子检测区”和“阵列点”可互换使用。
检测体系
本发明提供了一种基于表面探针的定量PCR检测体系,所述检测体系包括:
(a)一固相载体,所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,其中,n为≥2的正整数,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区;
其中,所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸,所述淬灭引物捕获核酸为单链核酸,并且所述淬灭引物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面,并且所述淬灭引物捕获核酸带有第一可检测标记物,所述的第一可检测标记物选自下组:荧光基团、发光标记物(luminescent label)、量子点(quantum dots)、或其组合;
(b)与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中所述引物对包括第一引物和第二引物,其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物的5’端或5’侧连接有淬灭基团,
并且,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被淬灭。
在另一优选例中,第二引物也可以和第一引物一样有淬灭剂,并在表面有对应的不同的引物捕获子检测区。
在另一优选例中,第一引物和第二引物都有淬灭剂,但是同时对应一个或者多个子检测区,也就是说与该对引物对应的每个子检测区都同时固定了对应的两种引物捕获核酸。
淬灭引物捕获核酸和扩增引物
在本发明中,对于待检测的各靶标核酸序列,使用至少一个、通常两个对应的特异性引物来进行特异性扩增。
两个引物(引物对)不仅增加扩增反应的特异性和加速扩增产物的形成,由此对应固相表面上的两种表面探针也可增加检测的特异性和信号。如果一个引物对里的两个引物都是淬灭引物,其相对应的两种表面探针可以是分别固定在不同的表面定量子检测区,也可以是混合固定在同一个表面定量子检测区。
特异性引物的设计遵循传统的PCR引物设计,引物本身长度在15–25核苷酸单位为佳。短的引物有利于提升与表面探针的杂交效率,由此可以更大程度区别于扩增物与表面探针的杂交。
应理解,虽然标记物淬灭剂优选在在淬灭引物5’末端,但是该标记物可偶联或合成在淬灭引物的任一位置,只要不影响链式反应的扩增,且在与表面探针杂交后离表面探针的荧光标记物足够近(小于25个核苷酸单位的距离)。
应理解,虽然优选淬灭引物与表面的淬灭引物捕获核酸是完全互补,但是也可以是部分互补,即淬灭引物与淬灭引物捕获核酸(即表面探针)的一部分是互补的。
然而,用扩增引物获得的产物的扩增延长部分的序列应不与表面探针互补。
优选地,通过使用两个特异性引物,该方法需要设计扩增物长度至少为100nt、150nt或以上。越长的扩增物与表面探针的杂交效率越低。
固相载体
在本发明中,表面探针被固定于固相载体的表面定量子检测区。
典型地,表面探针需要特定的方向性。表面探针的5’端更靠近固体表面,而3’端则远离固体表面。因为扩增产物从引物延长出来的部分会阻碍扩增产物的5’端靠近固体表面,表面探针这样的方向性保证了扩增产物与其杂交的可能性大大降低,从而表面探针可以更有效地区别未扩增引物和扩增产物。
表面探针定量PCR方法
本发明提供了一种表面探针定量PCR方法。
在本发明,用特异性引物对靶标核酸进行扩增并通过引物和扩增物与表面探针杂交效率的不同进行靶标的实时定量是本发明的核心。在所述方法中,靶标核酸被扩增前,带标记(如荧光淬灭剂)的引物与被标记(如荧光剂)的表面探针结合生成可探测信号;靶标核酸被扩增后,特异性引物被延长,延长后的引物即扩增产物与表面探针的杂交的可能性降低因此造成信号变化,通过此信号变化及其快慢程度可对靶标核酸定量。
为了便于理解,本发明人结合原理图(图2)以及现有技术(图1)进行描述。应理解,本发明的保护范围并不受所述原理或原理图的限制。
如图2所示,在本发明中,不采用同时具有荧光剂和淬灭剂的溶液探针,而是使用仅带有淬灭剂的引物,和固定在物理表面带有荧光剂的表面探针,通过物理表面上的荧光探针,实现定量PCR。
扩增前,部分引物和表面探针杂交。引物上的淬灭剂能有效抑制表面探针上的荧光剂,从而没有可检测的荧光信号或荧光信号非常微弱。
扩增过程中以及扩增后,引物被扩增到数百个bp的长度。本发明人的研究表明,由于热动力学以及位阻等多种原因,这个长度的扩增产品无法(或难以)足够靠近表面再与表面探针杂交。另一方面,随着扩增产物的增多,引物与溶液中的扩增产物的杂交要比引物与表面探针的杂交更易发生,因此表面探针的杂交比例逐渐下降,未杂交的表面探针的荧光剂得以发光,该阵列点的荧光逐渐增强,提供可探测荧光信号。
优选地,本发明提供了实时定量检测样品中一个或多个靶标核酸的方法。所述方法在做多重定量检测尤其有优势,和传统的qPCR相比,反应溶液中不需要对应靶标核酸的带标记的探针,扩增反应也只需要普通的聚合酶,而不需要具有5’→3’的外切酶活性的特殊扩增酶例如Taq聚合酶。当然,在本发明的检测体系或方法中,也可以使用具有5’→3’的外切酶活性的扩增酶或聚合酶。
在多重检测方面,由于检测信号来源于表面探针,而因为表面探针本身的物理位置可用于区别其上对应的靶标核酸,所以多重检测可以只用一种标记物实现,而不需要传统多重qPCR的多个荧光剂。该方法可用于至少1–100种靶标核酸的定量检测,或者多于100种。而传统的多重qPCR技术受限于荧光剂的种类和光学设计,通常只能做4-6重实时定量检测,极少数能做到8重。
而在本发明中,非常适合进行多重定量检测,尤其是多重实时定量检测。在本发明中,多重的数量没有特别限制,可以是≥2的任何正整数,优选地,为2-10000或2-500,较佳地5-250,更佳地9-100或16-96。
典型地,在本发明中,可以在扩增反应时,在选定的时间和温度对每一个循环(或者每隔1个或者每隔2个循环)进行表面探针的信号读取。在靶标未被扩增时,有大量引物与表面探针杂交,引物上的淬灭剂通过荧光共振转移(FRET)原理抑制表面探针的荧光剂的信号。随着引物在扩增反应里的消耗,且扩增产物因为其长度受限于热动力学原理不能足够接近固体表面从而不能有效地与表面探针杂交,越来越多的表面探针没有对应的杂交物,表面探针的荧光剂附近不再有淬灭剂,因而表面探针的荧光信号越来越强。
试剂盒
本发明还提供了用于定量PCR检测的试剂盒,它包括:
(a)第一容器以及位于所述第一容器中的固相载体,
所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,其中,n为≥2的正整数,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区;
其中,所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸,所述淬灭引物捕获核酸为单链核酸,并且所述淬灭引物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面,并且所述淬灭引物捕获核酸带有第一可检测标记物,所述的第一可检测标记物选自下组:荧光基团、发光标记物(luminescent label)、量子点(quantum dots);
(b)第二容器以及位于所述第二容器中的引物对,所述引物对是与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中所述引物对包括第一引物和第二引物,其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物的5’端或5’侧连接有淬灭基团,
并且,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被淬灭;
(c)任选的第三容器以及位于所述第三容器内的用于PCR扩增的缓冲液或缓冲组分;
(d)任选的第四容器以及位于所述第四容器内的用于PCR扩增的聚合酶;和
(e)任选的说明书,所述说明书记载了进行定量PCR检测的方法。
此外,本发明的试剂盒还可含有其他组分或部件,例如标准曲线、质控样品等。
在本发明中,所述的第一、第二、第三、和第四容器中的任何二个、三个或全部是同一容器。
在另一优选例中,所述的第一、第二、第三、和第四容器是不同的容器。
在一实施例中,所有的试剂本身都是可以存在于第一容器里的。
在另一优选例中,所有的试剂(酶,引物,盐)都以冻干的方式存放在第一容器里,待检测DNA融于相应的缓冲液里,反应的时候注入第一容器。
反应装置和检测系统
本发明还提供了基于表面探针的定量PCR的反应装置和检测系统。
一种代表性的反应装置如图3所示。
在本发明中,用于反应的芯片可以采用任何一种形态,只要反应腔有一内表面可以事先制备微阵列(表面定量子检测区阵列)且可以进行后续的荧光信号读取。
如图3所示,一种典型的设计为扁平反应腔设计。
该反应腔如图3所示,由三部分组成。第一部分101是一片塑料或者玻璃制品,第二部分102是另一块平面塑料或玻璃,通过第三部分103一块厚0.25mm的双面胶结合。双面胶有切割部分形成反应腔。反应腔也可以只由两部分组成:第一部分已含有构成反应腔的凹槽,第二部分可以带有单面胶,可直接粘合第一部分,也可以是通过超声融合、热融合、双面胶或者紫外线固化胶等方式与第一部分形成一个密闭的反应腔室。腔室有进出通道或者出入口可供流入反应溶液,反应溶液加入后,可以关闭通道上的阀门或者永久性闭合出入口。本示例中采用0.1mm厚的单面胶104永久性闭合出入口。
反应腔的一个内表面在反应芯片集成前,经过表面化学处理并点样了微阵列(表面定量子检测区阵列)。作为示例,图3显示了一个3x3的微阵列。该阵列用于检测3个不一样的核酸(2个靶标核酸和1个内参),对应每一个待测核酸序列有三个固定有与待测核酸相对应的表面探针的子检测区。对应每个待测核酸序列使用多于一个子检测区的检测,可以在其中一个子检测区的检测信号由于气泡或者杂质受到干扰时,仍有其他序列相同的点来确认待测靶标核酸。构成微阵列的子检测区个数可以是2-100,或者100个以上。
反应腔一侧材料必须是在荧光剂的相关波段(excitation and emission)有足够的透过率,透过率至少80%,最好90%以上;同时该侧材料的自发荧光越低越好。本示例中,反应腔的第一部分为低自发荧光的载玻片(Schott公司的33),该材料对可见光的透光性在90%以上,且自发荧光远低于普通玻璃材料。
表面核酸探针序列通常通过一小段链接物(linker)偶合到固体表面。
在本发明中,所述的链接物可以是寡聚核苷酸(oligo)、聚合物(polymer)(如PEG)、或组合。
本发明的核心是引物和扩增产物与表面探针的杂交的反应动力学不同导致杂交效率不同。为增大杂交效率的区别,偶联链接物(linker)长度不能超过10nm,最好不超过5nm,这样可供杂交的表面探针离固体表面足够近而使得扩增产物无法靠近。固体表面通常会经过表面化学处理以生成可与偶联链接物反应的活性基团如NHS酯、琉酯等。偶联链接物与固体表面之间的链接是热稳定的,并不因为PCR的冷却加热循环而断开或者脱落。本示例中采用了表层有可供偶联的NHS酯的载玻片(Arrayit等公司均提供该种载玻片)。表面探针为人工合成序列,在5’端合成有可与载玻片表面的NHS酯产生共价偶联的氨基基团。氨基基团与脱氧核糖核酸序列间有偶联链接物聚二乙醇链[PEG]6(polyethylene glycol)。脱氧核糖核酸的序列分别与下述引物互补,并在其3’端偶联荧光剂Cy3。
表面探针阵列(即子检测区阵列)可采用常规生成微阵列的方法。本示例中采用Scienion公司的无接触式点样机点样。接触式的点样机例如Arrayit公司的也是常用工具之一。本示例中阵列点(即各子检测区)的直径在100微米左右,每个点的边到边间距为100微米左右。
每种表面探针的总数应远低于该阵列点附近溶液中对应的引物数量,但要仍要在一定数量之上,使得当阵列点附近溶液中引物数量因为扩增锐减后,该阵列点上会有相当百分比的表面探针不再能捕获到能与之杂交的引物。微阵列上每个点的表面探针密度应高于500fmole/cm2,最好高于2000fmole/cm2。扩增前,对应的引物与表面探针的杂交使得绝大部分表面探针上的荧光剂被抑制,阵列点的荧光亮度最低。当有相应的靶标核酸存在并被扩增,所对应引物被延长(扩增),绝大部分表面探针不再有对应的引物与其杂交,该阵列点的荧光亮度达到最高值。若初始靶标核酸的浓度相对较低,PCR反应完成时,为示例计预设40个循环,对应引物只有部分被扩增,那对应的表面探针点上仍有部分表面探针有对应引物与其杂交,该阵列点的荧光亮度则处于最大亮度和最低亮度的一个中间值。阵列点的荧光亮度与被消耗的引物即扩增产物数量有一一对应并单调递增的关系,因此每个阵列点的荧光变化程度以及快慢可用于定量其对应初始靶标核酸的浓度。
PCR的加热冷却循环控制可以在反应腔的一侧或两侧同时进行。两侧同时进行温度控制可以提高反应腔的温度调节速率,从而缩短反应时间。为示例计,此处预设仅从一面进行加热冷却循环。不论是单面或者双面进行温度控制,反应腔越薄,温度调节越快,反应腔溶液越容易达到各温度节点上的热平衡,因此反应腔厚度通常在2mm以下,最好在1mm以下,本示例中采用0.25mm的设计。温度控制一侧的固体材料厚度在保证芯片的强度的情况下,越薄的材料加热冷却循环越快。在本示例中为0.5mm的聚碳酸酯薄片。另外,因为荧光信号的读取是从玻璃一侧进行,这里使用黑色的聚碳酸酯以进一步降低荧光读取时的背景噪声。
PCR的加热冷却循环有多种常见方法,例如用热电模块、水浴、油浴控制与反应腔接触的金属模块或者用红外线直接对溶液进行加热。在本示例中,由计算机控制的热电模块对铜块进行加热冷却循环,铜块因为热导率高,从而使反应腔可以在每次温度变化时更快达到热平衡。
反应腔内表面的微阵列荧光信号读取可采用常见的单色荧光信号读取系统。图4描述了一个典型的单色荧光信号读取系统。本示例中,微阵列上的表面探针的荧光信号的采集使用了荧光显微镜(Olympus IX73),其原理与上图描述的系统一致。
应用
本发明方法尤其对多重定量检测DNA有利。
传统qPCR如果需要实现多重检测,就需要每个待测标志物配一个荧光剂,这使得设备的光学设计变得非常复杂,而且光谱有限,能做到的多重性有限。
本发明把待测信号从溶液中转移到物理表面上,物理表面上可以进行多个位置点样,每个点样点(即子检测区)都可以针对不一样的待测标志物设计部一样的表面探针序列,但是每个点都可以使用同一种荧光剂,从而实现一种荧光剂下的多重定量检测。
就应用领域或场合而言,本发明可用于微生物的鉴定。例如对于上呼吸道感染的情况下,可通过针对常见的病毒和细菌的特异性序列设计多重表面探针定量检测,以确定具体的微生物感染源。例如可针对HPV的不同亚型的特异序列设计多重表面探针定量检测,可用一次反应就对HPV样本分型。
本发明的主要优点包括:
(a)可快速、简便地进行定量分析。
(b)可以并行地同时检测数量众多的靶序列。
(c)仅需要使用一种或两种可检测标记物和相应的淬灭基团,使得制造成本和使用成本都大幅下降。
(d)检测体系的抗干扰能力强。
(e)避免了使用常规的游离态的探针,处于游离态的只有引物(对),没有探针。
(f)本发明的检测背景光噪低。在本发明中,因为溶液中的引物标记物为淬灭剂,溶液中本身并无任何荧光剂(哪怕是被暂时抑制的荧光剂),所以检测中表面定量子检测区周围的背景光噪对引物浓度的高低以及引物多少并不敏感。传统qPCR的反应溶液中有暂时被抑制的荧光剂,因为荧光抑制作用不可能是100%,尤其是TaqMan探针没有发卡(hairpin)结构时抑制效率更低,所以传统qPCR的背景光噪与探针浓度直接相关。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
制备基于表面探针的定量PCR反应装置
在该实施例中,制备图3所示的基于表面探针的定量PCR反应装置。
其中,采用的淬灭引物捕获核酸如下:
#1:NH2-(PEG)6-CAGCAGTGTAAGCAACGACCCT-Cy3(SEQ ID No.:1)
#2:NH2-(PEG)6-GCTCGGTTGCAGCACGAATGG-Cy3(SEQ ID No.:2)
#3:NH2-(PEG)6-GCCTTGTACGGTTCCCTTGCTT-Cy3(SEQ ID No.:3)
将上述淬灭引物捕获核酸分别点样在固相载体的不同子检测区:#1固定在第一组子检测区即图三的第一列的3个子检测区,#2固定在第二组子检测区即第二列的3个子检测区,#3固定在第三组子检测区即第三列的3个子检测区。
实施例2
基于表面探针的定量PCR反应和检测
2.1扩增反应中的反应物:
反应物包括:标准PCR试剂如聚合酶(polymerase),dNTP,MgCl2等。本实施例采用:
‐赛默飞世尔公司的GeneAmpTM Fast PCR Master Mix 1X(如前所述,本发明并不需要聚合酶有5’->3’外切核酸酶活性外切酶活性)
‐2-6mM MgCl2
‐0.5mg/ml BSA
‐三对在5’端标记了BHQ(Black Hole Quencher)的PCR扩增引物,浓度均为300nM
○引物的Tm都设计在63–70℃
○扩增产物的长度都设计在300个核苷酸单位以上
‐待检测样本,包括有靶标核酸1(HPV type 11)和内参靶标核酸(humanβ-globingene),而没有靶标核酸2(HPV type 18)
2.2方法
采用两步式PCR(注:传统三步式PCR同样适用)。三步式PCR时,荧光信号的读取可选在退火或者扩增(extension)时段,优选在扩增时段。PCR的温度设定为:
1.热变性,95℃,10分钟
2. 40次热循环,每个循环包括:
a.95℃,10秒
b.55℃,120秒(其中,在55℃的最后5秒读取微阵列的荧光信号)
2.3引物
待测靶标1(HPV亚型11)的引物:
F:BHQ-AGGGTCGTTGCTTACACTGCTG(SEQ ID No.:4)
R:ACCTGAATCGTCCGCCATCCT(SEQ ID No.:5)
扩增产物长度=348bp
F是淬灭引物,淬灭基团为BHQ(Black hole quencher)。
待测靶标2(HPV亚型18)的引物:
F:BHQ-CCATTCGTGCTGCAACCGAGC(SEQ ID No.:6)
R:TGTGTGACGTTGTGGTTCGGC(SEQ ID No.:7)
扩增产物长度=327bp
F是淬灭引物,淬灭基团为BHQ(Black hole quencher)。
内参(humanβ-globin gene primers)的引物:
F:BHQ-AAGCAAGGGAACCGTACAAGGC(SEQ ID No.:8)
R:GGAGCAGGAACACTTGATGGGG(SEQ ID No.:9)
扩增产物长度=302bp
F是淬灭引物,淬灭基团为BHQ(Black hole quencher)。
2.4固相载体
使用实施例1制备的固相载体,其中,在子检测区分别固定有用于捕获不同淬灭引物的淬灭引物捕获核酸。
2.5结果
如图5所示,结果表明,固相载体的各子检测区(即微阵列点)的荧光信号与待检测物的有无和浓度大小直接相关。图中直虚线为探测待测靶标是否存在的临界值。另外三条曲线为每个扩增循环时每一组子检测区的平均相对荧光信号。一组子检测区由三个子检测区组成,均固定有对应同一种靶标核酸的淬灭引物捕获核酸(即表面探针)。每一个子检测区的相对荧光信号为光学系统所读取的子检测区信号与其周围背景区域的差值。曲线上的每一个点为同一组里三个子检测区的相对荧光信号的平均值。图中所示内参和靶标核酸1所对应的曲线(相对荧光信号)分别在第20个和第32个循环左右相继越过临界值,表明待测样本中切实检测到靶标核酸1(HPV亚型11)和内参(humanβ-globin gene),而且内参的浓度约为靶标核酸1的浓度的10^[log2(32-20)]=3845倍。靶标核酸2所对应的曲线始终未能越过临界曲线,表明该反应未能检测到靶标核酸2(HPV亚型18)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 深圳闪量科技有限公司
<120> 表面探针定量PCR方法
<130> P2017-2345
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcagtgta agcaacgacc ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcggttgc agcacgaatg g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccttgtacg gttcccttgc tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agggtcgttg cttacactgc tg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acctgaatcg tccgccatcc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccattcgtgc tgcaaccgag c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtgtgacgt tgtggttcgg c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagcaaggga accgtacaag gc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggagcaggaa cacttgatgg gg 22
Claims (10)
1.一种基于表面探针的定量PCR检测体系,其特征在于,所述检测体系包括:
(a)一固相载体,所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,其中,n为≥2的正整数,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区;
其中,所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸,所述淬灭引物捕获核酸为单链核酸,并且所述淬灭引物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面,并且所述淬灭引物捕获核酸带有第一可检测标记物,所述的第一可检测标记物选自下组:荧光基团、发光标记物、量子点、或其组合;
(b)与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中所述引物对包括第一引物和第二引物,其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物的5’端或5’侧连接有淬灭基团,
并且,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物的信号被淬灭。
2.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的淬灭引物的数量Q1与相应的淬灭引物捕获核酸的数量Q0之比(Q1/Q0)≥2,较佳地≥5,或≥10,更佳地≥100或≥1000。
3.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的检测体系还包括选自下组的一种或多种组分:
(c)用于PCR扩增的缓冲液或缓冲组分;
(d)用于PCR扩增的聚合酶。
4.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的聚合酶选自下组:Taq酶、Pfu酶、Pwo酶、vent酶、KOD酶、superfi酶、或其组合。
5.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的第一引物和第二引物扩增出的扩增产物的长度为≥100bp,较佳地≥150bp,或≥200bp,更佳地≥250,或≥300bp。
6.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,所述的淬灭引物捕获核酸具有下式I结构:
X0-X1-X2-X3 (I)
式中,
X0为淬灭引物捕获核酸与固相载体连接的连接基团;
X1为无或柔性过渡区,所述柔性过渡区选自下组:长度为1-15nt的柔性过渡核酸片段、长度为1-10nm的柔性过渡聚合物片段、或其组合;
X2为捕获区,其中所述捕获区的序列与所述淬灭引物的序列是基本互补或完全互补的;
X3为无或长度为1-20nt的3’端序列区。
7.如权利要求1所述的检测体系,其特征在于,在所述固相载体上,所述表面定量子检测区数量为m,m为≥1的正整数,并且m≤n;和/或
n为2-500,较佳地5-250,更佳地9-100或16-96;和/或
m为2-500,较佳地5-250,更佳地9-100或16-96。
8.一种进行定量PCR检测的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)提供一待检测样品和权利要求1所述的基于表面探针的定量PCR检测体系;
(b)在聚合酶存在下,在适合PCR扩增的条件下,用所述的定量PCR检测体系对所述待检测样品进行PCR扩增;
(c)检测所述PCR扩增过程中或扩增后的固相载体上一个或多个表面定量子检测区的第一可检测标记的信号;和
(d)对所检测的第一可检测标记的信号进行分析,从而获得所述待检测样品的定量的检测结果。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的进行定量PCR检测为多重PCR检测。
10.一种用于定量PCR检测的试剂盒,其特征在于,包括:
(a)第一容器以及位于所述第一容器中的固相载体,
所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区,其中,n为≥2的正整数,并且至少一个子检测区为表面定量子检测区;
其中,所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭引物捕获核酸,所述淬灭引物捕获核酸为单链核酸,并且所述淬灭引物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面,并且所述淬灭引物捕获核酸带有第一可检测标记物,所述的第一可检测标记物选自下组:荧光基团、发光标记物、量子点;
(b)第二容器以及位于所述第二容器中的引物对,所述引物对是与所述淬灭引物捕获核酸相匹配的且用于扩增靶序列的引物对,其中所述引物对包括第一引物和第二引物,其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物,所述淬灭引物的5’端或5’侧连接有淬灭基团,
并且,所述淬灭引物与至少一个表面定量子检测区的淬灭引物捕获核酸是可结合从而形成双链结构,并且在所述双链结构中,所述的淬灭引物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被淬灭;
(c)任选的第三容器以及位于所述第三容器内的用于PCR扩增的缓冲液或缓冲组分;
(d)任选的第四容器以及位于所述第四容器内的用于PCR扩增的聚合酶;和
(e)任选的说明书,所述说明书记载了进行定量PCR检测的方法。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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