CN112760423B - 用于检测诺如病毒gi型和gii型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
用于检测诺如病毒gi型和gii型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测领域，具体涉及用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法，引物组包括诺如病毒GI型引物组和诺如病毒GII型引物组，诺如病毒GI型引物组包括外引物GI‑OF、外引物GI‑OB、内引物GI‑IF、内引物GI‑IB、环引物GI‑LF和环引物GI‑LB，诺如病毒GII型引物组包括外引物GII‑OF、外引物GII‑OB、内引物GII‑IF、内引物GII‑IB、环引物GII‑LF和环引物GII‑LB。该引物组可特异、灵敏扩增诺如病毒GI型和GII型，该检测方法操作简单、快速、准确、灵敏度高，成本较低，对实验操作人员和仪器设备要求不高，适合规模性推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
诺如病毒(Norwalk Viruses)是一种无包膜单股正链RNA病毒，属杯状病毒科，是导致非细菌性肠胃炎的主要原因。诺如病毒可分为G I～G V五个基因群，其中引起人类感染的主要是GI和GII群。在已报道的由病原菌引起的食源性疾病中，超过58％的病例是由诺如病毒所致。据统计，在美国，诺如病毒每年造成570至800人死亡，5.6万至7.1万人住院，40万人次急诊，170万至190 万人次门诊。诺如病毒病的主要特征是喷射性呕吐、非血性腹泻、恶心、腹部绞痛和低烧等，潜伏期约为12至48小时。在健康人群中，症状持续时间一般不超过48h，属于自限性疾病，但儿童和老年人感染后症状更严重、患病时间更长，甚至增加了住院的风险。在温带地区的国家，大多数感染发生在秋季和冬季，至少70％的疫情报告发生在半封闭的区域，如卫生保健机构、学校、医院和游轮。诺如病毒可以通过多种途径感染人类，包括口腔途径，通过接触受感染者的排泄物或雾化的呕吐物，以及通过受污染的表面、食物或水传播。
由于诺如病毒具有较高传染性，因此快速、准确的检测技术对预防和控制其传播具有重要意义。目前，国内外报道的诺如病毒的核酸检测方法主要有常规PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR和基因芯片等。常规PCR和巢式PCR 操作繁琐，扩增产物需要经过电泳检测才能观察到扩增结果，检测时间长，灵敏度较差。实时荧光定量PCR对操作人员有很高的经验要求，对实验环境有着严格的分区要求，不利于在基层现场推广使用。基因芯片技术检测成本昂贵，稳定性较差，目前还无法在基层推广应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法。该引物组可特异、灵敏扩增诺如病毒GI型和GII型，该检测方法操作简单、快速、准确、灵敏度高，成本较低，对实验操作人员和仪器设备要求不高，适合规模性推广和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组，所述引物组包括诺如病毒GI型引物组和诺如病毒GII型引物组；
其中，所述诺如病毒GI型引物组包括SEQ ID NO.1所示的外引物GI-OF、 SEQ IDNO.2所示的外引物GI-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物GI-IF、SEQ ID NO.4所示的内引物GI-IB、SEQ ID NO.5所示的环引物GI-LF和SEQ ID NO.6 所示的环引物GI-LB；
其中，所述诺如病毒GII型引物组包括SEQ ID NO.7所示的外引物GII-OF、 SEQ IDNO.8所示的外引物GII-OB、SEQ ID NO.9所示的内引物GII-IF、SEQ ID NO.10所示的内引物GII-IB、SEQ ID NO.11所示的环引物GII-LF和SEQ ID NO.12所示的环引物GII-LB。
本发明提供的一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组，可灵敏、特异性的有效用于快速检测诺如病毒GI型和GII型。
第二方面，本发明提供了一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组。
优选的是，所述试剂盒还包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液、100×SYBR Green I、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶。
上述任一方案中优选的是，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含如SEQ ID NO.13所示序列的质粒体外转录RNA，所述阴性对照为去核酸的超纯水。
本发明提供的试剂盒灵敏度高、特异性强、可以快速扩增诺如病毒GI型和GII型，具有广阔的应用前景。
第三方面，本发明提供了一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的荧光检测方法，包括如下步骤：
步骤S1、从样品中提取RNA；
步骤S2、对所述RNA进行恒温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1所述的用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组；
步骤S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
优选的是，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系包括以下终浓度的反应混合物：(0.75～1.25)×RNA恒温扩增反应缓冲液、(1.5～2.5)×SYBR Green I、0.28～0.36U/μLBst DNA聚合酶、0.03～0.05U/μL AMV逆转录酶、0.1～0.3μM 外引物OF、0.1～0.3μM外引物OB、1.5～1.7μM内引物IF、1.5～1.7μM内引物IB、 0.7～0.9μM环引物LF、0.7～0.9μM环引物LB。
上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系的体积为20～55μL。
上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系体积为 25μL，其中，所述反应体系中包括以下终浓度的反应混合物：1×RNA恒温扩增反应缓冲液、2×SYBR Green I、0.32U/μL Bst DNA聚合酶、0.04U/μL AMV逆转录酶、0.2μM外引物OF、0.2μM外引物OB、1.6μM内引物IF、1.6μM内引物IB、0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB。
上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液12.5μL、 100×SYBR Green I 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、5U/μL AMV逆转录酶0.2μL、引物组1μL、样品RNA模板2.0μL、其余为去核酸的超纯水补足25μL。
上述任一方案中优选的是，所述引物组1μL包括5μM外引物OF、5μM外引物OB、40μM内引物IF、40μM内引物IB、20μM环引物LF和20μM环引物LB。
上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，所述恒温扩增的程序为63℃条件下反应45min。
上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，同时设置以如SEQ ID NO.13所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为阴性对照进行检测。
本发明提供的检测方法操作简单，不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，快速、准确、灵敏度高、特异性强，成本较低，对实验操作人员和仪器设备要求不高，适合规模性推广和应用。
附图说明
图1为采用诺如病毒GI型第一组引物进行检测获得的扩增曲线；
图2为采用诺如病毒GI型第二组引物进行检测获得的扩增曲线；
图3为采用诺如病毒GI型第三组引物进行检测获得的扩增曲线；
图4为采用诺如病毒GI型第四组引物进行检测获得的扩增曲线；
图5为采用诺如病毒GI型第五组引物进行检测获得的扩增曲线；
图6为采用诺如病毒GII型第一组引物进行检测获得的扩增曲线；
图7为采用诺如病毒GII型第二组引物进行检测获得的扩增曲线；
图8为采用诺如病毒GII型第三组引物进行检测获得的扩增曲线；
图9为采用诺如病毒GII型第四组引物进行检测获得的扩增曲线；
图10为采用诺如病毒GII型第五组引物进行检测获得的扩增曲线；
图11为采用诺如病毒GI型和GII型最佳引物组进行检测的特异性验证结果图；
图12为实时荧光恒温扩增方法检测诺如病毒GI型灵敏度结果图；
图13为实时荧光恒温扩增方法检测诺如病毒GII型灵敏度结果图；
图14为8份活杂色蛤等贝类样品中检测诺如病毒GI型阳性的结果图；
图15为7份活杂色蛤等贝类样品中检测诺如病毒GII型阳性的结果图；
图16为2份草莓样品检测诺如病毒GI型阳性的结果图；
图17为2份草莓样品检测诺如病毒GII型阳性的结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
第一方面，本发明实施例提供了一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组，所述引物组包括诺如病毒GI型引物组和诺如病毒GII型引物组；
其中，所述诺如病毒GI型引物组包括SEQ ID NO.1所示的外引物GI-OF、 SEQ IDNO.2所示的外引物GI-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物GI-IF、SEQ ID NO.4所示的内引物GI-IB、SEQ ID NO.5所示的环引物GI-LF和SEQ ID NO.6 所示的环引物GI-LB；
其中，所述诺如病毒GII型引物组包括SEQ ID NO.7所示的外引物GII-OF、 SEQ IDNO.8所示的外引物GII-OB、SEQ ID NO.9所示的内引物GII-IF、SEQ ID NO.10所示的内引物GII-IB、SEQ ID NO.11所示的环引物GII-LF和SEQ ID NO.12所示的环引物GII-LB。
本发明实施例提供的一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组，可灵敏、特异性的有效用于快速检测食品中的诺如病毒GI型和GII型。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的检测诺如病毒GI型和GII 型恒温扩增的引物组。
本发明实施例提供的试剂盒灵敏度高、特异性强、可以快速扩增诺如病毒 GI型和GII型，具有广阔的应用前景。
本发明实施例提供的食品中诺如病毒GI型和GII型实时荧光恒温扩增检测试剂盒，检测灵敏度优于荧光定量RT-PCR，检测时间相比荧光定量RT-PCR缩短一半，可在35分钟内完成，操作简便、快捷，既可以使用廉价的恒温荧光检测仪，又可以使用荧光定量PCR仪，可适用于现场检测，具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。
进一步地，所述试剂盒还包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液、100×SYBR Green I、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含如 SEQ IDNO.13所示序列的质粒体外转录RNA，所述阴性对照为去核酸的超纯水。
第三方面，本发明实施例提供了一种用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的荧光检测方法，包括如下步骤：
步骤S1、从样品中提取RNA；
步骤S2、对所述RNA进行恒温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1所述的用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组；
步骤S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
本发明实施例提供的检测方法可以检测在贝类食品、浆果中的诺如病毒GI 型和GII型，操作简单，核酸扩增在63℃恒温条件下即可进行；快速高效，不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，特别是添加环引物后在20-30min即可检测到扩增产物，且产物可以扩增到109倍，准确、灵敏度高、特异性强，成本较低，对实验操作人员和仪器设备要求不高，适合规模性推广和应用。
进一步地，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系包括以下终浓度的反应混合物：(0.75～1.25)×RNA恒温扩增反应缓冲液(例如可以为0.75×RNA 恒温扩增反应缓冲液、1×RNA恒温扩增反应缓冲液或1.25×RNA恒温扩增反应缓冲液等)、(1.5～2.5)×SYBRGreen I(例如可以为1.5×SYBR Green I、2×SYBR Green I或2.5×SYBR Green I等)、0.28～0.36U/μL Bst DNA聚合酶(例如浓度可以为0.28U/μL、0.32U/μL或0.36U/μL等)、0.03～0.05U/μL AMV逆转录酶 (例如浓度可以为0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL等)、0.1～0.3μM外引物 OF(例如浓度可以为0.1μM、0.2μM或0.3μM等)、0.1～0.3μM外引物OB(例如浓度可以为0.1μM、0.2μM或0.3μM等)、1.5～1.7μM内引物IF(例如浓度可以为1.5μM、1.6μM或1.7μM等)、1.5～1.7μM内引物IB(例如浓度可以为 1.5μM、1.6μM或1.7μM等)、0.7～0.9μM环引物LF(例如浓度可以为0.7μM、 0.8μM或0.9μM等)、0.7～0.9μM环引物LB(例如浓度可以为0.7μM、0.8μM 或0.9μM等)。
进一步地，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系的体积为20～55μL，例如反应体系的体积可以为20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL或 55μL等。
进一步地，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系体积为25μL，其中，所述反应体系中包括以下终浓度的反应混合物：1×RNA恒温扩增反应缓冲液、2×SYBR Green I、0.32U/μL Bst DNA聚合酶、0.04U/μL AMV逆转录酶、0.2μM 外引物OF、0.2μM外引物OB、1.6μM内引物IF、1.6μM内引物IB、0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB。
进一步地，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液12.5μL、100×SYBR Green I 0.5μL、8U/μL BstDNA聚合酶1μL、5U/μL AMV逆转录酶0.2μL、引物组1μL、样品RNA模板2.0μL、其余为去核酸的超纯水补足25μL。
进一步地，所述引物组1μL包括5μM外引物OF、5μM外引物OB、40μM 内引物IF、40μM内引物IB、20μM环引物LF和20μM环引物LB。
进一步地，当检测样品中是否存在诺如病毒GI型时，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液12.5μL、100×SYBR Green I 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶 1μL、5U/μL AMV逆转录酶0.2μL、引物组1μL(包括：5μM外引物GI-OF、5μM 外引物GI-OB、40μM内引物GI-IF、40μM内引物GI-IB、20μM环引物GI-LF、 20μM环引物GI-LB)、样品RNA模板2.0μL、其余为去核酸的超纯水补足25μL。
进一步地，当检测样品中是否存在诺如病毒GII型时，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液12.5μL、100×SYBR Green I 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、 5U/μL AMV逆转录酶0.2μL、引物组1μL(包括：5μM外引物GII-OF、5μM 外引物GII-OB、40μM内引物GII-IF、40μM内引物GII-IB、20μM环引物GII-LF、 20μM环引物GII-LB)、样品RNA模板2.0μL、其余为去核酸的超纯水补足25μL。
进一步地，在步骤S2中，所述恒温扩增的程序为63℃条件下反应45min。
进一步地，在步骤S2中，同时设置以如SEQ ID NO.13所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为阴性对照进行检测。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1诺如病毒GI型和GII型实时荧光恒温扩增的引物组设计及筛选
1.引物组设计
本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行诺如病毒 GI型基因组特异序列的筛选，筛选在诺如病毒GI型中特异的、在其他病毒中不存在或同源性低的基因片段作为检测分子。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。诺如病毒基因组具有3个开放阅读框 (Open reading frames,ORFs)，ORF1编码的是聚合蛋白，其在3C蛋白酶的作用下，可产生包括RNA多聚酶在内的6种功能不同的非结构蛋白，按N-C端的顺序依次编码：蛋白48(p48)、NTP酶(NTPase)、蛋白22(p22/p20)、病毒基因组连接蛋白(Vpg)、类3C蛋白酶(3CLpro)和RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)。ORF2和ORF3共同编码结构蛋白，负链RNA经过复制后，得到包括 ORF2和ORF3的亚基因组，其中ORF2编码主要结构蛋白VP1，其含有诺如病毒 GI型特异性的抗原决定簇；ORF3编码病毒微小结构蛋白VP2。ORF1-ORF2的连接点附近的序列是相对最保守的。
本发明根据GenBank下载16组诺如病毒GI型序列，选取诺如病毒GI型的特异性基因片段(GenBank M87661.2)的ORF1-ORF2连接序列保守区，采用LAMP Primer Explorer 5软件自行设计引物，针对诺如病毒GI型设计了五组恒温扩增引物，一组有六个恒温扩增的引物，包括两个外引物(OF和OB)、两个内引物 (IF和IB)和两个环引物(LF和LB)，并使用Primer blast(http://www.ncbinlm.nih. gov/tools/primer-blast/)进行评估。本发明设计的GI型五组引物组基因序列如表 1所示。
本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行诺如病毒 GII型基因组特异序列的筛选，筛选在诺如病毒GII型中特异的、在其他病毒中不存在或同源性低的基因片段作为检测分子。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。据文献报道，诺如病毒GII型4型一直是世界各地流行诺如病毒的主要基因型，约占70％-82％。中国分离到的诺如病毒主要基因型同样主要为GII型4型，约占70％。本发明根据GenBank下载16 组诺如病毒GII型序列，选取诺如病毒GII型4型的特异性基因片段(GenBank HM802555.1)RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp) 基因保守区，采用LAMP Primer Explorer 5软件自行设计引物，针对诺如病毒GII 型设计了五组恒温扩增引物，一组有六个恒温扩增的引物，包括两个外引物(OF 和OB)、两个内引物(IF和IB)和两个环引物(LF和LB)，并使用Primer blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。本发明设计的GII 型五组引物组基因序列如表2所示。
表1本发明设计的五组诺如病毒GI型实时荧光恒温扩增引物组
表2本发明设计的五组诺如病毒GII型实时荧光恒温扩增引物组
2.特异性扩增基因片段的序列比对
2.1诺如病毒GI型种内保守性和种外特异性比对分析
自根据GenBank下载16组诺如病毒GI型序列，经限制在诺如病毒GI型种内保守性BLAST比对分析，诺如病毒GI型的特异性基因片段(GenBank M87661.2) 的ORF1-ORF2连接序列保守性较好，序列同源性为98％～100％。经限制在诺如病毒GI型种外特异性BLAST比对分析，特异性良好，在ORF1-ORF2连接特异序列设计引物能够将鉴定出诺如病毒GI型。
2.2诺如病毒GII型种内保守性和种外特异性比对分析
自根据GenBank下载16组诺如病毒GII型序列，经限制在诺如病毒GII型种内保守性BLAST比对分析，诺如病毒GII型的特异性基因片段(GenBank HM802555.1)的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase， RdRp)基因序列保守性较好，序列同源性为98.8％～100％。经限制在诺如病毒 GII型种外特异性BLAST比对分析，特异性良好，在RdRp特异序列设计引物能够将鉴定出诺如病毒GII型。
3.引物筛选
对本发明设计的诺如病毒GI型五组引物进行筛选优化，引物筛选试验结果表明，第一组引物2个阳性对照出峰时间约7min，一个阴性对照56min有轻微翘尾，扩增结果如图1所示；第二组引物2个阳性对照出峰时间约10min和11min，阴性对照无扩增，扩增结果如图2所示；第三组引物2个阳性对照出峰时间约 11min和11.5min，阴性对照无扩增，扩增结果如图3所示；第四组引物2个阳性对照出峰时间约7min，一个阴性对照在55min处有大幅度翘尾，扩增结果如图4 所示；第五组引物2个阳性对照出峰时间约7min，1个阴性对照在59min处有轻微翘尾，扩增结果如图5所示。由此可见，第二组引物扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线，其它病原体核酸均无扩增，表明本发明所设计的诺如病毒GI型实时荧光恒温扩增第二组引物组具有很好的特异性。因此，确定选用第二组引物组为最佳的可供特异性检测诺如病毒GI型实时荧光恒温扩增引物组序列。本实施例最终确定的诺如病毒GI型引物组基因序列如表3所示，其中阳性对照为实施例2中制备的阳性对照品，阴性对照为去核酸的超纯水。
表3本发明设计的诺如病毒GI型实时荧光恒温扩增引物组
对本发明设计的诺如病毒GII型五组引物进行筛选优化，引物筛选试验结果表明，第一组引物2个阳性对照出峰时间约30min，曲线倾斜向上，有引物二级结构(图6)；第二组引物2个阳性对照出峰时间约13min，曲线倾斜向上，有引物二级结构(图7)；第三组引物阳性对照约54min出峰(图8)；第四组引物2 个阳性对照出峰时间约26-30min，曲线倾斜向上，有引物二级结构(图9)；第五组引物2个阳性对照出峰时间约12min，阴性对照无扩增(图10)。由此可见，第五套引物扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线，其它病原体核酸均无扩增，表明本发明所设计的诺如病毒GII型实时荧光恒温扩增第五组引物组具有很好的特异性。因此，确定选择第五组引物组为最佳的可供特异性检测诺如病毒GII 型恒温扩增引物组序列。本实施例最终确定的诺如病毒GII型引物组基因序列如表4所示。
表4本发明设计的诺如病毒GII型实时荧光恒温扩增引物组
实施例2引物组的特异性扩增验证
1.阳性对照品的制备
根据实施例1获得的最佳诺如病毒GI型、GII型特异性恒温扩增基因序列，选取含诺如病毒GI型和GII型阳性扩增的序列在内的如SEQ ID NO.13所示的序列构建质粒作为阳性对照，其中在GI型和GII型阳性对照基因序列的上下游分别添加了1个酶切位点碱基序列，在GI型、GII型中间添加了2个酶切位点碱基序列，在GII型后面添加了两个酶切位点碱基序列。诺如病毒GI型和GII型阳性对照如 SEQ ID NO.13经人工合成基因制备质粒，并经体外转录RNA作为阳性对照(委托宝生物工程(大连)有限公司完成制备)，分装并于-20℃保存备用。SEQ ID NO.13所示的序列中存在多个酶切位点，用于后续的酶切和连接反应，可以保护碱基，确保酶切效果更好，用于提高将来酶切时的活性。
诺如病毒GI群和GII群阳性对照品的基因组序列SEQ ID NO.13：
GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGAAGCTTGAAAGATTTCCAGCAA GGTCATACATGAAATCAAGACTGGTGGATTGGAAATGTATGTCCCAGGATG GCAGGCCATGTTCCGCTGGATGCGCTTCCATGACCTCGGATTGTGGACAG GAGATCGCGATCTTCTGCCCGAATTCGTAAATGATGATGGCGTCTAAGGAC GCTACATCAAGCGTGGATGGCGCTAGTGGCGCTGGTCAGTTGGTACCGGA GGTTAATGCTTCTGACCCTCTTGCAATGGATCCTGTAGCAGGTTCTTCGAC AGCAGTCGCGACTGCTGGACAAGTTAATCCTATTGATCCCTGGATAATTAA TAATTTTGTGCAAGCCCCCCAAGGTGAATTTACTATTTCCCCAAATAATACC CCCGGTGATGTTTTGTTTGATTTGAGTTTGGGTCCCCATCTTAATCCTTTCT TGCTCCATCTATCACAAATGTATAATGGTTGGGTTGGTAACATGAGAGTCA GGATTATGCTAGCTGCCATGGCATATGGGCGGTGACAGCAAGGGGACCT ACTGCGGTGCACCAATCTTAGGTCCAGGAAGTGCCCCAAAGCTCAGC ACCAAGACTAAATTCTGGAGATCATCCACGGCACCACTCCCACCTGG TACCTATGAGCCAGCCTACCTCGGCGGCAAGGACCCCAGAGTTAAGG GTGGCCCTTCATTGCAACAAGTTATGAGGGACCAGCTGAAACCATTC ACTGAACCCAGGGGTAAACCACCAAAACCAAGTGTGTTAGAAGCTGC CAAGAAAACCATCGTCAATGTCCTTGAACAAACAATTGATCCACCTC AAAAATGGTCATTTGCGCAGGCATGCGCATCCCTTGACAAGACCACT TCCAGTGGTCACCCGCACCACATGCGGAAAAACGACTGCTGGAACG GGGAATCCTTTACAGGCAAATTGGCAGACCAGGCTTCCAAGGCCAAC CTGATGTTCGAGGAGGGAAAGAACATGACCCCAGTCTACACGGGTG CGCTTAAGGACGAGCTGGTCAAGACTGACAAAATTTATGGCAAGATC AAAAAGAGGCTTCTCTGGGGTTCGGACCTGGCGACCATGATCCGGT GCGCTCGAGCATTCGGGGATATCCCCGGG
2.特异性验证病毒
本发明为验证所设计的引物组恒温扩增特异性，选取与诺如病毒GI型、GII 型相类似的轮状病毒核酸、甲型肝炎病毒核酸、札幌病毒核酸和戊型肝炎病毒核酸等食源性病毒核酸进行特异性验证。
3.实时荧光恒温扩增检测
恒温扩增是利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增。恒温扩增反应需要特别设计2 条内引物和2条外引物，以及提高扩增效率的环引物，特异性靶DNA在 60℃～65℃恒温条件下(如水浴箱内)保温约30min，即可完成恒温核酸扩增反应。恒温扩增最终产物是由大量菜花样结构组成的茎环状DNA混合物，由于恒温扩增产生了巨大数量的DNA产物，故可通过反应管内副产物的浊度或荧光(如：荧光染料SYBR Green I)来对产物进行检测。
3.1实时荧光恒温扩增反应体系
实时荧光恒温扩增反应体系总体积为25μL，其中含有：2×RNA恒温扩增反应缓冲液12.5μL，100×SYBR Green I 0.5μL，8U/μL Bst DNA聚合酶1μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，引物组1μL(包括：5μM外引物OF、5μM外引物OB、40μM 内引物IF、40μM内引物IB、20μM环引物LF、20μM环引物LB)，样品RNA模板2.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL，具体如表5所示，其中，2×RNA恒温扩增反应缓冲液可购自广州双螺旋基因科技有限公司，SYBR Green I购自 Invitrogen公司，Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶购自New England Biolabs公司。
表5实时荧光恒温扩增反应体系各组分
3.2进行实时荧光恒温扩增反应。程序为(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)：
恒温荧光检测仪：63℃条件下反应45个循环。
实时荧光定量PCR仪：荧光基团选择FAM或SYBR，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，45个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
本发明使用实时荧光定量PCR仪进行恒温扩增。
3.3对照扩增反应
3.3.1在试样实时荧光恒温扩增反应的同时，设置阳性对照、阴性对照。
各对照反应体系中，除模板外其余组分及恒温反应条件与3.1相同，且阳性对照、阴性对照体积也应达到试样RNA模板体积要求。
3.3.2以如SEQ ID NO.13所示序列的质粒体外转录RNA作为恒温扩增反应体系的阳性对照模板。
3.3.3以去核酸的超纯水作为恒温扩增反应体系的阴性对照模板。
4.结果判定
根据有无“S”型荧光信号扩增曲线判定结果。
阴性：无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45。
阳性：Ct值<35，可报告为阳性。
可疑：Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
5.引物组的特异性扩增验证结果
利用本发明方法对诺如病毒GI型和GII型、轮状病毒、甲型肝炎病毒、札幌病毒和戊型肝炎病毒进行检测。结果如图11所示，图中1和2为诺如病毒GI型和GII型RNA出现特异性扩增曲线，3～6为其他病毒未检测到扩增曲线，只有诺如病毒GI型和GII型RNA出现了特异性扩增曲线，其他病毒RNA未检测到扩增曲线，说明所设计的引物特异性强。
实施例3实时荧光恒温扩增检测灵敏度试验
1.灵敏度试验方法
1.1引物组、2×RNA恒温扩增反应缓冲液及SYBR Green I染料浓度的优化
将筛选好的内引物从1.5μM至1.7μM以0.1μM为间距递增；外引物从0.1μM至0.3μM以0.1μM为间距递增；环引物从0.7μM至0.9μM以0.1μM为间距递增；2×RNA恒温扩增反应缓冲液从0.75×至1.25×以0.25×为间距递增； SYBR Green I染料浓度从1.5×至2.5×以0.5×为间距递增。利用Taguchi法探究摸索最佳引物浓度组合。
1.2酶反应液的筛选及优化
酶反应液为Bst DNA聚合酶，为确定Bst DNA聚合酶的最佳用量和比例，分别对不同用量的Bst DNA聚合酶(0.28U/μL、0.32U/μL、0.36U/μL)摸索最佳用量。
1.3梯度稀释灵敏度试验
分别将诺如病毒GI型和GII型体外转录RNA质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、 1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、 1copies/μL，经实施例2的实时荧光恒温扩增反应体系进行检测，验证本发明实施例所设计的诺如病毒GI型和GII型恒温扩增引物组所建立的实时荧光恒温扩增检测方法的灵敏度。
2.灵敏度试验结果
2.1反应体系各物质浓度的优化的结果
通过Taguchi法进行实验设计，根据所获得的最佳浓度范围进一步进行优化，从多次重复试验中发现，各物质终浓度：内引物浓度为1.6μM，外引物浓度为0.2μM，环引物浓度为0.8μM，2×RNA恒温扩增反应缓冲液为1×，SYBR Green I染料浓度为2×时荧光增幅相对较高，且引物用量最少，所以选择内引物最佳浓度为1.6μM、外引物最佳浓度为0.2μM、环引物引物最佳浓度为0.8μM、 2×RNA恒温扩增反应缓冲液最佳浓度为1×、SYBR Green I染料最佳浓度为2×。
2.2酶反应液的优化结果
分别对不同用量的Bst DNA聚合酶检测结果进行比较，确定Bst DNA聚合酶用量为0.32U/μL，即25μL反应体系用量为1μL。
2.3反应体积优化试验结果和最终反应体系的确定
为确定实时荧光恒温扩增反应体积的差异，采用25μL体系与50μL体系进行实时荧光恒温扩增检测比较，显示两种体系检测结果一致，因此选定25μL实时荧光恒温扩增反应体系作为实际应用的反应体系。结合上面的优化结果，确定诺如病毒GI型和GII型实时荧光恒温扩增检测方法的反应体系，见表5。
2.4梯度稀释灵敏度试验结果
按照1.3的方法进行梯度稀释灵敏度试验，结果如图12和图13所示，图 12为诺如病毒GI型的恒温扩增结果，图13为诺如病毒GII型的恒温扩增结果，图中标号1～9分别为1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、 1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、 1copies/μL的不同浓度体外转录RNA质粒阳性对照样本(上述浓度为阳性质粒样本的浓度，不是终浓度)。经多次试验显示，诺如病毒GI型和GII型的 1copies/μL浓度RNA三个平行样本为概率性检出(2/3、1/3)；5copies/μL浓度三个平行样本均检出，均存在明显荧光扩增曲线，且曲线形态良好。采用 5copies/μLRNA样本作为模板进一步进行20个重复测试，20个样本均检出，确定本发明所设计的诺如病毒GI型和GII型实时荧光恒温扩增检测的引物组和反应体系的检测灵敏度为5copies/μL(样品RNA模板储存液浓度)，即反应体系中病毒RNA的浓度为0.4copies/μL(样品RNA模板终浓度)。
实施例4一种诺如病毒GI型和GII型实时荧光恒温扩增检测试剂盒及使用方法
1.该试剂盒的组成包括：
引物组(序列如表3和表4所示)；
2×RNA恒温扩增反应缓冲液；
100×SYBR Green I；
8U/μL Bst DNA聚合酶；
5U/μL AMV逆转录酶；
阳性对照质粒RNA；
去核酸的超纯水。
本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。
2.检测时所需要的器材
保温设备：实时荧光定量PCR仪；移液器(量程0.1-200μL)；样品架、浮子(仅用于水浴锅)；乳胶或一次性手套若干。
3.试剂盒的应用方法
3.1样本要求
适用样本类型：贝类食品、浆果等样本。样本RNA提取可以按照提取试剂盒操作进行，把样本RNA用于检测实验或保存于-80℃。
3.2操作步骤
(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，放置于冰盒上。
(2)依据表6中的实时荧光恒温扩增反应体系加样于EP管。
2×RNA恒温扩增反应缓冲液(可购自广州双螺旋基因科技有限公司)是将实时荧光恒温扩增反应所需的含有dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgSO4、 (NH4)2SO4、甜菜碱等反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物，所述混合物中各物质的浓度为2.8mM dNTPs、40mM Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO4、 20mM(NH4)2SO4、1.6M甜菜碱。
(3)试剂配制
若有N个待检样品，则参照下表6，按照N+4个数量计算各组分用量(N 个待检样品+1个阳性对照+1个阴性对照，还有一些不必要的损失)，将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30秒，取23μL分装于 0.2mL PCR管中，分别加入待测RNA样品2μL用于检测。
表6
| 试剂组分 | 使用量 |
| 2×RNA恒温扩增反应缓冲液 | 12.5×(N+4)μL |
| 引物组 | 1×(N+4)μL |
| 8U/μL Bst DNA聚合酶 | 1×(N+4)μL |
| 5U/μL AMV逆转录酶 | 0.2×(N+4)μL |
| 100×SYBR Green I | 0.5×(N+4)μL |
| 超纯水 | 7.8×(N+4)μL |
4.3依据实施例2的实时荧光恒温扩增反应体系上样。
4.4依据实施例2的结果判定规则进行结果的判定。
每个反应需设置阴性对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
5.注意事项
上述试剂以及阳性对照品在-20℃条件下保存。
反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
实施例5检测食品中诺如病毒GI型和GII型试剂盒的应用
1.病毒的收集
1.1贝类中病毒的收集
取贝类数量不得少于10只，用无菌刀剥离贝类内脏团中消化腺，匀浆，称取约2g并转移至50mL离心管中，加入1mL PBS(pH5.7～8.0)混匀。加入10μL 的蛋白酶K，漩涡混匀，37℃320r/min摇床孵育1h，而后60℃水浴摇床再次孵育15min。室温下3000g离心5min，取上清液转移至一新的50mL离心管中，记录体积数，用于RNA的提取。
1.2硬果表面病毒的收集
将浸润PBS的无菌棉擦拭硬果表面，记录擦拭面积，适合最大擦拭面积约 100cm2。无菌棉放入500μL 0.5mol/L的硫氤酸弧裂解缓冲液中，按压无菌棉，将液体全部挤出，重复上述操作3次，留取裂解液用于RNA的提取。
1.3软果表面病毒的收集
取软果6颗
12颗放入400mL体积的带滤网的均质袋中，加入40mLTGBE 缓冲液(1％三甘氨酸和牛肉提取物的缓冲液，pH调节至9.5，该缓冲液购买于 Sigma公司)、30U的黑曲霉果胶酶，室温下60r/min振荡孵育20min。对于酸性软果，在孵育过程中，每10min监测洗脱液的pH值，当pH值低于9.0，则应用NaOH溶液调节至9.5。每调节一次pH值，则需要延长10min的孵育时间。将洗脱液转移到50mL离心管中，4℃10000g离心30min，上清液转入干净的离心管中，用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0。加入0.25×体积(上清液体积的0.25倍)的5×PEG/NaCl溶液(配制方法：加入500g聚乙二醇8000，87gNaCl 定容到450mL的容量瓶中。轻轻混合摇动/搅拌，如有必要，轻微加热，直到固体溶解，然后定积至1000mL。)，振荡60s，5℃过夜或60r/min振荡孵育 60min。5℃10000g离心30min，弃上清液，50℃10000g离心5min，弃上清液，加入500μL PBS(pH7.3±0.2)重悬沉淀。对于浆液过多的部分软果类样品，PBS重悬沉淀后，加入500μL的氯仿-正丁醇(体积比为1:4)，涡旋混合，室温下孵育5min，5℃10000g离心15min，取上清液用于RNA的提取。
注：上述病毒收集方法都是报道的常用方法。
2.RNA提取
按照磁珠法病毒RNA提取试剂盒的操作步骤提取诺如病毒样本的RNA (可购自于广州双螺旋基因科技有限公司)。用50μL去核酸的超纯水进行溶解并置于-80℃环境备用。
注：或采用其他商品化的提取试剂盒提取样品RNA。这些方法都是报道的常用方法。
3.将该检测方法应用于市场中贝类水产品、浆果等食品的检测，按照上述方法进行样品处理和提取总RNA，进行实时荧光恒温扩增反应，检测其中是否含有诺如病毒GI型和GII型。
4.用本发明的试剂盒对于获取的172份食品样品，包括冻杂色蛤、活杂色蛤、牡蛎、蛤蜊等105份贝类样品，草莓、树莓等67份浆果样品进行了检测。结果显示，从8份活杂色蛤等贝类样品、2份草莓样品中检出诺如病毒GI型阳性，从7份活杂色蛤等贝类样品、2份草莓样品中检出诺如病毒GII型阳性，其余为阴性。如图14所示，是该8份活杂色蛤等贝类样品的诺如病毒GI型阳性检测结果；如图15所示，是该7份活杂色蛤等贝类样品的诺如病毒GII型阳性检测结果；如图16和图17所示，是2份草莓样品的诺如病毒GI型和GII 型阳性检测结果。
5.采用实时荧光定量RT-PCR方法《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时RT-PCR方法》SN/T 4784—2017，对采用本发明的试剂盒检测上述食品样品的诺如病毒GI型和GII型检测结果进行验证，且本发明试剂盒检测呈现的荧光信号增幅Ct值明显优于实时荧光定量RT-PCR方法，具有检测灵敏度高的优势，且诺如病毒GI型和GII型的检出率要高于实时荧光定量RT-PCR方法，如例举部分的Ct值比较结果见表7。
表7本发明试剂盒实时荧光恒温扩增法与实时荧光定量RT-PCR的比较结果
本发明的方法应用于食品中诺如病毒GI型和GII型检测将具有广阔的前景，广泛适用于对贝类水产品、浆果等领域。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
序列表
<110> 大连民族大学
<120> 用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgttccgc tggatgcg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgtcgaag aacctgctac 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtccttag acgccatcat cattccatga cctcggattg tg 42
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catcaagcgt ggatggcgct aggatccatt gcaagagggt 40
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaagatcgc gatctcctgt c 21
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtggcgctg gtcagtt 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggagtggtgc cgtggatgat caggaagtgc cccaaagct 39
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggaccccag agttaagggt ggccctgggt tcagtgaatg g 41
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccagaattt agtcttggtg ctg 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccttcattg caacaagtta tgag 24
<210> 13
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgactaat acgactcact atagggaagc ttgaaagatt tccagcaagg tcatacatga 60
aatcaagact ggtggattgg aaatgtatgt cccaggatgg caggccatgt tccgctggat 120
gcgcttccat gacctcggat tgtggacagg agatcgcgat cttctgcccg aattcgtaaa 180
tgatgatggc gtctaaggac gctacatcaa gcgtggatgg cgctagtggc gctggtcagt 240
tggtaccgga ggttaatgct tctgaccctc ttgcaatgga tcctgtagca ggttcttcga 300
cagcagtcgc gactgctgga caagttaatc ctattgatcc ctggataatt aataattttg 360
tgcaagcccc ccaaggtgaa tttactattt ccccaaataa tacccccggt gatgttttgt 420
ttgatttgag tttgggtccc catcttaatc ctttcttgct ccatctatca caaatgtata 480
atggttgggt tggtaacatg agagtcagga ttatgctagc tgccatggca tatgggcggt 540
gacagcaagg ggacctactg cggtgcacca atcttaggtc caggaagtgc cccaaagctc 600
agcaccaaga ctaaattctg gagatcatcc acggcaccac tcccacctgg tacctatgag 660
ccagcctacc tcggcggcaa ggaccccaga gttaagggtg gcccttcatt gcaacaagtt 720
atgagggacc agctgaaacc attcactgaa cccaggggta aaccaccaaa accaagtgtg 780
ttagaagctg ccaagaaaac catcgtcaat gtccttgaac aaacaattga tccacctcaa 840
aaatggtcat ttgcgcaggc atgcgcatcc cttgacaaga ccacttccag tggtcacccg 900
caccacatgc ggaaaaacga ctgctggaac ggggaatcct ttacaggcaa attggcagac 960
caggcttcca aggccaacct gatgttcgag gagggaaaga acatgacccc agtctacacg 1020
ggtgcgctta aggacgagct ggtcaagact gacaaaattt atggcaagat caaaaagagg 1080
cttctctggg gttcggacct ggcgaccatg atccggtgcg ctcgagcatt cggggatatc 1140
cccggg 1146
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gatggcaggc catgttcc 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acaggatcca ttgcaagagg 20
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgaattcgg gcagaagatc gcctggatgc gcttccatga 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgatgatggc gtctaaggac gctccggtac caactgacca 40
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcctgtccac aatccgagg 19
<210> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatgcgctt ccatgacc 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctgtcgaag aacctgctac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgtccttag acgccatcat catcggattg tggacaggag a 41
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<211> 41
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgggcagaa gatcgcg 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcagttggt accggaggt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttccagcaag gtcatacatg 20
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cttgtccagc agtcgc 16
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cgccatccac gcttgatgta cttccatgac ctcggattg 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgctggtc agttggtcag gatccattgc aagagg 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtccttagac gccatcatca t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cggaggttaa tgcttctgac 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttccagcaag gtcatacatg 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ataggattaa cttgtccagc ag 22
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgccatccac gcttgatgta cttccatgac ctcggattg 39
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggcgctggtc agttggtcag gatccattgc aagagg 36
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtccttagac gccatcatca t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cggaggttaa tgcttctgac 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaccacttcc agtggtcac 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atcatggtcg ccaggtcc 18
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cttggaagcc tggtctgcca aaaaacgact gctggaacgg 40
<210> 41
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtctacacgg gtgcgcttaa ggaaccccag agaagcctct t 41
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acgagctggt caagactgac 20
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
atggtcattt gcgcaggc 18
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<212> DNA
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agcagtcgtt tttccgcatg tgatgcgcat cccttgacaa g 41
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acaggcaaat tggcagacca ggtggggtca tgttctttcc ct 42
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cgggtgacca ctggaagtg 19
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cttccaaggc caacctgatg 20
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<400> 52
tcccacctgg tacctatgag ccaacttgtt gcaatgaagg gc 42
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 53
gtcttggtgc tgagctttgg 20
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<212> DNA
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tacctcggcg gcaagga 17
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<212> DNA
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<400> 56
cttgtccagc agtcgc 16
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cgccatccac gcttgatgta cttccatgac ctcggattg 39
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ggcgctggtc agttggtcag gatccattgc aagagg 36
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gtccttagac gccatcatca t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cggaggttaa tgcttctgac 20
Claims (3)
1.一种非诊断目的的用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、从样品中提取RNA；
步骤S2、对所述RNA进行恒温扩增；其中，在反应体系中，采用用于检测诺如病毒GI型和GII型恒温扩增的引物组，所述引物组包括诺如病毒GI型引物组和诺如病毒GII型引物组；其中，所述诺如病毒GI型引物组包括SEQ ID NO.1所示的外引物GI-OF、SEQ ID NO.2所示的外引物GI-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物GI-IF、SEQ ID NO.4所示的内引物GI-IB、SEQ IDNO.5所示的环引物GI-LF和SEQ ID NO.6所示的环引物GI-LB；所述诺如病毒GII型引物组包括SEQ ID NO.7所示的外引物GII-OF、SEQ ID NO.8所示的外引物GII-OB、SEQ ID NO.9所示的内引物GII-IF、SEQ ID NO.10所示的内引物GII-IB、SEQ ID NO.11所示的环引物GII-LF和SEQ ID NO.12所示的环引物GII-LB；
步骤S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性；
在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系体积为25μL，其中，所述反应体系中包括以下终浓度的反应混合物：1×RNA恒温扩增反应缓冲液、2×SYBR Green I、0.32U/μL Bst DNA聚合酶、0.04U/μL AMV逆转录酶、0.2μM外引物OF、0.2μM外引物OB、1.6μM内引物IF、1.6μM内引物IB、0.8μM环引物LF和0.8μM环引物LB。
2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述恒温扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2×RNA恒温扩增反应缓冲液12.5μL、100×SYBR Green I 0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、5U/μL AMV逆转录酶0.2μL、引物组1μL、样品RNA模板2.0μL、其余为去核酸的超纯水补足25μL。
3.根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于，所述引物组1μL包括5μM外引物OF、5μM外引物OB、40μM内引物IF、40μM内引物IB、20μM环引物LF和20μM环引物LB。
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| 一起 GⅡ型诺如病毒混合感染疫情的病原鉴定及分析;冯微宏等;《中国卫生检验杂志》;20140630;第24卷(第11期);摘要，第1574页1.2部分至1575页2.3部分 * |
| 水环境中诺如病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用;罗鸿斌等;《安徽农业科学》;20171231;第45卷(第15期);第57页1.2部分，第58-59页2结果与分析部分，第59页2.6-2.7部分 * |
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