CN117487896A - 拮抗剂以及含有其的pcr预混液、pcr检测试剂盒和pcr检测方法 - Google Patents

拮抗剂以及含有其的pcr预混液、pcr检测试剂盒和pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物及环境检测领域，具体涉及一种拮抗剂以及含有其的PCR预混液、PCR检测试剂盒和PCR检测方法。该拮抗剂包括含量比例为（5~60mg）：（10~100mg）：（0.1~1mmol）的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂。本申请提供合适配方的拮抗剂，在对水体中核酸样品检测的过程中，通过在PCR反应体系中引入该拮抗剂，能够有效缓解提取自水体的核酸样品中各类抑制剂对于实时荧光定量PCR反应的影响，避免抑制条件下定量值偏低的问题，能够提升检测的精密度及灵敏性。

Description

拮抗剂以及含有其的PCR预混液、PCR检测试剂盒和PCR检测 方法
技术领域
本申请涉及生物及环境检测领域，具体涉及一种拮抗剂以及含有其的PCR预混液、PCR检测试剂盒和PCR检测方法。
背景技术
水体（例如污水）病毒监测已经在全世界范围内成为了一种重要公共卫生辅助管理手段，例如用于新型冠状病毒感染规模的预警与预测工作。研究证实，同样可以通过水源病毒监测来开展针对诺如病毒、甲型流感病毒、猴痘病毒等其他病毒的人群尺度的感染规模预警预测工作。当前，开展多病原体协同监测，已经成为了水体监测发展的新方向及必然趋势。
然而，相比于临床样品，由于水体样品中含有大量包括腐殖酸、植源性多糖、植物多酚等在内的PCR抑制剂，且在核酸提取的过程中，部分抑制剂由于结构与核酸具有类似性，无法被彻底清除。这使得针对水体样品进行荧光定量PCR检测的过程中，不可避免地会受到PCR抑制剂的影响。在抑制剂存在的条件下，会导致检测的样品CT值后延，造成病毒浓度的低估，同时也会导致荧光增量降低，造成低浓度样品检出率下降，出现假阴性的问题。然而，目前市售的核酸检测试剂盒在设计的过程中尚未考虑到含PCR抑制剂样品的检测问题，导致检测水体病毒浓度的定量准确性受到影响。
综上，目前针对水体病毒监测，尚缺乏一种可以有效拮抗水体样品中PCR抑制剂影响的核酸检测产品。
发明内容
基于此，本申请的一个或者多个实施例提供一种能够有效缓解水体样品中PCR抑制剂影响的拮抗剂，同时提供一种包含对应拮抗剂的核酸检测试剂盒及其对应的水体病毒检测及有效性判定方法。
本申请的一个或者多个实施例提供一种拮抗剂，所述拮抗剂包括含量比例为（5~60mg）：（10~100mg）：（0.1~1mmol）的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂。
在本申请的一些具体实施方式中，所述拮抗剂满足如下（1）至（3）所示条件中的一个或者多个：
（1）所述反转录强化剂包括gp32蛋白、E.Coli SSB蛋白和Taq SSB蛋白中的一种或者多种；
（2）所述酶保护剂包括牛血清蛋白、牛血清白蛋白组分V和重组白蛋白中的一种或者多种；以及，
（3）所述金属离子螯合剂包括乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中的一种或者多种。
本申请的一个或者多个实施例还提供一种PCR预混液，所述PCR预混液包括拮抗剂以及PCR扩增试剂，所述拮抗剂包括反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂，所述的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂在包含所述PCR预混液的PCR反应体系中的浓度分别为5~60mg/L、10~100mg/L和0.1mmol/L~1mmol/L。
在本申请的一些具体实施方式中，所述拮抗剂满足如下（1）至（3）所示条件中的一个或者多个：
（1）所述反转录强化剂包括gp32蛋白、E.Coli SSB蛋白和Taq SSB蛋白中的一种或者多种；
（2）所述酶保护剂包括牛血清蛋白、牛血清白蛋白组分V和重组白蛋白中的一种或者多种；以及，
（3）所述金属离子螯合剂包括乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中的一种或者多种。
在本申请的一些具体实施方式中，所述PCR扩增试剂包括酶和PCR反应液。
本申请的一个或者多个实施例又提供一种PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒包括：
1）所述的拮抗剂，以及，上述定义的PCR扩增试剂；或者，
2）所述的PCR预混液。
在本申请的一些具体实施方式中，所述PCR检测试剂盒还包括检测目标核酸的引物对和探针、阴性对照标准品、阳性对照标准品、核酸稀释液以及核酸提取试剂中的一种或者多种。
在本申请的一些具体实施方式中，所述PCR检测试剂盒还包括辅助质控核酸片段以及检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针，所述辅助质控核酸片段不属于待测样本污染物所含的核酸。
本申请的一个或者多个实施例还提供一种目标核酸的PCR检测方法，所述PCR检测方法包括：
对待测样本的核酸进行PCR扩增，根据所得扩增结果确定所述待测样本的核酸中含有目标核酸的情况；
PCR扩增的PCR反应体系添加有所述的拮抗剂，或者使用所述的PCR预混液；
或者PCR扩增采用所述的PCR检测试剂盒。
在本申请的一些具体实施方式中，所述PCR检测方法还包括：在所述阳性对照标准品和所述待测样本的PCR反应体系中添加所述辅助质控核酸片段，并采用检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针进行PCR扩增，根据所得扩增结果辅助判断所述待测样本的核酸中含有目标核酸的情况。
在本申请的一些具体实施方式中，所述PCR检测方法对扩增结果的判读标准如下：
a）所述阴性对照标准品对应有扩增，则需重新检测；
b）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应有扩增，所述目标核酸对应无扩增，则需重新检测；
c）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应有扩增且CT≤38，则所述待测样本判定为阳性，结合标准曲线定量；
d）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应有扩增但CT>38，扩增曲线为S型且在对数坐标下存在大于两个数量级的线性增长期，则所述待测样本判定为疑似阳性，需再次复核检验，若复核检验的结果仍为疑似阳性或阳性则判定为阳性并结合标准曲线定量，若复核检验的结果为阴性则判定为阴性；
e）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应无扩增，则所述待测样本判定为阴性；
f）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应有扩增，所述目标核酸对应有扩增，则需重新检测，直至所述辅助质控核酸片段不再出现扩增后再参照c）项、d）项、e）项判读标准进行判读。
在本申请的一些具体实施方式中，所述待测样本包括水样。
与传统技术相比，本申请实施例的有益效果包括：
本申请提供合适配方的拮抗剂，在对水体中核酸样品检测的过程中，通过在PCR反应体系中引入该抗剂，能够有效缓解提取自水体的核酸样品中各类抑制剂对于实时荧光定量PCR反应的影响，避免抑制条件下定量值偏低的问题，能够提升检测的精密度及灵敏性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为示例3中新型冠状病毒E基因的反转录实时荧光定量PCR标准曲线；
图2为示例3中诺如病毒GII型ORF1基因的反转录实时荧光定量PCR标准曲线；
图3为示例3中甲型流感病毒M基因的反转录实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本申请中，%(w/w)与wt%均表示重量百分比，%(v/v)指体积百分比，%(w/v)指质量体积百分数。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请实施例的第一方面
本申请的一个或者多个实施例提供一种拮抗剂，所述拮抗剂包括含量比例为（5~60mg）：（10~100mg）：（0.1~1mmol）的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂。该拮抗剂能够有效拮抗核酸样品中包括腐殖酸、植源性多糖、多酚、高价金属离子等在内的多种PCR抑制剂，且不会影响不含抑制剂样品的扩增效果及定量值。
应当理解的是，本申请的拮抗剂，其可以是现配型，也可以是即用型的。如果是现配型的，其所含成分是单独包装的或者部分混合包装，在使用的过程中，可以先配置成合适浓度的储备液，用该储备液进行PCR检测的过程中，添加合适用量，使各成分在PCR反应体系中的终浓度达到相应的工作浓度即可。
应当理解的是，本申请对拮抗剂的剂型不做特别限定，可以是液剂，也可是粉剂。
本申请实施例中，反转录强化剂能在一步反转录荧光定量PCR的过程中提高cDNA的产率，从而避免样品中的抑制剂干扰cDNA合成。反转录强化剂包括但不限于：gp32蛋白、E.Coli SSB蛋白、Taq SSB蛋白或其他单链结合蛋白，可以选用一种，也可以选用多种。在拮抗剂为液剂的条件下，所述反转录强化剂在拮抗剂中的储备浓度为0.5~20μg/μL（例如为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/μL）。在使用的过程中，所述反转录强化剂在最终PCR体系中的工作浓度为5~60 ng/μL（例如为5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60 ng/μL）。
本申请实施例中，酶保护剂作为牺牲剂消耗可能破坏蛋白功能的抑制剂，保护PCR体系中的酶（Taq酶或反转录酶）。酶保护剂包括但不限于：牛血清蛋白、牛血清白蛋白组分V、重组白蛋白，可以选用一种，也可以选用多种。在拮抗剂为液剂的条件下，酶保护剂的储备浓度为5~50μg/μL（例如为5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50μg/μL）。在使用的过程中，酶保护剂在最终PCR体系中的工作浓度为10~100 ng/μL（例如为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 ng/μL）。
本申请实施例中，金属离子螯合剂螯合样品中可能残留的铝、铁、钙等高价阳离子，避免其在PCR反应时与Taq酶结合。金属离子螯合剂包括但不限于：乙二胺四乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸，可以选用一种，也可以选用多种。在拮抗剂为液剂的条件下，所述金属离子络合剂在拮抗剂中的储备浓度为10~50 mmol/L（例如为10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50 mmol/L）。更进一步地，金属离子络合剂在最终PCR体系中的工作浓度为0.1~1 mmol/L（例如为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mmol/L）。
在其中一些示例中，所述拮抗剂包括0.5~20μg/μL反转录强化剂、5~50μg/μL酶保护剂和10~50 mmol/L金属离子螯合剂。
在其中一些示例中，所述拮抗剂还包括冻存保护剂，保证上述反转录强化剂及酶保护剂在冷冻条件下可保持活性。所述冻存保护剂包括但不限于：甘油、二甲基亚砜、二硫苏糖醇、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，可以选用一种，也可以选用多种。可选地，所述甘油在所述拮抗剂中的浓度为20~70%(w/w)（例如为20%、22.5%、25%、27.5%、30%、32.5%、35%、37.5%、40%、42.5%、45%、47.5%、50%、52.5%、55%、57.5%、60%）。可选地，所述二甲基亚砜在所述拮抗剂中的浓度为1~5%(w/w)（例如为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%）。所述二硫苏糖醇在所述拮抗剂中的浓度为0.1~0.5%(w/w)（例如为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）。所述氯化钠在所述拮抗剂中的浓度为50~300 mmol/L（50、75、100、12.5、150、175、200、225、250、275、300 mmol/L）。所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在所述拮抗剂中的浓度为10~50 mmol/L（例如为10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L）。
可选地，所述拮抗剂包括0.5~20μg/μL反转录强化剂、5~50μg/μL酶保护剂、10~50mmol/L金属离子螯合剂、20~70%(w/w)甘油、0.1~0.5%(w/w) 二硫苏糖醇、50~300 mmol/L氯化钠和10~50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
本申请实施例的第二方面
本申请实施例提供一种PCR预混液，所述PCR预混液包括拮抗剂以及PCR扩增试剂，所述拮抗剂包括反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂，所述的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂在包含所述PCR预混液的PCR反应体系中的浓度分别为5~60mg/L、10~100mg/L和0.1mmol/L~1mmol/L。
本申请中，“PCR预混液”指PCR反应体系中模板、引物、探针以外的PCR反应所需的混合物，其包括酶、dNTP、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4、Tris-HCl、DMSO、甜菜碱、牛血清蛋白、Tween-20等PCR反应所需的成分。
应当理解是，所述PCR预混液可以是即用型的，也可以是现配型的PCR预混液包括独立包装的拮抗剂和PCR扩增试剂，使用的过程中，再将拮抗剂和PCR扩增试剂混合。如第一方面中提到的，拮抗剂中的各种成分也可以是独立包装的。PCR扩增试剂所含的各成分也可以分开包装的，例如包括独立包装的酶（例如反转录酶、热封闭Taq酶、化学封闭Taq酶、UNG酶等）和PCR反应液（包括dNTP、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4、Tris-HCl、DMSO、甜菜碱、牛血清蛋白、Tween-20等PCR反应所需的成分）。在其中一些示例中，所述试剂盒包括，高浓度酶储备液，其中包含反转录酶和热封闭Taq酶。进一步地，高浓度酶储备液中各个功能酶的浓度为其工作浓度的20~30倍（例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30倍）。进一步地，PCR反应液中各组分浓度为其工作浓度2~4倍（例如为2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4倍）。
本申请实施例的第三方面
本申请实施例提供一种PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括：
1）所述的拮抗剂，以及，杉树定义的PCR扩增试剂；或者，
2）所述的PCR预混液。
在其中一些示例中，所述PCR检测试剂盒还包括检测目标核酸的引物对和探针、阴性对照标准品、阳性对照标准品、核酸稀释液、核酸提取试剂等。
本申请对检测目标核酸的引物对和探针不做特别限定，可以是检测病毒核酸的引物对和探针，例如是检测水样中可能存在的病毒的核酸的引物对和探针，包括但不限于检测辣椒轻斑驳病毒、新型冠状病毒、诺如病毒GII型、甲型流感病毒的核酸的引物对和探针。
在其中一些示例中，所述PCR检测试剂盒还包括辅助质控核酸片段以及检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针，所述辅助质控核酸片段不属于待测样本污染物所含的核酸。
由于水体样品中的病毒浓度普遍较低，尽管经过富集浓缩后，部分样品的CT值仍然较高，处于检出限附近。而在进行核酸检测与定量时，需要使用具有较高浓度待检测目标片段的标准品或阳性对照品，存在由于标准品或阳性对照品由于实验人员操作不当而导致污染的风险。在这种情况下，污染的标准品或阳性对照品会对于检测水体样品中本底值极低的病毒浓度造成较大影响，出现大量无法判定的假阳性现象。然而，目前市售的核酸检测试剂盒在设置阴阳性判定标准时尚未考虑到这一问题及相应的规避策略。因此，目前缺少一种可以有效排除标准品或对照品污染的样品检测有效性判定标。本申请通过辅助质控核酸片段的引入，可以指示在整个操作过程中是否存在标准品污染，从而辅助判断较低临界检出浓度的样品的阴/阳性判定，有助于及时指正假阳性样品，提供更加完善的质量控制。
本申请中的辅助质控核酸片段，可以是独立包装的，也可以是混合在其他试剂中的，例如混合于阳性对照标准品中、混合于核酸稀释液中，可以以106 copies/mL~108copies/mL的浓度混合于阳性对照标准品或者核酸稀释液中。本申请对辅助质控核酸片段不做特别限定，可以为人工合成的已灭绝生物（例如天花病毒）的核酸片段或其他的不属于待测品污染物的核酸。
本申请试剂盒中，检测目标核酸的引物对和探针、检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针，均可以以引物-探针储备液的形式存在所述试剂盒，各引物对、各探针在引物-探针储备液中的储备浓度为10~100 μmol/L（例如为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100μmol/L），在一些实施例中，各引物的储备浓度为20 μmol/L，各探针的储备浓度为10 μmol/L。更进一步地，各引物和各探针在最终PCR体系中的工作浓度为100~1000 nmol/L（例如为100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 nmol/L），在一些实施例中，各引物的工作浓度为400nmol/L，各探针的储备浓度为200 nmol/L。
本申请实施例的第四方面
本申请实施例提供一种目标核酸的PCR检测方法，所述PCR检测方法包括：
对待测样本的核酸进行PCR扩增，根据所得扩增结果确定所述待测样本的核酸中含有目标核酸的情况；
PCR扩增的PCR反应体系添加有所述的拮抗剂，或者使用所述的PCR预混液；
或者PCR扩增采用所述的PCR检测试剂盒。
在其中一些示例中，所述PCR检测方法还包括：在所述阳性对照标准品和所述待测样本的PCR反应体系中添加所述辅助质控核酸片段，并采用检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针进行PCR扩增，根据所得扩增结果辅助判断所述待测样本的核酸中含有目标核酸的情况。
在其中一些示例中，所述PCR检测方法对扩增结果的判读标准如下：
a）所述阴性对照标准品对应有扩增，则需重新检测；
b）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应有扩增，所述目标核酸对应无扩增，则需重新检测；
c）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应有扩增且CT≤38，则所述待测样本判定为阳性，结合标准曲线定量；
d）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应有扩增但CT>38，扩增曲线为S型且在对数坐标下存在大于两个数量级的线性增长期，则所述待测样本判定为疑似阳性，需再次复核检验，若复核检验的结果仍为疑似阳性或阳性则判定为阳性并结合标准曲线定量，若复核检验的结果为阴性则判定为阴性；
e）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应无扩增，则所述待测样本判定为阴性；
f）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应有扩增，所述目标核酸对应有扩增，则需重新检测，直至所述辅助质控核酸片段不再出现扩增后再参照c）项、d）项、e）项判读标准进行判读。
本申请对待测样本不做特别限定，包括但不限于水样。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
1、材料
1.1拮抗剂
拮抗剂，液剂，具体成分为：2.5μg/μL gp32蛋白，5μg/μL牛血清蛋白组分V，10mmol/L乙二胺四乙酸，50%(w/w)甘油，0.5%(w/w)二硫苏糖醇，100 mmol/L 氯化钠，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
1.2引物对和探针、反应体系以及程序
试剂盒中，用于扩增和检测污水中辣椒轻斑驳病毒（特异性基因）、新型冠状病毒（E基因）、诺如病毒GII型（ORF1基因）、甲型流感病毒（M基因）的引物和探针的序列及储备浓度如表1所示；
表1、检测目标核酸的引物对和探针
表1中，用于检测辣椒轻斑驳病毒的探针5’端修饰荧光报告基团FAM，3’端修饰荧光淬灭基团MGB；用于检测新冠病毒E基因的探针5’端修饰荧光报告基团FAM，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ1；用于检测诺如病毒GII型ORF1基因的探针5’端修饰荧光报告基团ROX，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ2；用于检测甲型流感病毒M基因的探针5’端修饰荧光报告基团VIC，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ1。
试剂盒中添加至阳性对照标准品及核酸稀释液中的辅助质控核酸片段如SEQ IDNO.13所示，以含有该片段的的pUC57质粒的形式添加，浓度为108 copies/mL。SEQ IDNO.13：ATGTTCAAGCTGTTAATATCAATCTCGATAAACGTGAACAGGCTGTCGGAGCCACAGTTTCGAGACGAGGAGATTTAGAAATGTTGGGATTATTGCATGATAGAATGGTTCAGTGGCAAA。
表2、检测辅助质控核酸片段的引物对和探针
表2中，探针5’端修饰荧光报告基团CY5，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ3。同时，储备液中引物的浓度为20μmol/L，探针的浓度为10μmol/L。
试剂盒中，高浓度酶储备液为翌圣生物生产的HU Enzyme Mix，PCR反应液为翌圣生物生产的Multiplex One Step RT-qPCR Probe Buffer，试剂盒的实时荧光定量PCR反应体系如表3所示。
表3、实时荧光定量PCR反应体系
PCR反应程序如下所示。
表4、实时荧光定量PCR反应程序
为确保生物安全，各检测示例所涉及的全部实验均在生物安全P2级实验室内进行。
1.3结果判读
表5、添加外源非天然序列条件下实时荧光定量PCR反应的结果判读标准
2、检测方法
示例1：验证拮抗剂缓解水体样品PCR抑制的效果
为验证本申请开发的拮抗剂是否可以有效缓解水体样品中PCR抑制剂对于实时荧光定量PCR检测结果的影响，且拮抗剂提升无抑制剂样品的定量结果。分别再添加与不添加拮抗剂的条件下，对于提取经富集的污水样品所得的原始核酸样品（受抑制样品）及采用DEPC处理水稀释20倍后的核酸样品（不受抑制样品）进行定量分析，并通过比较CT值高低判断对于PCR抑制的缓解效果。
检测步骤包括：
1. 样品采集与富集：待测试水样取自北京市某大型再生水厂，100 mL水样经巴氏消毒灭活潜在病原微生物后，使用超滤法富集至0.5 mL。
2. 核酸提取：使用Qiagen生产的RNeasy Power Microbiome Kit提取富集样品中的核酸，特别的，为确保提取原样品中具有较为明显的PCR抑制，在核酸提取的过程中不使用IRS溶液进行抑制剂脱除。
3. 配置RT-PCR反应体系：参照表3，含拮抗剂组按照每个反应10 μL 2×PCR反应液、0.8μL 25×高浓度酶储备液、4μL引物-探针储备液、0.2μL拮抗剂、5μL 待检测核酸样品配置反应体系；不含拮抗剂组使用含50%(w/w)甘油、0.5%(w/w)二硫苏糖醇、100 mmol/L 氯化钠和20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的空白冻存保护液代替拮抗剂配置反应体系；每个样品在每个条件下均设置6个技术重复。
4. RT-PCR扩增：将PCR八联管置于实时荧光定量PCR仪上，按照表4程序进行RT-PCR反应。
5. 结果判读：依照表5判读扩增结果，各样品的辅助质控核酸片段检测结果均为未扩增，表明操作过程中未发生标准品污染现象。添加拮抗剂后受抑制样品及不受抑制样品各病毒检测的CT值如表6、表7、表8所示（CT值以均值±SD的形式展示），可以看出，对于受抑制样品，添加拮抗剂后，辣椒轻斑驳病毒、诺如病毒GII型的CT值相比于未添加条件下均出现明显下降，表明PCR抑制作用得到缓解，特别是添加拮抗剂后甲型流感病毒的6个技术重复均检出临界CT值，但在不添加拮抗剂条件下6个技术重复均未检出，表明拮抗剂可显著改善PCR抑制对于临界样品检测的影响，降低假阴性结果的发生。与此同时，对于稀释20倍后得到的不受抑制样品，辣椒轻斑驳病毒、诺如病毒GII型的CT值在是否添加拮抗剂的条件下无显著差异，表明拮抗剂的添加不会影响不受抑制样品的扩增与定量。
表6、添加拮抗剂对辣椒轻斑驳病毒检测的影响
表7、添加拮抗剂对诺如病毒GII型检测的影响
表8、添加拮抗剂对甲型流感病毒检测的影响
示例2：确定添加辅助质控核酸片段的有效性
为确保本申请中加入到阳性对照及核酸稀释液中的辅助质控核酸片段的有效性，分别对于其在污水样品中的不存在性及指示阳性对照标准品污染的准确性进行验证。具体的，选择27个再生水厂的污水进水样品验证辅助质控核酸片段是否存在于污水样品中；与此同时，通过在加样过程中人为将接触过阳性对照标准品的枪头插入加入DEPC处理水的体系中已制造人为污染样品以验证其指示阳性对照标准品污染的准确性。
检测步骤包括：
1. 样品采集与富集：待测试水样取自全国27个大型再生水厂，200 mL水样经巴氏消毒灭活潜在病原微生物后，使用超滤法法富集至0.5 mL。
2. 核酸提取：使用Qiagen生产的RNeasy Power Microbiome Kit提取富集样品中的核酸。
3. 配置RT-PCR体系：参照表3，按照每个反应10 μL 2×PCR反应液、0.8μL 25×高浓度酶储备液、4μL引物-探针储备液、0.2 μL拮抗剂、5μL待检测核酸样品、DEPC处理水或阳性对照标准品配置反应体系，每个待检测样品均设置3个技术重复，并额外设置3个加入DEPC处理水的样品，在体系配置结束后，使用10μL枪头小心接触含有阳性对照标准品的体系后，快速触碰加入DEPC处理水的样品后丢弃。
4. RT-PCR扩增：将PCR八联管置于实时荧光定量PCR仪上，按照表4程序进行RT-PCR反应。
5. 结果判读：依照表5判读扩增结果，27个大型再生水厂的样品经富集提取后均未检出辅助质控核酸片段，表明该辅助质控核酸片段不存在于水体样品中，适合作为辅助质控核酸片段指示标准品污染。同时，人为引入污染的三个样品的辅助质控核酸片段检测结果均出现扩增，表明该判定方法对于阳性对照标准品污染具有较好的灵敏性。
示例3：验证本申请中试剂盒对水体中常见受关注病毒的检测效果及灵敏性
为验证本申请中试剂盒对水体中常见受关注病毒的检测效果及灵敏性，选择新型冠状病毒、诺如病毒GII型和甲型流感病毒进行检测效果测试，方法为采用含有待检测基因序列的标准质粒的系列浓度梯度样品验证多重反转录实时荧光定量PCR的检测灵敏性并绘制标准曲线，其中，含有待检测基因序列的PUC57质粒由上海生工生物合成，采用TE缓冲液溶解，数字PCR定量，并进一步使用TE缓冲液稀释至108 copies/mL、107 copies/mL、106copies/mL、105 copies/mL、104 copies/mL。
1. 配置RT-PCR体系：参照表3，按照每个反应10 μL 2×PCR反应液、0.8μL 25×高浓度酶储备液、4μL引物-探针储备液、0.2 μL拮抗剂、5 μL 待检测核酸样品、DEPC处理水或阳性对照标准品配置反应体系，每个样品设置三个平行。配置完成后将反应管瞬时离心，置于冰上暂存。
2. RT-PCR扩增：将PCR八联管置于实时荧光定量PCR仪上，按照表4程序进行RT-PCR反应。
3. 结果判读：依照表5判读扩增结果，并根据待测样品浓度及检测CT值绘制各待测基因的标准曲线，其中新冠病毒E基因、诺如病毒GII型ORF1基因、甲型流感病毒M基因标准曲线分别如图1、图2、图3所示，可以看出，对于最低浓度为104 copies/mL的样品，所述试剂盒均可稳定检出，且在104 - 108copies/mL范围内，检测CT值与样品对数浓度存在良好线性关系，证明所述试剂盒对于水体中受关注的病毒具有良好的检测效果及灵敏性。
示例4：验证本申请中试剂盒在真实污水样品中的检测效果
为验证本申请所开发的试剂盒对真实污水样品的检测效果，从北京市某大型再生水厂采集24小时连续进水样品，经巴氏消毒灭活后进行检测，设置三个平行样品检测。
1. 样品采集与富集：待测试水样取自北京市某大型再生水厂，100 mL水样经巴氏消毒灭活潜在病原微生物后，使用超滤法法富集至0.5 mL。
2. 核酸提取：使用Qiagen生产的RNeasy Power Microbiome Kit提取富集样品中的核酸。
3. 配置RT-PCR体系：参照表3，按照每个反应10 μL 2×PCR反应液、0.8μL 25×高浓度酶储备液、4μL引物-探针储备液、0.2 μL拮抗剂、5μL 待检测核酸样品、DEPC处理水或阳性对照标准品配置反应体系，每个样品设置三个平行。配置完成后将反应管瞬时离心，置于冰上暂存。
4. RT-PCR扩增：将PCR八联管置于实时荧光定量PCR仪上，按照表4程序进行RT-PCR反应。
5. 结果判读：依照表5判读扩增结果，各样品的外源添加辅助质控核酸片段检测结果均为未扩增，表明操作过程中未发生标准品污染现象。结合标准曲线进行定量，确定原污水中新型冠状病毒、诺如病毒GII型及甲型流感病毒的浓度情况如表9所示（浓度以均值±SD的形式展示），结合结果可确定所述试剂盒可以检出真实污水样品中的三种受关注病毒，具有在水体病毒监测工作中的应用潜力。
表9、采用验证本申请中试剂盒检测污水样品中三种受关注病毒的结果
示例5：探究PCR抑制拮抗剂各组分的独立及组合效果
为确定拮抗剂中反转录强化剂、酶保护剂及金属离子螯合剂各自对于拮抗PCR抑制的效果及其组合的必要性。分别使用超滤法（富集倍数高但无外源药剂添加、样品中PCR抑制剂类型以腐殖酸和多糖为主）和氯化铁法（富集倍数低但需外加三氯化铁作为沉淀剂、样品中PCR抑制剂类型以残留铁离子为主）富集同一污水样品，并使用提取所得核酸在添加拮抗剂不同成分的条件下对于其中诺如病毒GII型VP1基因进行实时荧光定量PCR分析，并通过比较CT值高低判断拮抗剂中不同组分对于PCR抑制的缓解效果及不同组分间的协同组合作用。
检测步骤包括：
1. 样品采集与富集：待测试水样取自北京市某大型再生水厂，100 mL水样经巴氏消毒灭活潜在病原微生物后，分别使用超滤法或氯化铁沉淀法富集至0.5或1mL。
2．核酸提取：使用Qiagen生产的RNeasy Power Microbiome Kit提取富集样品中的核酸，特别的，为确保提取原样品中具有较为明显的PCR抑制，在核酸提取的过程中不使用IRS溶液进行抑制剂脱除。
3. 配置RT-PCR体系：参照表3，对于各个不同处理组，根据处理组类别分别加入反转录强化剂、酶保护剂、金属离子螯合剂中的一种或几种（所涉组分添加浓度对应表3），不含拮抗剂组使用含50%(w/w)甘油、0.5%(w/w)二硫苏糖醇、100 mmol/L氯化钠、20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的空白冻存保护液代替拮抗剂配置反应体系，每个样品在每个条件下均设置6个技术重复。
4. RT-PCR扩增：将PCR八联管置于实时荧光定量PCR仪上，按照表4程序进行RT-PCR反应。
5. 结果判读：依照表5判读扩增结果，各样品的外源添加辅助质控核酸片段检测结果均为未扩增，表明操作过程中未发生标准品污染现象。不同处理组中检测到诺如病毒GII型VP1基因的CT值如表10所示（CT值以均值±SD的形式展示）。可以看出，在仅添加单一组分时，对于采用超滤法浓缩富集的样品，拮抗剂中三种组分的缓解效果排序为：反转录强化剂 > 酶保护剂 > 金属离子螯合剂；而对于采用氯化铁法富集的样品，排序则为：反转录强化剂 > 金属离子螯合剂 > 酶保护剂，这主要是由于不同样品中PCR抑制剂类型不同所造成的。两种组分的组合基本上不会造成抑制效果，且反转录强化剂、酶保护剂及金属离子螯合剂三种组分组合条件下检测的CT值要明显低于仅添加一种或两种组分的处理组。上述对比数据表明，为了适应不同水体样品检测的需要，如拮抗剂应同时包括反转录强化剂、酶保护剂及金属离子螯合剂三种组分。
表10、诺如病毒GII型VP1基因检测的结果
示例6：探究反转录强化剂的最适工作浓度范围
拮抗剂中反转录强化剂，其主要成分为gp32蛋白或E.Coli SSB蛋白等单链结合蛋白。由于这类单链结合蛋白的成本在拮抗剂的三种组分中相对较高，为尽可能控制拮抗剂的总成本，对于PCR抑制拮抗剂中反转录强化剂的工作浓度进行优化，以期确定反转录强化剂的最适工作浓度范围。
检测步骤包括：
1. 样品采集与富集：待测试水样取自北京市某大型再生水厂，100 mL水样经巴氏消毒灭活潜在病原微生物后，使用超滤法富集至0.5 mL。
2. 核酸提取：使用Qiagen生产的RNeasy PowerMicrobiome Kit提取富集样品中的核酸，特别的，为确保提取原样品中具有较为明显的PCR抑制，在核酸提取的过程中不使用IRS溶液进行抑制剂脱除。
3．配置RT-PCR体系：参照表3配置反应体系，对于各个不同处理组，分别加入gp32蛋白至工作浓度分别为0 ng/μL、1 ng/μL、2 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL、20 ng/μL、60 ng/μL、120 ng/μL，每个样品在每个条件下均设置6个技术重复。
4. RT-PCR扩增：将PCR八联管置于实时荧光定量PCR仪上，按照表4程序进行RT-PCR反应。
5. 结果判读：依照表5判读扩增结果，各样品的外源添加非天然序列检测结果均为未扩增，表明操作过程中未发生标准品污染现象。不同处理组中检测到诺如病毒GII型VP1基因的CT值如表11所示（CT值以均值±SD的形式展示）。从结果可以看出，当反转录强化剂的浓度低于2 ng/μL时，未表现出明显的缓解PCR抑制的效果。而当反转录强化剂的浓度达到5~20 ng/μL时，PCR抑制的缓解效果随反转录强化剂用量的增加而略有增强，但随着工作浓度进一步增加至120 ng/μL，PCR抑制的缓解程度不再发生明显变化，表明反转录强化剂的作用已经饱和，因此，从确保效果与控制成本的双向出发，以将PCR抑制的影响控制在0.5个CT值之内为标准，拮抗剂中反转录强化剂的工作浓度范围确定为5~60 ng/μL，最适范围确定为20 ng/μL左右。
表11、不同反转录强化剂工作浓度下对于PCR抑制的缓解效果
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (12)

1.一种拮抗剂，其特征在于，所述拮抗剂包括含量比例为（5~60mg）：（10~100mg）：（0.1~1mmol）的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂。
2.根据权利要求1所述的拮抗剂，其特征在于，所述拮抗剂满足如下（1）至（3）所示条件中的一个或者多个：
（1）所述反转录强化剂包括gp32蛋白、E.Coli SSB蛋白和Taq SSB蛋白中的一种或者多种；
（2）所述酶保护剂包括牛血清蛋白、牛血清白蛋白组分V和重组白蛋白中的一种或者多种；以及，
（3）所述金属离子螯合剂包括乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中的一种或者多种。
3.一种PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液包括拮抗剂以及PCR扩增试剂，所述拮抗剂包括反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂，所述的反转录强化剂、酶保护剂以及金属离子螯合剂在包含所述PCR预混液的PCR反应体系中的浓度分别为5~60mg/L、10~100mg/L和0.1mmol/L~1mmol/L。
4.根据权利要求3所述的PCR预混液，其特征在于，所述拮抗剂满足如下（1）至（3）所示条件中的一个或者多个：
（1）所述反转录强化剂包括gp32蛋白、E.Coli SSB蛋白和Taq SSB蛋白中的一种或者多种；
（2）所述酶保护剂包括牛血清蛋白、牛血清白蛋白组分V和重组白蛋白中的一种或者多种；以及，
（3）所述金属离子螯合剂包括乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸中的一种或者多种。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括酶和PCR反应液。
6.一种PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括：
1）权利要求1至2中任一项所述的拮抗剂，以及，权利要求3至5中任一项定义的PCR扩增试剂；或者，
2）权利要求3至5中任一项所述的PCR预混液。
7.根据权利要求6所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括检测目标核酸的引物对和探针、阴性对照标准品、阳性对照标准品、核酸稀释液以及核酸提取试剂中的一种或者多种。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括辅助质控核酸片段以及检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针，所述辅助质控核酸片段不属于待测样本污染物所含的核酸。
9.一种目标核酸的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR检测方法包括：
对待测样本的核酸进行PCR扩增，根据所得扩增结果确定所述待测样本的核酸中含有目标核酸的情况；
PCR扩增的PCR反应体系添加有权利要求1至2中任一项所述的拮抗剂，或者使用权利要求3至5中任一项所述的PCR预混液；
或者PCR扩增采用权利要求6至8中任一项所述的PCR检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的目标核酸的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR检测方法还包括：在所述阳性对照标准品和所述待测样本的PCR反应体系中添加所述辅助质控核酸片段，并采用检测所述辅助质控核酸片段的引物对和探针进行PCR扩增，根据所得扩增结果辅助判断所述待测样本的核酸中含有目标核酸的情况。
11.根据权利要求10所述的目标核酸的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR检测方法对扩增结果的判读标准如下：
a）所述阴性对照标准品对应有扩增，则需重新检测；
b）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应有扩增，所述目标核酸对应无扩增，则需重新检测；
c）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应有扩增且CT≤38，则所述待测样本判定为阳性，结合标准曲线定量；
d）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应有扩增但CT>38，扩增曲线为S型且在对数坐标下存在大于两个数量级的线性增长期，则所述待测样本判定为疑似阳性，需再次复核检验，若复核检验的结果仍为疑似阳性或阳性则判定为阳性并结合标准曲线定量，若复核检验的结果为阴性则判定为阴性；
e）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应无扩增，所述目标核酸对应无扩增，则所述待测样本判定为阴性；
f）所述阴性对照标准品对应无扩增，所述辅助质控核酸片段对应有扩增，所述目标核酸对应有扩增，则需重新检测，直至所述辅助质控核酸片段不再出现扩增后再参照c）项、d）项、e）项判读标准进行判读。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的目标核酸的PCR检测方法，其特征在于，所述待测样本包括水样。
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