CN111690771A - 用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组、检测试剂盒及检测方法，引物组包括外引物OF、外引物OB、内引物IF、内引物IB、环引物LF和环引物LB，其中，所述外引物OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外引物OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述内引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组、检测试剂盒及方法。
背景技术
甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)是引起人类急性病毒性肝炎的主要病原菌，可在海水、淡水、废水和土壤中存活。该病毒具有耐低温和耐清洗剂和某些化学试剂的特性，其传播通常与食用受污染的食物有关，如海产品和肉制品。在全球范围内，甲型肝炎病毒感染是急性病毒性肝炎的主要病因，其发病率十分高，传染途径主要通过粪口途径传播，或通过摄入受污染的食物和水，或通过人与人之间的交流传播。甲型肝炎病毒通过食物传播，除了贝类水产品外，水果和蔬菜，包括草莓、西红柿、生菜、芹菜等，均有可能受到甲型肝炎病毒的污染。流行病学调查表明，甲型肝炎病毒是贝类食物传播的常见病原体，可引起使人衰弱的疾病，甚至导致死亡。1955年，瑞典首次发现由贝类食物传播的传染性肝炎病例，其中629例与食用牡蛎有关。在20世纪80年代，发生了多起食用受污染的贝类食物而患有肝炎的中毒事件。1988年，中国上海暴发了最大规模、最严重的甲型肝炎病毒中毒事件，近30万人在食用了受污染的贝类食品后患肝炎疾病。在东亚、欧洲、美洲、大洋洲、澳大利亚和非洲都曾暴发过与食用贝类食物有关的肝炎疾病，其中，甲型肝炎病毒引发肝炎暴发率高达12.8％。虽然，政府部门在贝类养殖区执行了一些预防污染的战略，但与食用贝类有关的病毒性食源性疫情在许多国家仍在持续发生。目前，各个国家甲型肝炎病感染的发生率各不相同。在发展中国家，大多数人在儿童期受到感染，成年人具有免疫力。然而在发达国家，由于卫生标准的提高，HAV感染已变得不那么常见。儿童期早期感染相对罕见，大多数成年人易感染，这可能导致在普通人群中大规模爆发甲型肝炎。因此，针对食品中甲型肝炎病毒建立一套科学、准确、快速、低廉的检测方法是十分必要的。
传统的检测甲型肝炎病毒方法是在细胞培养中分离病毒，然后进行血清综合分析。然而，传统的检测方法耗时，耗力，且不适合对污染样品进行大规模检测。随着分子生物学的快速发展，基于核酸的检测技术已广泛应用于检测临床、环境和食物样品中甲型肝炎病毒，如PCR技术、逆转录PCR技术和实时荧光定量PCR技术。然而，这些检测技术对实验操作人员和仪器设备要求较高，不适合规模性推广和应用。在对甲型肝炎病毒检测中除了需要提高检测的灵敏性，还应在准确性和特异性方面做进一步研究。
对于目前甲型肝炎病毒检测技术存在的问题主要在于：全基因组测序可准确鉴定病毒，但是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低。实时RT-PCR检测已被开发用于实验室检测甲型肝炎病毒，但是，这些检测方法有内在缺陷，要么需要高精度的放大仪器，要么需要复杂而精细的方法来检测放大产物。基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足食品中甲型肝炎病毒快速检测的需要。综上所述，从目前来看，不同检测方法均存在着各自的优势和弊端，只有综合运用各种检测工具，才能实现快速高效的检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组，该引物组可特异、灵敏扩增甲型肝炎病毒。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组，其包括外引物OF、外引物OB、内引物IF、内引物IB、环引物LF和环引物LB，其中，所述外引物OF的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述外引物OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述内引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的引物组。
如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括2×恒温扩增反应缓冲液、34×TEGreen、BcaBEST酶、AMV逆转录酶。
优选地，2×恒温扩增反应缓冲液，所述BcaBEST酶浓度为102U/μL，AMV逆转录酶为5U/μL。
如上所述的试剂盒，优选地，该试剂盒还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示序列的质粒体外转录RNA，所述空白对照为去核酸的灭菌水。
一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的荧光检测方法，其包括如下步骤：
S1、从样品中提取RNA；
S2、对步骤S1提取的所述RNA进行恒温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述的用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组；
S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，建议重复实验，
若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样品判断为阳性，否则为阴性。
如上所述的荧光检测方法，优选地，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系为25μL，其中，所述反应体系中含有终浓度为：1×恒温扩增反应缓冲液，0.34×TB Green，65U的BcaBEST酶，1U的AMV逆转录酶，0.2μM的外引物OF和外引物OB，1.6μM内引物IF和内引物IB，0.8μM环引物LF和环引物LB；加入RNA模板1.0μL。
如上所述的荧光检测方法，优选地，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系25μL，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有：2×恒温扩增反应缓冲液12.5μL，34×TB Green 0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM外引物OF/OB 0.5μL，40μM内引物IF/IB 1μL，20μM环引物LF/LB 1μL，样品RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。
如上所述的荧光检测方法，优选地，在步骤S2中，所述恒温扩增的程序为63℃条件下反应45min。
如上所述的荧光检测方法，优选地，在步骤S2中，同时设置以如SEQ ID NO.8所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组，可灵敏、特异性的有效用于快速检测食品中的甲型肝炎病毒。本发明提供的荧光检测方法可以检测在贝类水产品、水果、蔬菜和水质中的甲型肝炎病毒，包括草莓、西红柿、生菜、芹菜等检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。所提供的食品中甲型肝炎病毒恒温扩增—实时荧光检测方法和恒温扩增检测试剂盒，性能指标与荧光定量RT-PCR具有同等水平，检测时间可在30分钟-45分钟完成，操作简便、快捷，既可以使用廉价的恒温检测仪，又可以使用荧光定量PCR仪，可适用于现场检测，具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。
附图说明
图1为第一套引物筛选图，阳性出峰时间约10min，空白对照无扩增；
图2为第二套引物筛选图，阳性出峰时间约13min，空白对照55min有微弱翘尾，且曲线倾斜向上，有引物二级结构；
图3为第三套引物筛选图，阳性出峰时间约8min，但空白对照30min出现假阳性；
图4为第四套引物筛选图，阳性出峰时间约25min；
图5为第五套引物筛选图，较晚(约57min时)才出现微弱扩增；
图6为甲型肝炎病毒特异性验证结果；图中标号1为甲型肝炎病毒RNA出现特异性扩增曲线，标号2～5为其他病毒未检测到扩增曲线；
图7为恒温扩增—实时荧光反应体系的筛选优化结果；图中标号1为筛选组合4，标号2为筛选组合3，标号3为筛选组合2，标号4为筛选组合1；
图8为恒温扩增—实时荧光方法检测灵敏度结果；图中标号1～9分别为1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL的不同浓度体外转录RNA；
图9为4份贝类水产品样品中甲型肝炎病毒试剂盒的检测结果；图中标号1～5分别为阳性对照、冻煮杂色蛤肉、冻生开杂色蛤肉、冻杂色蛤、活杂色蛤样品，出现了特异性荧光信号扩增曲线；标号6为空白对照未检测到扩增曲线；
图10为1份水果样品中甲型肝炎病毒试剂盒的检测结果；图中标号1为阳性对照，标号2为速冻红豆果样品，出现了特异性荧光信号扩增曲线；标号3为空白对照未检测到扩增曲线；
图11为2份养殖水样品中甲型肝炎病毒试剂盒的检测结果；图中标号1为阳性对照，标号2和3为养殖水样品，出现了荧光信号特异性扩增曲线；标号4为空白对照未检测到扩增曲线。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1甲型肝炎病毒恒温扩增检测引物组设计及筛选
1.引物组设计
本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行甲型肝炎病毒基因组特异序列的筛选，筛选在甲型肝炎病毒中特异的、在其他病毒中不存在或同源性低的基因片段作为检测分子。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。本发明根据GenBank下载26组甲型肝炎病毒序列，经比对选取甲型肝炎病毒保守区的特异性基因片段多聚蛋白基因(polyprotein gene)(GenBank EU131373)，采用LAMPPrimer Explorer 5软件自行设计引物，设计了五组恒温扩增引物，一组有六个的引物，包括两个外引物(OF和OB)、两个内引物(IF和IB)和两个环引物(LF和LB)，并使用Primerblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。本发明设计的五组引物组基因序列如表1所示。
表1本发明设计的五组甲型肝炎病毒恒温扩增引物组
2.特异性扩增基因片段的序列比对
2.1种内保守性比对
自根据GenBank下载26组甲型肝炎病毒靶标基因序列，经比对分析对在甲型肝炎病毒种内序列同源保守性为100％以上。
2.2种间特异性比对
种间特异性比对结果显示，在种间与其他物种仅约50％序列相似，仅有部分序列与其他物种类似，上下游引物均不在其中，靶标基因序列特异性良好。
3.引物筛选
对本发明设计的五组引物进行筛选优化，引物筛选试验结果表明，第一套引物阳性出峰时间约10min，空白对照无扩增，扩增结果如图1所示；第二套引物阳性出峰时间约13min，空白对照55min有微弱翘尾，且曲线倾斜向上，有引物二级结构，扩增结果如图2所示；第三套引物阳性出峰时间约8min，但空白对照30min出现假阳性，扩增结果如图3所示；第四套引物阳性出峰时间约25min，扩增结果如图4所示；第五套引物较晚约57min才出现微弱扩增，扩增结果如图5所示。由此可见，第一套引物扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线，其它病原体核酸均无扩增，表明本发明所设计的甲型肝炎病毒恒温扩增第一套引物组具有很好的特异性。因此，确定将获得第一套引物组(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6)为最佳的可供特异性检测甲型肝炎病毒恒温扩增引物组序列，其核苷酸序列扩增产物如序列表SEQ ID No.7所示。本实施例的引物组基因序列如表2所示。
表2本发明所用的甲型肝炎病毒恒温扩增引物组
实施例2引物组的特异性扩增验证
1.阳性对照品的制备
根据实施例1获得的最佳甲型肝炎病毒特异性恒温扩增基因序列，选取含阳性扩增的序列SEQ ID NO.7所示序列在内的甲型肝炎病毒基因组靶基因序列如SEQ ID NO.8所示的序列，经人工合成基因制备质粒，并经体外转录RNA作为阳性对照(委托宝生物工程(大连)有限公司完成制备)，分装并于-20℃保存备用。
阳性对照品的基因组序列SEQ ID NO.8：700bp
TTCAAGAGGGGTCTCCGGGAATTTCCGGAGTCCCTCTTGGAAGTCCATGGTGAGGGGACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTTCCCTTTCCCTTTTCCCTTTCCTATTCCCTTTGTTTTGCTTGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTAAATCTGTTTCTCTATAAGAACACTCATTTTTCACGCTTTCTGTCTTCTTTCTTCCAGGGCTCTCCCCTTGCCCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGGGTCAACTCCATGATTAGCATGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGACACAGATGTTTGGAACGTCACCTTGCAGTGTTAACTTGGCTTTCATGAATCTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGACTCTCATCCAGTGGATGCATTGAGTGGATTGACTGTCAGGGCTGTCTTTAGGCTTAATTCCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACATCATTTGGCCTTAAATGGGATTCTGTGAGAGGGGATCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTGTTTGCCTCTGAGGTACTCAG
2.特异性验证病毒
本发明为验证所设计的引物组恒温扩增特异性，选取与甲型肝炎病毒相类似的轮状病毒、诺如病毒、札幌病毒和戊型肝炎病毒等食源性病毒的RNA进行特异性验证。这些RNA均为委托宝生物工程(大连)有限公司人工合成的体外转录RNA。
3.恒温扩增—实时荧光检测
3.1恒温扩增荧光反应体系
恒温扩增—实时荧光反应体系中含有：2×反应缓冲液12.5μL，0.34×TB Green0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM外引物OF/OB 0.5μL，40μM内引物IF/IB 1μL，20μM环引物LF/LB 1μL，1～100ng样品RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。
3.2进行恒温扩增—实时荧光反应。程序为(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)：
等温扩增仪：63℃条件下反应45min。
实时荧光定量PCR仪：荧光基团选择FAM或SYBR，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，45个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
3.3对照扩增反应
3.3.1在试样恒温扩增—实时荧光反应的同时，设置阳性对照、空白对照。
各对照反应体系中，除模板外其余组分及恒温反应条件与3.1相同，且阳性对照、空白对照体积也应达到试样RNA模板体积要求。
3.3.2以如SEQ ID NO.8所示序列的质粒体外转录RNA为模板时，作为恒温扩增反应体系的阳性对照模板。
3.3.3以去核酸的超纯水为模板时，作为恒温扩增—实时荧光反应体系的空白对照模板。
4.结果判定
根据有无“S”型荧光信号扩增曲线判定结果。
阴性：无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45。
阳性：Ct值<35，可报告为阳性。
可疑：Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
5.引物组的特异性扩增验证结果
利用上述方法对甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒、札幌病毒和戊型肝炎病毒的RNA进行检测。结果如图6所示，只有甲型肝炎病毒RNA出现了特异性扩增曲线，其他病毒RNA未检测到扩增曲线，说明所设计的引物特异性强。
实施例3恒温扩增—实时荧光检测反应体系的优化
1.恒温扩增—实时荧光检测反应体系的摸索
使用实施例2中的阳性对照品甲型肝炎病毒体外转录RNA作为检测样本，使用第一套引物组进行恒温扩增—实时荧光检测检测体系的建立及优化测试。按照表3中的试剂组成、浓度及体积配置，设计四个组合用于筛选优化最佳的恒温扩增反应体系。恒温扩增—实时荧光反应程序、对照设置和结果判定按照实施例2中的进行。
表3 恒温扩增反应体系优化的组合筛选配置表
2.恒温扩增—实时荧光检测体系的建立及优化结果
按照表3恒温扩增反应体系优化的组合筛选配置表，分别对阴性对照(Negativecontrol，不含阳性序列的质粒)、0.01ngRNA，0.1ngRNA，1ngRNA(阳性对照)的模板进行恒温扩增，恒温扩增结果见图7。从恒温扩增-实时荧光检测结果来看，添加AMV逆转录酶的筛选组合3和筛选组合4可以明显提高BcaBEST 2.0/BcaBEST 3.0的恒温扩增的反应速率。从BcaBEST评价的反应体系中，筛选组合4的BcaBEST 2.0的效果要好于BcaBEST 3.0。最终确定筛选组合4的具有明显S形扩增曲线，且曲线光滑，Ct值较为合适的检测体系，如表4所示。
表4 恒温扩增的反应体系
| 试剂 | 体积 | 终浓度 |
| 2×恒温扩增反应缓冲液 | 12.5μL | 1× |
| 10μM外引物(OF和OB) | 0.5μL | 0.2μM |
| 40μM内引物(IF和IB) | 1μL | 1.6μM |
| 20μM环引物(LF和LB) | 1μL | 0.8μM |
| 102U/μL BcaBEST酶 | 0.6μL | 65U |
| 5U/μL AMV逆转录酶 | 0.2 μL | 1U |
| 0.34×TB Green | 0.25μL | 0.34× |
| 1～100ng RNA模板 | 1.0μL | —— |
| 去核酸的超纯水 | 补足25μL | —— |
| 总体积 | 25.0μL | —— |
2×恒温扩增反应缓冲液、BcaBEST酶、AMV逆转录酶、TB Green可购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例4恒温扩增—实时荧光检测灵敏度试验
1.灵敏度试验方法
分别将甲型肝炎病毒体外转录RNA质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL，经实施例1的恒温扩增荧光反应体系进行检测，验证本案所设计的甲型肝炎病毒恒温扩增引物组所建立的恒温扩增—实时荧光检测方法的灵敏度。
2.灵敏度试验结果
检测结果如图8所示，图中标号1～9分别为1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL的不同浓度体外转录RNA。经多次试验显示，1copies/μL浓度RNA为概率性检出(70％)；5copies/μL浓度三个平行样本均检出，均存在明显荧光扩增曲线，且曲线形态良好。采用5copies/μL RNA样本作为模板进一步进行20个重复测试，确定本发明所设计的甲型肝炎病毒恒温扩增检测的引物组和反应体系的检测灵敏度为5copies/μL。
常用的Bst DNA聚合酶只有链置换性能，而本发明使用的BcaBEST酶既有链置换性能又具有逆转录性能，结合AMV酶的逆转录作用，增强了逆转录性能效果，因而明显地提高了检测灵敏度。
实施例5一种甲型肝炎病毒恒温扩增检测试剂盒及使用方法
1.该试剂盒的组成包括：
引物组(序列如表2所示)；
2×恒温扩增反应缓冲液；
102U/μL BcaBEST酶；
5U/μL AMV逆转录酶；
34×TB Green；
阳性对照质粒RNA；
去核酸的超纯水。
本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。
2.检测时所需要的器材
保温设备：等温检测仪或实时荧光定量PCR仪；移液器(量程0.1-200μL)；样品架、浮子(仅用于水浴锅)；乳胶或一次性手套若干。
3.试剂盒的应用方法
3.1样本要求
适用样本类型：水产品、水果和蔬菜等样本。样本RNA提取可以按照提取试剂盒操作进行，把样本RNA用于检测实验或保存于-80℃。
3.2操作步骤
(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，放置于冰盒上。
(2)依据表4中的的恒温扩增—实时荧光反应体系加样于EP管。
2×恒温扩增反应缓冲液(可购自宝生物工程(大连)有限公司)是将恒温扩增反应所需的含有dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、甜菜碱等反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。
(3)试剂配制
若有N个待检样品，则参照下表5，按照N+5个数量计算各组分用量(N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照+1个空白对照，还有一些不必要的损失)，将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30秒，取24μL分装于0.2mL PCR管中，分别加入待测RNA样品1μL用于检测。
表5 N个待检样品试剂配制参考表
4.3依据实施例2的恒温扩增—实时荧光反应体系上样。
4.4依据实施例2的结果判定规则进行结果的判定。
每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
5注意事项
上述试剂以及阳性对照品在-20℃条件下保存。
反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
实施例6检测食品中甲型肝炎病毒试剂盒的应用
1.病毒的收集
1.1贝类中病毒的收集
取贝类数量不得少于10只，用无菌刀剥离贝类内脏团中消化腺，匀浆，称取约2g并转移至50mL离心管中，加入1mL PBS混匀。加入10μL的蛋白酶K，漩涡混匀，37℃320r/min摇床孵育1h，而后60℃水浴摇床再次孵育15min。室温下3 000g离心5min，取上清液转移至一新的50mL离心管中，记录体积数，用于RNA的提取。
1.2硬果表面病毒的收集
将浸润PBS的无菌棉擦拭硬果表面，记录擦拭面积，适合最大擦拭面积约100cm2。无菌棉放入500μL 0.5mol/L的硫氤酸弧裂解缓冲液中，按压无菌棉，将液体全部挤出，重复上述操作3次，留取裂解液用于RNA的提取。
1.3软果表面病毒的收集
取软果6颗～12颗放入400mL体积的带滤网的均质袋中，加入40mL TGBE缓冲液、30U的黑曲霉果胶酶，室温下60r/min振荡孵育20min。对于酸性软果，在孵育过程中，每10min监测洗脱液的pH值，当pH值低于9.0，则应用NaOH溶液调节至9.5。每调节一次pH值，则需要延长10min的孵育时间。将洗脱液转移到50mL离心管中，4℃10 000g离心30min，上清液转入干净的离心管中，用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0。加入0.25体积的5×PEG/NaCl溶液，振荡60s，5℃过夜或60r/min振荡孵育60min。5℃10 000g离心30min，弃上清液，50℃10000g离心5min，弃上清液，加入500μL PBS重悬沉淀。对于浆液过多的部分软果类样品，PBS重悬沉淀后，加入500μL的氯仿-正丁醇，涡旋混合，室温下孵育5min，5℃10 000g离心15min，取上清液用于RNA的提取。
1.4蔬菜中病毒的收集
蔬菜用生理盐水或PBS或灭菌水溶解为5～10％浓度悬浊。10,000～15,000rpm离心5min，取上清液用于RNA的提取。
1.5水中病毒的收集
取水样品体积(适合0.3L～5L)，混匀。正压或抽滤方法将水体滤过直径47mm、孔径0.45μm的正离子滤膜，将滤膜转移至一新的50mL离心管A中，加入4mL TGBE缓冲液。在原盛装样品的瓶子中加入10mL TGBE缓冲液，室温下500r/min摇床振荡离心管A和瓶子20min，收集离心管A和容器中的洗脱液至新离心管B中。在瓶子中再加入TGBE缓冲液2mL，颠倒数次冲刷瓶壁，收集洗脱液至50mL离心管B中。用0.1mol/L盐酸溶液调节洗脱液至pH 7.0，收集洗脱液并转移至超滤管，4 000g离心15min。将超滤管底浓缩液转移至新的离心管，用PBS溶液补齐体积至500/L，保留用于RNA的提取。
2.RNA提取
按照磁珠法病毒RNA提取试剂盒的操作步骤提取甲型肝炎病毒样本的RNA(071091M，可购自于广州双螺旋基因科技有限公司)。用50μL去核酸的超纯水进行溶解并置于-80℃环境备用。
注：或采用其他商品化的提取试剂盒提取样品RNA。3.将该检测方法应用于市场中贝类水产品、水果、蔬菜等食品以及滩涂养殖用水的检测，按照上述方法进行样品处理和提取总RNA，进行恒温扩增—实时荧光反应，检测其中是否含有甲型肝炎病毒。
4.用本发明的试剂盒对于获取的167份食品样品，包括冻杂色蛤、活杂色蛤、扇贝等113份贝类，草莓、红豆果等35份水果，西红柿、生菜、芹菜等6份蔬菜，养殖水等13份水样品进行了检测。结果显示，从冻煮杂色蛤肉、冻生开杂色蛤肉、冻杂色蛤、活杂色蛤等4份贝类样品检出甲型肝炎病毒阳性，结果如图9所示，图中标号1～5分别为阳性对照、冻煮杂色蛤肉、冻生开杂色蛤肉、冻杂色蛤、活杂色蛤样品，出现了特异性荧光信号扩增曲线；标号6为空白对照未检测到扩增曲线；
速冻红豆果1份水果样品检出甲型肝炎病毒阳性，结果如图10所示，图中标号1为阳性对照，标号2为速冻红豆果样品，出现了特异性荧光信号扩增曲线；标号3为空白空白对照未检测到扩增曲线；
2份养殖水样品中检出甲型肝炎病毒阳性，其余为阴性。结果如图11所示，。图中标号1为阳性对照，标号2和3为养殖水样品，出现了荧光信号特异性扩增曲线；标号4为空白空白对照未检测到扩增曲线。
5.采用实时荧光定量RT-PCR方法《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时RT-PCR方法》SN/T 4784—2017，对采用本发明的试剂盒检测上述食品和水样品的甲型肝炎病毒检测结果进行验证，阳性重复性为100％，且本发明试剂盒检测呈现的荧光信号增幅Ct值明显优于实时RT-PCR方法，具有检测灵敏度高的优势，如例举部分的Ct值比较结果见表6。
表6 本发明试剂盒与现有的实时RT-PCR法的检测Ct值比较结果
本发明的方法应用于食品中甲型肝炎病毒检测将具有广阔的前景，广泛适用于对贝类水产品、水果、蔬菜、环境水质等领域。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
序列表
<110> 中联瑞（北京）生物科技有限责任公司，大连民族大学
<120> 用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组、试剂盒及方法
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtcaactcc atgattagca t 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagtacctc agaggcaa 18
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccaaggca tctcttcata gaagtttgga acgtcacctt gc 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggaggactg actctcatcc aagaggtctg gaattaagcc ta 42
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccttgtgga agatcaaaga ga 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcattgagtg gattgactgt c 21
<210> 7
<211> 424
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtcaactcc atgattagca tggagctgta ggagtctaaa ttggggacac agatgtttgg 60
aacgtcacct tgcagtgtta acttggcttt catgaatctc tttgatcttc cacaaggggt 120
aggctacggg tgaaacctct taggctaata cttctatgaa gagatgcctt ggatagggta 180
acagcggcgg atattggtga gttgttaaga caaaaaccat tcaacgccgg aggactgact 240
ctcatccagt ggatgcattg agtggattga ctgtcagggc tgtctttagg cttaattcca 300
gacctctctg tgcttagggc aaacatcatt tggccttaaa tgggattctg tgagagggga 360
tccctccatt gacagctgga ctgttctttg gggccttatg tggtgtttgc ctctgaggta 420
ctca 424
<210> 8
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcaagaggg gtctccggga atttccggag tccctcttgg aagtccatgg tgaggggact 60
tgatacctca ccgccgtttg cctaggctat aggctaaatt ttccctttcc cttttccctt 120
tcctattccc tttgttttgc ttgtaaatat taattcctgc aggttcaggg ttcttaaatc 180
tgtttctcta taagaacact catttttcac gctttctgtc ttctttcttc cagggctctc 240
cccttgccct aggctctggc cgttgcgccc ggcggggtca actccatgat tagcatggag 300
ctgtaggagt ctaaattggg gacacagatg tttggaacgt caccttgcag tgttaacttg 360
gctttcatga atctctttga tcttccacaa ggggtaggct acgggtgaaa cctcttaggc 420
taatacttct atgaagagat gccttggata gggtaacagc ggcggatatt ggtgagttgt 480
taagacaaaa accattcaac gccggaggac tgactctcat ccagtggatg cattgagtgg 540
attgactgtc agggctgtct ttaggcttaa ttccagacct ctctgtgctt agggcaaaca 600
tcatttggcc ttaaatggga ttctgtgaga ggggatccct ccattgacag ctggactgtt 660
ctttggggcc ttatgtggtg tttgcctctg aggtactcag 700
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catggagctg taggagtcta 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagtacctc agaggcaa 18
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctccggcgt tgaatggtaa cctcttaggc taatacttct atg 43
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actgactctc atccagtgga agaggtctgg aattaagcct a 41
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaatatccg ccgctgt 17
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcattgagtg gattgactgt c 21
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttggaacgtc accttgc 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgagtacctc agaggcaa 18
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctccggcgt tgaatggtac ttctatgaag agatgccttg 40
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
actgactctc atccagtgga agaggtctgg aattaagcct a 41
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaatatccg ccgctgt 17
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcattgagtg gattgactgt c 21
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
taggctctgg ccgttg 16
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgagtacctc agaggcaa 18
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtttcacccg tagcctaccc catggagctg taggagtcta 40
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cggaggactg actctcatcc aagaggtctg gaattaagcc ta 42
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccaagttaac actgcaaggt g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcattgagtg gattgactgt c 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcatggagct gtaggagtct 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tccactggat gagagtcagt 20
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgtagcctac cccttgtgga aggtttggaa cgtcaccttg ca 42
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgccttggat agggtaacag cgctccggcg ttgaatggtt 40
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcggatattg gtgagttgtt aaga 24
Claims (9)
1.一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组，其特征在于，其包括外引物OF、外引物OB、内引物IF、内引物IB、环引物LF和环引物LB，其中，所述外引物OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外引物OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述内引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×恒温扩增反应缓冲液、34×TB Green、BcaBEST酶、AMV逆转录酶。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含如SEQ ID NO.8所示序列的质粒体外转录RNA，所述空白对照为去核酸的超纯水。
5.一种用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的荧光检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、从样品中提取RNA；
S2、对步骤S1提取的所述RNA进行恒温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1所述的用于检测食品中甲型肝炎病毒恒温扩增的引物组；
S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，建议重复实验；
若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样品判断为阳性，否则为阴性。
6.根据权利要求5所述的荧光检测方法，其特征在于，在步骤S2中，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系25μL，其中，所述反应体系中含有终浓度为：1×恒温扩增反应缓冲液，0.34×TB Green，65U的BcaBEST酶，1U的AMV逆转录酶，0.2μM的外引物OF和外引物OB，1.6μM内引物IF和内引物IB，0.8μM环引物LF和环引物LB；加入RNA模板1.0μL。
7.根据权利要求5所述的荧光检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系25μL，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有：2×反应缓冲液12.5μL，34×TB Green 0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM外引物OF/OB 0.5μL，40μM内引物IF/IB 1μL，20μM环引物LF/LB 1μL，样品RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。
8.根据权利要求5所述的荧光检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述恒温扩增的程序为63℃条件下反应45min。
9.根据权利要求5所述的荧光检测方法，其特征在于，在步骤S2中，同时设置以如SEQID NO.8所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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