CN105102630A - 试验方法和系统 - Google Patents

Abstract

检测和定量样品中靶核酸序列的试验方法和系统，其在靶标特异性探针序列和捕获探针序列存在的情况下使用扩增方法和实时扩增方法，用于显示样品中靶序列的扩增并从而表明该靶序列是否存在。

Description

试验方法和系统

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年8月16日提交的美国临时专利申请号61/684,104的优先权和权益，该专利申请的说明书通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

已开发了多种不同方法用于检测样品混合物中是否存在给定的核酸序列。这些方法被用于诊断、研究工具、病原体检测的目的和多种其他应用。已证明在鉴定给定靶核酸序列是否存在方面高度有用(特别是预期这类靶标的拷贝数目较低时)的一种方法是实时聚合酶链式反应，或实时PCR。

实时PCR常规用于对生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述参见，例如MTevfikDorak(编)(2006)Real-timePCR(AdvancedMethods)(《实时PCR(高级方法)》)，TF公司(Taylor&Francis)，第一版ISBN-10:041537734XISBN-13:978-0415377348，和Logan等(编)(2009)Real-TimePCR:CurrentTechnologyandApplications(《实时PCR：新编技术和应用》)，凯斯特学术出版社(CaisterAcademicPress)，第一版ISBN10:1904455395，ISBN-13:978-1904455394。其他细节还可参见例如Gelfand等，“HomogeneousAssaySystemUsingTheNucleaseActivityofANucleicAcidPolymerase(使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均匀分析系统)”USPN5,210,015；Leone等，(1995)“MolecularbeaconprobescombinedwithamplificationbyNASBAenablehomogenousreal-timedetectionofRNA(分子信标探针与NASBA扩增的结合能均匀实时检测RNA)”NucleicAcidsRes.26:2150-2155；以及Tyagi和Kramer(1996)“Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization(分子信标：杂交时发荧光的探针)”NatureBiotechnology14:303-308。传统上，用于在单一反应容器(如多孔板的孔)中检测多于一种靶核酸/样品的单孔多重技术(multiplexing)利用对各扩增子具有特异性的自淬灭PCR探针(诸如TAQMAN^TM或分子信标探针)来实现。在与溶液中的扩增子结合后，或在PCR过程中的探针降解后，所述探针不淬灭(unquench)，生成可检测信号。所述探针用不同波长的荧光团标记，使得能在单个“单罐式”反应中实现多至约5个靶标的多重化能力。由于实际光谱范围和标记物发射的限制，很难实现超过约5个探针/反应。这严重限制了单一反应的多重化，进而严重限制了每个样品能被筛选的靶标数量，并提高了检测多种感兴趣靶标的试剂成本和设备复杂性。

核酸阵列代表另一种多重化检测扩增产物的方法。最常见地，对样品进行扩增反应，然后在核酸阵列上分别检测扩增子。例如Sorge“MethodsforDetectionofaTargetNucleicAcidUsingAProbeComprisingSecondaryStructure(使用包含二级结构探针检测靶核酸的方法)”USPN6,350,580提出了通过从扩增混合物中纯化探针来捕获扩增后释放的探针然后检测探针。这种生成和检测扩增子的多步法使对于扩增混合物的实时分析变得不切实际。

还提出了多种在存在捕获核酸的情况下扩增反应物的方法。例如，Kleiber等“IntegratedMethodandSystemforAmplifyingAndDetectingNucleicAcids(扩增和检测核酸的综合方法与系统)”USPN6,270,965提出了通过渐消式(evanescence)诱发荧光来检测扩增子。相似地，Alexandre等“IdentificationandQuantificationofaPluralityofBiological(Micro)OrganismsorTheirComponents(多种(微)生物体或其成分的鉴定和定量)”USPN7,829,313，提出了在阵列上检测扩增子。在另一个示例中，通过检测作为扩增结果生成的探针片段来检测靶多核苷酸，所述检测是例如通过结合至电极，然后进行电化学检测。参见，例如Aivazachvilli等，“DetectionofNucleicAcidAmplification(核酸扩增的检测)”美国公布号2007/0099211；Aivazachvilli等，“SystemsandMethodsforDetectingNucleicAcids(检测核酸的系统和方法)”美国公布号2008/0193940，和Scaboo等，“MethodsAndSystemsforDetectingNucleicAcids(检测核酸的方法和系统)”美国公布号2008/0241838。

所有这些方法均存在限制其用于多重靶核酸检测的实践限制。例如Kleiber(USPN6,270,965)依靠渐消式诱发荧光以检测阵列表面处的扩增子的荧光，并且需要复杂和昂贵的光学元件和阵列。Alexandre(USPN7,829,313)提出在阵列上检测扩增子；如Kleiber所述，这显著增加了阵列成本，因为必须个体化设计各阵列以检测各扩增子。实践中，对于阵列上的不同扩增子可能难以实现相似的杂交动力学，特别是当扩增子相对较大时，正如Alexandre中所述。另外，对于如何在其中有同样包含高水平信号背景的伴随溶液相的阵列上或者在原位热循环中保持稳定的阵列上检测信号，本领域几乎没有提供指导。

本发明克服了本领域中这些问题和其他问题。通过通读以下内容可以更完整地理解本发明。

发明概述

本发明提供了新颖的阵列方法和系统，以及这类方法和系统中使用的装置、试剂和反应混合物。在至少一个方面，本发明提供了一种检测样品中是否存在至少一种第一靶核酸序列(并可选地定量其增量)的方法。该方法包括对样品进行扩增反应，所述扩增反应能够在至少一种第一核酸探针组存在的情况下扩增靶核酸序列。该第一探针组包含含有与其连接的荧光团的捕获探针、与捕获探针的至少一部分和靶核酸序列的至少一部分互补的靶标特异性核酸探针，且该靶标特异性探针包含与其连接的淬灭剂，从而使淬灭剂在该靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光团的荧光。该方法还包括在一个或多个聚合酶链式反应循环后检测来自样品的荧光，荧光的增加表明靶核酸序列的存在和/或其含量增加。

相应地，本发明还包括一种反应混合物，其包含含有一种或多种感兴趣的靶核酸的样品、用于扩增感兴趣靶核酸序列的扩增试剂和至少一种第一探针组，所述第一探针组包含含有与其连接的荧光团的捕获探针以及与捕获探针的至少一部分和靶核酸序列的至少一部分互补的靶标特异性核酸探针，且所述靶标特异性核酸探针包含与其连接的淬灭剂。淬灭剂与探针连接，从而使淬灭剂在靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光团的荧光。

本发明还包括一种反应腔室，其包含反应区域，所述反应区域中放置有含有一种或多种感兴趣的靶核酸的样品、用于扩增靶核酸序列的扩增试剂和至少一种第一探针组，所述第一探针组包含含有与其连接的荧光团的捕获探针以及与捕获探针的至少一部分和靶核酸序列的至少一部分互补的靶标特异性核酸探针，且该靶标特异性探针包含与其连接的淬灭剂，从而使淬灭剂在该靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光团的荧光。

本发明还包括本发明的方法/装置的实施方式中使用的扩增引物和靶探针。例如，本发明包括用于特异性检测天花病毒的引物和探针(例如从可能包含混合的痘病毒内容物的样品中检测)。这类引物和探针包括VAR-1探针、VAR-2探针、VAR-3探针、VAR-4探针、VAR-1引物1、VAR-1引物2、VAR-2引物1、VAR-2引物2；VAR-3引物1、VAR-3引物2、VAR-4引物1和VAR-4引物2。

附图简述

图1显示本发明的试验方法的示意图。

图2提供用于根据本发明进行扩增和检测反应的反应/检测腔室装置的示意图。

图3显示示例性荧光检测系统的示意图。

图4显示用于根据本发明进行扩增和检测反应的替代性流动相试验系统的示意图。

图5显示在对10个不同靶标特异的所有引物和探针存在的情况下10000个拷贝的MS2靶标的扩增结果。

图6显示使用本发明的试验对MS2靶标浓度进行滴定的结果。

图7显示在带标记的靶标特异性探针序列和未带标记的捕获探针存在的情况下1百万个拷贝的FluA/H3靶核酸序列的扩增结果。

具体实施方式

在进一步详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定装置或生物系统，因为它们当然可能变化。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不是限制性的。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如，关于本文所讨论的耗材腔室的“一个表面”，任选地包含两个或多个表面的结合等。

除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。在说明和要求保护本发明的过程中，将依据以下定义使用以下术语。

本发明一般涉及使用基于实时PCR的检测方法检测样品材料中靶核酸的方法和系统。本发明受益于提供比现有方法更大的多重性和更低的信号背景水平的能力。

上述多重性问题的极佳方法参见同为申请人所有的美国专利申请号13/399,872，其通过引用全文纳入本文以用于全部目的。简言之，在这类方法中，提供了一种探针，其具有与靶序列互补的第一部分和不与靶序列互补的第二带标记的折翼(flap)部分。该带标记的折翼部分在扩增靶序列后被释放并被固体支持物(例如基材表面)上提供的互补捕获探针序列捕获。固体支持物的表面上带标记的折翼部分的累积表明靶序列存在且正被扩增。通过针对不同待测试靶序列使用不同折翼部分序列，并通过将与那些折翼部分序列互补的不同捕获探针排列在基材上的不同位置，可以通过单个扩增反应过程有效地检测单个样品中是否存在多种不同的靶序列。此外，由于带标记的折翼部分无需与靶标杂交，其序列可基于所需捕获探针序列或基材上的序列进行选择。结果是，可使用通用捕获探针或捕获探针组来测得任何靶序列。

本发明对这些方法提供了进一步改进，使得信号生成增强且背景信号水平下降。具体而言，本发明的方法使用了第一靶标特异性核酸探针组，它们与感兴趣的靶核酸序列的至少一部分互补。这些靶标特异性探针还包含与靶标特异性探针的某部分相连的淬灭剂基团。这些方法还使用了第二核酸捕获探针组，它们与靶标特异性探针互补。这些捕获探针还包含与捕获探针上某位置相连的荧光团，使得两条探针杂交在一起时该荧光团被靶标特异性探针上的淬灭剂基团淬灭，并能对荧光团进行适当激发光照。结果是，来自未杂交捕获探针的荧光信号将显著大于来自靶标特异性探针-捕获探针杂交体的荧光信号。

在本发明的方法中，对于待分析其中是否存在靶核酸序列的样品材料，在靶标特异性核酸探针和带标记的捕获探针的存在下对其进行扩增。如本文详述的那样，本发明的方法还包括通过使用多个靶标特异性探针和空间分离的多个捕获探针(如探针阵列)来检测样品内的多个靶核酸序列。如本文中所用，扩增指反复复制感兴趣的靶序列以增加靶核酸分子的总数。多种不同扩增方法是本领域熟知的，包括聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)。

在特别优选的方面中，在PCR反应中扩增靶序列。简言之，PCR扩增方法使用两条引物序列，它们在靶序列上游与包含感兴趣靶序列的核酸的反向平行链(anteparallelstrand)互补并起始这些反向平行链扩增，使得引物延伸会复制包含靶序列及其互补序列的核酸序列。该反应涉及反应混合物的重复热循环以使含靶序列的互补链解链，使引物退火至分离的链，使用聚合酶对那些引物进行延伸，并重复这些循环以使复制的链解链并基于这些复制链产生更多拷贝。该反复复制过程的结果是，靶核酸以指数形式复制，例如一个靶标经复制产生两个拷贝，后者经复制产生四个拷贝等。

在本发明使用的扩增过程期间，每次扩增循环都减少了靶标特异性探针分子可用于结合并淬灭带标记的捕获探针的含量。该可用靶标特异性探针的减少的原因可以下一种或多种：由于扩增样品中靶序列的数目增加而固定靶标特异性探针，或在扩增期间消化靶标特异性探针。

在实时PCR反应中，对含有感兴趣的靶序列的样品进行PCR反应，该PCR反应经设计以扩增感兴趣的靶序列，例如在靶标特异性探针和捕获探针都存在的情况下使用引物结合靶标的两条反向平行链的上游序列。例如，在使用具备固有外切核酸酶活性的聚合酶时，在扩增过程期间可通过该外切核酸酶活性消化与靶序列杂交的任何靶标特异性探针。在多个扩增循环后，反应混合物中靶标特异性探针的含量将显著下降，且更少的捕获探针上的荧光团被淬灭，导致荧光信号随靶序列扩增而增加。通过在一个或多个扩增循环后观察来自反应的荧光，可鉴定是否存在靶序列。类似地，如下文更详细讨论的那样，通过观察不同扩增循环数后的荧光增加，甚至可以定量起始材料中靶标的含量。

图1示意性地显示了本发明的反应过程。如图所示，捕获探针组102中各探针携带相连的荧光部分或荧光团(F)，其被固定在基材表面104上。虽然捕获探针优选结合基材表面以便于解调和多重化，但如下文更详细讨论的那样，与基材的结合并非本发明的方法下信号生成或检测所必需。还提供了靶标特异性探针106，其与捕获探针102和感兴趣的靶核酸序列互补。这些靶标特异性探针包含相连的淬灭剂部分(Q)。选择捕获探针102上荧光团F和靶标特异性探针106上淬灭剂Q的位置，使得在探针102和106杂交在一起时，淬灭剂Q位于与荧光团F足够近的距离内，从而在另行经受激发光照时淬灭荧光团的荧光。

随后使上述探针接触可能含有感兴趣的靶核酸(如靶序列108)的样品材料，并使用聚合酶对靶序列进行PCR反应，所述聚合酶包含例如固有的外切核酸酶活性。PCR过程包括多个反复的解链、退火和延伸反应步骤，导致适当引物110跨靶序列108的延伸。在各退火步骤期间，至少一些靶标特异性探针106会退火至靶序列108。由于延伸反应期间由聚合酶对靶序列进行复制，聚合酶的外切核酸酶活性会消化与靶标杂交的靶标特异性探针106，避免其与捕获探针102杂交，从而使与捕获探针相连的荧光团解除淬灭。

虽然在优选的方面中，本发明的方法应用的PCR反应使用具有固有外切核酸酶活性的聚合酶，如上文所述，但这类活性不是感兴趣的靶序列在扩增后的信号生成所需要的。具体而言，对于靶标特异性探针与捕获探针或靶序列的结合而言，在给定的反应混合物中会存在平衡。由于PCR反应期间靶序列被扩增，该平衡会朝更多的靶标特异性探针与靶标结合、而非结合并淬灭带标记的捕获探针的方向移动。结果是，该扩增导致荧光信号增加。

应理解，对于具有或不具有外切核酸酶活性的方法，扩增反应过程中反应的敏感性将取决于(至少部分取决于)靶标特异性探针和捕获探针的相对浓度。例如，并如上文所述，预期靶标特异性探针在与样品中任何靶标杂交和与捕获探针杂交之间的存在平衡，导致一些带标记的捕获探针可能处于未杂交且未淬灭的状态。当靶序列的拷贝数对于靶标特异性探针的拷贝数相对较低时(情况通常如此)，预期其影响不显著。通常，扩增期间生成的靶标的量可多至允许起始靶标浓度远低于任何可测量效果。在靶标拷贝数显著更高时，会由于固定靶标特异性探针而提高起始的背景荧光水平。在这类情况下，需要提供更高浓度的靶标特异性探针以抵消该效果。可基于靶序列的拷贝数调节靶标特异性探针的确切浓度以降低基线。

或者，可以两种、三种或更多种浓度或捕获效率提供捕获探针区域，从而对捕获进行优化调节以使其对跨扩增循环前后的浓度范围敏感。因此，对于任何给定的扩增反应，可选择适当的阵列区域，例如具有优化的捕获效率。

如上文所述，在优选的方面中，以固定在固体支持物上的方式提供捕获探针。捕获探针的固定提供了集中捕获探针相关信号的便捷机制，例如可使用标准荧光检测技术解调的表面。此外，可将多个不同的捕获探针(即具有不同的核酸序列)排列在表面上，其中各不同的捕获探针序列提供于离散的位置中，从而可以使用单个阵列在单个反应过程中检测多个不同靶序列。具体而言，在存在捕获探针阵列的情况下，使多个不同靶标特异性探针序列接触可能含有一种或多种不同靶序列的样品，其中阵列中各位点包含与某一不同靶标特异性探针互补的捕获探针。扩增后，存在的那些靶序列会导致与其相连的靶标特异性探针消化，其继而导致相应的带荧光标记的捕获探针解除淬灭状态。通过鉴定产生荧光增强的捕获探针，可确定样品中存在的靶序列。用于制备捕获探针阵列的示例性方法参见例如美国专利申请号13/399,872和61/600,569，其全文通过引用全文纳入本文用于全部目的。

在本文中，本发明提供了允许高度多重化检测感兴趣核酸的方法及相关装置、系统和耗材，例如用于生物样品中的检测病毒、细菌、疟原虫属、真菌或其他病原体。在优选的方面中，所述耗材包含信号优化的腔室，该信号优化的腔室在腔室内表面上具有高效热稳定核酸检测阵列。该阵列被构造为包含多至约100种或更多种不同带标记的捕获探针。该方法包括与阵列上捕获探针互补的靶标特异性探针，且那些靶标特异性探针包含淬灭剂部分，如上文所述。如前所述，在反应室中扩增感兴趣的靶核酸的一部分期间，携带淬灭剂的靶标特异性探针被消化且其淬灭捕获探针荧光的能力被基本消除。可使靶标特异性探针接触阵列上的捕获探针然后将样品导入阵列。或者，可将样品材料与靶标特异性探针混合然后导入阵列。

因此，在第一方面，提供了检测靶核酸的方法。该方法包括提供检测腔室，该检测腔室在腔室的至少一个表面上具有至少一个高效核酸检测阵列。如本文中所用，“高效核酸阵列”是在杂交条件下与靶标特异性探针有效杂交的捕获核酸探针阵列。在典型的实施方式中，阵列被设置在反应/检测腔室的内表面上。可以通过从点样法到化学或光化学合成的任何传统阵列技术在表面上形成该阵列。通过控制识别探针的捕获探针区域的长度来实现高效(较短的探针比较长的探针更有效地杂交，小到对于杂交条件而言的最小杂交长度)。可以通过在捕获位点(捕获探针上与靶探针杂交的位置)和表面之间包含连接序列或结构(因而在距离表面的选定距离上形成捕获位点，其可以降低对杂交的表面效应)来使捕获位点对于与靶探针杂交而言更高效/更可得。例如，可以使用核酸序列和/或聚乙二醇接头。

该捕获核酸探针被设置以捕获相对小的探针核酸，这也提高了阵列效率。通过在包含淬灭剂基团的靶标特异性探针存在的情况下观察阵列上捕获探针荧光的减弱或淬灭来检测靶标特异性探针与阵列的结合。相反地，靶序列扩增的检测是通过检测来自捕获探针的荧光增加来实现的，因为靶标特异性淬灭探针被扩增反应消耗和/或被扩增的靶标固定。

优选地，这在反应或检测腔室中进行，该腔室构造为增强总体反应和检测。“反应腔室”或“检测腔室”通常指部分或全部封闭的结构，在其中分析样品或检测靶核酸。该腔室可完全封闭，或可包含流控偶联到所述腔室的端口或通道，例如用于递送试剂或反应剂。该腔室的形状可变化，例如，取决于实际应用和可用的系统设备。在一些情况下，该腔室可构造为降低阵列近端的背景信号。当其尺寸上成形以降低信号背景(如通过包含接近阵列的较小尺寸(如腔室厚度)(因而降低靠近所述阵列处溶液生成的信号量))时，或者当该腔室另行构造以降低背景(如通过使用涂层(如光学涂层)或结构(如挡板或靠近所述阵列的其他形状结构))时，腔室可以是“构造为降低阵列近端的背景信号”。通常，腔室构造为在阵列附近具有某一尺寸(例如，深度)，使得溶液中的信号足够低以允许检测阵列处的信号差异。例如，在一个实施方式中，阵列上方的腔室深度小于约1mm；理想地，腔室深度小于约500μm。通常，阵列上方的腔室深度小于约400μm、小于约300μm、小于约200μm或小于约150μm。在本文提供的一个实施例中，腔室深度为约142μm。这类较薄的腔室也具有较少的热质量，从而其温度循环比较厚腔室更快且更有效，有益于热循环扩增方法。

在一些实施方式中，将具有待检测靶核酸的一个或多个拷贝的样品加载到检测腔室中。将一种或多种扩增引物和包含淬灭剂基团的靶标特异性探针与一种或多种靶核酸拷贝杂交。在扩增引物依赖的扩增反应中扩增一种或多种靶核酸拷贝的至少一部分。在使用具有外切核酸酶活性的聚合酶来进行时，该扩增反应导致靶标特异性探针的切割，例如归因于扩增酶的核酸酶活性。这导致可供结合阵列上捕获探针的靶标特异性探针的数目减少，并因而导致那些捕获探针上荧光团的总体淬灭减少，即导致从阵列表面测得的荧光增加，该增加表明样品中存在靶核酸。

如前所述，优选薄的反应或检测腔室，因为其中能造成背景信号的热物质和液体体积较少。在典型的实施方式中，该阵列附近的腔室深度或其他维度上小于约1mm，更典型地，在该阵列附近的至少一个维度上是约500μm或更小，优选约250μm或更小，例如约10μm-约200μm，并且在一些实施方式中，该阵列附近的腔室在某一维度上是约150μm。在本文一个实施例中，阵列上方的腔室深度为约142μm。在本文另一个实施例中，腔室深度为约100μm。相关的腔室维度取决于检测系统的信号检测路径，例如当通过传递光到阵列上来生成信号时，其中一些光从阵列溢出阵列并进入阵列上方的液体中时，所述相关维度是阵列上方的腔室深度。

对于上文所述其他试验形式(如美国申请号13/399,872中所述)，阵列通常提供以非限速数量的与带标记探针(如释放的带标记探针片段)杂交的捕获核酸。在这类方法中，需要带标记探针不使阵列饱和。然而，在本发明中，对带标记的捕获探针的数量进行设计，从而作为靶序列扩增的结果，使与捕获探针结合的靶探针数目发生可测量的变化。由于典型扩增反应中扩增期间靶标浓度的显著变化和相应量的靶标特异性探针消耗，与带标记的捕获探针结合的靶探针量的变化会产生可测量的效果。虽然反应混合物中靶标特异性探针的量可以广泛变化，但在特别优选的方面，反应混合物中靶标特异性探针的浓度范围可以是约10nM-约1uM，优选约50nM-约200nM。

典型的捕获探针阵列密度是约350fmol/cm²或更大，如约2000fmol/cm²或更大、2500fmol/cm²或更大、3000fmol/cm²或更大、4000fmol/cm²或更大、4500fmol/cm²或更大，或者5000fmol/cm²或更大。阵列效率也与待捕获探针的长度呈函数关系。尽管探针确实需要足够长以在杂交过程中于给定T_m下结合，但较短的探针通常呈现更有效的杂交。通常待由阵列捕获的探针的长度为约50个核苷酸或更短；这些阵列包含具有对应的互补捕获核酸序列的位点(捕获探针的核酸序列也可任选地包含其他序列，例如，以隔开表面上的互补区域(捕获位点)，例如，以降低表面效应)。更典型地，探针和捕获位点的序列(不包含任何可选的用于分隔的其他序列)长度为约40个核苷酸或更短，例如约20个核苷酸至约35个核苷酸。

在一些情况下，选择用于给定分析的阵列的捕获探针和互补靶标特异性探针，使得提供覆盖阵列的所有成员的窄范围Tm。特别地，为了确保与捕获阵列的最优和稳定的杂交，给定阵列中的捕获探针各自具有的T_m在该阵列各其他成员的约10℃内，并且优选在该阵列的各其他探针的约7℃、5℃或3℃内。这样的窄T_m范围使得杂交稳定，并且所得信号生成涵盖阵列的所有成员。由于靶标特异性探针具有感兴趣的靶序列所确定的序列，因此会降低杂交体控制Tm的能力。然而，通常，可选择总体靶标中的不同靶标特异性序列以实现较窄的Tm范围。

如上文所述，选择捕获探针上荧光团和靶标特异性探针上淬灭剂的位置，使得在两条探针杂交在一起时，淬灭剂位于与荧光团足够近的距离内，从而在经受激发光照时能量能从荧光团转移至淬灭剂。在某些方面，这通过将淬灭剂和荧光团与其相应探针序列上的互补碱基相连来实现。将标记基团和淬灭剂与核苷酸连接，特别是与核苷酸的核碱基部分连接是本领域熟知的。

在特别优选的方面，淬灭剂基团位于靶标特异性探针的5’位置处或附近，因此在扩增反应期间其不会中断切割/消化。

也可改变阵列上捕获探针的取向。例如，可使捕获探针在其3’或5’端与阵列表面相连，且可使荧光团更接近或更远离阵列表面。在特别优选的方面，捕获探针经由其5’端与表面相连，并在靠近该末端处携带其荧光团，例如在3’端核苷酸上。应理解，可通过直接共价连接至表面或表面上的涂层，或者经由间插结合分子(interveningassociationmolecule)(例如通过生物素-亲和素连接)、核酸杂交偶联(例如使用与捕获探针末端存在的标签序列互补的单独连接的核酸)等进行探针与阵列表面的连接。同样，示例性表面、涂层和核酸固定技术参见例如美国专利申请号61/600,569，其在前文中全文纳入本文以用于全部目的。

根据耗材的确切设置，可通过任何不同机制将样品载入本发明的装置/系统的腔室。在一个方便的应用中，通过与腔室可操作连通的至少一个端口或流体通道来加载样品。例如，可在耗材的顶表面制造端口，所述端口引导进入所述腔室。这使加载简化，例如通过移液器或其他液体递送装置加载。或者，流体或微流体通道、毛细管等可用于样品递送。

本发明的方法可用于检测样品中感兴趣核酸和/或对核酸定量，例如实时进行。因此，一方面，可选多个扩增循环中扩增靶核酸然后从阵列检测信号，信号检测后靶核酸部分得以补充扩增，即在靶标特异性探针的其它拷贝的存在下)。一个或多个扩增循环后，反应混合物中保持游离的靶标特异性探针序列(如未消化且未与扩增的靶序列杂交的那些)能与阵列上的捕获探针杂交并淬灭其连接的荧光团。随后，测试阵列是否存在荧光，测得的信号强度对应于样品中靶核酸的存在和/或含量。通常，对样品扩增超过1个循环后开始检测，通过增加靶标特异性探针的数目来增加信号水平，所述靶标特异性探针被扩增反应消耗或被扩增的靶序列量的增加所固定。例如，可选对靶核酸扩增至少例如2、3、4、5轮或更多轮扩增循环后从阵列检测信号。

带标记的捕获探针通常包含荧光或发光标记物，尽管也可使用其他标记物如量子点。在一个优选实施方式中，所述标记物是荧光染料。由捕获探针产生的信号通常是光学信号。类似地，将靶标特异性探针上的淬灭剂基团选择为来自所用荧光团的能量接受体，例如在荧光团发射的波长下作为能量接受体。如本文中所用，该淬灭剂可以是非发射性淬灭剂，例如其接受来自荧光团的能量而不以光的形式发射能量。或者，该致敏剂可以发射光能，但所发射光能的波长被用于分析来自阵列的荧光的检测系统滤除。因此，淬灭剂仅指自荧光团接受荧光能量且不在检测系统的经检测波长范围内发射的基团，所述检测系统用于监测荧光团发射波长的荧光。在其他方面，靶标特异性序列上的淬灭剂可包括发射性淬灭剂，且总体分析仪器系统可包括能够在靶标特异性序列上不存在“淬灭剂”基团的情况下差异化检测“淬灭剂”所发射辐射和捕获探针的荧光团所发射辐射的光学系统。结果是，当靶标特异性序列与阵列结合并照射有特异性激发捕获探针荧光团的激发波长时，该荧光团会以其第一特征性波长发射，其会经由能量转移被“发射性”淬灭剂基团吸收。结果是，发射性淬灭剂会以其第二特征性波长发射。当靶标特异性探针不再与阵列结合时(例如作为扩增反应消耗的结果)，由未淬灭的捕获探针的荧光团所发射的能量将以第一特征性波长发射。使用常规的双波长荧光检测光学部件，可以基于其特征性荧光信号检测阵列的两种状态。

通常通过检测对应于捕获探针上光学标记物的一种或多种光学信号波长来检测信号。因为阵列上靶探针的结合位置能用于区分不同靶标特异性探针，所以不需要在不同探针上采用不同标记物以区分多重扩增反应(在样品中存在超过一种的靶标时，设计以扩增多种靶核酸的扩增反应)中的探针。换言之，在一些实施方式中，捕获探针的位置特异性针对给定的靶序列。

虽然以与阵列上捕获探针相连的标记物基团的方式进行一般描述，但应理解可以使用不需要使用预先标记的捕获探针的其他检测方案。例如，在一些实施方式中，可以使用插入染料。插入染料通常在整合到或插入到双链核酸(例如捕获探针/靶标特异性探针杂交体)内之后产生可检测信号事件，。在本发明的内容中，靶标特异性探针与阵列上互补捕获探针的杂交在阵列表面处产生双链体，该双链体可以纳入插入染料，并且提供指示该杂交的独特信号。插入染料为本领域熟知，并且包含描述于如Gudnason等，NucleicAcidsResearch,(2007)，第35卷，第19，e127中的那些，该文献通过引用纳入以用于所有目的。类似地，靶标特异性探针可提供有荧光或其他光学可检测标记基团，而捕获探针不包含标记基团或互补基团，例如淬灭剂或能量接受体基团。在对靶序列进行任何扩增前，这些带标记的探针会与其对应的捕获探针杂交，在基材(如阵列)表面产生信号浓度。在溶液中扩增靶序列期间，荧光标记的靶标特异性探针被消化，使标记释放至溶液中并减少了与表面上捕获探针杂交的带标记的靶标特异性探针的量。如上文所述，样品中靶序列的存在导致表面杂交信号量随后续扩增循环而减少。在一些方面，靶标特异性探针可包含淬灭剂基团，例如，正如在常规的探针组中所见。

相似地，虽然特别优选光学信号检测方法，通常也可以使用非光学标记和/或检测方法来进行探针设计和测试方法，例如使用电化学检测方法，例如ChemFETS、ISFETS等，任选地与靶标特异性探针上的电化学标记物基团联用，例如具有大带电基团以在检测器表面或其附近放大检测靶标特异性探针与阵列探针的杂交。在本发明中，与靶标特异性探针相关的信号会因而在扩增过程期间由于靶序列被消耗或固定而降低。

可就阵列的一个或多个区域来检测局部背景，通过针对所述背景进行校正来使信号强度测量值标准化。通常，标准化的信号强度为小于总信号的约10％，例如总信号的约1％至约10％。在实施方式的一类实施例中，标准化的信号强度为总信号的约4％至约7％。通常，当约1％或更多信号定位于阵列时，例如当约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多信号定位于腔室某一区域的阵列上时，可以将阵列信号和背景区分开。能够区分相对于背景的甚至更低水平的信号，但这一般不是优选的。这些方法也可包括通过对阵列上捕获核酸斑点差异进行校正(如通过校正斑点大小和/或斑点密度)、或对阵列不同区域的不均匀视野进行校正，来使信号强度标准化。

同时检测样品中多种靶核酸的能力代表了本发明的优选方面。样品可以具有一种或多种靶核酸，而阵列包含能够检测超过一种靶标/样品的多种捕获核酸类型。捕获核酸类型可以在阵列上空间分隔，不需要使用多种标记物(虽然，如上所述，可以使用多种标记物)。在多重方案中，使各自对不同核酸靶标具有特异性的多种扩增探针与样品一起孵育，所述样品可包含一种或多种靶核酸。例如，在一些实施方式中，可以存在约5-约100种或更多种捕获核酸类型。待检测的各可能靶标也会采用不同的靶探针，例如在扩增反应中任选地存在约5-约100种或更多种带标记的靶探针类型，各自特异性针对一种可能的感兴趣靶标。阵列包含相应的捕获核酸探针，例如，约5-约100种或更多种捕获核酸探针类型。这允许通过阵列检测和处理相应的大量信号。例如，在探针与阵列杂交后，可以根据阵列上信号位置检测约5-约100种或更多种不同的信号。应理解，阵列上捕获探针类型的数量通常由单个反应体积内能够多重化的不同扩增反应的数量决定。然而，在一些情况中也能使用具有更大数量的不同捕获探针(如大于100、大于1000、10000种或更多种捕获探针类型)的捕获阵列，例如，当扩增反应被汇集用于通过阵列的研究等情况时。

尽管本文的很多讨论是针对基于PCR的扩增，但可用其他扩增反应来替代。例如，可使用包含与扩增反应偶合的切割反应的多酶系统，例如包含易切断的键的切割的那些(参见，例如USPN5,011,769；USPN5,660,988；USPN5,403,711；USPN6,251,600)和叉状核酸结构(US7,361,467；US5,422,253；US7,122,364；US6,692,917)的那些。也可以使用与TaqMan样切割偶合的解旋酶依赖性扩增(Tong,Y等，2008BioTechniques45:543-557)。可以使用基于核酸序列的扩增(NASBA)或连接酶链式反应(LCR)。在NASBA方法中，探针可以和扩增引物一起与模板杂交，如PCR中的那样。探针可以通过逆转录酶或所加内切核酸酶的核酸酶作用切割，以与PCR中由聚合酶释放相似的方式破坏或切割探针。NASBA的一个潜在优势是无需热循环。这简化了整体装置和系统的要求。对NASBA的描述参见，例如，Compton(1991)"Nucleicacidsequence-basedamplification(基于核酸序列的扩增)"Nature350(6313):91-2。对于使用NASBA来检测例如致病性核酸，参见，例如Keightley等(2005)“Real-timeNASBAdetectionofSARS-associatedcoronavirusandcomparisonwithreal-timereversetranscription-PCR(实时NASBA检测SARS相关的冠状病毒及与实时逆转录PCR的比较)”，JournalofMedicalVirology77(4):602-8。当使用LCR型反应时，可以使用内切核酸酶切割探针，而不是依赖于扩增酶的核酸酶活性。

在典型的实施方式中，检测由阵列放射的信号并测量信号强度。信号强度与样品中靶核酸的存在和/或量相关联。通常，样品扩增超过1轮循环后开始检测，以通过增加由扩增固定或消化的靶探针的数量来增加信号水平。例如，可任选地将靶核酸扩增至少，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10轮或更多轮扩增循环后从阵列检测信号。

在一个典型的实施方式中，扩增反应期间，以选定的时间、温度和扩增循环间隔从阵列捕获荧光或其他光学图像。分析这些图像以确定靶核酸是否在样品中存在，并且提供对样品中起始靶核酸浓度的定量。结合使用平均灰度强度测量值、背景校正和基线调整来分析图像。可以对阵列中的各斑点局部测量背景。通过测量感兴趣阵列区域(例如，阵列点)周围溶液的同心环的图像强度来计算背景。然后校正各个区域的信号以计算该区域的局部背景。还可以使来自各区域的经校正的信号进一步标准化以考虑到点样差异以及视野中的不均匀光照。从前几轮循环(通常5-15轮循环)中获得的经校正强度测量值的平均值用于调整基线并对来自各区域的测量值标准化。

关于基于扩增后信号强度测量值定量核酸方法的其他细节可以在上文所述的参考文献和如下文献中找到：JangB.Rampal(编者)(2010)Microarrays(微阵列)：第2卷，ApplicationsandDataAnalysis(应用和数据分析)(MethodsinMolecularBiology(分子生物学方法))胡马纳出版社；第2版，ISBN-10:1617378526,ISBN-13:978-1617378522；StephenA.Bustin(编者)(2004)A-ZofQuantitativePCR(定量PCR大全)(IULBiotechnology(IUL生物技术),第5卷)(IUL生物技术系列)InternationalUniversityLine；第1版，ISBN-10:0963681788,ISBN-13:978-0963681782；和Kamberova和Shah(2002)DNAArrayImageAnalysis:Nuts&Bolts(DNA阵列图像分析：基本要点)(Nuts&Boltsseries(基本要点系列))DNA出版社；第2版，ISBN-10:0966402758,ISBN-13:978-0966402759。

在一些配置中，这些捕获探针可选偶联到移动基材(例如珠、树脂、颗粒等(本文通常与“珠”互换称谓))，而不是静态基材。例如，如本文其它地方所述，可以使用平面基材来提供阵列的捕获探针，其与靶标特异性探针及其相连的淬灭剂杂交。给定靶核酸序列的存在通过检测因其互补靶标特异性探针的消化或固定而解除淬灭的捕获探针位置而测得。因为各捕获探针及其互补靶标特异性探针对特定靶序列具有特异性，如果该捕获探针解除淬灭，其指示该靶标存在并且被扩增。

在移动相基材中，使给定分析中的各不同类型的捕获探针偶联到同样含有独特标记物的不同移动基材上。然后使该移动基材通过检测通道以鉴定珠并隐含地鉴定捕获探针以及该捕获探针是否被淬灭。如果在对应特定捕获探针的给定珠上检测到带标记的捕获探针解除淬灭，则指示与该捕获探针(和互补靶标特异性探针)相关联的靶序列在样品中存在并且被扩增。本发明的这个方面可以在终点检测中使用，如整体扩增反应完成之后使用，但是也可以在定量分析中使用，例如，一轮或多轮扩增循环后从扩增混合物中虹吸出部分珠，并从珠上测量带标记的探针信号强度。

多种不同珠类型可以与本发明的这个方面联用。例如，可以使用聚苯乙烯、纤维素、丙烯酸、乙烯、二氧化硅、顺磁或其他无机颗粒、或任意各种其他类型的珠。如前所述，珠通常用独特标记特征差异化标记。再者，可以使用多种不同标记物类型，包含有机荧光标记物、无机荧光标记物(如量子点)、发光标记物、电化学标记物等。这些标记物广泛市售可得，并且设置以易于偶联到合适的活性珠上。在荧光标记基团的情况中，可以通过2、3、4种或更多种光谱上不同的荧光标记基团和不同水平的各种标记物的不同组合来提供大量的标记物特征，从而提供无需使用宽的激发照射光谱如多重激光就能提供宽范围的独特标记特征。

本发明的方法通常使用本文所述的装置、系统、耗材和试剂盒来进行。能提供所述装置、系统和耗材的所有特征以实践本文所述方法，并且本文所述方法可与所述装置、系统、耗材和试剂盒联用。

本发明的反应/检测腔室通常以单罐方式使用，例如反应和检测在同一腔室中进行。高效阵列形成于该腔室的至少一个内表面上。在该方法的扩增和阵列杂交步骤过程中，阵列通常与扩增反应物和产物接触。这允许用户进行一轮或多轮扩增反应循环，通过实时监测来自阵列的信号来检测结果，然后再进行一轮或多轮扩增反应，再检测。因此，来自阵列的信号强度可用于实时检测并定量一种或多种感兴趣的核酸。

本发明的耗材包含腔室和该腔室内表面上的高效阵列。该腔室通常较薄(浅)，如深度小于约1mm。通常，腔室越薄，阵列上的溶液越少，这降低了来自溶液的信号背景。通常所需腔室深度的范围是约1μm–约500μm。就耗材生产的容易性而言，该腔室在阵列上方的厚度范围通常是约10μm–约250μm，如厚度约100μm–约150μm。该腔室可以包含具有试剂递送端口的表面，例如用于通过手工或自动移液器递送样品。

图2提供了示例性耗材的放大示意图。在这个示例中，底表面层1和上表面层2通过中间层3接合。在层1、2和3组装后切口4形成腔室。端口5形成便利通道以在组装后将缓冲液和试剂递送到腔室中。可以在形成切口顶表面或底表面的区域的顶层或底层上形成高效阵列。在一个方便的实施方式中，当采用落射荧光检测来检测结合到阵列的标记物时，在下表面上制造阵列，设置耗材以通过本发明装置和系统中定位于下表面下的检测光学器来观察。通常，顶表面和/或底表面会包含窗口，检测光学器可以通过该窗口来观察阵列。

中层3可以根据待使用的耗材组装方法采用任何不同形式。在一个方便的实施方式中，顶表面和底表面1和2通过压敏粘合材料形成的层3来结合。压敏的粘合层(例如，带)是熟知的并且广泛可用。参见，例如，Benedek和Feldstein(编)(2008)HandbookofPressure-SensitiveAdhesivesandProducts(《压敏粘合剂和产品手册》)：卷1：FundamentalsofPressureSensitivity(压敏的基本原理)，卷2：TechnologyofPressure-SensitiveAdhesivesandProducts(压敏粘合剂和产品技术)，卷3：ApplicationsofPressure-SensitiveProducts(压敏产品的应用)，CRC出版社；第1版，ISBN-10:1420059343，ISBN-13:978-1420059342。

也可以使用用于接合顶表面和底表面以形成腔室的其他制造方法。例如，顶表面和底表面可以通过顶表面和/或下表面上的衬垫或成形要素接合在一起。该衬垫或要素任选地融合或附着到上表面和/或下表面的相应区域。硅和聚合物芯片制造方法可用于形成顶表面或底表面的要素。对要素制造(包含微要素制造)方法的介绍，参见，例如Franssila(2010)IntroductiontoMicrofabrication(《微制造介绍》)，Wiley出版社；第2版，ISBN-10:0470749830，ISBN-13:978-0470749838；Shen和Lin(2009)“Analysisofmoldinsertfabricationfortheprocessingofmicrofluidicchip(《用于微流体芯片处理的模塑插入制造的分析》)”，聚合物工程和科学出版社，塑料工程协会公司(PolymerEngineeringandSciencePublisher:SocietyofPlasticsEngineers,Inc.)，卷49，第1期，第104(11)页；Abgrall(2009)Nanofluidics(《纳米流体》)ISBN-10:159693350X，ISBN-13:978-1596933507；Kaajakari(2009)PracticalMEMS:Designofmicrosystems,accelerometers,gyroscopes,RFMEMS,opticalMEMS,andmicrofluidicsystems(《实践MEMS：设计微系统、加速度计、陀螺仪、RFMEMS、光学MEMS和微流体系统》)，小齿轮出版社(SmallGearPublishing)，ISBN-10:0982299109，ISBN-13:978-0982299104；Saliterman(2006)FundamentalsofBioMEMSandMedicalMicrodevices(《BioMEMS和医学微型装置的基本原理》)，SPIE出版社，ISBN-10:0819459771，ISBN-13:978-0819459770；以及Madou(2002)FundamentalsofMicrofabrication:TheScienceofMiniaturization(《微制造的基本原理：小型化的科学》)，第2版，CRC出版社；ISBN-10:0849308267，ISBN-13:978-0849308260。这些制造方法可用于基本形成顶表面或底表面所需的任何要素，消除了对中间层的需要。例如，在顶表面和/或底表面形成下陷，并将这两个层接合，由此形成腔室。

在一些实施方式中，该衬垫或要素引导紫外线或辐射可固化的粘合剂的流动。这种粘合剂在上表面和下表面之间流动，并且接受UV光或辐射(如电子束或“EB”辐射)，因而使上表面和下表面彼此结合。可用的粘合剂(包含UV和可辐射固化的粘合剂)的描述，参见，例如Ebnesajjad(2010)HandbookofAdhesivesandSurfacePreparation:Technology,ApplicationsandManufacturing(《粘合剂和表面制备手册：技术、应用和生产》)，威廉安德鲁出版社(WilliamAndrew)；第1版，ISBN-10:1437744613，ISBN-13:978-1437744613；Drobny(2010)RadiationTechnologyforPolymers(《聚合物的辐射技术》)，第2版，CRC出版社，第2版，ISBN-10:1420094041，ISBN-13:978-1420094046。

在其他实施方式中，可通过超声将上表面和下表面融合在一起，而衬垫或表面要素划定耗材中融合的区域和待产生的腔室或其他构造要素。用于融合材料的超声焊接和相关技术在如下文献中有描述，例如Astashev和Babitsky(2010)，UltrasonicProcessesandMachines:Dynamics,ControlandApplications(FoundationsofEngineeringMechanics)(《超声工艺和机械：动力学、控制和应用(工程机械的基础)》)，Springer出版社；第1版，ISBN-10:3642091245，ISBN-13:978-3642091247；和Leaversuch(2002)“Howtousethosefancyultrasonicweldingcontrols(怎样使用那些奇特的超声焊接控制)”PlasticsTechnology48(10):70-76。

在另一个实例中，所述要素是上表面或下表面上的透明区域，和相应的上表面或下表面上的对应阴影区域。在这个实施方式中，可通过引导激光通过透明区域并且到阴影区域上来将上表面和下表面由激光焊接在一起。激光焊接方法在如下文献中有描述：例如Steen等，(2010)LaserMaterialProcessing(《激光材料处理》)Springer出版社；第4版，ISBN-10:1849960615，ISBN-13:978-1849960618；Kannatey-Asibu(2009)PrinciplesofLaserMaterialsProcessing(WileySeriesonProcessingofEngineeringMaterials)(《激光材料处理原理(Wiley工程材料处理系列)》)，Wiley出版社，ISBN-10:0470177985，ISBN-13:978-0470177983；和Duley(1998)LaserWelding(《激光焊接》)韦利科学公司，ISBN-10:0471246794，ISBN-13:978-0471246794。

在一些实施方式中，捕获核酸阵列通常与作为耗材、检测腔室等一部分的窗上的热稳定涂层偶联。窗本身可以包含，例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料。可购得适用于涂覆该窗的多种涂层。通常，基于以下因素选择涂层：与阵列基材的相容性(例如，阵列连接的腔室表面是玻璃还是聚合物)，衍生或处理以包含适于连接阵列成员的活性基团的能力，和与处理条件的相容性(例如，热稳定性、光稳定性等)。例如，该涂层可以包含：化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧化物、氮杂环丙烷、醛、包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺或α,β-不饱和酮、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。对表面涂层和其用于生物分子和表面连接的描述，参见，例如，Plackett(编者)(2011)Biopolymers:NewMaterialsforSustainableFilmsandCoatings(《生物聚合物：可持续膜和涂层的新材料》)，Wiley出版社，ISBN-10:0470683414，ISBN-13:978-0470683415；Niemeyer(编者)(2010)，BioconjugationProtocols:StrategiesandMethods(MethodsinMolecularBiology)(《生物偶联方案：策略和方法(分子生物学方法)》)，Humana出版社；第1版，ISBN-10:1617373540，ISBN-13:978-1617373541；Lahann(编者)(2009)，ClickChemistryforBiotechnologyandMaterialsScience(《生物技术和材料科学的点击化学》)，Wiley出版社，ISBN-10:0470699701，ISBN-13:978-0470699706；Hermanson(2008)，BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)，第2版，学术出版社；第2版，ISBN-10:0123705010，ISBN-13:978-0123705013；Wuts和Greene(2006)Greene'sProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(《有机合成中的保护基团》)，韦利科学公司(Wiley-Interscience)；第4版，ISBN-10:0471697540,#ISBN-13:978-0471697541；Wittmann(编者)(2006)，ImmobilisationofDNAonChipsII(TopicsinCurrentChemistry)(《芯片上DNA的固定II(现代化学专题)》)，Springer出版社，第1版，ISBN-10:3540284362，ISBN-13:978-3540284369；Licari(2003)，CoatingMaterialsforElectronicApplications:Polymers,Processing,Reliability,Testing(MaterialsandProcessesforElectronicApplications)(《电子应用的涂层材料：聚合物、处理、可靠性、测试(电子应用的材料和处理)》)，威廉安德鲁出版社，ISBN-10:0815514921，ISBN-13:978-0815514923；Conk(2002)，FabricationTechniquesforMicro-OpticalDeviceArraysStormingMedia(微型光学期间阵列的制造技术，风暴媒体出版)，ISBN-10:1423509641，ISBN-13:978-1423509646，以及石油和颜色化学协会(OilandColourChemists'Association)(1993)，SurfaceCoatings-Rawmaterialsandtheirusage(《表面涂层-原材料及其应用》)，第3版，Springer出版社；第3版，ISBN-10:0412552108，ISBN-13:978-0412552106。

制造核酸阵列的方法是现有的并且能通过在内腔室表面(如耗材、检测腔室等的内腔室表面)上形成阵列来适用于本发明。能用于在内腔室表面形成阵列的核酸微阵列形成技术描述在，例如Rampal(编者)，Microarrays:VolumeI:SynthesisMethods(MethodsinMolecularBiology)(微阵列：卷I：合成方法(分子生物学方法))，Humana出版社；第2版，ISBN-10:1617376639,ISBN-13:978-1617376634；Müller和Nicolau(编者)(2010)，MicroarrayTechnologyandItsApplications(BiologicalandMedicalPhysics,BiomedicalEngineering)(微阵列技术及其应用(生物和医学物理、生物医学工程))，Springer出版社；第1版，ISBN-10:3642061826,ISBN-13:978-3642061820；Xing和Cheng(编者)(2010)Biochips:TechnologyandApplications(BiologicalandMedicalPhysics,BiomedicalEngineering)(生物芯片：技术和应用(生物和医学物理、生物医学工程))，Springer出版社；第1版，ISBN-10:3642055850,ISBN-13:978-3642055850；Dill等(编者)(2010)Microarrays:Preparation,Microfluidics,DetectionMethods,andBiologicalApplications(IntegratedAnalyticalSystems)(微阵列：制备、微流体、检测方法和生物应用(集成分析系统))，Springer出版社，ISBN-10:1441924906,ISBN-13:978-1441924902；Whittmann(2010)ImmobilisationofDNAonChipsII(TopicsinCurrentChemistry)(芯片上DNA的固定II(现代化学专题))，Springer出版社；第1版，ISBN-10:3642066666,ISBN-13:978-3642066665；Rampal(2010)，DNAArrays:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology)(DNA阵列：方法和方案(分子生物学方法))，Humana出版社；第1版，ISBN-10:1617372048,ISBN-13:978-1617372049；Schena(作者，编者)(2007)，DNAMicroarrays(MethodsExpress)(DNA微阵列(方法快报))，Scion出版社；第1版，ISBN-10:1904842151,ISBN-13:978-1904842156；Appasani(编者)(2007)，Bioarrays:FromBasicstoDiagnostics(生物阵列：从基础到诊断)，Humana出版社；第1版，ISBN-10:1588294765,ISBN-13:978-1588294760；和UlrikeNuber(编者)(2007)，DNAMicroarrays(AdvancedMethods)(DNA微阵列(高级方法))TF公司(Taylor&Francis)，ISBN-10:0415358663,ISBN-13:978-0415358668。把DNA连接到表面以形成阵列的技术可包含任何不同点样法、使用化学反应表面或涂层、光导向的合成、DNA印刷技术，和很多本领域可用的其他方法。

定量阵列密度的方法在上面引用的参考文献以及Gong等(2006)“Multi-techniqueComparisonsofImmobilizedandHybridizedOligonucleotideSurfaceDensityonCommercialAmine-ReactiveMicroarraySlides(商业胺反应性微阵列载玻片上固定和杂交寡核苷酸表面密度的多技术比较)”Anal.Chem.78:2342-2351中描述。

本发明的耗材可以包装在容器中，或包装材料中以形成试剂盒。该试剂盒也可以包含可用于使用该耗材的组分，例如，对照试剂(例如，对照模板、对照探针、对照引物等)、缓冲液等。

装置和系统

使用耗材和/或实践本发明的方法的装置和系统也是本发明的特征。装置或系统可以包含耗材的要素，例如，反应腔室和阵列(以耗材形式或者装置的专用部件形式)。最典型地，该装置通常具有接收器，例如安置上述耗材的平台，以及用于监测阵列的检测光学器件，用于热循环腔室的模块，和具有控制热循环、检测和信号后处理的系统指令的计算机。

示例性系统的示意图示于图3。如图所示，耗材10安置在平台20上。环境控制模块(ECM)30(例如，包括Peltier装置，冷却风扇等)提供环境控制(例如，温度的热循环)。由光源40(如灯、电弧灯、LED、激光等)提供照明光。光学系统50将光从光源40导向耗材10。由光学系统监测来自耗材10的信号，并且将信号信息传递给计算机60。计算机60还任选地控制ECM30。可以由计算机60来处理信号信息，并且输出至用户可观察的显示器70和/或打印机。可将ECM30安置在耗材10的上方或下方，并且可以包含其他观察光学器件80(位于平台20的上方或下方)。

设置平台/接收器以安置耗材用于热循环和分析。该平台可以包含与耗材的相应要素匹配的对准(registration)和对齐要素，例如对齐臂、扳手、孔、栓等。该平台可包含盒来接收和定向耗材，将其以与其他装置元件可操作连接的方式放置，尽管这在很多实施方式中不是必需的，例如将耗材直接安置在平台上的情况中。设置装置元件来与耗材一同运作，并且装置元件可包含用于向耗材递送缓冲液和试剂的流体递送系统，热循环或其他温度控制或环境控制模块，检测光学器件等。在腔室置于装置内而不是整合到耗材中的实施方式中，通常设置装置元件以在腔室上或腔室附近处操作。

对耗材的流体递送可以通过该装置或系统来完成，或可以在将耗材加载到该装置或系统中之前进行。流体处理元件可被整合入该装置或系统，或可以配置成与该装置或系统分开的单独加工工位。流体处理元件可以包含将试剂或缓冲液递送到耗材中端口的(手动或自动)移液器，或可以包含毛细管、微制造的装置通道等。可用于加载所述耗材的手动和自动移液器和移液器系统可从各种来源购得，所述来源包括赛默科技公司(ThermoScientific)(美国)、艾本德公司(Eppendorf，德国)、Labtronics公司(加拿大)等。一般来说，可购得各种流体处理系统，并且可将其整合到本发明的装置和系统中。参见例如Kirby(2010)，Micro-andNanoscaleFluidMechanics:TransportinMicrofluidicDevices(微米级和纳米级流体力学：微流体装置中的运输)，ISBN-10:0521119030,ISBN-13:978-0521119030；Bruus(2007)，TheoreticalMicrofluidics(OxfordMasterSeriesinPhysics)(理论微流体(牛津物理大师丛书)，牛津大学出版社，美国ISBN-10:0199235090,ISBN-13:978-0199235094；Nguyen(2006)，FundamentalsAndApplicationsofMicrofluidics(微流体的基础和应用)，第2版，(IntegratedMicrosystems(整合的微系统))，ISBN-10:1580539726,ISBN-13:978-1580539722；Wells(2003)，HighThroughputBioanalyticalSamplePreparation:MethodsandAutomationStrategies(ProgressinPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis)(高通量生物分析样品制备：方法和自动策略(药学和生物医学分析中的进展))，爱思唯尔科学公司；第1版，ISBN-10:044451029X,ISBN-13:978-0444510297。耗材任选地包含设置以与递送系统匹配的端口，例如，用于通过移液器或毛细管递送装置进行加载的合适尺寸的端口。

ECM或热调节模块可以包含促进热循环的要素，诸如热电模块、Peltier装置、冷却风扇、散热器、经设置以与腔室的外表面部分匹配的金属板、流体浴等。很多这种热调节组件可用于整合到本发明的装置和系统中。参见例如Kennedy和Oswald(编)(2011)PCRTroubleshootingandOptimization:TheEssentialGuide(《PCR解决问题和优化：基本手册》)，凯斯特学术出版社，ISBN-10:1904455727；ISBN-13:978-1904455721；Bustin(2009)ThePCRRevolution:BasicTechnologiesandApplications(《PCR革命：基本技术和引用》)，剑桥大学出版社；第1版，ISBN-10:0521882311，ISBN-13:978-0521882316；Wittwer等(编)(2004)RapidCycleReal-TimePCR-MethodsandApplications(《快速循环实时PCR方法和应用》)，施普林格出版社；第1版，ISBN-10:3540206299，ISBN-13:978-3540206293；Goldsmid(2009)IntroductiontoThermoelectricity(SpringerSeriesinMaterialsScience)(《热电性介绍(Springer材料科学系列)》)，施普林格出版社；第1版，ISBN-10:3642007155，ISBN-13:978-3642007156；以及Rowe(编)(2005)ThermoelectricsHandbook:MacrotoNano(《热电手册：宏观到纳米》)，CRC出版社；第1版，ISBN-10:0849322642，ISBN-13:978-0849322648。热调节模块例如可以被制成接收耗材的盒的形式，或可以被安置在平台上与耗材可操作附近处。

通常，ECM或热调节模块具有反馈控制系统，该系统可操作地连接到计算机，该计算机控制该模块或是该模块的一部分。计算机指导的反馈控制是仪器控制的现有方法。参见，例如，Tooley(2005)PCBasedInstrumentationandControl(《基于PC的仪器和控制》)，第3版，ISBN-10:0750647167，ISBN-13:978-0750647168；Dix等(2003)Human-ComputerInteraction(《人-计算机互动》)(第3版)，普伦蒂斯·霍尔出版社(PrenticeHall)，第3版，ISBN-10:0130461091，ISBN-13:978-0130461094。通常，通过计算机实施系统控制，计算机可以使用例如作为输入的脚本文件以生成目标温度和循环时程，以及指定何时由检测光学器件观察/拍摄图像。通常在反应过程中的不同时间点拍摄多个图像，并且通过计算机分析以生成强度与时间关系的曲线，由此得到靶标的浓度。

该光学系统可以包含任何典型光学系统组件，或可以可操作地连接至此类组件。该光学系统将照射光导向耗材，例如，聚焦到耗材的阵列或阵列区域上。该光学系统还可以检测从阵列发射的光(例如，荧光或发光信号)。可任选的现有光学组分的描述参见，例如，Kasap等(2009)CambridgeIllustratedHandbookofOptoelectronicsandPhotonics(《剑桥光电子和光子图示手册》)，剑桥大学出版社；第1版，ISBN-10:0521815967，ISBN-13:978-0521815963；Bass等(2009)HandbookofOptics(《光学手册》)，第3版，卷I:GeometricalandPhysicalOptics,PolarizedLight,ComponentsandInstruments(set)(几何和物理光学，偏振光、组件和仪器(组))，MHP出版社(McGraw-HillProfessional)；第3版，ISBN-10:0071498893，ISBN-13:978-0071498890；Bass等(2009)HandbookofOptics(《光学手册》)，第3版，卷II:Design,FabricationandTesting,SourcesandDetectors,RadiometryandPhotometry(设计、制造和测试，来源和检测器，辐射测量和光度测量)，MHP出版社；第3版，ISBN-10:0071498907，ISBN-13:978-0071498906；Bass等(2009)HandbookofOptics(《光学手册》)，第3版，卷III:VisionandVisionOptics(视觉和视觉光学)，MHP出版社，ISBN-10:0071498915，ISBN-13:978-0071498913；Bass等(2009)HandbookofOptics(《光学手册》)，第3版，卷IV：OpticalPropertiesofMaterials,NonlinearOptics,QuantumOptics(材料的光学属性，非线性光学、量子光学)，MHP出版社，第3版，ISBN-10:0071498923，ISBN-13:978-0071498920；Bass等(2009)HandbookofOptics(《光学手册》)，第3版，卷V：AtmosphericOptics,Modulators,FiberOptics,X-RayandNeutronOptics(大气光学、调节剂、光纤、X-射线和中子光学)，MHP出版社；第3版，ISBN-10:0071633138，ISBN-13:978-0071633130；以及Gupta和Ballato(2006)TheHandbookofPhotonics(《光子手册》)，第2版，CRC出版社，第2版，ISBN-10:0849330955，ISBN-13:978-0849330957。典型的光学系统组件包含任何下列组件：激发光源、弧光灯、汞弧光灯、LED、透镜、光学过滤器、棱镜、相机、光检测器、CMOS相机和/或CCD阵列。在一个理想的实施方式中，使用落射荧光检测系统。该装置也可以包含或联接至阵列读取模块上，该模块使阵列中信号的位置与待检测的核酸相关联。

在本发明的移动基材实施方式的内容中，在某些方面，反应容器可以直接联接到检测通道，例如，在集成式微流体通道系统内，或通过扩增混合物和检测通道之间的合适流体界面。或者，可以在检测通道上提供流体界面例如传统流式细胞仪中存在的流体界面，以从扩增反应混合物中采样。该检测通道通常设置成其尺寸在给定时间基本上仅允许单个珠穿过通道。该检测通道通常包含检测窗，该检测窗允许对珠的激发，并且收集从珠发出的荧光信号。在许多情况下，采用熔融石英或玻璃毛细管或其他透明微流体通道作为检测通道。

本发明的光学检测系统通常包含能够递送一种或多种激发波长的激发光的一种或多种激发光源。也包含了设置为收集从检测通道发出的光并且从荧光信号过滤激发光的光学系统。该光学系统也通常包含其他分离元件，用于传送荧光信号，以及用于将珠发出的荧光信号成分与捕获探针发出的信号成分分开。

图4提供了示例性总体检测系统、系统400的示意图。如图所示，该系统包含第一和第二激发光源，诸如激光402和404，其各自提供不同波长的激发光。或者，可以使用单个宽光谱光源或多个窄光谱光源以在一个或多个合适波长范围内递送激发光以激发样品中的可检测标记物，例如，与珠相关联的那些和与带标记的探针相关联的那些。

实线箭头显示的来自各激光的激发光束被导向检测通道408，例如，通过使用定向光学器件(如分色镜406)进行所述导向。通过收集光学器件例如物镜408收集检测通道412中珠410发出的光。然后使收集的光通过滤镜414，该滤镜被设置以使虚线箭头所示的发出的荧光通过，但排除收集的激发辐射。收集的荧光包括第一发射光谱处由捕获探针上的标记物发出的荧光，以及一种或多种(取决于珠中所用标记物的数量)不同发射光谱处由珠标记物信号发出的荧光信号。收集的荧光然后通过分色镜416，该分色镜将来自捕获探针的荧光反射到第一检测器420。然后，使来自珠的剩余荧光信号经历进一步的分离，该分离通过使信号通过第二分色镜418来进行，第二分色镜将第一珠信号组分反射到第二检测器422，并且使第二珠信号组分通过到达第三检测器424。这些检测器通常联接至合适的处理器或计算机以存储与所检测的珠相关联的信号数据，并分析信号数据以确定珠的特性，并由此确定捕获探针和相关靶核酸序列的特性。另外，在进行时程实验时，如在整体扩增反应中一轮或多轮扩增循环后对珠取样，所述处理器或计算机可以包含程序控制来定量信号数据和起始靶序列拷贝数量。

本发明的装置或系统可以包含或可操作地偶联有系统指令，例如收录在计算机或计算机可读介质中的系统指令。这些指令可以控制该装置或系统的任何方面，例如，将信号强度的一个或多个测量值与由热调节模块实施的数个扩增循环相关联，以测定由装置检测到的靶核酸的浓度。

系统可以包含可操作地偶联至其他装置组件的计算机，例如，通过合适的配线或通过无线连接。该计算机可以包含，例如：由热调节模块控制热循环的指令(例如使用上述反馈控制)，和/或指定何时由光学系统拍摄或观察图片的指令。该计算机可以接收图像信息或将图像信息转化成数字信息和/或信号强度与时间的关系曲线，测定由该装置分析的靶核酸的浓度等。该计算机可以包含用于使信号强度标准化来解决背景的指令，例如就阵列的一个或多个区域检测局部背景，并通过针对所述背景校正来使阵列信号强度测量值标准化。相似地，该计算机可以包含通过对阵列捕获核酸点样上的差异、或对阵列不同区域的视野不均进行校正，来使信号强度标准化的指令。

如下所述通过实验示范本发明的方法：

在一个实验中，所有引物和探针序列都订购自IDT公司(爱荷华州科拉尔维尔市)并经冻干。然后使其在水中重悬至储液浓度(100uM-200uM)并且用于制备PCR反应的引物/探针储液。将NVSPCR缓冲液与引物和探针合并以制备PCR主混物。

通过Array-Itspotbot2(加利福尼亚州桑尼维尔)用传统微阵列点样技术在官能化表面(由官能化聚合物被覆的COP基材)上点样。已点样的载玻片在75％湿度下孵育8-15小时，然后用DI水淋洗并用氩气干燥。带标记的捕获探针在50mM的pH8.5点样缓冲液中以100nM-50uM范围的多个浓度点样，产生信号强度的范围。

使用双侧压敏粘合剂垫圈、聚碳酸酯盖和任选的透明密封在官能化、阵列的表面之上构建基于芯片的反应腔室。反应腔室的总体积为约30uL，其高度为150um。

向PCR主混物中加入已知浓度的靶序列并将所得的溶液加载到反应容器中。对容器进行密封并且如图3所示将其装载到线路板热循环仪上。

靶序列来自质粒储液中或者包括这些扩增子储液的之前反应中所得的扩增子。在NanoDrop2000仪器(马萨诸塞州沃瑟姆市的赛默飞世尔科技公司)上使用UV-Vis光谱定量所有的靶标分子。

热循环条件包含在95℃下85秒的热起始步骤，之后是40轮循环，每轮的解链和延伸分别为5秒和30秒。在延伸步骤末尾处收集表面的图像。计算各试验中的斑点的平均像素强度并且针对循环数绘制曲线以产生实时PCR曲线。对于10重反应，对所有试验都试验250nM探针/150nM引物的浓度。

图5显示在对10个不同靶标特异的所有引物和探针存在的情况下MS2靶标的10000个拷贝的扩增结果。

图6显示使用本发明的试验对MS2靶标浓度进行滴定的结果。

使用FluA/H3靶序列的约100万个拷贝进行类似的实验。在与靶序列互补的标准探针存在的情况下在反应容器内进行扩增反应，所述反应容器包含使用与Taqman探针互补的未标记捕获探针点样的阵列。图7显示多个扩增循环期间阵列表面荧光倒数(inversefluorescence)的曲线图。如图7所示，随着扩增循环的增加，荧光减少。

说明本发明方法的多个方面的另一个实验涉及包含痘病毒的样品的试验。在这类实验中，设计了多个靶探针和扩增引物以用于本发明的方法和装置。作为天花致病物的天花病毒是痘病毒科和正痘病毒属的成员，其还包括人病原体痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒和若干其他相关哺乳动物病毒。天花病毒可以有两种形式——导致致死率为30-40％的重症疾病的重型天花(Variolamajor)和致死率小于1％的轻型天花(Variolaminor)。参见例如，Harrison等，PNAS101:11178-92(2004)。

已经描述了若干基于PCR的实验，用于检测天花病毒或正痘病毒属的其他成员。然而，许多这类试验似乎缺少其声称具有的特异性或普遍性。例如，大部分这类现有试验靶向血凝素(HA)基因(参见例如，Ropp,S.L.,等，“PCRStrategyforIdentificationandDifferentiationofSmallpoxandOtherOrthopoxviruses(用于鉴定和区分天花病毒和其他正痘病毒的PCR策略)”Microbiology33:2069-2076(1995)；Ibrahim,M.S.等，“Real-TimePCRAssayToDetectSmallpoxVirus(检测天花病毒的实时PCR试验)”JournalofClinicalMicrobiology41:3835-3839(2003)；Aitichou,M.等，“Dual-probereal-timePCRassayfordetectionofvariolaorotherorthopoxviruseswithdriedreagents(用于使用干燥试剂检测天花病毒和其他正痘病毒的双探针实时PCR试验)”JournalofVirologicalMethods153:190-5(2008)；Kulesh,D.A.等，“Smallpoxandpan-OrthopoxVirusDetectionbyReal-Time3J-MinorGrooveBinderTaqManAssaysontheRocheLightCyclerandtheCepheidSmartCyclerPlatforms(通过罗氏LightCycler和CepheidSmartCycler平台上的实时3J-小沟结合剂TaqMan试验进行天花病毒和泛正痘病毒检测)”JournalofClinicalMicrobiology42:601-609(2004)；以及He,J.等，“SimultaneousDetectionofCDCCategory“A”DNAandRNABioterrorismAgentsbyUseofMultiplexPCR&RT-PCREnzymeHybridizationAssays(使用多重PCR和RT-PCR酶杂交试验同时检测CDC“A”类DNA和RNA生物战剂)”Viruses1:441-459(2009))。此外，虽然已注意到之前的试验中使用的HA基因在各痘病毒之间具有一定差异(参见例如Nitsche,A.,等，“DetectionofOrthopoxvirusDNAbyReal-TimePCRandIdentificationofVariolaVirusDNAbyMeltingAnalysis(通过实时PCR检测正痘病毒DNA并通过解链分析鉴定天花病毒DNA)”JournalofClinicalMicrobiology42:1207-1213(2004))，但可能在特定病毒之间存在差异的小缺失和SNP通常在各天花病毒毒株本身之间并不保守，使得该靶标难以进行试验设计。参见例如US20040029105，其涉及使用HA作为扩增靶标检测天花病毒。还描述了靶向其他区域的试验(参见例如Kulesh,D.A.,同上；Shchelkunov,S.N.,等，“MultiplexPCRdetectionandspeciesdifferentiationoforthopoxvirusespathogenictohumans(使人致病的正痘病毒的多重PCR检测和物种分化)”MolecularandCellularProbes19:1-8(2005)；Fedele,C.G.,等，“AUseofinternallycontrolledreal-timegenomeamplificationfordetectionofvariolavirusandotherorthopoxvirusesinfectinghumans(使用内部控制的实时基因组扩增以检测感染人的天花病毒和其他正痘病毒)”JournalofClinicalMicrobiology44:4464-70(2006)；Scaramozzino,N.等，“Real-timePCRtoidentifyvariolavirusorotherhumanpathogenicorthopoxviruses(用于鉴定天花病毒或其他人致病性正痘病毒的实时PCR)”ClinicalChemistry53:606-13(2007)；以及Loveless,B.M.等，“DifferentiationofVariolamajorandVariolaminorvariantsbyMGB-Eclipseprobemeltcurvesandgenotypinganalysis(通过MGB-Eclipse探针解链曲线和基因分型分析区分重型天花和轻型天花变体)”MolecularandCellularProbes23:166-170(2009))。

一种轻型天花毒株和多种重型天花毒株的基因组序列可获自NCBInr数据库，如同痘病毒科的许多其他成员的基因组序列那样，从而可以计算机模拟搜索它们基因组内的独特区域。然而，即使如此，由于高度的基因组序列类似性，难以通过先前的传统试验形式对这些病毒进行示差检测。

在本实验中，使用了Insignia程序(可于URL“insignia.cbcb.umd.edu”在线获取)以鉴定天花病毒(包括重型和轻型)的独特基因组区域。这些区域显示与其他痘病毒之间的差异足以用于设计本发明的特异性检测天花病毒的核酸导向试验(即特异性针对天花病毒的试验，其不会对痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、骆驼痘病毒等产生假阳性检测)。

为鉴定天花病毒基因组的独特区域，设置了Insignia参数以鉴定所有重型和轻型天花基因组中包含、但不存在于任何其他基因组的序列(从而排除了所有其他已测序的痘病毒和所有其他已测序的生物体)。还设置了特征链长度的Insignia参数，其显示独特区域的长度(以核苷酸计)。对于许多生物体，将特征链长度设置为100个核苷酸或更多通常鉴定出多个独特区域。在这类情况下，整个区域可用作核酸导向试验的靶标(即正向扩增引物、反向扩增引物和靶探针都可由靶生物体特有的序列构成)。对于本实验，在天花特异性Insignia检索中，仅小于等于39个核苷酸的特征链长度生成了独特区域。这可能是因为各痘病毒之间高度的序列保守性。

在本实验中，当特征链长度被设置为大于等于35个核苷酸时，生成了14个独特区域(表1；基因组编号对应于天花重型病毒Bangledesh-1975)。用这些区域针对NCBInr数据库进行BLAST检索以检测独特性并显示最接近的序列匹配。14个区域中的12个与最接近的击中序列(hitsequence)之间仅有1-3个核苷酸的差异，该差异可能不足以进行天花特异性试验，而两个区域(表1中的区域7和8)与最接近的匹配序列之间显示了较高程度的差异。因此，将这两个区域用于进行下文进一步描述的试验。

表1显示了天花病毒(包括重型和轻型)特异性区域的Insignia结果。特征链长度被设置为大于等于35个核苷酸。

表1

鉴定出的第一个感兴趣独特区域(表1中的区域7)对应于天花重型病毒Bangledesh-1975的核苷酸970-1007。进一步分析围绕该38个核苷酸序列的较大区域后，发现只有来自核苷酸977-1007的31个核苷酸延伸在所有测序的天花病毒毒株中保守。在该31个核苷酸的区域中，5个核苷酸与最接近的牛痘病毒序列不匹配。通过将引物1置于该序列中(参见表2)来将该差异应用于试验VAR-1(对于扩增引物和靶探针序列，参见表7)。该试验的引物2利用了2个其他SNP，而探针与若干痘病毒之间具有精确的同源性。

表2显示了Insignia鉴定的区域7周围的120个碱基对的区域(其对应于天花重型病毒Bangledesh-1975的977-1095的119个碱基对的区域)。用下划线表示区域7中保守的31个核苷酸。VAR-1的靶探针和扩增引物P1和P2以粗斜体表示。天花病毒和其他基因组之间的SNP在黑盒中着重显示。天花病毒中的SNP(在大于1个基因组序列中)在灰盒中着重显示，且在天花试验设计中避免(且通常应如此)。

表2

鉴定的第二个独特区域(表1中的区域8)对应于天花重型病毒Bangledesh-1975的核苷酸161598-161635。对该序列针对NCBInr数据库进行BLAST检索，在该区域中鉴定到了3个SNP。更有趣的是，在分析围绕该序列的较大区域时，发现在最接近的相关基因组(一些牛痘病毒毒株的基因组)中，该序列的上游和下游都存在基因组重排(参见下文表3)。这些重排允许使用跨特定区域的扩增引物或靶探针进行试验设计，所述区域在天花病毒中毗连但在其他基因组中不毗连(连接区域)。与仅依赖SNP进行区分的试验相比，这类试验可以提供甚至更高的特异性。

表3显示了Insignia鉴定的区域8周围的300个碱基对的区域。区域8用下划线表示。天花病毒和其他基因组之间的SNP在黑盒中着重显示。天花病毒中的SNP(在大于1个基因组序列中)在灰盒中着重显示，其在天花试验设计中避免(并应如此)。序列下方#符号表示的序列在最接近的基因组(一些牛痘基因组)中重复并形成上游连接。下游连接(也存在于牛痘基因组)位于序列下方^符号表示的三个核苷酸之间。

表3

设计了三个试验以利用这些连接区域：VAR-2、VAR-3和VAR-4(对于扩增引物和靶探针序列，同样参见表7)。

在VAR-2试验(表4)中，P1扩增引物跨Insignia鉴定的区域8上游的连接区域，且P2扩增引物跨该区域下游的连接区域。探针位于Insignia鉴定的区域8本身内并利用了该区域中的3个SNP。表4显示了相对位置天花特异性试验VAR-2。扩增引物序列P1和P2由序列下方的星号表示，而探针区域由序列下方的加号表示。其他形式如表3所用，不同之处是为清晰起见省略黑色着重显示的SNP。

表4

VAR-3试验(表5)具有跨上游连接区域的探针，其中P1和P2扩增引物各自利用1个SNP，其位于连接的不同侧(在牛痘研究组中相隔约300个碱基对，序列在那些基因组中反转)。表5显示了天花特异性试验VAR-3。P1和P2扩增引物由序列下方的星号表示，而探针区域由序列下方的加号表示。其他形式如表3所用，不同之处是为清晰起见省略了黑色着重显示的SNP。

表5

VAR-4试验(表6)中由扩增引物扩增的序列区域(120个碱基对)跨下游连接，其中P1与来自VAR-3区域(118bp)的P2重叠(以相反方向)，利用1个SNP，探针跨下游区域，且P2利用了一个SNP且位于连接的另一侧(在最接近的基因组中距离约7kb且反转)。表6显示了天花特异性试验VAR-4。P1和P2由序列下方的星号表示，而探针区域由序列下方的加号表示。其他形式如表3所用，不同之处是为清晰起见省略了黑色着重显示的SNP。

表6

表7

表7显示了天花病毒特异性试验的引物/探针序列和特征。

尽管已经出于阐述和理解的目的在某种程度上详细地描述了本发明，但是本领域技术人员通过阅读本说明书可清楚地了解，可在不背离本发明真实范围的情况下进行各种形式和细节的变化。例如，上述所有的技术和设备都可以用于各种组合。本申请中提到的所有公开出版物、专利、专利申请和/或文献都通过引用全文纳入本文中，相当于所述各单独的公开出版物、专利、专利申请和/或文献都独立且单独地通过引用纳入本文用于所有目的。

Claims (19)

1.一种检测样品中是否存在至少一种第一靶核酸序列的方法，所述方法包括：

对所述样品进行扩增反应，所述扩增反应能够在至少一种第一核酸探针组存在的情况下扩增所述靶核酸序列，所述第一核酸探针组包含：

捕获探针，其包含与其连接的荧光团；

靶标特异性核酸探针，其与所述靶核酸序列和所述捕获探针的至少一部分互补，且包含与其连接的淬灭剂，从而在所述靶标特异性核酸探针与所述捕获探针杂交时，所述淬灭剂淬灭来自所述荧光团的荧光；以及

在一个或多个聚合酶链式反应循环后检测来自所述样品的荧光，荧光的增加表示存在所述靶核酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，所述捕获探针与基材表面相连。

3.如权利要求1所述的方法，所述扩增反应包含PCR反应。

4.如权利要求3所述的方法，所述PCR反应使用具有外切核酸酶活性的聚合酶。

5.如权利要求4所述的方法，所述PCR反应能够扩增多个不同靶核酸序列并在多个不同核酸探针组存在的情况下进行，不同的探针组各自包含不同的捕获探针和不同的靶标特异性探针，所述捕获探针具有与其相连的荧光团，所述靶标特异性探针各自与不同的捕获探针和不同的多个靶核酸序列之一互补且具有与其相连的淬灭剂，从而在各靶标特异性核酸探针与互补捕获探针杂交时，所述淬灭剂淬灭来自所述荧光团的荧光。

6.如权利要求5所述的方法，所述多个不同探针组中的捕获探针各自固定在基材上可检测的不同位置处。

7.如权利要求1所述的方法，所述至少一种第一靶核酸序列包含天花病毒序列。

8.如权利要求7所述的方法，所述靶标特异性核酸探针包含以下一种或多种探针：VAR-1探针、VAR-2探针、VAR-3探针或VAR-4探针。

9.如权利要求1所述的方法，其中，使用以下一种或多种引物扩增所述靶核酸序列：VAR-1引物1、VAR-1引物2、VAR-2引物1、VAR-2引物2；VAR-3引物1、VAR-3引物2、VAR-4引物1或VAR-4引物2。

10.一种反应混合物，其包含：

含有感兴趣的靶核酸的样品，

用于扩增所述感兴趣的靶核酸序列的扩增试剂；以及

至少一种第一探针组，所述第一探针组包含捕获探针和靶标特异性核酸探针，所述捕获探针包含与其相连的荧光团，所述靶标特异性核酸探针与所述靶核酸序列和所述捕获探针的至少一部分互补且具有与其相连的淬灭剂，从而在所述靶标特异性探针与所述捕获探针杂交时，所述淬灭剂淬灭来自所述荧光团的荧光。

11.如权利要求10所述的混合物，所述靶标特异性核酸探针包含以下一种或多种探针：VAR-1探针、VAR-2探针、VAR-3探针或VAR-4探针。

12.如权利要求11所述的混合物，所述混合物还包含以下一种或多种扩增引物：VAR-1引物1、VAR-1引物2、VAR-2引物1、VAR-2引物2；VAR-3引物1、VAR-3引物2、VAR-4引物1或VAR-4引物2。

13.一种反应腔室，其包含：

反应区域，其中置有：

含有感兴趣的靶核酸的样品，

用于扩增所述感兴趣的靶核酸序列的扩增试剂；以及

至少一种第一探针组，所述第一探针组包含捕获探针和靶标特异性核酸探针，所述捕获探针包含与其相连的荧光团，所述靶标特异性核酸探针与所述靶核酸序列和所述捕获探针的至少一部分互补且具有与其相连的淬灭剂，从而在所述靶标特异性探针与所述捕获探针杂交时，所述淬灭剂淬灭来自所述荧光团的荧光。

14.如权利要求13所述的反应腔室，所述捕获探针固定于所述反应腔室的内表面上。

15.如权利要求13所述的反应腔室，其中，多个不同捕获探针固定于所述反应腔室内表面上的阵列中，各不同的捕获探针固定在离散的位置。

16.一种检测样品中是否存在至少一种第一靶核酸序列的方法，所述方法包括：

对所述样品进行扩增反应，所述扩增反应能够在至少一种第一核酸探针组存在的情况下扩增所述靶核酸序列，所述第一核酸探针组包含：

靶标特异性核酸探针和捕获探针，所述靶标特异性核酸探针具有与其相连的荧光标记并与所述靶核酸序列的至少一部分互补，所述捕获探针与固体支持物相连且与所述靶标特异性探针的至少一部分互补；以及

在一个或多个聚合酶链式反应循环后检测来自所述固体支持物的荧光，荧光的减少表示存在所述靶核酸序列。

17.如权利要求16所述的方法，所述至少一种第一靶核酸序列包含天花病毒序列。

18.如权利要求17所述的方法，所述靶标特异性核酸探针包含以下一种或多种探针：VAR-1探针、VAR-2探针、VAR-3探针或VAR-4探针。

19.如权利要求16所述的方法，其中，使用以下一种或多种引物扩增所述靶核酸序列：VAR-1引物1、VAR-1引物2、VAR-2引物1、VAR-2引物2；VAR-3引物1、VAR-3引物2、VAR-4引物1或VAR-4引物2。