CN115305295A - 一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒检测领域，具体是一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法。本发明通过实验比较，找到了水体中青蟹呼肠孤病毒富集的最佳方案，并结合高灵敏性荧光定量RT‑PCR技术，建立了针对养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测方法。本发明通过常规超滤管富集水体中青蟹呼肠孤病毒，显著缩短了病毒富集时间，提高了病毒的富集效率；在此基础上利用高灵敏性荧光定量RT‑PCR进行病毒检测，确保了检测的灵敏性和准确性。本发明有效的填补了目前水体中青蟹呼肠孤病毒检测方法的空白，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体地说，是一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法。
背景技术
青蟹呼肠孤病毒(Mud Crab Reovirus，MCRV)易于传播和流行，是目前养殖青蟹最主要的病原之一。近年来的流行病学研究显示，该病毒几乎存在于所有青蟹养殖区域，对青蟹养殖产业的健康发展带来了巨大威胁。该病毒属于无囊膜病毒，对自然环境耐受能力强，青蟹繁殖过程中水体携带该病毒更容易使其在苗种生产和养殖过程中进行传播。我们前期研究发现MCRV可以在养殖水体中长期存在，且常规消毒剂杀灭效果有限。因此，建立水体中MCRV检测方法并进行跟踪监测，对于生产无MCRV苗种及青蟹养殖产业健康发展都具有指导意义。
当前对于养殖用水中MCRV污染问题还没引起足够的重视，相应的监测体系还没建立起来。由于水体中病毒含量远低于组织中病毒含量，因此很难通过水样直接检测病毒，必须对水样中病毒进行富集和浓缩，这是后续进行病原检测的前提条件。水体中病毒常以游离或吸附于水体颗粒形式存在，抽滤法、聚乙二醇沉淀法、超滤管法、高速离心法及超速离心法，是几种常见水体病原微生物富集的方法。通过采集含MCRV水样进行实验和比较，选择合适的MCRV富集方法，对于有效监测水体中的MCRV含量具有重要意义。
此外，随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量技术因其检测靶基因灵敏性高、反应特异性强、有较好的重复性及操作污染少等多个优点，已广泛应用于不同类型病毒的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法。在充分富集病毒的基础上，结合实时荧光定量RT-PCR技术，建立青蟹养殖和繁育过程中水体MCRV检测技术，可为MCRV预防和控制，乃至青蟹苗种MCRV净化提供必要的技术支撑。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明通过实验比较，找到了水体中MCRV富集的最佳方案，并结合高灵敏性荧光定量RT-PCR技术，建立了针对养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测方法。该方法通过常规超滤管富集水体中MCRV，显著缩短了病毒富集时间，提高了病毒的富集效率；在此基础上利用高灵敏性荧光定量RT-PCR进行病毒检测，确保了检测的灵敏性和准确性。本发明有效的填补了目前水体中MCRV检测方法的空白，具有显著的经济效益和社会效益。
本发明的第一方面，提供一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包含用于浓缩水体病毒的超滤管，和高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂。
其中，所述超滤管为商品化常规实验耗材，不同品牌产品预计有类似过滤效果。本发明为方便操作，选择最常见的Millipore密理博50kDa超滤离心管，单次上样体积可达15ml；多次上样体积可达50ml，样品浓缩倍数约为300-500倍。
进一步的，所述超滤管内含有纤维素膜，用于截留病毒颗粒，所述超滤管纤维素膜截留蛋白的理论分子量应为50kDa或大于50kDa。
进一步的，所述超滤管单次最小上样量为4ml/管，可以连续多次上水样，每管一次能检测多达50ml水体。
进一步的，所述超滤管以吊篮式离心最高转速为4000g/min，或以角转子最高转速5000g/min，浓缩病毒的最小体积低于100μl。
进一步的，加入到超滤管中的待测养殖水样需先提前室温静置1小时沉淀大颗粒，然后用医用纱布过滤，滤液以3000r/min离心10min取上清，以除去藻类和中颗粒悬浮物。
本发明的试剂盒使用超滤管进行病毒浓缩，病毒的理论回收率超过95％，整个病毒浓缩过程不超过3小时，显著优于其它常见病毒浓缩方法，如超速离心法、聚乙二醇沉淀法、高速离心法和超滤法。
本发明通过实验比较发现，在浓缩相同体积水体的条件下，使用超滤管浓缩MCRV，绝大多数病毒都会被截留，超滤管法获取病毒RNA浓度最高，并且病毒含量CT值最低(值越低，病毒含量越高)；超速离心法和聚乙二醇沉淀法实验结果相近，但超速离心法稍好于聚乙二醇沉淀法；水体直接通过高速离心法浓缩病毒，病毒含量损失明显增多。此外，超滤管法病毒浓缩时间明显也短于超速离心法和聚乙二醇沉淀法。因此，超滤管法浓缩MCRV，综合优势显著，具体实验结果见表1。
进一步的，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂包括基于病毒基因组片段11(VP11)的ORF区设计的一对特异性引物，引物设计参考MCRV基因组VP11节段序列(GenBank编号HQ414137.1)及另外两个分离毒株VP11节段序列(SsRV，GenBank编号HQ414137.1；MCRV-NH，SEQ ID NO:1)，利用在线软件预测病毒VP11基因的编码区，在VP11基因ORF区内部保守区域设计一对定量引物：上游引物VP11-F序列为5′–GTC AGA ATG TCGTTC ATA CTT TGT–3′(SEQ ID NO:2)，下游引物VP11-R序列为5′–ATT CAG GAG TTC CGGACA GAT–3′(SEQ ID NO:3)；还包括基于VP11的特异的TaqMan探针，探针设计基于VP11基因保守区，探针序列VP11-Probe：5′–FAM-CTG ATG CGT TCG ATT-MGB–3′(SEQ ID NO:4)。
进一步的，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂还包括含有适于荧光探针的Taq酶预混试剂(例如，2×Premix Ex Taq(Probe qPCR))，反转录酶预混试剂(例如，Primescript RT Master Mix，含随机引物Random6)，梯度稀释的标准品质粒，阳性对照，阴性对照(灭菌双蒸水)。所述的试剂所包含的Taq酶预混试剂和反转录试剂均为市售试剂，2×Premix Ex Taq(Probe qPCR))和Primescript RT Master Mix为本发明推荐使用的试剂，均为可用但不限于这两种试剂。标准品质粒为构建的包含VP11基因ORF区全长的双链DNA载体，为pMD19T-VP11。该标准品质粒浓度范围(1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)。阳性对照为稀释的标准品质粒(1×105拷贝/μL)，阴性对照为ddH2O。
进一步的，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂的PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL(根据仪器需要是否加入)，cDNA模板2μL，ddH2O 6.8μL，总反应体积为20μl。其中ROX参考染料添加与仪器类型有关，有些仪器设备不需要添加参比染料。
进一步的，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂的PCR反应程序为：95℃预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。
更进一步的，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂检测病毒的方法包括以下步骤：
(a)提取水体总RNA，检测RNA质量；质量合格RNA样品加入DNase I，去除DNA污染；
(b)反转录时，反转录体系除反转录酶、RNase抑制剂外，为保证反转录效果，需加入随机引物Random6，置于42℃水浴30min；
(c)在配制的荧光定量RT-PCR反应体系中，除含有2×Premix Ex Taq(ProbeqPCR)10μL，VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL(可选)，DNA模板2μL(待检测样品核酸、阳性或阴性对照样品)，ddH2O 6.8μL，总反应体积为20μl；
(d)荧光定量RT-PCR的反应条件为：95℃预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。
(e)根据荧光定量RT-PCR反应产生的Ct值，确定是否存在MCRV，并计算水体中病毒含量。
本发明的第二方面，提供一种采用如上所述的试剂盒检测养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的方法，包含病毒浓缩过程和病原检测过程，具体包括以下步骤：
(A)待检测养殖水样需先提前室温静置1小时，沉淀水体大颗粒，然后用医用纱布过滤，滤液以3000r/min离心10min取上清；
(B)将上清水体连续多次上样(每管分多次离心，连续添加)，上样总体积不超过50ml；
(C)将所述超滤管放置吊篮，以4000g/min的离心力离心，或通过角转子以5000g/min速度离心，浓缩液体积大约100μl时停止离心；
(D)用移液器吹悬病毒浓缩液，并将其转移到2ml离心管；
(E)按照高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂的说明提取浓缩病毒RNA，检测RNA质量，质量合格RNA样品加入DNase I，去除DNA污染；
(F)反转录时，反转录体系除反转录酶、RNase抑制剂外，为保证反转录效果，需加入随机引物Random6，置于42℃水浴30min；
(G)在配制的荧光定量RT-PCR反应体系中，含有2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，引物VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，探针VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL(可选)，cDNA模板2μL(待检测样品核酸、阳性或阴性对照样品)，ddH2O 6.8μL，总反应体积为20μl；
(H)荧光定量RT-PCR的反应条件为：95℃预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。
(I)根据荧光定量RT-PCR反应产生的CT值，确定是否存在病毒感染，并计算水体病毒含量。
本发明优点在于：
本发明从提高病毒浓缩效率和采用高灵敏性荧光定量RT-PCR两个层面提高该检测试剂盒的实用性和灵敏性：
1、采用了超滤管法进行病毒浓缩，该方法与其它常规浓缩方法相比，具有病毒回收率高、用时短及成本低的特点，是一种便捷、高效的水体病毒浓缩方法。
(1)病毒回收率高。通过对比几种常规水体病毒浓缩方法，发现超滤管浓缩获取病毒RNA浓度最高，表明富集病毒效果最好。这与超滤管法本身的特点有关。超滤管法浓缩病毒其实是通过超滤膜的孔径大小截留大分子物质，病毒颗粒远大于50kDa，理论上水体中所有病毒都会被截留在超滤管内，确保了病毒回收的高效率。
(2)病毒浓缩时间短。通过对比实验，我们可以发现，在保障病毒回收效率的前提下，超滤管法浓缩病毒用时最短。虽然高速离心法和抽滤法用时更短，但高速离心法病毒损失较大，而抽滤法无法获取MCRV。
(3)病毒浓缩成本更低。本发明建立过程中，通过比较实验表明了超滤管法使用成本明显低于超速离心法。超速离心法虽然是病毒浓缩的经典方法，但超速离心机设备价格高，属于昂贵实验设备，其耗材也昂贵。相比较之下，超滤管法只需要配备普通离心机和超滤管就能完成病毒浓缩。
2、采用高灵敏性荧光定量RT-PCR进行病毒检测，保障了检测的灵敏性和特异性。
(1)检测方法具有靶标基因表达水平高的优势。青蟹呼肠孤病毒共表达13个蛋白基因，我们通过表达水平分析，发现VP11基因表达水平最高。目前存在的青蟹呼肠孤病毒检测方法大多是基于VP1或VP6基因设计引物而建立的，这两个基因表达水平明显低于VP11。在同一检测样品中，基于高表达基因设计引物进行病原检测，相当于病毒模板数量更多，这更容易检测到病毒的存在，提高了检测的灵敏性。
(2)检测试剂盒本身的荧光定量PCR检测技术灵敏性高。与普通RT-PCR、套式RT-PCR、胶体金技术相比，荧光定量PCR检测技术灵敏性要更高，也是目前公认的、常用的高灵敏性病原检测技术。本发明建立的MCRV检测技术病原定量的下限为10拷贝/反应，病原检测的下限为2.5拷贝/反应，这已达到荧光定量PCR检测技术的极限水平。
(3)该检测方法的灵敏性特异性强。使用本发明的检测方法对青蟹和对虾常见病原检测，发现含MCDV、WSSV、DIV1、EHP及副溶血弧菌核酸的样品均未出现可见的扩增曲线，说明该方检测法特异性强，不会因这些病原混合感染或存在而影响MCRV检测结果。
由此，本发明基于上述两点建立的水体中MCRV检测试剂盒及检测方法具有明显的比较优势，是目前检测水体中MCRV含量的最佳可行方案。
3、本发明提供了一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒及使用方法，在青蟹苗种繁育水体和养殖过程水体、水环境MCRV的检测过程中具有很好的应用价值。
首先，该检测方法在青蟹苗种繁育过程中水体中MCRV检测方面具有很好的应用前景。MCRV是一种条件性病原，水体中含有MCRV，特别是病毒含量较高时，均易导致青蟹受精卵和幼体感染该病原。由于育苗水体病毒含量很低，水体中MCRV需先进行浓缩，并且借助高灵敏性检测方法，才能避免假阴性出现。本发明找到了水体MCRV最佳浓缩方案，并借助TaqMan高灵敏探针进行病原检测，能很好的满足苗种繁育阶段水体病原检测的需要。
其次，该病毒检测方法在养殖水体病原调查方面也有很好的应用前景。对养殖水体中MCRV进行检测，是进行全面流行病学研究的基本要求。与苗种繁育水体相比，养殖水体透明度低，藻类等颗粒悬浮组分多，本发明通过静置、过滤及低速离心等手段去除大颗粒杂质，然后进行病毒浓缩，确保了该水体病毒检测方法的普适性，能满足养殖水体病毒检测的需要。
最后，该检测方法还能用于环境水体中MCRV的检测。当前，随着绿色养殖的发展，对水环境的要求也更高，本发明建立的水体MCRV检测方法，也可以用于调查环境中的MCRV携带情况。据我们前期研究发现，MCRV耐受环境能力非常强，在自然环境中存活时间可达3个月甚至更长。从养殖水体携带的MCRV进入大的水环境，容易造成环境污染，甚至对其它物种造成潜在感染威胁。因此，该检测方法在水环境病毒检测方面也具有潜在应用价值。
附图说明
图1.MCRV标准曲线；横坐标为样品的拷贝数，纵坐标为CT值。
图2.标准品质粒qRT-PCR扩增曲线；图中1～8号标准品质粒浓度分别为1×108，1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102和1×101拷贝/μL。
图3.灵敏性检测；qRT-PCR扩增曲线1～4号标准品质粒浓度分别为1×101，0.5×101，0.25×101和1×100拷贝/μL。
图4.特异性检测；1，阳性对照；2-3，MCRV阳性样品；4，MCDV；5，WSSV；6，DIV1；7，EHP；8，副溶血弧菌；9，阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：超速离心法能有效富集病毒
超速离心是纯化和浓缩病毒最经典的方法，是利用超速离心机强劲的离心力将水体中病毒离心至管底，进而达到浓缩和纯化病毒的目的。利用超速离心机进行水体病毒浓缩采取以下步骤：
(a)水体前处理：待检测养殖水样需先提前室温静置1小时，沉淀水体大颗粒，然后用医用纱布过滤，滤液以3000r/min离心10min取上清；
(b)超速离心：取50mL处理后的水样，转入贝克曼超速离心机专用离心管中，随后至于4℃，以40000×g离心力超速离心2h；
(c)病毒收集和裂解：将超速离心后上清尽可能去除干净，加入1mL RNA裂解液，振荡混匀后，裂解5min；
(e)RNA提取：按照试剂盒说明书(比如，全式金公司的Transzol UP Plus RNAKit)步骤提取浓缩病毒RNA，检测RNA质量，质量合格RNA样品加入DNase I，去除DNA污染；
(f)反转录：提取的总RNA经检查合格后，经检测符合要求后进行反转录。反转录具体步骤按照试剂盒反转录试剂盒(比如，TAKARA Primescript RT Master Mix)操作说明书进行。反转录时，反转录体系除含有反转录酶、RNase抑制剂和RNA模板外，为保证反转录效果，需加入随机引物Random6，置于42℃水浴30min，合成的cDNA用于随后PCR扩增；
(g)定量RT-PCR：定量引物(VP11-F：5′–GTC AGA ATG TCG TTC ATA CTT TGT–3′，SEQ ID NO:2)；VP11-R：5′–ATT CAG GAG TTC CGG ACA GAT–3′，SEQ ID NO:3)和一条TaqMan探针(VP11-Probe：5′–FAM-CTG ATG CGT TCG ATT-MGB–3′，SEQ ID NO:4)。在配制的荧光定量RT-PCR反应体系中，含有2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，引物VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，探针VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL(可选)，cDNA模板2μL(待检测样品核酸、阳性或阴性对照样品)，ddH2O 6.8μL，总反应体积为20μl；
(h)荧光定量RT-PCR的反应条件为：95℃预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。
(i)病毒含量计算：根据荧光定量RT-PCR反应产生的CT值，确定水体是否存在MCRV污染，并依据标准品质粒计算水体中MCRV含量。
实验结果如表1所示，使用50ml预处理的水体，通过超速离心法获取的病毒样品提取的RNA均浓度为74.8ng/μL，通过定量RT-PCR分析，1μL cDNA做模板时的CT值为34.61。
实施例2：高速离心法富集病毒效果有限
高速离心是利用普通的高速离心机的离心力，将水样中悬浮的病毒或吸附病毒的细小颗粒离心至离心管底部，弃去上清液后，在离心管底部获得沉降的病毒粒子和携带病毒粒子的颗粒。与超速离心相比，高速离心机属于常规实验设备，使用方便，但离心力相对较低，特别是体积较大时离心力有限。高速离心法浓缩病毒步骤如下：
(a)水体前处理：参考实施例1步骤(a)；
(b)高速离心：将50mL处理水体加入到50mL的离心管中，在4℃条件下10000×g离心20min；
(c)病毒收集和裂解：将高速离心后管内上清尽可能去除干净，加入1mL RNA裂解液，振荡混匀后，裂解5min；
(d)RNA提取及荧光定量RT-PCR参考实施例1步骤(d-i)。
实验结果如表1所示，使用50ml预处理的水体，通过高速离心法获取的病毒样品提取的RNA均浓度为60.2ng/μL，通过定量RT-PCR分析，1μL cDNA做模板时的CT值为35.2。
实施例3：抽滤法无法进行MCRV富集
水样抽滤是最简单浓缩方法，主要是利用抽气泵使得内外压强发生变化，水体在压力差的作用下通过滤膜，同时将病毒或吸附病毒颗粒物截留在滤膜上，一次可以过滤较大体积水体。具体操作步骤如下：
(a)水体前处理：参考实施例1步骤(a)；
(b)真空抽滤：选取规格为0.22μm滤膜，将100mL上述处理后的水体加入真空抽滤泵进行抽滤中；
(c)病毒收集和裂解：取抽滤后的滤膜，将其剪碎并浸泡在2ml RNA裂解液中，裂解5分钟后，以10000rpm转速离心，将碎滤膜与裂解液分离；
(d)RNA提取及荧光定量RT-PCR操作参考实施例1步骤(d-i)。
实验结果如表1所示：每50ml预处理的水体通过抽滤法获取的病毒样品，所获得病毒提取的RNA均浓度为0，通过定量RT-PCR分析，1μL cDNA做模板时没有S型扩增曲线出现，CT值为未检出。
实施例4：聚乙二醇沉淀法富集效果较好，但耗时最长
聚乙二醇沉淀法是常见水体病毒富集的方法，富集MCRV具体操作过程如下：
(a)水体前处理：参考实施例1步骤(a)；
(b)聚乙二醇沉淀：取50ml预处理过的养殖水体，加入PEG8000，至其终浓度为8％，并加入NaCl至其终浓度为0.3mol/L，搅拌混匀，4℃静置过夜，在高速冷冻离心机中以10000rpm离心30min，弃上清；得重悬的水体病毒浓缩液；
(c)病毒收集和裂解：用pH7.4的0.1ml的PBS重悬病毒粒子沉淀，加入1mL RNA裂解液，振荡混匀后，裂解5min；
(d)RNA提取及荧光定量RT-PCR操作参考实施例1步骤(d-i)。
实验结果如体表1所示，每50ml预处理的水体通过聚乙二醇法获取的病毒样品，所获得病毒提取的RNA均浓度为73.3，通过定量RT-PCR分析，1μL cDNA做模板时的CT值为34.9。
实施例5：超滤管法浓缩水体病毒效果显著
超滤管通常用于蛋白质浓缩，根据滤膜截留的蛋白分子量盒孔径不同，分为不同规格。超滤管内液体在受到离心力的作用下，小规格分子可以通过滤膜，大规格分子不能通过，可以促使水体中的病毒粒子得到浓缩。我们将采取水样通过以下步骤完成病毒的浓缩和病毒的检测：
(a)待检测养殖水样需先提前室温静置1小时，沉淀水体大颗粒，然后用医用纱布过滤，滤液以3000r/min离心10min取上清；
(b)将上清水体连续多次上样(每管分多次离心，连续添加)，上样总体积不超过50ml；
(c)将所述超滤管放置吊篮，以4000×g/min的离心力离心，或通过角转子以5000×g/min速度离心，浓缩液体积约100μl时停止离心；
(d)用移液器吹悬病毒浓缩液，随后将超滤管倒置入50mL离心管中将浓缩液离心，并将浓缩液转移到1.5ml离心管，加入1ml细胞裂解液；
(e)RNA提取及荧光定量RT-PCR操作参考实施例1步骤(d-i)。
实验结果显示：每50ml预处理的水体通过超滤管法获取的病毒样品，所获得病毒提取的RNA均浓度为80.3，通过定量RT-PCR分析，1μL cDNA做模板时的CT值为33.5。
总之，与上述四种浓缩方法相比，超滤管法浓缩病毒提取RNA浓度最高，并且计算出的病毒含量也最高(CT最小，表明病毒含量最高)。
表1几种常见水体病毒富集方法效果分析
Figure BDA0003718481590000101
实施例6：基于TaqMan探针的qRT-PCR检测方法引物扩增效率计算
(1)RNA提取和反转录
参考实施例1中步骤，合成的cDNA用于定量分析。
(2)引物和探针
参考实施例1中所述荧光定量RT-PCR所用引物(VP11-F，VP11-R)和探针(VP11-Probe)。
(3)TaqMan探针qRT-PCR反应
在配制的荧光定量RT-PCR反应体系中，除含有2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)、ROX，正向引物VP11-F、反向引物VP11-R和探针VP11-Probe外，加入不同浓度梯度的标准品质粒，补充灭菌双蒸水，总体积至20μl。先使用推荐的标准程序进行预实验，通过分析qRT-PCR产物的熔解曲线，确定引物的特异性与可行性。在此基础上，通过正交试验确定上、下游引物的最佳配比浓度(获得最小的CT值(cycle threshold))；通过改变PCR反应温度，寻找最佳退火温度和反应时间，并最终确定反应参数。
(4)qRT-PCR反应体系和条件建立
实验结果表明，当引物终浓度均为2μmol/L时，退火和反应温度为60℃时，检测样品可获得较小的CT值和更强的荧光信号强度。通过对引物和探针浓度进行筛选试验，从而确定最佳反应总体系为20μL：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL，DNA模板2μL，ddH2O 6.8μL。优化后的TaqMan qRT-PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃放置10s，60℃30s，40个循环。
(5)qRT-PCR扩增效率计算
将实验室保存的标准品(1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)作为反应模板，每个梯度设置5个重复，按照实施例3建立的方法进行荧光定量PCR反应，由仪器自动绘制标准曲线并生成线性方程和相关系数R2。根据线性方程的斜率计算引物的扩增效率，利用统计学方法计算各梯度CT值的变异系数(CV)，分析其重复性和稳定性。实验结果如图1所示：线性方程：CT＝-3.242X+40.442(其中，X为质粒数量的对数)，该线性方程的相关系数R2为0.998，说明标准曲线上个点值具有良好的线性关系，并且基于标准曲线斜率计算的引物扩增效率为103.416％，该值处于该类反应的最优范围内(95-105％)。统计分析得到CT值变异系数(CV)处于0.2％－1.4％之间，说明该检测方法具有良好的稳定性和重复性(表2)。
表2.MCRV标准品质粒的CT值和变异系数
Figure BDA0003718481590000111
Figure BDA0003718481590000121
实施例7：检测方法灵敏性高
在前述标准品质粒10倍系列稀释基础上，进一步制备了10、5、2.5和1拷贝/μL标准品质粒。将倍比稀释的质粒作为模板进行荧光定量PCR反应，通过分析CT值变异系数，确定该方法的检测极限值；通过分析扩增曲线对应CT值，判断是否病毒的感染程度及含量。从图2可以看出，以标准品质粒为模板时，质粒数量为10、5和2.5拷贝/反应均能有效扩增，得到良好的“S”型扩增曲线，质粒浓度为10拷贝/μL时样品间重复性很好，并且检测值仍在标准曲线的线性范围内，表明该检测方法可以用于纯品病毒粒子的绝对定量，灵敏度高达10拷贝/μL。当质粒浓度为5或2.5拷贝/μL时，检测值已非线性，已不适于样品的绝对定量。尽管如此，这两个梯度质粒样品都能获得“S”型扩增曲线，表明仍可用于病毒的定性检测，灵敏度达2.5拷贝/μL(图3)。
实施例8：检测方法特异性强
为分析该检测方法的特异性，以携带MCRV鳃组织样本作为阳性对照，以健康青蟹鳃组织cDNA样本作为阴性对照，使用甲壳类常见病原核酸样本，如MCDV(Mud CrabDicistrovirus)的cDNA以及WSSV(White Spot Syndrome Virus)、DIV1(DecapodIridescent Virus 1)、EHP(Enterocytozoon hepatopenaei)或副溶血弧菌的DNA，进行荧光定量PCR反应。实验结果显示，使用含MCDV、WSSV、DIV1、EHP及副溶血弧菌核酸的样品均未出现可见的扩增曲线，说明该方检测法特异性强，不会因这些病原混合感染或存在而影响MCRV检测结果(图4)。
实施例9：检测试剂盒应用于青蟹苗种场水体MCRV检测
为进一步验证该检测方法的实用性，并了解青蟹苗种繁育阶段水体中MCRV污染状况，使用实施例5建立的病毒检测方法对采自浙江宁海某青蟹苗种场的水体进行跟踪检测，包括蓄水池、取水口、砂滤池外侧海水、砂滤池、暗沉淀池及育苗池，取自来水作为阴性对照。检测结果见表3：在育苗场出现MCRV感染后，对海湾取水口、砂滤池外侧、砂滤池、暗沉池、蓄水池和育苗池的水样分别进行MCRV检测，结果如表3所示。在海水取水口、1号蓄水池、自来水中均未检出MCRV，但在2号蓄水池、砂滤池、暗沉淀池及育苗池均检测到了MCRV，表明从2号蓄水池开始到育苗池都存在病毒的污染。考虑到2号蓄水池病毒含量最高，很可能时2号蓄水池最先受到病毒污染，最终导致育苗车间病毒污染。
表3青蟹苗种场水体MCRV携带情况调查
Figure BDA0003718481590000131
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院东海水产研究所
<120> 一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法
<130> /
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 612
<212> DNA
<213> 青蟹呼肠孤病毒(Mud Crab Reovirus)
<400> 1
atgaataggt caaaagcaat aaacttccaa ccttttatgt tagaaactcg gccaccccta 60
accaccatcc ctataatgga ccagttggtt gaaattggag aacgttctaa tcaaaagtgg 120
agcatgaccg accggttgtt ctttgcgatt aggaagatca atcctatatt cgtcacttcg 180
agccagatac cttcaaaatt tgattacacc attctccaga tgcccactca gctaattgcc 240
tcattgaaag agacactttt gttcttagcc ttctcatatt acctaagaga atatcaagat 300
aaggttggtc aaatgaaatt ttacccagta gccatgaaaa acatgattcc tattgtcaac 360
tatctcaaag atcgtgttca taacaacttt gacactactt tggaacaggc atatcgtcag 420
aatgtcgttc atactttgtt tgcttctgat gcgttcgatt tactttccgg catgatcgct 480
actactagac ttgatctgat tcagaggacc aggatctgtc cggaactcct gaatgtactt 540
aacaaaatgt cctttattct catttatgca ccaaatcgac catctatact ctcttggaaa 600
aaccaaagtt ga 612
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gtcagaatgt cgttcatact ttgt 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
attcaggagt tccggacaga t 21
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ctgatgcgtt cgatt 15

Claims (7)

1.一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于浓缩水体病毒的超滤管，和高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂；所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂包括一对特异性引物，上、下游引物序列分别如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示，还包括特异的TaqMan探针，探针序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述超滤管内含有纤维素膜，所述超滤管纤维素膜截留蛋白的理论分子量为50kDa或大于50kDa。
3.根据权利要求2所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述超滤管以吊篮式离心最高转速为4000g/min，或以角转子最高转速5000g/min，浓缩病毒的最小体积低于100μl。
4.根据权利要求1所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂还包括含有适于荧光探针的Taq酶预混试剂和含随机引物Random6的反转录酶预混试剂，梯度稀释的标准品质粒，阳性对照，阴性对照(灭菌双蒸水)。
5.根据权利要求4所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂的PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL(根据仪器需要是否加入)，cDNA模板2μL，ddH2O 6.8μL，总反应体积为20μl。
6.根据权利要求5所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂的PCR反应程序为：95℃预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。
7.一种采用如权利要求1-6任一所述的试剂盒检测养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的方法，其特征在于，包含病毒浓缩过程和病原检测过程，具体包括以下步骤：
(A)待检测养殖水样需先提前室温静置1小时，沉淀水体大颗粒，然后用医用纱布过滤，滤液以3000r/min离心10min取上清；
(B)将上清水体连续多次上样，每管分多次离心，连续添加，上样总体积不超过50ml；
(C)将所述超滤管放置吊篮，以4000g/min的离心力离心，或通过角转子以5000g/min速度离心，浓缩液体积大约100μl时停止离心；
(D)用移液器吹悬病毒浓缩液，并将其转移到2ml离心管；
(E)按照高灵敏性荧光定量RT-PCR病毒定量检测试剂的说明提取浓缩病毒RNA，检测RNA质量，质量合格RNA样品加入DNase I，去除DNA污染；
(F)反转录时，反转录体系除反转录酶、RNase抑制剂外，为保证反转录效果，需加入随机引物Random6，置于42℃水浴30min；
(G)在配制的荧光定量RT-PCR反应体系中，含有2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，引物VP11-F和VP11-R各0.4μL(10μM)，探针VP11-Probe 0.4μL(10μM)，ROX 0.4μL(可选)，cDNA模板2μL(待检测样品核酸、阳性或阴性对照样品)，ddH2O 6.8μL，总反应体积为20μl；
(H)荧光定量RT-PCR的反应条件为：95℃预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环；
(I)根据荧光定量RT-PCR反应产生的CT值，确定是否存在病毒感染，并计算水体病毒含量。
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CN111218530B (zh) * 2020-03-19 2023-10-31 广西壮族自治区水产科学研究院 荧光定量pcr检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒

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