MXPA04012501A - Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuatificacion de acido nucleico viral de la hepatitis a. - Google Patents

Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuatificacion de acido nucleico viral de la hepatitis a.

Info

Publication number
MXPA04012501A
MXPA04012501A MXPA04012501A MXPA04012501A MXPA04012501A MX PA04012501 A MXPA04012501 A MX PA04012501A MX PA04012501 A MXPA04012501 A MX PA04012501A MX PA04012501 A MXPA04012501 A MX PA04012501A MX PA04012501 A MXPA04012501 A MX PA04012501A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
sequence
nucleic acids
hav
nucleotides
Prior art date
Application number
MXPA04012501A
Other languages
English (en)
Inventor
Shyamala Venkatakrishna
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of MXPA04012501A publication Critical patent/MXPA04012501A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/15—Modifications characterised by incorporating a consensus or conserved sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
    • C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
    • C12Q2545/114—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis involving a quantitation step
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/143—Magnetism, e.g. magnetic label
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Se describe cebadores especificos a virus de la hepatitis A y sondas derivadas de las regiones conservadas del genoma del virus de la hepatitis A. tambien se describen ensayos a base de acido nucleico usando los oligonucleotidos de captura, cebadores y sondas.

Description

directa del genoma viral llega a ser difícil debido a su composición del ARN. HAV codifica cuatro proteínas de cápside (A, B, C y D) las cuales contienen los dominios antigénicos principales reconocidos por anticuerpos de individuos infectados. Además de las proteínas de la cápside, los dominios antigénicos han sido reportados en proteínas no estructurales tales como 2A y la proteasa codificada viral. Otro dominio antigénico de HAV importante ha sido descrito en la unión entre el precursor de cápside Pl y 2A. HAV es adquirido normalmente por la ruta fecal-oral, por ya sea contacto de persona a persona o ingestión de alimento o agua contaminada. Sin embargo, existe el potencial para transmisión de HAV por productos de plasma recolectados. La ausencia de una cubierta de lípidos hace al HAV muy resistente a inactivación fisicoquímica, y el virus puede soportar tratamiento de calor convencional de productos sanguíneos. De esta forma, el HAV, así como también el Parvovirus B19, han sido transmitidos a través de la administración de derivados de plasma recolectados . El desarrollo de ensayos de diagnóstico sensibles y específicos para identificar los antígenos de HAV y/o anticuerpos en individuos infectados así como también pruebas a base de ácido nucleico para detectar las muestras virémicas para excluirlas de la transfusión representa un reto de salud pública importante. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 5,290,677 para Robertson et al., describe la captura de virus HAV entero usando anticuerpos. El ARN es aislado, y se 5 genera ADNc. El ADNc es entonces amplificado por PCR usando cebadores a partir de la región de cápside VP1 y VP3 del genoma de HAV, y el producto amplificado es detectado usando sondas de la misma región del genoma. La selección de los cebadores y sondas se basa en el genotipo del HAV a ser 10 detectado. Permanece una necesidad para el desarrollo de pruebas de diagnóstico confiables para detectar el virus de hepatitis A en muestras virémicas, con el fin de prevenir la transmisión del virus a través de sangre y derivados de 15 plasma o por contacto personal cerrado. Sumario de la Invención La presente invención se basa en el desarrollo de una prueba diagnóstica a base de ácido nucleico confiable, sensible para la detección de HAV en muestras biológicas a 20 partir de individuos infectados potencialmente . Las técnicas - ' descritas en la presente utilizan ácido nucleico de muestra extraída como un templado para amplificación de regiones genómicas conservadas de la secuencia de HAV usando PCR, amplificación mediada por transcripción (TMA) , así como 25 también un ensayo de 5" nucleasa, tal como la técnica de TaqMan™. Los métodos permiten la detección de HAV en muestras virémicas . En ciertas modalidades, la invención objeto usa cebadores y sondas derivadas de la región 5' UTR del genoma del HAV. Por otra parte, los métodos permiten un análisis de un reactor en donde los ácidos nucleicos de muestra capturados pueden ser sometidos a amplificación y detección en el mismo recipiente. Usando los métodos de la invención, las muestras infectadas pueden ser identificadas y excluidas a partir de la transfusión, así como también a partir de la preparación de derivados sanguíneos . Por consiguiente, en una modalidad, la invención objeto es dirigida a un método para detectar la infección con HAV en una muestra biológica. El método comprende: (a) poner en contacto un soporte sólido con la muestra biológica bajo alta concentración de sal caotrópica o condiciones de hibridización en donde se forma un complejo entre el soporte sólido y los ácidos nucleicos objetivo; (b) separar el soporte sólido de (a) a partir de la muestra; (c) amplificar los ácidos nucleicos objetivo si están presentes; y (d) detectar la presencia de los ácidos nucleicos objetivo amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HAV en la muestra.
En otra modalidad, la invención objeto es dirigida a un método para detectar la infección con HAV en una muestra biológica. El método comprende: (a) poner en contacto un soporte sólido con la muestra biológica bajo alta concentración de sal caotrópica o condiciones de hibridización en donde se forma un complejo entre el soporte sólido y los ácidos nucleicos objetivos; (b) separar el soporte sólido de (a) a partir de la muestra; y (c) amplificar las cadenas objetivo usando cebadores derivados de 5'UTR del genoma del HAV, tales como cebadores representados por las secuencias que comprenden SEQ ID NO: 1 y 2. En ciertas modalidades, el método además comprende la etapa de usar una sonda de 5"UTR del genoma del HAV, tal como la sonda de SEQ ID NO: 3 para detectar la presencia de los oligonucleótidos objetivo amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HAV en la muestra . ¦En una modalidad adicional, la invención se dirige a un método para detectar la infección de HAV en una muestra biológica, el método comprende: aislar los ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica que se sospecha consiste de HAV; amplificar los ácidos nucleicos usando por lo menos dos cebadores en donde (a) cada uno de los cebadores no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y un cebador comprende una secuencia de nucleotido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:l y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 10 nucleótidos contiguos a partir de la SEQ ID NO: 2 o (b) cebadores que tienen 90% de identidad de secuencia a una secuencia de nucleotido de (a) , en donde cada uno de los dos cebadores es complementario suficientemente a una porción de las cadenas con sentido y sin sentido, del ácido nucleico aislado para hibridizar con el mismo; y detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HA.V en la muestra. En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos son aislados a partir de la muestra biológica por un método que comprende : (a) poner en contacto un soporte sólido que comprende los ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo · con una muestra biológica bajo condiciones de hibridización en donde las cadenas de ácido nucleico objetivo se hibridizan con los ácidos nucleicos de captura, y (b) separar el soporte sólido a partir de la muestra.
En modalidades adicionales, se realizan el aislamiento, amplificación y detección en un solo recipiente. En una modalidad adicional, los ácidos nucleicos de captura comprenden uno o más oligonucleótidos , en donde cada uno de los oligonucleótidos no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos a partir de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. En aún una modalidad adicional, los ácidos nucleicos de captura además comprenden una cadena de homopolimero de aproximadamente 15-25 nucleótidos en longitud, tal como poliA, poliT, poliG, poliC o poliU. En otra modalidad, la amplificación comprende PCR, amplificación mediada por transcripción (TMA) o TaqMan. En una modaldiad adicional, el método además comprende usar un oligonucleótido de sonda etiquetada para detectar el producto amplificado. La sonda no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y por lo menos 10 nucleótidos contiguos que comprende la SEQ ID NO: 3. En ciertas modalidades, la sonda además comprende etiquetas detectadles en el extremo 5' y en el extremo 3', tal como una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FAM) , tetrametil rodamina (TAMRA) , y 2', 4', 5', 7 ' -tetracloro-4-7-diclorofluoresceina (TET) . En aún otra modalidad, la invención se dirige a un método para detectar la infección HAV en una muestra biológica, el método comprende: (a) poner en contacto un soporte sólido con ácidos nucleicos de captura que comprende uno o más oligonucleótidos , en donde uno o más oligonucleotidos comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, bajo condiciones en donde los ácidos nucleicos de captura llegan a ser asociados con el soporte sólido, (b) poner en contacto el soporte sólido de (a) con la muestra biológica bajo condiciones de hibridización en donde las cadenas de ácido nucleico objetivo a partir de HAV cuando están presentes se hibridizan con los ácidos nucleicos de captura; y (c) separar el soporte sólido de (b) a partir de la muestra, (d) amplificar los ácidos nucleicos usando un cebador con sentido que comprende la SEQ ID N0:.l y un cebador antisentido que comprende SEQ ID NO:2, en donde los cebadores con sentido y antisentido son suficientemente complementarios a una porción de las cadenas con sentido y antisentido, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridizar con el mismo ; y (e) detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HAV en la muestra. En ciertas modalidades de los métodos anteriores, el soporte sólido comprende perlas, tales como perlas magnéticas y el aislamiento, amplificación y detección son realizados en un recipiente sencillo. ' En modalidades adicionales, la invención se dirige a un oligonucleótido el cual comprende una secuencia de nucleótido que consiste de cualquiera de las secuencias de nucleótido representadas en la Figura 1. En modalidades adicionales, la invención objeto es dirigida a un oligonucleótido aislado de no más de 60 nucleótidos en longitud que comprende : (a) una secuencia de nucleótidos de por lo menos 10 nucleótidos contiguos a partir de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 2 y 3; (b) una secuencia de nucleótido que tiene 90% de identidad de secuencia a una secuencia de nucleótido de (a) , o (c) complementos de (a) y (b) . En ciertas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos a partir de la SEQ ID NO: 1, 2 ó 3. En modalidades adicionales, el oligonucleótido además comprende una etiqueta detectable en el extremo 5' y/o el extremo 3". En ciertas modalidades, la etiqueta detectable es una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FAM) , tetrametil rodamina (TAMRA) , y 2', 4', 5', 7 " -tetracloro- , 7-diclorofluoresceina (TET) . En aún una modalidad adicional, la invención se dirige a un equipo de prueba de diagnóstico que comprende uno o más cebadores descritos en la presente, e instrucciones para realizar la prueba de diagnóstico. En ciertas modalidades, el equipo de prueba además comprende una sonda de oligonucleótido que comprende una secuencia de hibridización específica a HAV de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos enlazados a una etiqueta detectable . En una modalidad adicional, la invención se dirige a un equipo para detectar HAV en una muestra biológica. El equipo comprende los ácidos nucleicos de captura que comprenden uno o más oligonucleótidos , en donde uno o más oligonucleótidos comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO; 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14; cebadores que comprenden SEQ ID NO: 1 y 2; y una sonda de oligonucleótido que comprenden la SEQ ID N0:3. En ciertas modalidades, el equipo de prueba además comprende una polimerasa e instrucciones para realizar la prueba de diagnóstico. En una modalidad adicional, la invención se dirige a un equipo para detectar infección con HAV en una muestra biológica, el equipo comprende: Ácidos nucleicos de captura que comprenden uno o más oligonucleótidos, en donde cada uno de los oligonucleótidos no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. Por lo menos dos cebadores en donde (a) cada uno de los cebadores no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y un cebador comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO : 1 y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; e Instrucciones escritas para identificar la infección de HAV. En ciertas modalidades, el equipo además comprende un oligonucleótido de sonda de no más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y por lo menos 10 nucleótidos contiguos a partir de la SEQ ID NO: 3. La sonda puede además comprender etiquetas detectables en el extremo 5" y en el extremo 6". En algunas modalidades, la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , tetrametilrodamina (TAMRA) , y 2 " , 4 " , 5' , 7 '-tetracloro- , 7-diclorofluoresceína (TET) . En ciertas modalidades, los equipos anteriores además comprenden una polimerasa y amortiguadores. Estos y otros aspectos de la presente invención llegarán a ser evidentes ante referencia a la siguietne descripción detallada y figuras anexas. Además, varias referencias son indicadas en la presente las cuales describen en ciertos procedimientos o composiciones más detalles . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1B- (SEQ ID NO:l y 2) representan cebadores de ejemplo para uso en la amplificación de ácidos nucleicos de HAV aislados . La Figura 2 (SEQ ID NO: 3) representa una sonda para uso en detección de la presencia de los oligonucleótidos objetivos amplificados indicando la presencia de HAV, donde X es 6-FAM (fluoresceína) , y Z es un enlazador más TAMRA (tetrametilrodamina) . Las Figuras 3A-3F (SEQ ID NO: 10-15), representan oligonucleótidos de captura de ejemplo para aislar ácidos nucleicos de HAV a partir de una muestra biológica. Las Figuras 4A-4B representan una secuencia objetiva del tipo silvestre de HAV (SEQ ID NO: 16) . La Figura 4B (SEQ ID NO: 17) representa una secuencia de control interno de ejemplo para uso como un control para captura de objetivo y amplificación. Las bases en negritas representan la secuencia en el tipo silvestre que se reemplazan en la secuencia de control interno. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinantes y virología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas son explicadas totalmente en la literatura. Ver, por ejemplo, Fundamental Virology, 2a edición, vol . I y II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds) ; A.L. , Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., Current Addition) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. , 1984) ; A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) . Debe ser indicado que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "a", "uno, una", "la, los, las" incluyen referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. De esta forma, por ejemplo, referencia a "un oligonucleotido" incluye una mezcla de dos o más oligonucleótidos , y similares. Las siguientes abreviaciones de aminoácidos son usadas en todo el texto. Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q) Ácido glutámico: Glu(E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: lie (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K) Metionina:Met (M) Fenilalanina : Phe(F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina:Thr (T) Triptófano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V) I; Definiciones Para describir la presente invención, serán empleados los siguientes términos, y son propuestos para ser definidos como se indica posteriormente. Los términos . "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima del producto. De esta forma, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, son incluidos dentro de la definición. Ambas proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas están comprendidas por la definición. Los términos también incluyen modificaciones postexpresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. 5 Adicionalmente , para propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína la cual incluye modif caciones, tales como deleciones, adiciones y substituciones (generalmente conservativas en naturaleza) , a la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la 10 actividad deseada". Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida a sitio, o puede ser accidental, tal como a través de mutaciones de huéspedes los cuales producen las proteínas o errores debido a amplificación de PCR. 15 Por "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un polipéptido, que la molécula indicada es separada y discreta a partir del organismo entero con el cual la molécula es encontrada en la naturaleza o está presente en la ausencia substancial de otras macromoléculas biológicas 20 del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a - · polinucleótido es una molécula de ácido nucleico evitada, en todo o parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza, o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con la 25 misma, o una molécula disasociada a partir del cromosoma.
Un polinucleótido "derivado de" o "específico para" una secuencia designada se refiere a una secuencia de polinucleótido la cual comprende una secuencia contigua de aproximadamente por lo menos aproximadamente 6 nucleotidos, preferentemente por lo menos aproximadamente 8 nucleotidos, más preferentemente por lo menos aproximadamente 10-12 nucleotidos, e incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente 15-20 nucleotidos que corresponden, es decir, son idénticos o complementarios a, una región de la secuencia de nucleotidos designada. El polinucleótido derivado no será necesariamente derivado físicamente a partir de la secuencia de nucleotidos de interés, pero puede ser generado en cualquier forma, pero no se limita a, síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción, la cual se basa en la información proporcionada por la secuencia de bases en la región a partir de la cual se deriva el polinucleótido. Como tal, puede representar ya sea una orientación con sentido o antisentido del polinucleótido original . "homología" se refiere al por ciento de similitud entre dos polinucleótidos o dos porciones de polipéptido. Dos ácidos nucleicos, o dos secuencias de polipéptido son "substancialmente homologas" entre si cuando la secuencias exhiben por lo menos aproximadamente 50%, preferentemente por lo menos aproximadamente 75%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 80%-85%, preferentemente por lo menos aproximadamente 90%, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 95%-98% de similitud de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Como se usa en la presente, substancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa al ácido nucleico especificado o secuencia de polipéptido. En general, "identidad" se refiere a un nucleótido-nucleótido exacto o correspondencia de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respec ivamente. El por ciento de identidad puede ser determinado por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas por alinear las secuencias, contar el número exacto de acoplamientos entre las dos secuencias alineadas, dividir la longitud de la secuencia más corta, y multiplicar el resultado por 100. Programas de computadora fácilmente adecuadas pueden ser usados para ayudar al análisis de homología e identidad, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Seguence and Structure M. o. Dayhoff ed. , 5 Suppl . 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washingtion, DC el cual adapta el algoritmo de homología local de Smith and Waterman Advances in Appl. Math 2:482-489, 1981 para análisis de péptido. Los programas para determinar la homología de secuencia de nucleótidos están disponibles en la Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, programas BESTFIT, FASTA y GAP, los cuales también confian en el algoritmo de Smith and Waterman. Estos programas son utilizados fácilmente con los parámetros de default recomendados por el fabricante y se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. Por ejemplo, el por ciento de homología de una secuencia de nucleótidos particular a una secuencia de referencia puede ser determinada usando el algoritmo de homología de Smith and Waterman con una tabla de clasificación default y una penalidad de espacio de seis posiciones de nucleótidos. Otro método para establecer el por ciento de homología en el contexto de la presente invención es usar el empaque PSRCH de programas con derechos de la University of Edinburg, desarrollado por John F. Collins and Shane S. Sturrok y se distribuye por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . A partir de este grupo de paquetes el algoritmo de Smith-Waterman puede ser empleado donde los parámetros de default son usados para la tabla de clasificación (por .ejemplo, penalidad de espacio abierto de 12, penalidad de extensión de espacio de uno, y un espacio de seis) . A partir de los datos generados el valor "Match" refleja "homología de secuencia. Otros programas adecuados para calcular el por ciento de identidad o similitud entre las secuencias son generalmetne conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros de default. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden ser usados usando los siguientes parámetros de default : código génetico=estándar; filtro=ninguno; cadena=ambos , corte=60; esperado=10 ; Matriz=BL0SUM61 ; Descripciones=50 secuencias; clasificado por=HIGH SCORE; Bases de datos: noredundante , GenBanck + E BL + DDBJ + PDB + GenBAnk CDS traducciones + proteina suiza +Spupdate + PIR. Detalles de estos programos pueden ser encontrados en la siguiente dirección de internet : http: //www. ncbi . nlm. gov/cgi-bin/BLAS . Alternativamente, puede ser determinada la homología por hibridización de polinucleótidos bajo condiciones las cuales forman dúplex estables entre las regiones homologas, seguido por digestión con nucleasas especificas a cadena sencilla, y determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ácido nucleico que son substancialmente homologas pueden ser identificadas en un experimento de hibridización de Southern, por ejemplo, bajo condiciones astringentes, como se define por ese sistema particular. Definir condiciones de hibridización apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra: DNA Cloning, supra, Nucleic Acid Hybridization, supra.
"Recombinante" como se usa en la presente para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de ADNc, ¦ genómico, viral, de origen semisintético o sintético el cual, por virtud de su origen o manipulación no se asocia con todo o una porción del polinucleótido con el cual se asocia en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés es clonado y después expresado en organismos transformados, como se describe además posteriormente. El organismo huésped expresa el gen extraño para producir la protelna bajo condiciones de expresión. Un "elemento de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido la cual ayuda en la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótido a la cual se enlaza. El término incluye promotores, secuencias de terminación de transcripción, dominios regulatorios corriente arriba, señales de poliadenilación, regiones no traducidas, incluyendo 5'-UTR y 3"-UTR y cuando sea apropiado, secuencias líder e increment.adores , las cuales proporcionan colectivamente la transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula huésped. Un "promotor" como se usa en la presente es una región regulatoria capaz de enlazar una polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia de nucleótido corriente abajo (dirección 3') operablemente enlazada en la misma. Para propósitos de la presente invención, una secuencia de promotor incluye el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de una secuencia de interés en niveles detectables arriba del antecedente. Dentro de la secuencia del promotor está un sitio de inicio de transcripción, así como también dominios de enlace de proteína (secuencias de consenso) responsables para el enlace de ARN o ADN polimerasa. Por ejemplo, el promotor puede ser una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una ARN polimerasa dependiente a ADN ( "transcriptasa" ) como una señal para enlazar al ácido nucleico y que empieza la transcripción de ARN en un sitio específico. Para enlace, tales transcriptasas generalmente requieren ADN el cual es de doble cadena en la porción que comprende la secuencia de promotor y su complemento; la porción templada (secuencia a ser transcrita) no necesita ser de doble cadena. Las ADN polimerasas dependientes a ADN individuales reconocen una variedad de secuencias de promotor diferente las cuales pueden variar marcadamente en su eficiencia en promoción de transcripción. Cuando una ARN polimerasa se enlaza a una secuencia de promotor para iniciar la transcripción, esa secuencia de promotor no es parte de la secuencia transcrita. De esta forma, las transcripciones de ARN producidas por la misma no incluirán esa secuencia. Una secuencia de control "dirige la transcripción" de una secuencia de nucleotido cuando la ARN o ADN polimerasa enlazará la secuencia de promotor y transcribe la secuencia adyacente . Una "ADN polimerasa dependiente a ADN" es una enzima que sintetiza una copia de ADN complementaria a partir de un templado de ADN. Ejemplos son ADN polimerasa I de E. coli y ADN polimerasa de bacteriófago T7. Todas las ADN polimerasas dependientes a ADN conocidas requieren un cebador complementario para iniciar la síntesis. Bajo condiciones adecuadas, una ADN polimerasa dependiente a ADN puede sintetizar una copia de ADN complementaria a partir de un templado de ARN. Una "ARN polimerasa dependiente a ADN" o una "transcriptasa" es una enzima que sintetiza copias de ARN múltiples a partir de una molécula de ADN de doble cadena o parcialmente doble cadena que tiene una secuencia promotora (usualmente de doble cadena) . Las moléculas de ARN ("transcripciones") son sintetizadas en la dirección 5' a 3" que inicia en una posición específica justo corriente abajo del ' promotor. Ejemplos de transcriptasas son la ARN polimerasa dependiente a ADN a partir de E. coli y bacteriófagos T7, T3 y SP6. Una "ADN polimerasa dependiente a ARN" o "transcriptasa inversa" es una enzima que sintetiza una copia de ADN complementaria a partir de un templado de ARN. Todas las transcriptasas inversas conocidas también tienen la capacidad de hacer una copia de ADN complementaria a partir de un templado de ADN; de esta forma, son tanto ADN polimerasas dependientes a ARN y ADN. Se requiere un cebador para iniciar la síntesis con tanto templados de ARN o ADN. "ARNasa H" es una enzima que degrada la porción de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Estas enzimas puede ser endonucleasas o exonucleasas . La mayoría de las enzimas transcriptasas inversas contienen normalmente una actividad de ARNasa H además de su actividad de polimerasa. Sin embargo, otras fuentes de las ARNasas H están disponibles sin una actividad de polimerasa asociada. La degradación puede resultar en separación de ARN a partir de un complejo de ARN:ADN. Alternativamente, la ARNasa H puede simplemente cortar el ARN en varias ubicaciones de tal forma que las porciones de la ARN se funden o permite a las enzimas desenrededar porciones del ARN. Los términos "polinucleótidos" , "oligonucleótidos" , "ácidos · nucleicos" y "molécula de ácido nucleico" se usan en la presente para incluir una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o deoxirribonucleótidos . Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. De esta forma, el término incluye ADN de triple, doble y cadena sencilla, así como también ARN de triple, doble y cadena sencila. También incluye modificaciones, tales como por metilación y/o coronación en el extremo y formas no modificadas del polinucleótido . Más particularmente, los términos "polinucleótido" , "oligonucleótido" , ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen polideoxiribonucleótidos (que contienen 2-deoxi-D-ribosa) , polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) , cualquier otro tipo de polinucleótido el cual es un N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen estructuras principales de no nucleotídico, por ejemplo, polímeros de poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido (PNA) ) y polimorfolino (comercialmente disponible de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, como Neugene) , y otros polímeros de ácido nucleico específicos a secuencia sintética que proporcionan los polímeros que contienen nucleobases en una configuración la cual permite el emparejamiento de bases y apilamiento de bases, tales como se encuentra en ADN y ARN. No hay distinción propuesta en .longitud entre los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" , "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" , y estos términos serán usados intercambiablemente . Estos términos se refieren solamente a la estructura primaria de la molécula. De esta forma, estos términos incluyen, por ejemplo, 3 '-deoxi-2 ' , 5 '-DNA, oligodeoxirribonucleótido N3 "P5 '£osforamidatos, 2 ' -O-alquil-ARN substituido, ADN de doble o cadena sencilla, así como también ARN de doble cadena o sencilla, híbridos de ADN:ARN, e híbridos entre PNA y DNA o ARN, y también incluyen tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas las cuales son conocidas en la técnica, metilación, "coronaciones", substitución de uno o más nucleótidos que se encuentran en forma natural con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres , fosforamidatos , carbamatos, etc) , con enlaces cargados negativamente (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.) y con enlaces cargados positivamente (por ejemplo, aminoalquilfosforamidatos , aminoalquilfosfotriésteres) , aquellos que contienen porciones colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácido nucleicos anoméricos alfa, etc.) así como también formas no modificadas del polinucleqtido u oligonucleótido. En particular, el ADN es ácido deoxiribonucleico . Como se usa en la presente, el término "región de ácido nucleico objetivo" o "ácido nucleico objetivo" denota una molécula de ácido nucleico con una "secuencia objetivo" a ser amplificada. El ácido nucleico objetivo puede ser ya sea de cadena sencilla o doble cadena y puede incluir otras secuencias además de la secuencia objetivo, las cuales no pueden ser amplificadas. El término "secuencia objetivo" se refiere a la secuencia de nucleótidos particulares del ácido nucleico objetivo el cual está para ser amplificado. La secuencia objetivo puede incluir una región de hibridización de sonda contenida dentro de la molécula objetiva con la cual una sonda formará un híbrido estable bajo condiciones deseadas. La "secuencia objetivo" puede también incluir las secuencias de complejo a las cuales los cebadores de oligonucleotido formaran el complejo y serán extendidos usando la secuencia objetiva como un templado. Donde el ácido nucleico objetivo es originalmente de cadena sencilla, el término "secuencia objetivo" también se refiere a la secuencia complementaria a la "secuencia objetiva" como se - presenta en el ácido nucleico objetivo. Si el "ácido nucleico objetivo" es originalmente de doble cadena, el término "secuencia objetiva" se refiere a tanto las cadenas más (+) y menos (-) . El término "cebador" o "cebador de oligonucleotido" como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleotido el cual actúa para iniciar la síntesis de una cadena de ácido nucleico complementaria cuando se coloca bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión de cebador se induce, es decir, en la presencia de nucleótidos y un agente inductor de polimerización tal como una ADN o AR polimerasa y en temperatura adecuada, pH, concentración de metal, y concentración de sal. El cebador es preferentemente de cadena sencilla para eficiencia máxima en amplificación, pero puede alternativamente ser de doble cadena. Si es de doble cadena, el cebador es primero tratado para separar sus cadenas antes de ser usado para preparar productos de extensión. Esta etapa de desnaturalización es efectuada típicamente por calor, pero puede alternativamente ser realizada usando álcalis, seguido por neutralización. De esta forma, un "cebador" es complementario a un templado, y forma un complejo por enlace de hidrógeno o hibridización con el templado para dar un complejo de cebador/templado para iniciación de síntesis por una polimerasa, la cual se extiende por la adición de bases enlazadas covalentemente enlazadas en su extremo 3' complementario al templado en el proceso de síntesis de ADN. Como se usa en la presente, el término "sonda" o "sonda de oligonucleotido" se refiere a una estructura comprendida de un polinucleótido, como se define anteriormente, que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico presente en el analito de ácido nucleico objetivo. Las regiones de polinucleótido de sondas pueden estar compuestas de ADN, y/o ARN, y/o análogos de nucleótido sintéticos. Cuando una "sonda de oligonucleótido" es para ser usada en un ensayo de 5" nucleasa, tal como la técnica TaqMan™, la sonda contendrá por lo menos un fluorescente y por lo menos un detenedor el cual se digiere por la actividad de 5' endonucleasa de una ' polimerasa usada en la reacción con el fin de detectar cualesquiera secuencias de oligonucleótido objetivo amplificadas. En este contexto, la sonda de oligonucleótido tendrá un número suficiente de enlaces de fosfodiéster adyacentes a su extremo 5' de tal forma que la actividad de 5'a 3 'nucleasa empleada puede degradar eficientemente la sonda de enlace para separar los fluorescentes y detenedores . Cuando una sonda de oligonucleótido es usada en la técnica de ???, será etiquetada adecuadamente, como se describe posteriormente . Se apreciará que las secuencias de hibridización no necesitan tener complementaridad perfecta para proporcionar híbridos estables. En muchas situaciones, híbridos estables se formarán donde tan poco como aproximadamente 10% de las bases se desacoplan, ignorando circuitos . de cuatro o más nucleótidos. Por consiguiente, como se usa en la presente el término "complementario" se refiere a un oligonucleótido que forma un dúplex estable con su "complemento" bajo condiciones de ensayo, generalmente donde hay aproximadamente 90% o más de homología. Los términos "hibridizar" e "hibridización" se refieren a la formación de complejos entre secuencias de nucleótidos las cuales son suficientemente complementarias para formar complejos por medio del emparejamiento de bases Watson-Crick. Donde un cebador "hibridiza" con objetivo (templado) , tales complejos (o híbridos) son suficientemente estables para servir a la función de cebador requerida por por ejemplo, la ADN polimerasa para iniciar la síntesis de ADN. Como se usa en la presente, el término "par de enlace" se refiere a moléculas primarias y secundarias que se enlazan específicamente entre sí, tal como pares de polihucleótido complementarias capaces de formar dúplex de ácido nucleico. "Enlace específico" del primer miembro del par de enlace al segundo miembro del par de enlace en una muestra se evidencia por el enlace del primer miembro al segµndo¦ miembro, o viceversa, con mayor afinidad y específicamente a otros componentes en la muestra. El enlace entre los miembros del par de enlace es típicmente no covalente. A menos que el contexto claramente lo indique de otra forma, los términos "molécula de afinidad" y "analito objetivo" como se usa en la presente se refiere a un primer y segundo miembros de un par de enlace, respectivamente. Los términos "molécula de enlace específico" y "molécula de afinidad" son usados intercambiablemente en la 5 presente y se refieren a una molécula que enlazará selectivamente, a través de un medio químico o físico a una substancia detectable presente en una muestra. Por "enlazar selectivamente" se entiende que la molécula enlaza preferencialmente al objetivo de interés o enlaza con mayor 10 afinidad al objetivo que a otras moléculas. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico enlazará a una secuencia substancialmente complementaria y no a secuencias no relacionadas . La "temperatura de fusión" o "Tm" de molécula de 15 ácido nucleico de doble cadena es definida como la temperatura en la cual la mitad de la estructura helicoidal del ácido nucleico es perdida debido a calentamiento u otra disociación del enlace de hidrógeno entre las pares de bases, por ejemplo, por tratamiento de ácido o álcali, o similares. 0 ¦ La Tm de una molécula de ácido nucleico depende de su • ·' -longitud y en. composición de base. Las moléculas de ácido nucleico enriquecidas en pares de base GC tienen una Tm superior que aquellas que tienen una abundancia de pares de bases de AT. Cadenas complementarias separadas de ácidos 5 nucleicos se reasocian espontáneamente o destemplan para formar ácidos nucleicos dúplex cuando la temperatura es disminuida abajo de Tm. La relación más alta de hibridización de ácido nucleico ocurre aproximadamente 25 °C abajo de Tm. La Tm puede ser estimada usando la siguiente relación: Tm=69.3 + 0.41 (GC)% (Marmur et al. (1962) J. Mol. Biol . 5:109-118). Como se usa en la presente, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un sujeto, que incluye comúnmente anticuerpos producidos por el sujeto. Las muestras típicas incluyen pero no se limitan a, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfoide, muestras de la piel, secreciones de la piel, tractos respiratorios, intestinales y genitourinarios, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro incluyendo pero no se limitan a medios condicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes , y componentes celulares. Las muestras biológicas preferidas son sangre, plasma y suero. Como se usa en la presente, los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable" se refiere a una molécula capaz de detección, incluyendo, pero no limitada a, isótopos radioactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes , cromóforos, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina o haptenos) y similares. El término "fluorescente" se refiere a una substancia o una porción del mismo el cual es capaz de exhibir fluorescencia en el intervalo detectable. Como se usa en la presente, un "soporte sólido" se refiere a una superficie sólida tal como perla magnética, perla de látex, pozo de placa de microtítulo, placa de vidrio, nylon, agarosa, acrilamida, y similares. II. Modos para llevar a cabo la Invención Antes de describir la presente invención en detalle, se entiende que esta invención no se limita a formulaciones particulares o parámetros de proceso como tales pueden, por supuesto variar. Se entiende también que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no se propone para ser limitante. Aunque un número de composiciones y métodos similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica de la presente invención, los materiales ¦ preferidos y métodos se describe en la presente . Como se nota anteriormente, la presente invención se basa en el descubrimiento de métodos diagnósticos novedosos para detectar exactamente la infección con virus de Hepatitis A (HAV) en una muestra biológica. Los métodos dependen de técnicas de detección a base de ácidos nucleicos sensibles que permiten la identificación de secuencias de ácidos nucleicos objetivos de HAV en muestras que contienen cantidades pequeñas de virus. En particular, en la presente se ha descubierto que el uso de secuencias a partir de HTR 3 " del genoma de HAV proporciona la detección rápida y sensible de HAV en muestras biológicas. Las secuencias para el genoma HAV, incluyendo el UTR 5', en un número de aislados de HAV son conocidas. Ver, por ejemplo, los números de acceso NCB1 K02990; AB020564; AB020565; AB020566; AB020567; AB020568; AB020569; AF268396; M16632; M14707; M20273; NC001489; X83302; Cohén et al. J. Virol . (1987) 61:50-59 . Para comparar las secuencias a partir de los varios aislados de HAV, éstas y otras secuencias de 5' UTR para uso con la presente invención pueden ser fácilmente aisladas. Para conveniencia, las varias moléculas de ácidos nucleicos para uso con la presente invención han sido numeradas con relación a no. de acceso NCBI K02990. La secuencia 5' UTR ocurre en las posiciones 1-723 de No. de acceso NCBI K02990. En la estrategia de la presente invención, los ácidos nucleicos objetivos son separados de ADN/ARN no homólogos. En un aspecto, los ácidos nucleicos objetivos son separados por formar un complejo con un soporte sólido. En otro aspecto, los ácidos nucleicos objetivos son separados por usar oligonucleótios de captura inmovilizados en un soporte sólido, donde los oligonucleotidos de captura pueden ser específicos para el organismo a ser detectado. Los ácidos nucleicos objetivos separados pueden entonces ser detectados por el uso de sondas de oligonucleótido objetivados con grupos reportadores, o amplificados. Para HAV; los ácidos nucleicos objetivos separados son preferentemente amplificados usando los cebadores en una región no traducida, tal como 5' UTR. Cebadores representativos a partir de esta región son cebadores que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1 y 2 (Figura 1) . En un aspecto de la presente invención la muestra biológica que porta potencialmente el ácido nucleico objetivo es puesta en contacto con un soporte sólido, opcionalmente que tiene oligonucleotidos de captura. Los oligonucleotidos de captura pueden ser asociados con el soporte sólido, por ejemplo, por enlace covalente de la porción de sonda al soporte sólido, por asociación de afinidad, enlace de hidrógeno o asociación no específica. Los oligonucleotidos de captura pueden incluir de aproximadamente 5 a aproximadamente '500 nucleótidos, preferente y aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos, o más preferente y aproximadamente 10 aproximadamente 60 nucleótidos o cualquier entero dentro de estos intervalos, tales como una secuencia que incluye 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26...35...40 , etc nucleótidos a partir de la región de interés. Oligonucleótidos de captura representativos son derivados de la secuencia 5 " UTR de un aislado de HAV, tal como aquellos representados en las Figuras 3A-3F (SEQ ID NO: 10-15) en la presente. El oligonucleótido de captura puede ser unido al soporte sólido en una variedad de maneras. Por ejemplo, el oligonucleótido puede ser unido al soporte sólido por unión del nucleótido terminal 3' ó 5 " del oligonucleótido de captura al soporte sólido. Más preferentemente, el oligonucleótido de captura es unido al soporte sólido por un enlazador el cual sirve para distanciar la sonda a partir del soporte sólido. El enlazador es usualmente por lo menos 10-50 átomos en longitud, más preferentemente por lo menos 15-30 átomos en longitud. La longitud requerida del enlazador dependerá del soporte sólido particular usado. Por ejemplo, un enlazador de seis átomos es generalmente suficiente cuando el poliestireno con reticulación alto se usa como el soporte sólido . Son conocidos una amplia variedad de enlazadores en la técnica los cuales pueden ser usdos para unir el oligonucleótido de captura al soporte sólido. El enlazador puede ser formado por cualquier compuesto el cual no interfiere significativamente con la hibridización de la secuencia objetivo al oligonucleótido de captura unido al soporte sólido. El enlazador puede ser formado de un oligonucleotido homopolimérico el cual puede ser agregado fácilmente en el enlazador por síntesis automatizada. La secuencia homopolimérica puede ser ya sea 5' a 3' a la secuencia específica a virus. En un aspecto de la invención, los oligonucleótidos de captura pueden ser enlazados a una cadena de homopolímero, tal como, por ejemplo poli A, poli T, poli G, poli C, poli U, poli dA, poli dT, poli dG, poli dC o poli DU con el fin de facilitar la unión al soporte sólido. La cadena de homopolímero puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente nucleótidos en longitud, o preferente o aproximadamente 12 a aproximadamente 25 nucleótidos en longitud, o cualquier entero dentro de estos intervalos, tales como por ejemplo, 10...12...16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos. Las secuencias homopoliméricas representativas incluyen secuencias poli T o poli A. Alternativamente, polímeros tales como polietilenglicol funcionalizado puede ser usado como el enlazador. Tales polímeros no interfieren significativamente con la hibridización de sonda al Oligonucleotido objetivo. Ejemplos de enlaces incluyen enlaces de polietilenglicol, carbamato y amida. Los enlaces entre el soporte sólido, el enlazador y el oligonucleotido de captura son preferentemente no escindidos durante la remoción de grupos protectores de bases bajo condiciones básicas en alta temperatura. El oligonucleótido de captura puede también ser fosforilado en el extremo 3' con el fin de prevenir la extensión de oligonucleótido de captura. El soporte sólido puede tomar muchas formas incluyendo, por ejemplo, nitrocelulosa reducida a forma particulada y recuperable ante paso del medio de muestra que contiene el soporte a través de un tamiz; nitrocelulosa o los materiales impregnados con partículas magnéticas o similares, lo cual permite a la nitrocelulosa migrar dentro del medio de muestra ante la aplicación de un campo magnético: perlas o partículas los cuales pueden ser filtrados o exhibir propiedades electromagnéticas, perlas de poliestireno ¦ las cuales fraccionan a la superficie de un medio acuoso; y sílice magnetizada. Ejemplos de tipos preferidos de soportes sólidos para inmovilización del oligonucleótido de captura incluye vidrio de poro controlado, placas de vidrio, poliestireno, perlas de poliestireno recubierta con avidina, celulosa, nylon, gel de acrilamida y dextrano activado. Un aspecto de la presente invención incluye un soporte sólido que comprende sílice o perlas magnéticas, opcionalmente la sílice o perlas magnéticas contienen grupos funcionales de amina primarias las cuales facilitan el enlace covalente o asociación de los oligonucleótidos de captura a las partículas de soporte magnético. Alternativamente, la sílice o perlas magnéticas tienen inmovilizadas en las mismas homopolímeros , tales como secuencias de poli T o poli A. El uso de un soporte sólido con sílice o perlas magnéticas permite un método de un reactor de aislamiento, amplificación y detección ya que el soporte sólido puede ser separado a partir de la muestra biológica por medio magnético. Las perlas o partículas magnéticas pueden ser producidas usando técnicas estándar u obtenidas a partir de fuentes comerciales. En general, las partículas o perlas pueden estar comprendidas de partículas magnéticas, aunque pueden también ser de otros metales u óxidos de metal magnéticos, ya sea en forma impura, aleación, o compuesta, mientras tengan una superficie reactiva y exhibir una capacidad para reaccionar con un campo magnético. Otros materiales que pueden ser usados individualmente o en combinación con fierro incluyen, pero no se limitan a, cobalto, níquel, y silicio. Una perla magnética adecuada para la aplicación en la presente invención incluye perlas magnéticas que contienen grupos poli dT marcados bajo la marca perlas de oligonucleótido magnéticas Sera-Mag™ por Seradyn, Indianapolis , . IN. La sílice magnética adecuada para la aplicación en la presente invención incluye sílice magnética MagPrep™ por Novagen, Madison, WI . Enseguida, la asociación de los oligonucleótidos de captura con el soporte sólido es iniciada por poner en contacto el soporte sólido con el medio que contiene los oligonucleótidos de captura. En un aspecto, la perla magnética que contiene los grupos poli dT se hibridiza con las secuencias objetivs que comprenden poli dA contiguas con 5 la secuencia seleccionada de la región de una cadena conservada del genoma de HAV. El poli dA en el oligonucleotido de captura y el poli dT en el soporte sólido se hibridizan por lo que inmovilizan o asocian los oligonucleótidos de captura con el soporte sólido. En otro 10 aspecto, la perla magnética ha inmovilizado en su superficie de secuencias nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 nucleótidos, preferente y aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleótidos derivados de las secuencias de nucleótidos descritas en la Solicitud de 15 Patente de los Estados Unidos de Norteamérica copendiente comúnmente asignada no. de serie 10/267,922, presentada el 9 de Octubre de 2002. El soporte sólido es puesto en contacto con la muestra biológica bajo altas concentraciones de sales 20 caotrópicas o bajo condiciones de hibridización . Los • " oligonucleótidos de captura se hibridizan a las cadenas objetivos presentes en la muestra biológica. Típicamente, hibridizaciones de oligonucleótidos de captura a los objetivos pueden ser realizadas en aproximadamente 15 25 minutos, pero puede tomar tanto como 3 a 48 horas.
En otro aspecto, las partículas magnéticas de sílice son expuestas al medio que contiene el material objetivo bajo condiciones diseñadas para promover la formación de un complejo. El complejo es más preferentemente formado en una mezcla de partícula magnética de sílice, el medio y una sal caotrópica. Las sales caotrópicas son sales de iones caotrópicas que son altamente solubles en soluciones acuosas. Los iones caotrópicos proporcionados por tales sales, en suficientemente alta concentración en soluciones acuosas de proteínas o ácidos nucleicos, provoca a las proteínas desdoblarse, a los ácidos nucleicos perder su estructura secundaria, o en el caso de ácidos nucleicos de doble cadena, fundirse . Se piensa que los iones caotrópicos tienen estos efectos porque alteran las redes de enlace de hidrógeno que existe en agua líquida y por lo que hace proteínas desnaturalizadas y ácidos nucleicos termodinámicamente más estables que sus contrapartes correctamente plegadas o estructuradas. Iones caotrópicos representativos incluyen, pero no se limitan a, guanidinio, yodo, perclorato y tricloroacetato . Preferido en la presente invención está el ion de guanidinio. Las sales caotrópicas incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, yoduro de sodio, perclorato de sodio, y tricloroacetato de sodio. Son preferidas las sales de guanidinio, y particularmente preferido es el tiocinato de guanidina. La concentración de iones caotrópicos para uso en esta práctica del presente método es preferentemente entre aproximadamente 0.1 M y 7 , pero más preferentemente entre aproximadamente 0.5 y 5 M. La concentración de iones caotrópicos en la mezcla debe ser suficientemente alta para provocar al material objetivo biológico adherirse a las partículas magnéticas de sílice en la mezcla, pero no tan alta como para substancialmente desnaturalizar, degradar o provocar al material objetivo precipitarse de la mezcla. Las proteínas y moléculas grandes de ácido nucleico de doble cadena, tales como ácidos nucleicos, son estables en concentraciones de sales caotrópicas entre 0.5 y 2 M, pero son conocidas para precipitarse de la solución en concentraciones de sal caotrópica arriba de aproximadamente 2 M. En un aspecto de la presente invención, el complejo formado como se describe anteriormente es incubado hasta que por lo menos algo del material de ácido nucleico es adherido a la partícula magnética de sílice para formar un complejo. Esta etapa de incubación es realizada en una temperatura de por lo menos aproximadamente 0°C, preferentemente por lo menos aproximadamente 4°C, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 20°C, con la condición de que la temperatura de incubación no sea más de aproximadamente 75 °C. De esta forma, las temperaturas en el intervalo de 0°C a 75°C, preferentemente 4°C a 50°C, y más preferentemente, aproximadamente 15°C a aproximadamente 35°C, o cualquier entero dentro de estos intervalos encontrará uso en la presente. La etapa de incubación es realizada preferentemente en una temperatura abajo de la temperatura en la cual las partículas magnéticas de sílice empiezan a perder su capacidad para enlazar reversiblemente el material de ácido nucleico, y puede ser realizada en aproximadamente la temperatura ambiente (es decir en aproximadamente 25°C) . El soporte sólido es entonces separado de la muestra biológica por filtrar, pasar a través de una columna, o por un medio magnético. Como se apreciará por un experto en la técnica, el método de separación dependerá del tipo de soporte sólido seleccionado. Ya que los objetivos se hibridizan a los oligonucleótidos de captura inmovibilizados en el soporte sólido, las cadenas objetivas son por lo mismo separadas a partir de impurezas en la muestra. En algunos casos, los ácidos nucleicos extraños son por lo mismo separados a partir de impurezas en la muestra. En algunos "casos., los ácidos nucleicos extraños, proteínas, carbohidratos, lípidos, residuos celulares, y otras impurezas pueden todavía ser enlazados al soporte, aunque en concentraciones mucho menores que las encontradas inicialmente en la muestra biológica. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que algunos materiales indeseables pueden ser removidos por lavar el soporte con un medio de lavado . La separación del soporte de sólido a partir de la muestra biológica remueve preferentemente por lo menos aproximadamente 70%, más preferente y aproximadamente 90%, y más preferentemente, por lo menos aproximadamente 95% de los ácidos nucleicos no objetivos en la muestra. Los métodos de la presente invención pueden también incluir amplificar el oligonucleotido objetivo capturado para producir ácidos nucleicos amplificados. Amplificar un ácido nucleico objetivo usa una ácido nucleico polimerasa para producir múltiples copias del oligonucleotido objetivo o fragmentos del mismo. Técnicas de amplificación adecuadas son bien conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo amplificación asociada con transcripción, reacción de cadena polimerasa (PCR) , amplificación mediada por replicasa, y reacción de cadena ligasa (LCR) . Los cebadores para uso con los ensayos de la invención son preferentemente únicos para el organismo la presencia de los cuales es para ser detectados. De esta forma., para la detección de HAV, por ejemplo, los cebadores se derivan de las regiones conservadas en la región no traducida de HAV, tal como aquellos mostrados en la Figura 1. Cebadores y oligonucleótidos de captura para uso en los ensayos son fácilmente sintetizados por técnicas estándar, por ejemplo, síntesis de fase sólida por medio de química de fosforamidita, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,458,066 y 4,415,732; Beaucage et al. (1992) Tetrahedron 48:2223-2311; y Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (Io de Abril de 1987) . Otros métodos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el método fosfotriéster descrito por Narang et al., Meth. Enzymol . (1979) 68:90 y el método fosfodiéster descrito por Bro n et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:109. Poli (A) o poli (C) , u otras extensiones de nucleótidos no complementarias pueden ser incorporadas en sondas usando estos mismos métodos . Las extensiones de óxido de hexaetileno pueden ser acopladas a sondas por métodos conocidos en la técnica. Cload et al. (1991) J. Am. Chem. Soc . 113:6324-6326; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica no. 4,914,210 para Levenson et al.; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359; y Hora et al. (1986) Tet . Lett . 27:4705-4708. Típicamente, las secuencias de cebador están en el intervalo de entre 10-75 nucleótidos en longitud, tales como 15-60, 20-40 y así, más típicamente en el intervalo de entre 18-40 nucleótidos de ¦ largo, y cualquier longitud entre los intervalos establecidos. La sonda típica está en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de largo, tales como 15-40, 18-30 y así sucesivamente, y cualquier longitud entre los intervalos establecidos.
Por otra parte, las sondas pueden ser acopladas a etiquetas para detección. Hay varios medios conocidos para derivar oligonucleótidos con funcionalidades reactivas las cuales permiten la adición de una etiqueta. Por ejemplo, 5 varios procedimientos están disponibles para sondas de biotinilización de tal forma que pueden ser unidas etiquetas radioactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes , enzimáticas o densidad de electrones por medio de avidina. Ver, por ejemplo, Broken et al., Nucí. Acids Res. (1978) 5:363-384 la 10 cual describe el uso de etiquetas de ferritina-avidina- biotina; y Chollet et al. Nucí. Acids. Res. (1985) 13:1529- 1541 la cual describe biotinilización de las terminaciones 5' de oligonucleótidos por medio de un brazo enlazador de aminoalquilfosforamida. Varios métodos son también 15 disponibles para sintetizar oligonucleótidos derivados de amino los cuales son fácilmente etiquetados por fluorescentes u otros tipos de compuestos derivados por grupos reactivos a amino, tales como isotiocianato, N-hidroxisuccinimida, o similares, ver, por ejemplo, Gonnolly (1987) Nucí. Acids Res. 20 15:3131-3139, Gibson et al. (1987) Nucí. Acids. Res. 15:6455- - · 6467 y Patente de los Estados Unidos NO. 4,605,735 a Miyoshi et al. Los métodos son también disponibles para sintetizar oligonucleótidos derivados de sulfidrilo los cuales pueden ser reaccionados con etiquetas específicas a tiol, ver, por 25 ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,757,141 a Fung et al., Connolly et al. (1985) Nucí. Acids . Res. 13:4485-4502 y Spoat et al. (1987) Nucí. Acids Res. 15:4837-4848. Una revisión comprensiva de metodologías para etiquetar fragmentos de ácidos nucleicos se proporciona en Matthews et al., Anal. Biochem. (1988) 169:1-25. Por ejemplo, las sondas pueden ser etiquetadas fluorescentemente por enlazar una molécula fluorescente a la terminación no ligante de la sonda. La guía para seleccionar etiquetas fluorescentes apropiadas puede ser encontrada en Smith et al., Meth Enzymol (1987) 155:260-301, arger et al., Nucí. Acids Res. (1991) 19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR. Etiquetas fluorescentes preferidas incluyen fluoresceina y derivados de la misma, tales como se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,318,846 y Lee et al., Cytometry (1989) 10:151-154, y 6-FA (fluoresceina) , JOE (2 ' , 7 'dimetoxi-4 ' , 5 ' -diclorofluoresceina) , TAMRA (tetrametilrodamina) , ROX (rodamina X), HEX-1, HEX-2, Zoé, TET-1 o MAN-2 y similares. Adicionalmente , las sondas pueden ser etiquetadas con un éster de acridinio (AE) usando las técnicas descritas posteriormente. Tecnologías actuales permiten a la etiqueta AE ser colocada en cualquier ubicación dentro de la sonda. Ver, por ejemplo, Nelson et al. (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" en Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed.) Academic Press, San Diego, CA; Nelson et al . (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR" , en The Polymerase Chain _Reaction, Mullís et al . (eds) Birkhauser, Boston, MA; Weeks et al . , Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry et al . , Clin. Chem. (1988) 34: 2087-2090. Una molécula E puede ser unida directamente a la sonda usando química de brazo enlazador a base de no nucleótido que permite la colocación de la etiqueta en cualquier ubicación dentro de la sonda. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 5,585,481 y 5,185,439. En ciertas modalidades, el control interno (IC, por sus siglas en Inglés) o un estándar interno es agregado para servir como un control para captura de objetivo y amplificación. Preferentemente, el IC incluye una secuencia que difiere de las secuencias objetivo, es capaz de hibridizar con las secuencias de sonda usadas para separar los oligonucleótidos específicos para el organismo a partir de la muestra, y es capaz de amplificación. El uso del control interno permite el control del proceso de separación, el proceso de amplificación, y el' sistema de detección, y permite el monitoreo del comportamiento de ensayo y cuantificación para la muestra. El IC puede ser incluido en cualquier punto adecuado, por ejemplo, en el amortiguador de lisis. En una modalidad, el IC comprende ARN que contiene una parte de la secuencia de nucleótido de HAV y una secuencia única que hibridiza con la sonda. De esta forma, en ciertas modalidades, el IC incluye una porción del genoma del HAV con una secuencia modificada con 5-30, tal como 6..9...12..15..20 y así sucesivamente o 5 más bases substituidas con otras bases. Las bases substituías pueden ser ubicadas sobre la longitud total de la secuencia objetivo de tal forma que solamente 2 ó 3 secuencias consecutivas son reemplazadas. Un IC representativo para HAV es mostrado en la Figura 4B y comprende 721 pb derivadas de 0 5'UTR del genoma del HAV. Las bases caso superiores, plegadas en la Figura 4B representan las bases que han sido substituidas para las bases que ocurren en la secuencia del tipo silvestre (ver Figura 4A) . El ensayo puede incluir adicionalmente sondas específicas al estándar interno (sonda 5 IC) . Las sondas representativas para la secuencia de IC son detalladas en los ejemplos como SEQ ID NO:18 y 19. La sonda IC puede opcionalmente ser acoplada con una etiqueta detectable que es diferente de la etiqueta detectable para la 0 secuencia objetivo. En modalidades donde la etiqueta • ¦' .detectable es .un fluoróforo, el IC puede ser cuantificado espectrofotométricamente y por limitar los estudios de detección. Típicamente, el número de copias de IC el cual no 5 interfiere con la detección objetivo se determina valorando el IC con IU fi o/copias/PFU de objetivo, preferentemente en el extremo inferior, y una curva estándar es generada por diluir una muestra de estándar internacionalmente aceptado. En otra modalidad, un IC, como se describe anteriormente, se combina con ARN aislado de la muestra de acuerdo a técnicas estándar conocidas por aquellos de experiencia en la técnica. El A N es entonces transcrito en forma inversa usando una transcriptasa inversa para proporcionar ADNc . Las secuencias de ADNc pueden ser opcionalmente amplificadas (por ejemplo, por PCR) usando cebadores etiquetados. Los productos de amplificación son separados, típicamente por electroforesis , y la cantidad de etiqueta incorporada (proporcional a la cantidad del producto amplificado) se determina. La cantidad de AR m en la muestra en entonces calculada por comparación con la señal producida por los estándares conocidos . Los cebadores y sondas descritos anteriormente pueden ser usados en técnicas basadas en reacción de cadena polimerasa (PCR) para detectar infección de HAV en muestras biológicas. PCR es una técnica para amplificar una secuencia de- ácido nucleico objetivo deseada contenida en una molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas. En PCR, un par de cebadores se emplea en exceso para ibridizar a las cadenas complementarias del ácido nucleico objetivo. Los cebadores son cada uno extendidos por una polimerasa usando el ácido nucleico objetivo como un templado. Los productos de extensión llegan a ser secuencias objetivo por si mismos después de la disociación a partir de la cadena objetivo original. Nuevos cebadores son entonces hibridizados y extendidos por una polimerasa, y el ciclo se repite para incrementar geométricamente el número de moléculas de secuencia objetivo. El método de PCR para amplificar las secuencias de ácido nucleico objetivo en una muestra es bien conocido en la técnica y ha sido descrito en, por ejemplo, Innis et al. (eds.) PCR Protocols (Academic Press, Y 1990); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: Basic principies and automation, in PCR: A Practical Approach, McPherson et al. (eds.) IRL Press, Oxford; Saiki et al. (1986) Nature 324:163; así como también en las Patentes de los Estados Unidos de América No. 4,683,195, 4,683,202 y 4,889,818. En particular, PCR usa cebadores de oligonucleótidos relativamente cortos los cuales flanquean la secuencia de nucleótido objetivo a ser amplificada, orientada de tal forma que sus extremos 3' se confrontan entre si, cada cebador que se extiende hacia el otro. La muestra de • polinucleótido es extraída y desnaturalizada, preferentemente por calor, y se hibridiza con primeros y segundos cebadores los cuales están presentes en exceso molar. La polimerización es catalizada en la presencia de los cuatro trifosfatos deoxirribonucleótidos (dNTP, dATP, dGTP, dCTP y dTTP) usando un agente polimerizante de polinucleótido dependiente a cebador y templado, tal como cualquier enzima capaz de producir productos de extensión de cebador, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa 5 I, ADN T4 polimerasa, ADN polimerasa termoestable aisladas de Thermus aquaticus (Taq) , disponible de una variedad de fuentes (por ejemplo, Perkin Elmer) , Thermus thermophilus (United States Biochemicals) , Bacillus stereothermophilus (Bio-Rad) o Thermococcus litoralis ("Vent" polimerasa, New 10 England Biolabs) . Esto resulta en dos "productos grandes" los cuales contienen los cebadores respectivos en sus extremos 5' enlazados covalentemente a los complementos recientemente sintetizados de las cadenas originales. La mezcla de reacción es entonces regresada a condiciones de polimerización, por 15 ejemplo por disminuir la temperatura, inactivar un agente desnaturalizante, o agregar más polimerasa, y un segundo ciclo se inicia. El segundo ciclo proporciona las dos cadenas originales, los dos productos grandes a partir del primer ciclo, dos nuevos productos grandes replicados a partir de 20 las cadenas originales, y dos "productos cortos" replicados a - ¦ partir de productos grandes. Los productos cortos tienen la secuencia de la secuencia objetivo con un cebador en cada extremo. En cada ciclo adicional, se producen dos productos grandes adicionales, y un número de productos cortos iguales 25 al número de productos grandes y cortos que permanecen en el final del ciclo previo. De esta forma, el número de productos cortos que contiene la secuencia objetivo crece exponencialmente con cada ciclo. Preferentemente, PCR se lleva a cabo con un ciclizador térmico comercialmente disponible, por ejemplo, Perkin Elmer. Los ARN pueden ser amplificados por transcripción inversa de ARNm en ADNc, y después realizar PCR (RT-PCR) , como se describe anteriormente. Alternativamente, una enzima sencilla puede ser usada para ambas etapas como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,322,770, ARNm puede también ser transcrita en forma inversa en ADNc, seguido por reacción de cadena ligada de espacio asimétrico (RT-AGLCR por sus siglas en inglés) como se describe por Marshall et al. (1994) PCR Meth. App ..4 : 80-8 . El ensayo de 5' nucleasa fluoreogénico, conocido como ensayo TaqMan™ (Perkin-Elmer) , es un sistema de detección a base de PCR poderoso y versátil para objetivos de ácido nucleico. Por lo tanto, los cebadores y sondas derivados de regiones del genoma de HAV descritos en la presente pueden ser usados en análisis TaqMan™ para detectar la presencia de infección en una muestra biológica. El análisis se realiza junto con ciclización térmica por monitorear la generación de señales de fluorescencia. Se dispensa el sistema de ensayo con la necesidad para análisis electroforético de gel, y tiene la capacidad para generar datos cuantitativos que permiten la determinación de números de copias objetivos. El ensayo de 5' nucleasa fluorogénico es realizado convenientemente usando, por ejemplo, ADN polimerasa AmpliTaq Gold™, la cual tiene actividad de 5 "nucleasa endógena, para digerir una sonda de oligonucleótido estándar etiquetada con tanto un tinte reportador fluorescente y un detenedor (ver, Holland et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1991) 88:7276-7280; y Lee et al., Nucí. Acids Res. (1993) 21:3761-3766) . Los resultados de ensayo son detectados por medir cambios en fluorescencia que ocurren durante el ciclo de amplificación en cuanto se digiere la sonda fluorescente, desacoplando el tinte y etiquetas detenedoras y provocando un incremento en la señal fluorescente que es proporcional a la amplificación de ácido nucleico objetivo. Los productos de amplificación pueden ser detectados en solución o usando soportes sólidos. En este método, la sonda TaqMan™ es diseñada para hibridizar a una secuencia objetivo dentro del producto PRC deseado. El extremo 5' de la sonda TaqMan™ contiene un tinte informador fluorescente. El extremo 3' de la sonda se bloquea para prevenir la extensión de sonda y contiene un tinte que detendrá la fluorescencia del 5' fluoróforo. Durante la amplificación subsecuente, la etiqueta 5' fluorescente es escindida si una polimerasa con actividad de 5 "exonucleasa está presente en la reacción. La excisión del 5'fluoróforo resulta en un incremento en fluorescencia la cual puede ser detectada. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se relaciona a métodos para amplificar una secuencia de nucleótidos HAV objetivo usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad de 5' a 3' nucleasa, uno o más cebadores capaces de hibridizar a la secuencia objetivo de HAV, y una sonda de oligonucleótido capaz de hibridizar a la secuencia objetiva de HAV 3' con relación al cebador. Durante amplificación, la polimerasa digiere la sonda de oligonucleótido cuando es hibridizada a la secuencia objetivo, por lo que se separa la molécula reportadora a partir de la molécula detenedora. En cuanto se realiza la amplificación, la fluorescencia de la molécula reportadora es monitoreada, con fluorescencia que corresponde a la ocurrencia de amplificación de ácido nucleico. La molécula reportadora es preferentemente un tinte de fluoresceína y la molécula detenedora es preferentemente un tinte de rodamina. Mientras que la longitud de los cebadores y sondas puede variar, .las secuencias de sonda son seleccionadas de tal forma que tienen una temperatura de fusión superior que las secuencias de cebador. Preferentemente, las secuencias de sondas tienen una temperatura de fusión estimada que es aproximadamente 10°C superior a la temperatura de fusión para las secuencias de cebador de amplificación. Aquí, las secuencias de cebador son generalmente más cortas que las secuencias de sonda. Típicamente, las secuencias de cebador están en el intervalo de entre 10-75 nucleótidos de largo, más típicamente en el intervalo de 20-45. La sonda típica está en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de largo, más típicamente 15-40 nucleótidos de longitud. Para una descripción detallada del ensayo Taq an™, reactivos y condiciones para uso en el mismo, ver, por ejemplo, Holland et al., Proc . Nati. Acad. Sci, USA (1991) 88:7276-7280; Patentes de los Estados Unidos de América No. 5,538,848; 5,723,591 y 5,876,930. La secuencias de HAV descritas en la presente pueden también ser usadas como una base para ensayos de amplificación mediada por transcripción (TMA) . TMA proporciona un método para identificar secuencias de ácido nucleico objetivo presente en cantidades muy pequeñas en una muestra biológica. Tales secuencias pueden ser difíciles o imposibles para detectar usando métodos de ensayo directo. En particular, TMA es un sistema de amplificación objetivo de ácido nucleico autocatalítico, isotérmico que puede proporcionar más de un billón de copias de ARN de un secuencia objetivo. El ensayo puede ser hecho cualitativamente, para detectar exactamente la presencia o ausencia de la secuencia objetivo en una muestra biológica.
El ensayo puede también proporcionar una medición cuantitativa de la cantidad de la secuencia objetivo sobre un intervalo de concentración de varios órdenes de magnitud. TMA proporciona un método para sintetizar múltiples copias autocatalíticamente de una secuencia de ácido nucleico objetivo sin manipulación repetitiva de condiciones de reacción tales como temperatura, resistencia iónica y pH. Generalmente, TMA. incluye las siguientes etapas: (a) aislar ácido nucleico, incluyendo ARN, a partir de la muestra biológica de interés que se sospecha está infectada con HAV; y (b) combinar en una mezcla de reacción (i) el ácido nucleico aislado, (ii) primero y segundo cebadores de oligonucleótido, el primer cebador que tiene una secuencia de complejo suficientemente complementaria a la porción 3' terminal de una secuencia objetivo de ARN, si está presente (por ejemplo la cadena (+) ) , para formar en complejo con la misma, y el segundo cebador que tiene una secuencia de complejo suficientemente complementaria a la porción terminal 3' de la secuencia objetivo de su complemento (por ejemplo, la cadena (-) ) para formar en complejo con el mismo, en donde el' primer oligonucleótido además comprende una secuencia 5' a la secuencia de complejo la cual incluye un promotor, (iii) una transcriptasa inversa de ADN polimerasa dependiente a ARN y ADN, (iv) una actividad enzimática la cual degrada selectivamente la cadena de ARN de un complejo de ARN- DN (tal como AR asa H) y (v) una ARN polimerasa la cual reconoce el promotor. Los componentes de la mezcla de reacción pueden ser combinados en forma de etapas o de una sola vez . La mezcla de 5 reacción se incuba bajo condiciones donde se forma un oligonucleótido/secuencia objetivo, incluyendo cebador de ácido nucleico y condiciones de síntesis de ácido nucleico (incluyendo trifosfatos de ribonucleótido y trifosfatos de deoxirribonucleótido) por un periodo de tiempo suficiente 10 para proporcionar copias múltiples de la secuencia objetivo. La reacción toma lugar ventajosamente bajo condiciones adecuadas para mantener la estabilidad de componentes de reacción tales como las enzimas componentes y sin requerir modificación o manipulación de condiciones de reacción 15 durante el curso de la reacción de amplificación. Por consiguiente, la reacción puede tomar lugar bajo condiciones que son substancialmente isotérmicas e incluyen substancialmente concentración iónica y pH. La reacción no require convenientemente una etapa de desnaturalización para 20 separar el complejo de ARN-ADN producido por la primera - · reacción de extensión de ADN. Las ADN polimerasas adecuadas incluyen transcriptasas inversas, tales como la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviaria (AMV) (disponible de, por 25 ejemplo, Seikagaku America, Inc.) y transcriptasa inversa del virus de leucemia de murino de Molone (MMLV) (disponible de, por ejemplo, Bethesda Research Laboratories) . Promotores o secuencias promotoras adecuadas para incorporación en los cebadores son secuencias de ácido nucleico (ya sea que se presentan en forma natural, producidas sintéticamente o un producto de una digestión de restricción) que son reconocidas específicamente por una ARN polimerasa que reconoce y enlaza a esa secuencia e inicia el proceso de transcripción donde se producen las transcripciones de ARN. La secuencia puede opcionalmente incluir bases de nucleótidos que se extienden más allá del sitio de reconocimiento real para la ARN polimerasa lo cual puede impartir estabilidad agregada o susceptibilidad a procesos de degradación o eficiencia de transcripción incrementada. Ejemplos de promotores útiles incluyen aquellos los cuales son reconocidos por ciertas polimerasas de bacteriófago tales como aquellos de bcteriofago T3 , T7 o SP6, o un promotor de E. coli. Estas ARN polimerasas son fácilmente disponibles de fuentes comerciales, tales como New England Biolabs and Epicentre. Algunas de las transcriptasas inversas adecuadas para uso en los métodos de la presente tienen una actividad de RNAasa H, tales como transcriptasa inversa AMV. Puede, sin embargo, ser preferible agregar ARNasa H exógena, tal como ARNasa H de E. coli, incluso cuando se usa la transcriptasa inversa de AMV. ARN asa H es fácilmente disponible de, por ejemplo Bethesda Research Laboratories. Las transcripciones de ARN producidas por estos métodos pueden servir como templados para producir copias adicionales de la secuencia objetivo a través de los mecanismos descritos anteriormente. El sistema es autocatalitico y la amplificación ocurre autocatalíticamente sin la necesidad para modificar repetidamente o cambiar las condiciones de reacción tales como temperatura, pH, concentración iónica o similares . La detección puede ser hecha usando una amplia variedad de métodos, incluyendo secuenciación directa, hibridización con oligómeros específicos a secuencia, electroforesis de gel y espectrometría de masa. Estos métodos pueden usar formatos heterogéneos u homogéneos, etiquetas isotópicas o no isotópicas, asi como también sin etiquetas. Un método preferible de detección es el uso de sondas de oligonucleótido específicas a secuencia objetivo descritas anteriormente . Las sondas pueden ser usadas en ensayos de protección de hibridización (HPA) . En esta modalidad, ¦ las sondas son etiquetadas convenientemente con éster de acridinio (AE) , una molécula altamente quimioluminiscente . Ver, por ejemplo, Nelson et al (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminiscence" en Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, CA; Nelson et al. (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR" en The Polymerase Chain Reaction, Mullís et al. (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090. Una molécula AE está unida directamente a la sonda usando una química de brazo enlazador a base de no nucleótido que permite la colocación de la etiqueta en cualquier ubicación dentro de la sonda. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,585,481 y 5,185,439. La quimioluminiscencia es accionada por reacción con peróxido de hidrógeno alcalino el cual produce una N-metil acridona que colapsa subsecuentemente al estado molido con la emisión de un fotón. Cuando la molécula es unida covalentemente a una sonda de ácido nucleico, la hidrólisis es rápida bajo condiciones suavemente alcalinas. Cuando la sonda etiquetada por AE es exactamente complementaria al ácido nucleico objetivo, la relación de hidrólisis de AE es bastante reducida. De esta forma, la sonda etiquetada por AE hibridizada y no hibridizada puede ser detectada directamente en solución, sin la necesidad de separación física. HPA consiste generalmente de las siguientes etapas: (a) la sonda etiquetada por AE es hibridizada con el ácido nucleico objetivo en solución por aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos. Una solución alcalina suave es entonces agregada y AE acoplada a la sonda no hibridizada es hidrolizada. Esta reacción toma aproximadamente 5 a 10 minutos . EL AE asociado híbrido restante es detectado como una medición de la cantidad del objetivo presente. Esta etapa toma aproximadamente 2 a 5 segundos. Preferentemente, la etapa de hidrólisis diferencial es realizada en la misma temperatura como la etapa de hibridización, típicamente en 50 a 70°C. Alternativamente, puede ser realizada una segunda etapa diferencial en temperatura ambiente. Esto permite que sean usados pH elevados, por ejemplo en el intervalo de 10-11, lo cual produce grandes diferencias en la relación de hidrólisis entre sonda etiquetada or AE hibridizada y no hibridizada. ??? se describe en detalle, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,004,745; 5,948,899 y 5,283,174. T A es descrita en detalle, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,399,491. En un ejemplo de un ensayo típico, una muestra de ácido nucleico aislado, que se sospecha contiene una secuencia objetivo HAV, se mezcla con un concentrado de amortiguador que contiene amortiguador, sales, magnesio, trifosfatos de nucleótido, cebadores, ditiotreitol , y espermidina. La reacción es opcionalmente incubada en aproximadamente 100°C por aproximadamente dos minutos para desnaturalizar cualquier estructura secundaria. Después de enfriar a temperatura ambiente, transcriptasa inversa, AR polimerasa, y ARNasa H se agregan y se incuba la mezcla por dos a cuatro horas en 37°C. La reacción puede ser entonces ensayada por desnaturalizar el producto, agregar una solución de sonda, incubar 20 minutos en 60°C, agregar una solución para selectivamente hidrolizar la sonda no hibridizada, incubar la reacción seis minutos a 60°C, y medir la quimioluminiscencia restante en un luminómetro. Como es fácilmente aparente, el diseño de los ensayos descritos en la presente son sujetos a una gran cuestión de variación, y muchos formatos son conocidos en la técnica. Las descripciones anteriores son simplemente proporcionadas como pautas y una experiencia en la técnica puede fácilmente modificar los protocolos descritos, usando técnicas bien- conocidas en la técnica. Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, incluyendo los cebadores, sondas, soporte sólido con sondas enlazadas, así como también otros reactivos de detección, pueden ser proporcionados en equipos, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar los ensayos como se describe anteriormente. El equipo contiene normalmente en recipientes separados la combinación de cebadores y sondas (ya sea enlazados a una matriz sólida o separados con reactivos para enlazarlos a la matriz) , formulaciones de control (positiva y/o negativa) , reactivos etiquetados cuando el formato de ensayo requiere algunos reactivos y de generación de señal (por ejemplo, substrato de enzimas) si la etiqueta no genera una señal 5 directamente. Instrucciones (por ejemplo, escrita, cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo usualmente será incluido en el equipo. El equipo puede también contener, dependiendo del ensayo particular usado, otros reactivos empacados y materiales (es decir, amortiguadores de lavado y 10 similares) . Los ensayos estándar, tales como aquellos descritos anteriormente, pueden ser realizados usando estos equipos . III . Experimental Posteriormente se dan los ejemplos de modalidades 15 especificas para realizar la presente invención. Los ejemplos son ofrecidos para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención en ninguna forma. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud 20 con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, - · temperaturas, etc.), pero algunos errores experimentales y la desviación pueden, por supuesto, ser permitidos. En los siguientes ejemplos, las enzimas son compradas de fuentes comerciales, y usadas de acuerdo a las 25 direcciones de fabricación. Los filtros de nitrocelulosa y similares son también comprados de fuentes comerciales. En el aislamiento de fragmentos de ARN y ADN, excepto donde se indiquen, todas las manipulaciones de ARN y ADN se hacen de acuerdo los procedimientos estándar. Ver, Sambrook et al, supra. Las enzimas de restricción, ADN T ligasa, E. coli, ADN polimerasa I, fragmento de Klenow, y otros reactivos biológicos pueden ser comprados de proveedores comerciales y usados de acuerdo a las direcciones del fabricante. Los fragmentos de doble cadena y de ácido nucleico son separados en geles de agarosa. Ejemplo 1 Extracción de ARN de HAV de la muestra biológica Se compra el suero positivo a ácido nucleico de HAV de BioClincal Partners (Berkeley, CA) . Se usan dos procedimientos para aislar el ácido nucleico a partir de la muestra. En particular, se extrae el ARN por (a) enlazar a sílice; y (b) destemplar a oligonucleótidos específicos a obj etivo . (a) Aislamiento de ácido nucleico por enlace a sílice Se extrae el ARN por enlace a sílice usando el método descrito por Boom, R. Et al. (1990) "Rapid and simple method for purification of nucleic acids" J. Clin. Microbiol . 28, 495-503. En la presencia de altas concentraciones de sal caotrópica tal como isotiocianato de guanidinio, los ácidos nucleicos se enlazan a sílice. Los ácidos nucleicos dimensionados pequeños enlazan más eficientemente a la sílice bajo condiciones de pH ácido. Los ácidos nucleicos enlazados son eluidos eficientemente en baja concentración de sal, amortiguador de pH en temperaturas altas. La substitución de sílice magnetizada para sílice regular facilita bastante las etapas de lavado y elución de aislamiento de ácido nucleico. Se usa una base magnética para capturar las partículas de sílice enlazadas a ácido nucleico, de esta forma eliminado las centrifugaciones requeridas para sedimentar partículas de sílice regulares. El amortiguador de lisis usado es de Organon-Teknika (Durham, NC) . Este amortiguador de lisis contiene isotiocianato de guanidinio para solubilizar las proteínas e inactivar ARNasas y ADNasas . El detergente Tritón X-100 además facilita el proceso de solubilización y desintegración de estructura celular y proteínas nucleares, de esta forma liberando el ácido nucleico. El reactivo de lisis es acidificado para incrementar el enlace de ácido nucleico, y 50 µ? de amortiguador de elución alcalina se usa para eluir el ácido nucleico enlazado. El reactivo de lisis de 9.0 mi en prealicuota para extraer la forma de ácido nucleico 2.0 mi de plasma positiva IgM de HAV. Se usa la sílice magnetizada (partículas de MagPrep a partir de Novagen, Madison, I) para capturar las partículas de sílice enlazadas a ácido nucleico, de esta forma eliminado centrifugaciones requeridas para sedimentar partículas de sílice regulares. Los ácidos nucleicos enlazados son eluidos en 50 µ? de Tris pH 9.0 10 mM que contiene 1 mM de EDTA. Después de aislamiento de ácido nucleico, se determina la presencia de HAV por realizar TaqMan™ PC , como se describe posteriormente. (b) Aislamiento de ácido nucleico por destemplar a los oligonucleotidos específicos a objetivo Aunque el uso de sílice magnetizada facilita bastante el manejo rápido y fácil durante las etapas de lavado y elución, el aislamiento de ácido nucleico es todavía laborioso y consumidor de tiempo. Por lo tanto se usa la captura de una etapa de objetivo de ácido nucleico específico a partir de plasma o suero usando perlas magnéticas. Con el fin de hacer esto aplicable para una amplia variedad de pruebas de captura de ácido nucleico viral, se usan perlas magnéticas genéricas acopladas con oligo dT. Se usan perlas de oligo(d) magnéticas Sera-Mag (dT) (Seradyn, Indianapolis , IN) con una longitud oligo dT de aproximadamente 14 bps, en combinación con oligonucleotidos de captura que contienen la cola poli A en el extremo 3 " contiguo con la secuencia específica a HAV (designada en el final de la secuencia especificada posteriormente) . Se suspenden las perlas magnéticas en 0.4 mi de amortiguador de lisis TMA menos cebador (GenProbe, San Diego, CA) y se prueban los cebadores de captura individualmente o en combinación. Después de la captura, se lavan las perlas tres veces con un amortiguador de lavado de Hepes 10 m (pH 7.5), NP-40 al 0.5% que contiene NaCl 0.3 M. Las perlas con el ácido nucleico capturado se suspenden en 100 µ? de un reactivo de RT-OCR de una etapa TaqMan™ y se transfiere a una placa de microtítulo RT-PCR TaqMan™ por PCR TaqMan™ como se describe posteriormente. Varias combinaciones de oligonucleótidos son eficiente en capturar HAV como se describe por el ensayo TaqMan™. Los oligonucleótidos de captura son usados como sigue (la numeración indicada en el extremo de la secuencia corresponde a la posición dentro del genoma del HAV, con relación a NCBI número de acceso K02990. Las secuencias de captura son secuencias complementarias inversas a las posiciones especificadas, ya que HAV es un virus de ARN de cadena positiva) : CGGCGTTGAATGGTTTTTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp (NT483-503, más una cola poliA de 22 pb, p) fosforilado) (SEQ ID NO: 4) TCACCAATATCCGCCGCTGTTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp (nt451-474, más una cola poliA de 22 pb, p=fosforiladó) (SEQ ID NO: 5) AATTTAGACTCCTACAGCTCCATGCTAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp (nt: 291-319, más una cola poliA de 22 pb, p= osforilado) (SEQ ID NO: 6) TTGACCCCGCCGGGCGO AAAAAAAAAAAAAAAAp (264-280, más una cola poliA de 22 pb, p=fosforilada) (SEQ ID NO : 7) GAGCCTAGGGCAAGGGGAGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp (233-255, más una cola poliA de 22 pb, p=fosforilado) (SEQ ID NO: 8) AGCCTATAGCCTAGGCAAACGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAp (73-95, más una cola poliA de 22 pb, p=fosforilada) (SEQ ID NO: 9) . Ejemplo 2 Detección de ARN de HAV para Taq an™ Se usa la tecnología TaqMan™ para amplificar el ARN objetivo capturado. Para esto, los oligonucleótidos de amplificación consisten de un cebador específico a HAV. Los cebadores son como sigue : Cebadores de amplificación y sondas de detección en la región no traducida 5": VHAV1-GGATTGATTGTCAGGGCTGTC (Cebador con sentido-nt538-558) (Seq ID No:l) VHAV2 -CCCTCTCACAGGATCCCATTT (Cebador antisentido nt612-632, complementaria inversa) (Seq ID No: 2) VHAV3 -XCCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACCATTTZ (Sonda nt576-605) (Seq ID No. 3) Donde X=6-FAM (fluoresceina) , y Z=enlazador mas TAMRA (tetrametilrodamina) Se diluye el ácido nucleico del Ejemplo 1 para obtener aproximadamente 100 IU/20 µ? . Se obtienen los reactivos para el análisis TaqMan™ de Applied Biosystems, 5 Foster City, CA. La mezcla de reacción TaqMan™ en un volumen final de 50 mi contiene: 25 mi de mezcla RT-PCR de una etapa TaqMan™, 0.5 pmoles de cada uno de los cebadores de amplificación, y 0.2 pmol de la sonda. Las condiciones de reacción incluyen 30 minutos en 48°C para actividad RT, 10 10 min en 96°C para activar la enzima seguido por 45 ciclos de 30 segundos en 95°C, alternativamente con 30 segndos en 60°C en ABI 7900 Sequence Detector. Se usa el cebador con sentido de amplificación PCR VHAV1, cebador antisentido VHAV2 , y sonda VHAV3. 15 Se preparan la transcripción de control interno de 721 nts, Figura 4B (SEQ ID NO: 17) , la cual puede ser capturada y amplificada pero con una secuencia de enlace de sonda alterada. Las letras en negritas en la secuencia representada en la Figura 4B representa la secuencia en el IC 20 que reemplaza la secuencia en el objetivo (Figura 4A, SEQ ID - · NO.: 16) . Las secuencias de sonda de ejemplo para la IC son CAGTGACATGCAGGTCTAGCTz (SEQ ID NO; 18) o xCCCAGTGACATGCAGGTCTAGCTz (SEQ ID NO: 19) donde x=TET y z=enlazador + TAMRA. 25 Ejemplo 3 Eficiencia de amplificación de prueba y combinaciones de oligonucleótido de captura Se construye sintéticamente la secuencia de nucleótido de UTR 5' de HAV en base a la secuencia de NCBI no. de acceso K02990, se clona la secuencia en plásmidos M13 para proporcionar ADM de una cadena y se purifica el ADN. (a) Eficiencia de amplificación La concentración del ADN clonado y purificado es determinada espectrofotométricamente y se amplifican las diluciones de ADN que corresponden a 10,000 a 0.5 Cps por reacción en el ensayo de TaqMan™ y se detecta usando los métodos , cebadores y sondas descritos anteriormente . Típicamente, las señales a partir de las muestras realizadas <45 ciclos en un umbral de >0.2 se consideran positivas. La Tabla 1 detalla los resultados. Tabla 1 Cps/rxn Ciclo 45 0.5 cp 0.157663 1 cp 0.299065 5. cp 0.8231 10 cp 1.115975 50 cp 1.34539 100 cp 1.13805. 500 cp 2.361416 1000 cp 2.478576 5000 cp 2.815369 10000 cp 2.887422 negativa 0.072094 negativa 0.04076 (b) Combinaciones de oligonucleótido de captura Se prueba la eficiencia de combinaciones de captura/cebador usando ADNss de 25 Cps/reacción. La combinación de oligonucleótidos de captura que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, y 9 es la más eficiente . Por consiguiente, las secuencias de HAV novedosas y ensayos de detección usando estas secuencias han sido descritas. A partir de lo mencionado anteriormente, se apreciará que, aunque han sido descritas modalidades específicas de la invención en la presente para propósitos de ilustración, pueden ser hechas varias modificaciones sin desviación del espíritu y alcance de la presente. hace constar que con relación a esta fecha, mej.or método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención. (12) INTERNATIONAL APPLICATION PUBUSHED UNDER THE PATENT COOPERATION TREATY (PCT) (19) World Intellectual Property Organizaron Intemaiionál Bureau |] II IE I II 11 II ??? ? ll1 1 11 II n I ir I Ll ?G?? II (43) Internationa] Publication Date (10) International Publication Number 24 December 2003 (24.12.2003) PCT WO 2003/106641 A3 (51) International Patcnt Classification7: C12Q 1/70, (81) Designated States (nmional): AE, AG, AL, AM, AT, AU, 1/68, C07H 21/04 AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, (21) International Application Number: GM, HR, HU, TD, IL, IN, IS, JP, E, G, P, KR, KZ, LC, PCT US2003/018827 LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NT, NO, NZ, OM, PH, PL, PT, RO, RU, SC, SD, (22) Intemaiionál Filing Date: 12 June 2003 02.06.2003) SE, SG, SK. SL, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, YU, ZA, Z , ZW. (25) Filing Language: English (26) Publication Language: English (84) Designated States (regional): ARIPO patent (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), (30) Priority Data: Eurasian patent (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), 60/388,544 12 June 2002 (12.06.2002) US European patent (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL, PT, RO, (71) Applicant (for all designated Simes excepi US): CHI- SE, SI, SK, TR), OAPI patent (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, RON CORPORATION [US/US]; 4560 Horran Street, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). Emeryville, CA 94608 (US). Published: (72) Inventor; and — wit inlern lional search repo (75) Inventor/Applicant (for US only): SHYAMALA, Venkatakrishna [US/US]; c/o Chiron Corporation, Intellectual Property - R440, RO. Box 8097, Emeryville, CA (88) Date of publication of the International search report: 94662-8097 (US). 14 October2004 (74) Agent: LILLIS, Marcella; Chirori Corporation, IntellecFor iwo-lelier codes and other abbreviations, refer to the "Guid- tual Property R440, PO Box 8097, Emeryville, CA 94662- ance Notes on Codes and Abbreviations" appearing al ihe begín- 8097 (CA). ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazetle. < H " : vo vo o rH § (54) Title: IDENTIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDES FOR THE CAPTURE, DETECTION AND QUANTITATION OF <S| HEPATITIS A VIRAL NUCLEIC ACJD (57) Abstract: Hepatitis A virus-specific primers and probes derived from conserved regions of the hepatitis A virus genome are disclosed. Also disclosed are nucleic acid-based assays using the capture oligonucleotides, primers and probes.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un oligonucleótido aislado de no más de 60 nucleótidos en longitud caracterizado porque comprende: (a) una secuencia de nucleotido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos a partir de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID N0;1, 2 y 3; (b) una secuencia de nucleotido que tiene 90% de identidad de secuencia a una secuencia de nucleotido de (a) ; o (c) complementos de (a) y (b) . 2. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido es una secuencia de nucleotido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID N0;1, 2 y 3. 3. El oligonucleótido de conformidad con la -reivindicación. 1, caracterizado porque la secuencia de nucleotido comprende la SEQ ID NO: 1. 4. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleotido comprende la SEQ ID N0:2. 5. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótido comprende la SEQ ID N0:3. 6. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende una etiqueta detectable en el extremo S" y/o el extremo 3'. 7. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FA ) , tetrametilrodamina (TAMRA) y 2 ' , ' , 5' , 7 '-tetracloro-4-7-diclorofluoresceina (TET) . 8. Un grupo de dos cebadores para amplificar el ácido nucleico de virus de Hepatitis A, el grupo de cebadores caracterizado porque consiste de los cebadores que consisten de la SEQ ID N0:1 y SEQ ID N0:2. 9. Un método para detectar el virus de la Hepatitis A (HAV) en una muestra biológica, el método caracterizado porque comprende: aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica que se sospecha contiene HAV; amplificar los ácidos nucleicos aislados usando por lo menos dos cebadores derivados de UTR 5' del genoma del HAV, en donde cada uno de los cebadores tiene de 10 a 60 nucleótidos en longitud y es suficientemente complementaria a una porción de las cadenas sentido y antisentido, respectivamente, del ácido nucleico aislado para hibridizar con el mismo; y detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HAV en la muestra. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque (á) uno de los cebadores comprende una secuencia de nucleótido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID N0;1 y el otro cebador comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1, o (b) cebadores que tienen 90% de identidad de secuencia a una secuencia de nucleótido de (a) , y detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HAV en la muestra. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde los ácidos nucleicos son aislados de la muestra biológica por un método caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un soporte sólido que comprende ácidos nucleicos de captura asociados con el mismo con una muestra biológica bajo condiciones de hibridización en donde las cadenas de ácido nucleico objetivas se hibridizan con los ácidos nucleicos de captur ; y (b) separar el soporte sólido a partir de la muestra. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el soporte sólido comprende perlas. 5 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las perlas son perlas magnéticas. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque se realiza el aislamiento, amplificación y detección en un recipiente sencillo. 10 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los ácidos nucleicos comprenden uno o más oligonucleótidos, en donde cada uno de los oligonucleótidos no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y comprende por lo menos 10 15 nucleótidos contiguos a partir de una secuencia selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los ácidos nucleicos de captura 20 comprenden además una cadena de homopolímero en ya sea el - ' extremo 3' ó 5' de aproximadamente 15-25 nucleótidos en longitud, en donde la cadena homopolímero es seleccionada del grupo que consiste de poliA, poliT, poliG, poliC y poliU. 17. El método de conformidad con la reivindicación 25 16, caracterizado porque la cadena de homopolímero es una cadena poliA. 18. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porgue amplificar comprende PCR, amplificación mediada por transcripción (TMA) o TaqMan. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque comprende amplificar TMA. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque además comprende usar un oligonucleótido de sonda el cual comprende una etiqueta detectable para detectar la secuencia amplificada, en donde el oligonucleótido de sonda no tiene más de 60 nucleótidos en longitud y comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos que comprende la SEQ ID NO : 3. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la sonda comprende etiquetas detectables en el extremo 5' y en el extremo 3". 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FAM) , tetrametilrodamina (TAMRA) y 2 ' , 4' , 5' , 7 '-tetracloro-4~7diclorofluoresceina (TET) . 23. Un método para detectar infección con el virus de hepatitis A (HAV) en una muestra biológica, el método caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un soporte sólido con ácidos nucleicos de captura que comprende uno o más oligonucleótidos , en donde uno o más oligonucleótidos comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 Y SEQ ID NO : 14 , bajo condiciones en donde los ácidos nucleicos de captura llegan a ser asociados con el soporte sólido. (b) poner en contacto el soporte sólido de (a) con la muestra biológica bajo condiciones de hibridización en donde las cadenas de ácido nucleico objetivo a partir de HAV cuando están presentes se hibridizan con los ácidos nucleicos de captura; y (c) separar el soporte sólido de (b) a partir de la muestra; (d) amplificar los ácidos nucleicos usando un cebador con sentido que comprende SEQ ID NO : 1 y un cebador antisentido que comprende SEQ ID NO:2, en donde los cebadores con sentido y antisentido son suficientemente complementarios a una porción de las cadenas con sentido y antisentido, respectivamente, • del ácido nucleico aislado para hibridizar con el mismo; y (e) detectar la presencia de los ácidos nucleicos amplificados como una indicación de la presencia o ausencia de HAV en la muestra. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el soporte sólido comprende perlas. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque las perlas son perlas magnéticas. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el aislamiento, amplificación y detección son realizados en un recipiente sencillo. 27. Un equipo para detectar la infección con el virus de Hepatitis A (HAV) en una muestra biológica, el equipo caracterizado porque comprende: ácidos nucleicos de captura que comprenden uno o más oligonucleótidos, en donde cada uno de los oligonucleótidos no tiene más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y comprende una secuencia de nucleotido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, y SEQ ID NO: 14 ; por lo menos dos cebadores en donde (a) cada uno de los cebadores no tiene más de 60 nucleótidos en longitud y un -cebador comprende una secuencia de nucleotido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:l y el otro cebador comprende una secuencia de nucleotido de por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; e instrucciones escritas para identificar la infección con HAV. 28. El equipo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende además una polimerasa y amortiguadores . 29. El equipo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además comprende un oligonucleótido de sonda de no más de aproximadamente 60 nucleótidos en longitud y por lo menos 10 nucleótidos contiguos que comprende la SEQ ID NO: 3. 30. El equipo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la sonda además comprende etiquetas detectables en el extremo S" y en el extremo 3". 31. El equipo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente seleccionada del grupo que consiste de 6-carboxifluoresceina (6-FAM) , tetrametilrodamina (TAMRA) , y 2", 4', 5', 7'tetracloro-4-7-diclorofluoresceína (TET) .
MXPA04012501A 2002-06-12 2003-06-12 Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuatificacion de acido nucleico viral de la hepatitis a. MXPA04012501A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38854402P 2002-06-12 2002-06-12
PCT/US2003/018827 WO2003106641A2 (en) 2002-06-12 2003-06-12 Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis a viral nucleic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA04012501A true MXPA04012501A (es) 2005-02-17

Family

ID=29736491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA04012501A MXPA04012501A (es) 2002-06-12 2003-06-12 Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuatificacion de acido nucleico viral de la hepatitis a.

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20040072150A1 (es)
EP (1) EP1552022B1 (es)
JP (3) JP5361109B2 (es)
KR (2) KR20110101254A (es)
CN (2) CN102660539A (es)
AU (2) AU2003276719B2 (es)
BR (1) BR0311768A (es)
CA (1) CA2489346C (es)
CR (1) CR7651A (es)
ES (1) ES2402925T3 (es)
HR (1) HRP20050037A2 (es)
IS (1) IS7640A (es)
LV (1) LV13290B (es)
MA (1) MA27319A1 (es)
MX (1) MXPA04012501A (es)
NO (1) NO20050179L (es)
NZ (1) NZ537617A (es)
PL (1) PL374195A1 (es)
RU (1) RU2406762C2 (es)
WO (1) WO2003106641A2 (es)
ZA (1) ZA200500260B (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4753943B2 (ja) * 2004-07-13 2011-08-24 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ型肝炎ウイルス核酸の検出のための組成物及び方法
CN100389207C (zh) * 2005-10-27 2008-05-21 中国医学科学院医学生物学研究所 快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法
DE102006034844B3 (de) * 2006-07-27 2007-12-06 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von Hepatitis A-Viren (HAV) und/oder Parvoviren B19 (PB19) mittels Multiplex-PCR
JP5257147B2 (ja) * 2008-03-03 2013-08-07 東洋紡株式会社 ラベル
CN101838710A (zh) * 2010-06-04 2010-09-22 湖州市疾病预防控制中心 甲型肝炎病毒核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒及使用方法
TWI435935B (zh) * 2010-12-06 2014-05-01 Univ Nat Cheng Kung 快速檢測標靶核酸片段之套組及方法
BR112013031802A2 (pt) * 2011-09-07 2016-12-20 Grifols Therapeutics Inc molécula de ácido nucleico isolada, composição, métodos para a amplificação de uma sequência alvo, e para a determinação de hav em uma amostra, e, kit
JP6337470B2 (ja) * 2012-06-20 2018-06-06 東レ株式会社 核酸の検出方法および核酸検出キット
JP5993635B2 (ja) * 2012-07-05 2016-09-14 シーアイ化成株式会社 熱収縮性ポリエステル系フィルムおよびその製造方法
EP2743355B1 (en) 2012-12-13 2016-08-10 F. Hoffmann-La Roche AG HAV detection
RU2542968C2 (ru) * 2013-06-25 2015-02-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых днк-зондов для идентификации рнк энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита а и е из водной среды методом мультиплексной пцр
CA2999403A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-30 Biocartis Nv Improved detection of short homopolymeric repeats
WO2017089767A1 (en) * 2015-11-26 2017-06-01 Dnae Group Holdings Limited Single molecule controls
EP3650553B1 (en) * 2018-11-07 2023-07-12 Siemens Healthcare GmbH Method for detection of specific nucleic acids
CN111690771A (zh) * 2020-06-08 2020-09-22 中联瑞(北京)生物科技有限责任公司 用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组、试剂盒及方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283174A (en) * 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
US5639604A (en) * 1987-09-21 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Homogeneous protection assay
US6004745A (en) * 1987-09-21 1999-12-21 Gen-Probe Incorporated Hybridization protection assay
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
WO1991011534A1 (en) * 1990-01-24 1991-08-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce A rapid and sensitive test for detecting hepatitis a virus
US5200314A (en) * 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
AU3427993A (en) * 1991-12-23 1993-07-28 Chiron Corporation HAV probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
KR20010012175A (ko) * 1997-05-02 2001-02-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프, 피터 알. 쉬어리 폴리뉴클레오티드의 2단계 혼성화 및 포획법
WO2001083814A2 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 Syngenta Participations Ag Assay for nucleic acid analysis

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003276719B2 (en) 2009-03-12
AU2009202099A1 (en) 2009-06-18
RU2005100511A (ru) 2005-08-27
AU2003276719A1 (en) 2003-12-31
MA27319A1 (fr) 2005-05-02
HRP20050037A2 (en) 2005-08-31
JP5361109B2 (ja) 2013-12-04
EP1552022A2 (en) 2005-07-13
US20120219941A1 (en) 2012-08-30
WO2003106641A2 (en) 2003-12-24
EP1552022B1 (en) 2013-01-23
KR20110101254A (ko) 2011-09-15
BR0311768A (pt) 2005-04-05
ZA200500260B (en) 2006-07-26
WO2003106641A3 (en) 2004-10-14
KR20050010902A (ko) 2005-01-28
CN102660539A (zh) 2012-09-12
RU2406762C2 (ru) 2010-12-20
NZ537617A (en) 2006-09-29
CN1675378A (zh) 2005-09-28
LV13290B (en) 2005-07-20
JP2005535309A (ja) 2005-11-24
CA2489346A1 (en) 2003-12-24
JP2013208121A (ja) 2013-10-10
CR7651A (es) 2006-02-22
IS7640A (is) 2005-01-12
ES2402925T3 (es) 2013-05-10
JP2009291200A (ja) 2009-12-17
CA2489346C (en) 2015-07-14
US20040072150A1 (en) 2004-04-15
NO20050179L (no) 2005-03-09
EP1552022A4 (en) 2006-10-18
PL374195A1 (en) 2005-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8551706B2 (en) Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of West Nile Virus
US20120219941A1 (en) Identification of Oligonucleotides for the Capture, Detection and Quantitation of Hepatitis A Viral Nucleic Acid
US8119338B2 (en) Methods and compositions for detecting rhinoviruses
EP1910578A2 (en) Methods and compositions for detecting bk virus
US20030143527A1 (en) Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis B viral DNA
AU2002348426A1 (en) Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis B viral DNA

Legal Events

Date Code Title Description
HC Change of company name or juridical status
FG Grant or registration