CN111218530B - 荧光定量pcr检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)的引物组及试剂盒，属于病毒检测技术领域。具体包括检测十足目虹彩病毒1的引物和TaqMan‑MGB探针，以及基于上述检测引物和探针的试剂盒。本发明根据DIV1的MCP基因保守序列设计特异性的引物及TaqMan‑MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18‑T‑MCPDIV1，建立检测DIV1的TaqMan‑MGB探针荧光定量PCR方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽、简单快速等优点；并研发了相应的检测试剂盒便于推广应用，有利于DIV1的快速定量检测及相关疾病的防控。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地说是涉及荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒。
背景技术
十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)是近年新发现并鉴定的一种新型虹彩病毒，DIV1可感染凡纳滨对虾、罗氏沼虾、红螯螯虾、中国对虾等多种经济养殖虾类并可引起大规模死亡，也可感染浮游生物、河虾、鲫、螺蛳以及河蟹等常见水生生物成为传染源传播病毒；DIV1具多种易感宿主的特性使其更易于传播流行，已引起我国多个地区的养殖虾类暴发疫病大批死亡，成为中国养虾业面临的新威胁。
目前针对病毒病尚无有效的治疗方法，避免与病毒的接触是最有效的预防措施，而这又主要依赖于病毒传染源的快速检测。
但是，目前国际和国内均没有发布DIV1检测的相关标准，而农业农村部在DIV1监测计划中推荐采用套式PCR法进行检测；但在实际检测工作中，套式PCR法虽敏感性高，但需两轮PCR及电泳，操作繁琐，检测时间长且多次开盖容易交叉污染，特别在PCR分区条件不好的实验室容易形成气溶胶污染环境而出现假阳性。
此外，DIV1快速检测方法还有TaqMan探针定量PCR法和环介导恒温扩增技术(LAMP)，但TaqMan探针定量PCR由于探针长度太长，敏感性不够理想；LAMP灵敏、快速，但在实验室条件下容易出现假阳性。
因此，如何克服现有DIV1检测方法的不足，快速、高效、准确地检测DIV1，为亲虾筛选、虾苗检疫、疫情监测等提供重要的技术支持，为更好地预防和控制由DIV1引起的虾病害是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒。TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法既能发挥荧光定量PCR法的优势而克服套式PCR法的缺点，且其探针连接MGB基团相对于TaqMan探针因长度缩短易于与模板退火而更有利于提高方法的灵敏度，非常适用于对灵敏度要求高的病原体定量检测，可提高DIV1检测的效率和敏感性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组，包括上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1和TaqMan-MGB探针DIV1-qP1，序列如下：
DIV1-qF1：5’-CGGTGTCAGGAACACTACC-3’，SEQ ID No.1；
DIV1-qR1：5’-CAGTCATCACGGGAATACGAT-3’，SEQ ID No.2；
DIV1-qP1：5’-FAM-CCATAGGCACCGCAAA-MGB-3’，SEQ ID No.3；
其中，DIV1-qP1的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
根据虹彩病毒MCP基因保守性高的特点及TaqMan-MGB探针的优势，在DIV1的MCP基因保守序列设计了特异性的引物及TaqMan-MGB探针；
TaqMan-MGB探针是在TaqMan探针的3′端连上不发光的淬灭基团MGB(MinorGroove Binder)结合物，与TaqMan探针相比具有探针长度短、稳定性好、分辨率高等特点。
本发明还提供了一种基于上述引物组的检测试剂盒，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。
优选的：反应液包括2×Probe qPCR Mix、ROX Reference DyeⅡ、上游引物DIV1-qF1和下游引物DIV1-qR1、TaqMan-MGB探针DIV1-qP1和灭菌ddH2O。
优选的：反应液共2.3mL，每剂反应液为45μL，包含2×Probe qPCR Mix 25μL、ROXReference DyeⅡ0.5μL、10μmol/L上下游引物DIV1-qF1和DIV1-qR1各2.0μL、10μmol/LTaqMan-MGB探针2.0μL、灭菌ddH2O 13.5μL。
优选的：工作标准品为pMD18-T-MCPDIV1，浓度为1.0×101～1.0×109拷贝/μL，各200μL。
优选的：阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-MCPDIV1，阴性对照为不含DIV1DNA的对虾组织DNA溶液，各200μL。
重组质粒pMD18-T-MCPDIV1稳定性好，可满足作为工作标准品和阳性对照的要求。
本发明还提供了上述引物组在制备检测十足目虹彩病毒1的试剂盒中的应用，采用50μL反应体系，即45μL反应液加入5μL待检模板；荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸45s，扩增40个循环；在58℃结束时收集荧光信号。
本发明对反应退火温度及引物和探针使用浓度进行了优化，建立了检测DIV1的荧光定量PCR方法。起始模板范围为2×101～2×109拷贝/反应时，建立的标准曲线具有良好的线性关系，能够准确地反映目的产物的扩增；灵敏度高，对质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应，对虾组织的检测灵敏度约为10个拷贝/mg；对临床DIV1感染的阳性DNA稀释104倍之后仍然可以检测到阳性，与套式PCR法敏感性相当；特异性强，与其他虾常见病原菌及病毒无交叉反应；重复性好，组内和组间变异系数均小于1％；扩增和产物分析同步完成，整个检测过程仅需1h左右。说明采用TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR方法不仅能满足临床上对DIV1检测技术高灵敏度的需求，且具有操作简单、快速、可定量等优点。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒，取得的技术效果为根据DIV1的MCP基因保守序列设计特异性的引物及TaqMan-MGB探针和试剂盒；制备了重组质粒标准品pMD18-T-MCPDIV1，建立了检测DIV1的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽、简单快速等优点；与目前国内推荐的DIV1检测方法如套式PCR法进行276份临床样品检测结果的比较显示，应用本发明提供的引物组、试剂盒及检测方法，二者大部分检测结果一致，符合率为98.6％，同为阳性检测结果的样品含DIV1拷贝数较高，而检测结果不一致的样品DIV1拷贝数都较低(小于10拷贝/mg)；但TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法阳性检出率比套式PCR法稍高，发挥了MGB探针提高扩增效率及灵敏度的优势。可见所建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法检测DIV1拷贝数较高的样品时准确性高，而检测DIV1拷贝数较低的样品时较目前常用的套式PCR法也具有更好的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明荧光定量PCR检测DIV1待筛选引物扩增产物电泳示意图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1-2、3-4、5-6、7-8、9-10：分别为1组、2组、3组、4组、5组引物探针组合扩增的PCR产物；NC：阴性对照。
图2为本发明待筛选引物的荧光信号强度示意图。
图3为本发明DIV1-MCP基因的PCR扩增及重组质粒pMD18-T-MCPDIV1的PCR鉴定结果示意图，其中，M：DL1000 DNA Marker；1-2：DIV1-MCP基因；3-5：pMD18-T-MCPDIV1；NC：阴性对照。
图4为本发明1.0×103拷贝/μL的标准品为模板，探针终浓度为0.2μmol/L与引物不同终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μmol/L)组合进行荧光定量PCR扩增，荧光信号强度(敏感性)示意图。
图5为本发明1.0×103拷贝/μL的标准品为模板，引物终浓度为0.4μmol/L与探针不同终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L)组合进行荧光定量PCR扩增，荧光信号强度(敏感性)示意图。
图6为本发明标准品(1.0×100～1.0×109拷贝/μL)荧光定量PCR扩增曲线示意图。
图7为本发明荧光定量PCR检测DIV1的标准曲线示意图。
图8为本发明荧光定量PCR的特异性检测示意图。
图9为本发明荧光定量PCR法检测临床样品的荧光信号强度(敏感性)示意图。
图10为本发明套式PCR法检测临床样品的敏感性示意图。其中M：DL1000 DNAMarker；1-6：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的DIV1 DNA第一轮PCR产物；7-12：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的DIV1 DNA第二轮PCR产物；NC：阴性对照
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒。
十足目虹彩病毒1(DIV1)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的阳性材料均由本实验室鉴定并保存，也可由常规渠道获得，例如，传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)记载在《广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析》，南方农业学报，2013，44(12)：2089-2093，公众可从广西水产科学研究院获得；白斑综合征病毒(WSSV)记载在《凡纳滨对虾白斑综合征病毒广西株变异区基因的比较分析》，病毒学报，2014，30(1)：51-56，公众可从广西水产科学研究院获得，在此不再一一赘述。健康无DIV1感染凡纳滨对虾采自广西水产科学研究院国家级广西SPF凡纳滨对虾良种场；276份虾样品采自广西钦州、北海、防城港等地养殖场，品种有凡纳滨对虾、罗氏沼虾、红螯螯虾和克氏原螯虾，其中2018年和2019年分别收集142份和134份。
动物组织基因组DNA快速提取试剂盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL2000、氨苄青霉素、DH5α感受态细胞、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司；pMD18-T Vector克隆试剂盒、Probe qPCR Mix购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖购自英韦创津生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。荧光定量PCR仪为安捷伦公司的Mx3005P。
未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)的引物与TaqMan-MGB探针的设计与合成。
虹彩病毒的主衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)基因中含有许多高度保守的结构域，故以DIV1的MCP基因为检测靶基因。采用Primer Express 3.0软件按荧光定量PCR引物和MGB探针的设计原则，在MCP基因(KY681039)保守区域设计筛选多组特异的扩增引物和TaqMan-MGB探针，经Oligo7.0软件分析比较并适当修改优化获得5组评价理想的引物探针(见表1)，通过NCBI数据库进行Blast同源性比对验证后交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中探针的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
表1 初筛的引物及探针信息
应用上述5组引物探针组合对2份不同浓度的DIV1 DNA模板同时进行荧光定量PCR，参考试剂及仪器使用说明，采用20μL反应体系，引物和探针终浓度均为常规的0.2μmol/L，荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号。结果显示，第3组引物探针组合的效果最佳，其中PCR产物的电泳图结果显示第2组、3组、5组引物探针组合的条带亮度差别不大(参见图1)，但第3组荧光定量PCR的荧光信号强度比第2组和第5组高(参见图2)。按荧光定量PCR的原理，只有在引物扩增效率高且探针也高效与模板退火结合的情况下(本发明创新采用TaqMan-MGB探针的目的就是使探针长度缩短易于与模板退火以提高探针的效率)，引物在扩增的过程中才能同时切断探针释放荧光基团，才会产生强烈的荧光信号，即荧光信号强度可同时反映引物扩增和探针结合的效率，是方法整体效果的反映；而电泳条带的亮度仅能反映引物扩增效率，本发明实施这一工作目的是对待选引物的效果从另一个角度进行验证，以进一步明确待选引物探针组合的效果。经综合比较，第3组引物探针组合的效果最好，因此选取第3组为本发明的引物探针组合。
经上述实验初筛，获得一套效果较好的引物及探针组合(参见表2)用于DIV1荧光定量PCR检测方法的建立。
表2 本发明的引物及探针信息
实施例2
病原核酸的提取及重组质粒标准品的制备。
取50mg阳性病料组织，按照动物组织基因组DNA快速提取试剂盒说明书，提取虾常见病原DIV1、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的核酸DNA，最后加50μL洗脱缓冲液(EB)溶解DNA，置于–20℃保存备用。
以DIV1阳性材料提取的DNA为模板，使用引物DIV1-qF1和DIV1-qR1进行PCR扩增(扩增条件同实施例1)，产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T连接，转化DH5α，制备重组质粒pMD18-T-MCPDIV1，并进行PCR及测序鉴定。提取重组质粒pMD18-T-MCPDIV1，用核酸蛋白分析仪测定其浓度并转换为拷贝数，并以10倍梯度稀释至1.0×101～1.0×109拷贝/μL作为标准品，–20℃保存备用。
实验结果表明：PCR扩增DIV1的MCP基因，获得与预期目的片段大小一致的扩增条带；目的片段回收纯化后克隆入pMD18-T载体，重组质粒pMD18-T-MCPDIV1经PCR、测序鉴定，所得目的片段序列与GenBank上公布的MCP基因在本发明上下游引物之间的部分序列的同源性为100％，说明目的基因片段正确连接入pMD18-T载体(参见图3)。取阳性克隆菌液提取质粒，测定浓度并转换为拷贝数，pMD18-T-MCPDIV1浓度为4.62×109拷贝/μL，可满足标准品的要求。
实施例3
荧光定量PCR反应条件的优化。
以3个梯度(1.0×105、1.0×103、1.0×101拷贝/μL)的标准品DNA为模板，在56～64℃范围内以1℃的梯度为退火温度进行荧光定量PCR扩增(其他条件同实施例1)，以获得较低阈值循环数(Ct值)和较高的相对荧光强度增加值(ΔRn)时的退火温度为最佳。
结果表明，退火温度为58℃时Ct值最小且ΔRn最高，说明采用58℃退火时引物和探针都能与模板较好地结合，所以本发明选用58℃为最佳退火温度。其中，起始模板浓度为1.0×103拷贝/μL的标准品的荧光定量PCR扩增效果数据参见表3。
表3 DIV1荧光定量PCR采用不同退火温度的扩增效果
以3个梯度(1.0×105、1.0×103、1.0×101拷贝/μL)的标准品DNA为模板，采用探针终浓度为0.2μmol/L与引物不同终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μmol/L)组合进行荧光定量PCR，以获得较低的Ct值和较高的ΔRn时的引物终浓度为最佳。
结果表明，随着引物终浓度增大荧光信号强度逐渐增强(敏感性)，但引物终浓度在0.3～0.8μmol/L时的效果(Ct值和ΔRn)相差不大，为保证引物的扩增效率又不浪费实验材料，本发明选用0.4μmol/L为最佳引物终浓度；其中，起始模板浓度为1.0×103拷贝/μL的标准品为模板，探针终浓度为0.2μmol/L与引物不同终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μmol/L)组合进行荧光定量PCR扩增，荧光信号强度(敏感性)参见图4。
以3个梯度(1.0×105、1.0×103、1.0×101拷贝/μL)的标准品DNA为模板，采用筛选的最佳引物终浓度与探针不同终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L)组合进行荧光定量PCR，以获得较低的Ct值和较高的ΔRn时的探针终浓度为最佳。
结果表明，随着探针终浓度增大荧光信号强度不断增强(敏感性)，但探针终浓度在0.4～0.5μmol/L时的效果(Ct值和ΔRn)差别不大，为保证探针的效率又不浪费实验材料，本发明选用0.4μmol/L为最佳探针终浓度；其中，起始模板浓度为1.0×103拷贝/μL的标准品，0.4μmol/L上游引物/下游引物与探针不同终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L)组合进行荧光定量PCR扩增，荧光信号强度(敏感性)参见图5。
综上：经比较不同退火温度及不同引物和探针浓度组合的扩增效果，最终确定反应体系为：Probe qPCRMix(2×)25μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，上下游引物(10μmol/L)均为2.0μL，探针(10μmol/L)为2.0μL，模板5μL，用灭菌ddH2O补足至50μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸45s，扩增40个循环；在58℃结束时收集荧光信号。
实施例4
标准曲线的建立及敏感性试验。
以10个梯度(1.0×100～1.0×109拷贝/μL)的标准品DNA为模板，用优化后的荧光定量PCR方法进行检测；利用数据分析软件进行分析，建立起始模板拷贝数(X)的对数与Ct值(Y)之间的标准曲线和标准方程，并根据各标准品DNA的扩增结果来判断该方法的定量范围和敏感性。
实验结果表明：以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增的结果显示(参见图6)，高浓度标准品(1.0×104～1.0×109拷贝/μL)的扩增曲线呈明显的“S”型，低浓度标准品(1.0×103～1.0×101拷贝/μL)的扩增曲线因未达扩增平台期呈半“S”型，各梯度标准品扩增曲线重复性好、荧光强度增量明显、间距均匀；标准品浓度为1.0×101～1.0×109拷贝/μL时，分析建立的标准曲线的线性关系好(参见图7)，标准曲线方程为Y＝-3.249×LOG(X)+38.98，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为103.1％和1.000。建立的荧光定量PCR方法对标准品的扩增效率高，起始模板拷贝数范围为2.0×101～2.0×109拷贝/反应时，构建的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增，可用于定量分析。
经数据分析软件分析，标准品DNA为20拷贝/反应时，3个重复的Ct值分别为34.91、35.04、35.04，仍有明显的扩增曲线(参见图6)，且重复性好；标准品DNA为2拷贝/反应时，3个重复的Ct值分别为37.47、38.85、38.98，重复性差。因此，该方法的灵敏度约为20个拷贝/反应。为保证检测结果的准确性，应用该方法时建议以Ct值35为界限，若检测样品的Ct值小于或等于35，且有扩增曲线，则判为DIV1阳性；Ct值大于35，且有扩增曲线，则重复1次，如结果一致，判为DIV1阳性；Ct值大于35，重复结果未出现扩增曲线，判为DIV1阴性。
实施例5
特异性试验。
分别以DIV1、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的核酸DNA为模板，用优化后的荧光定量PCR方法进行检测，评价特异性。
实验结果表明：用建立的荧光定量PCR对虾常见重要病原DIV1、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的核酸进行检测(参见图8)，只有DIV1出现扩增曲线，Ct值分别为15.78、15.82、15.84，判为阳性；而其他病原均未出现扩增曲线，判为阴性。说明本发明的荧光定量PCR对DIV1的检测具有很好的特异性。
实施例6
重复性试验。
选取3个梯度(1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL)的标准品DNA为模板，在间隔第7天和第14天分别进行重复试验，每个梯度做3个平行，记录各次试验的Ct值，经过数据分析得到组内及组间的变异系数，评价标准品的稳定性及方法的重现性。变异系数(CV)＝标准偏差(SD)/平均数(X)。
实验结果表明：1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL 3组标准品的重复性试验结果见表4，组内实验的变异系数为0.27％～0.54％，组间实验变异系数为0.61％～0.95％，表明该方法的重复性和重现性都很好，结果稳定可靠；同时说明本发明制备的重组质粒DNA稳定性好，可作为标准品和阳性对照使用。
表4 DIV1荧光定量PCR重复试验结果
对比实验1
荧光定量PCR法与套式PCR法的敏感性比较。
将实施例2中从DIV1阳性病料组织提取的DNA以10倍梯度稀释(100～10-5)，取5μL各梯度DNA为模板同时进行荧光定量PCR法和套式PCR法检测(农业农村部DIV1监测计划推荐方法)，比较它们的敏感性。
实验结果表明：采用荧光定量PCR法和套式PCR法分别对10倍梯度稀释的DIV1阳性DNA(100～10-5)进行检测，结果(图9、10)显示，荧光定量PCR法和套式PCR法均可检测到10-4稀释度的阳性DNA，即荧光定量PCR法的敏感度可达到套式PCR法的敏感度。
对比实验2
荧光定量PCR法和套式PCR法检测临床样品的结果比较。
按实施例2的方法提取276份临床样品(凡纳滨对虾、红螯螯虾、罗氏沼虾和克氏原螯虾)的总DNA，分别采用荧光定量PCR法和套式PCR法进行检测，比较检测结果以检验荧光定量PCR法的临床实用性。
实验结果表明：分别使用荧光定量PCR法和套式PCR法对276份临床虾样品进行检测，检测结果见表5。有34份样品用两种方法检测均为阳性，Ct值为18.95～34.29，根据标准曲线Y＝-3.249×LOG(X)+38.98计算，其DIV1拷贝数在2.76×101～1.46×106拷贝/反应之间，虾组织中的DIV1含量约为1.38×101～7.3×105拷贝/mg；有3份样品经荧光定量PCR检测呈阳性而经套式PCR检测呈阴性，Ct值为35.87～36.42，其DIV1拷贝数在9.1×100～6.2×100拷贝/反应之间，虾组织中的DIV1含量约为4.6×100～3.1×100拷贝/mg；有238份样品用两种方法检测均为阴性。说明在实际检测工作中采用本发明的方法进行40个循环的反应，其对临床样品虾组织中DIV1的检测灵敏度约为10拷贝/mg。
表5 采用荧光定量PCR法和套式PCR法检测临床样品DIV1的结果比较
实施例7
一种检测十足目虹彩病毒1的引物组，包括上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1和TaqMan-MGB探针DIV1-qP1，引物序列如下：
DIV1-qF1：5’-CGGTGTCAGGAACACTACC-3’，SEQ ID No.1；
DIV1-qR1：5’-CAGTCATCACGGGAATACGAT-3’，SEQ ID No.2；
DIV1-qP1：5’-FAM-CCATAGGCACCGCAAA-MGB-3’，SEQ ID No.3；
其中，DIV1-qP1的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
一种基于上述引物组的检测试剂盒，包括反应液2.3mL(含2×Probe qPCR Mix、ROX Reference DyeⅡ、上下游引物DIV1-qF1和DIV1-qR1、TaqMan-MGB探针DIV1-qP1、灭菌ddH2O)，每剂反应液为45μL，加入5μL待检DNA溶液即可进行检测；还包括工作标准品、阳性对照和阴性对照，工作标准品为浓度1.0×101～1.0×109拷贝/μL的pMD18-T-MCPDIV1，阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-MCPDIV1，阴性对照为不含DIV1 DNA的对虾组织DNA溶液，各200μL。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区水产科学研究院
<120> 荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggtgtcagg aacactacc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagtcatcac gggaatacga t 21
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccataggcac cgcaaa 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcgaccca gatcagagcg 20
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggcagtcat cacggga 17
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccataggcac cgcaaa 16
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccgtcctc aacccaaatc 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtgagaag taatcggcag tc 22
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccataggcac cgcaaa 16
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacaagattg atttcgaccc ag 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtcatcac gggaatacga t 21
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccataggcac cgcaaa 16
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggagaggga aataacggga aaac 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtcagcatt tggttcatcc atg 23
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgcccatct aacaccatct cccgccc 27
Claims (1)
1.一种检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照；
所述反应液共2.3mL；每剂反应液为45μL，包含2×Probe qPCR Mix 25μL、ROXReference DyeⅡ0.5μL、10μmol/L上下游引物DIV1-qF1和DIV1-qR1各2.0μL、10μmol/LTaqMan-MGB探针2.0μL、灭菌ddH2O 13.5μL；
所述工作标准品为pMD18-T-MCPDIV1，浓度为1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL，各200μL；
所述阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-MCPDIV1，所述阴性对照为不含DIV1DNA的对虾组织DNA溶液，各200μL；
上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1和TaqMan-MGB探针DIV1-qP1，序列如下：
DIV1-qF1：5’-CGGTGTCAGGAACACTACC-3’，SEQ ID No.1；
DIV1-qR1：5’-CAGTCATCACGGGAATACGAT-3’，SEQ ID No.2；
DIV1-qP1：5’-FAM-CCATAGGCACCGCAAA-MGB-3’，SEQ ID No.3；
其中，DIV1-qP1的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
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