CN114946726A

CN114946726A - 一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内十足目虹彩病毒1的热激处理方法

Info

Publication number: CN114946726A
Application number: CN202210749728.9A
Authority: CN
Inventors: 邱亮; 郭晓萌; 黄倢; 高雯; 王海亮; 陈形
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内十足目虹彩病毒1的热激处理方法。该方法通过以下步骤实现：将待处理虾蟹保持存活的条件下使其体温提升至34~38℃；达到指定温度后，在该温度上下1℃范围内保持虾蟹的存活及其体温，热激处理；将热激处理后的虾蟹恢复到常规养殖温度。本发明通过TT/TR方法能够抑制虾蟹感染致命性病毒，提高病毒的清除效果，无需昂贵和费力的检疫程序，为宝贵的遗传资源和濒危甲壳动物物种的保存提供了一项创新措施，具有良好的应用前景。

Description

一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内十足目虹彩病毒1的热激处理方法

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内十足目虹彩病毒1的热激处理方法。

背景技术

凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）俗称南美白对虾，属于甲壳纲、十足目、对虾科、对虾属、滨对虾亚属，原产于美洲太平洋沿岸海域。凡纳滨对虾可在盐度0.5‰-35‰的水域中生长，海水、咸淡水和淡水中均能养殖。能在水温10-40℃的水域中生存，生长水温为15-38℃，最适生长水温为22-35℃。自 1988 年引入我国后，因其营养丰富、味道鲜美、养殖效益良好，在我国南、北方地区均有广泛养殖，是我国最重要的对虾养殖品种。

十足目虹彩病毒1 (DIV1)是一种新发现的甲壳动物病毒，分别在红螯螯虾和凡纳滨对虾中分离鉴定和报道。DIV1是十足目虹彩病毒属（Decapodiridovirus）的唯一成员，而十足目虹彩病毒属是虹彩病毒科（Iridoviridae）7个属之一(ICTV, 2022)。DIV1病毒粒子的平均直径约为150-160 nm，具有双链DNA基因组，约为166 kbp。近年来，甲壳类动物中DIV1感染（iDIV1）导致对虾养殖业的高死亡率和严重经济损失。

根据世界动物卫生组织（OIE）确定易感宿主的标准，除发现DIV1的两种自然感染物种外，DIV1的易感物种还包括罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、日本沼虾(M. nipponense)、斑节对虾(P. monodon)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)。凡纳滨对虾和脊尾白虾的临床体征是非特异性的，表现为空胃、空肠、肝胰腺萎缩，表面颜色减退，呈软壳状，部分体色发红。研究表明，人工感染可导致凡纳滨对虾、红螯螯虾和克氏原螯虾100%死亡。凡纳滨对虾养殖过程中，易感染DIV1等病毒。然而，迄今为止，还没有有效的手段来清除个体的iDIV1，特别是遗传育种项目中珍贵的精选品种或自然界濒危的十足目物种。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内十足目虹彩病毒1的热激处理方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内感染的十足目病毒1的热激处理方法，包括以下步骤：

（1）将待处理虾蟹保持存活的条件下使其体温提升至34~38℃；

（2）达到指定温度后，在该温度上下1℃范围内保持虾蟹的存活及其体温，热激处理1~30天；

（3）将热激处理后的虾蟹保持存活的条件下降低到常规养殖温度，完成一轮处理过程；

（4）如果降温后虾蟹体内病毒载量升高或者有复发迹象，再重复上述（1）~（3）步骤。

进一步的，所述的虾蟹的种类是对DIV1易感的物种，包括但不限于凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾、中国对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾、红鳌螯虾、脊尾白虾、梭子蟹等。

进一步的，步骤（1）的体温提升可以包括提升养殖水体方法，可以通过连续或分段加热其水体或将虾从低温的水体移到高温的水体的方式进行逐步或分段升温。

进一步的，步骤（1）所述的升温速率在1~10℃/天，整个过程需保证虾的存活。

进一步的，步骤（2）的热激处理的时间1~30天与热激温度呈负相关，温度越低，处理时间越长，温度越高，处理时间越短。

进一步的，温度与时间的关系符合(T-T0)*t=a，其中T为热激温度，T0为最低抑制温度，不同虾蟹的范围为33~35℃，t为时间（天），a为积温值，积温值不同虾蟹种类有所差异，范围在6~30度日变动。

进一步的，步骤（3）的温度恢复过程，可以是权利要求3和4的逆操作，具体速率在保持虾蟹存活的条件下可以有所差异。

进一步的，步骤（4）的病毒载量升高或有复发迹象，是指病毒核酸在靶组织中的载量比热激完成后的载量提升1个数量级以上或者虾蟹出现DIV1感染的症状和死亡率上升。

进一步的，本发明提供的方法可用于DIV1感染处于潜伏期或发病初期的虾蟹苗、仔虾蟹、稚虾蟹、次成虾蟹、成熟亲体的体内感染的DIV1的净化，无特定病原（SPF）状态的建立，珍稀或濒危虾蟹物种或进口虾蟹的去毒等的需求和生物安保体系的构建。

本发明的有益效果为：

（1）本发明养殖过程中，通过热激处理和温度恢复(TT/TR)方法能够降低活体虾蟹感染致命性病毒，提高虾蟹病毒的清除效果，在感染群体中，可通过36°C的热激方法重建无DIV1感染状态，无需昂贵和费力的检疫程序，这为宝贵的遗传资源和濒危甲壳动物物种的保存提供了一项创新措施。

（2）本发明首次报道热激对虾蟹养殖过程中，DIV1病毒的清除，为减少病毒感染提供了一种创新措施，特别是对具有特殊遗传特性的虾品种的幼虫和亲本，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为热激处理和温度恢复(TT/TR)的过程；

其中，A. 探索性实验；B. 重复性验证。

图2为TT/TR探索性实验不同组对凡纳滨对虾外观体征的变化。

图3为在TaqMan-qPCR检测的探索性和可重复性挑战中P/N阈值对DIV1阳性率的影响。

图4为在探索性实验(A)和重复性验证实验(B)中，每组虾的发病死亡、生存和意外死亡数量的变化。

图5为探索性实验(A)和重复性验证实验(B)中，由iDIV1引起的凡纳滨对虾累积死亡率；

其中，图例上方不同字母表示最终累积死亡率的差异有统计学意义(P < 0.05)。

图6为TT/TR探索性实验(A)和重复性验证实验期间(B)凡纳滨对虾肝胰腺中十足目虹彩病毒1 (DIV1)的载量。

图7为注射DIV1和PPB-His的凡纳滨对虾的组织病理学观察。黑色箭头表示核固缩；白色箭头表示嗜酸性和嗜碱性包涵体；

其中：A：eT28 3dpi的造血组织；B： eT34 25dpi的肝胰腺；C：eT30 3dpi的血淋巴；D：eC28 30dpi的上皮；E：eT36 30dpi的肝胰腺；F：eT38 20dpi的中肠后盲肠。标尺 = 20 μm。

图8为实验中凡纳滨对虾的地高辛标记的原位环介导等温扩增(ISDL)检测；

其中，A、B： eT28(4 dpi)；C、D：eT34(3 dpi)；E、F：eT34(25 dpi)；G：eC28(30dpi)；H, I：eT36(3 dpi)：J, K, L：eC28(30 dpi)。H为表皮上皮，表皮在脱水前被去除；A、B、E、G、J为肝胰腺小管；D为表皮上皮；F是血淋巴；H是上皮细胞；I为后中肠盲肠；K, L是造血组织。Bar = 20 μm。

图9. 实验中凡纳滨对虾组织的透射电子显微镜(TEM)观察。A、B、C为eT36在30dpi的肝胰腺细胞；D、E、F为eT28在3 dpi的样品；G、H、I表示eT34在25 dpi的样品。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1

1 为了验证本发明提供的方法的有效性，养殖过程中，为实验室内进行。

材料和方法：

2.1 实验动物

第一批进行热激攻毒实验的实验动物选用1000尾凡纳滨对虾，虾苗于2019年11月购自中国山东省日照某对虾养殖场(体长7.0±0.4 cm)，将虾放入6个装有80升32 ppt(千分之1)海水的塑料罐中，在27 ℃条件下放置4天。培养水每天以20%的速率不断曝气和更换。每天3次，按体重5%左右投喂配方饲料颗粒。

为了进行重复性验证，第二批1000尾凡纳滨对虾(体长5.0±0.4 cm)，虾苗于2021年6月从同一地点的一家虾场购买，并与第一批相同的方式进行实验室养殖。

2.2 常见虾病原检测

在攻毒实验前，采用实时荧光定量PCR或反转录实时荧光定量PCR检测对虾的潜在病原体，包括白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、致急性肝胰脏坏死的副溶血性弧菌(Vp _AHPND)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)和DIV1。

2.3 DIV1悬液的制备

DIV1悬液取自之前人工感染DIV1分离株SHIV 20141215的凡纳滨对虾样品，经实时荧光定量PCR检测为DIV1阳性，且WSSV、IHHNV、Vp _AHPND、TSV、YHV和CMNV阴性。从DIV1感染的虾中取约2.5 g头胸部组织(去除甲壳和肝胰腺)，然后用40 mL预冷PPB-Tris(376.07 mMNaCl, 6.32 mM K₂SO₄, 6.4 mM MgSO₄, 14.41 mM CaCl₂和50 mM Tris-HCl, pH 6.5-8.0)匀浆。悬液于4 ℃，转速10000 rpm离心10 min。将获得的沉淀重悬于25 mL PPB-Tris中，匀浆后再离心。两步上清液合并后，用500目筛绢和0.45 μm滤膜过滤。使用实时荧光定量PCR方法定量悬液中的DIV1浓度。在攻毒实验中，用PPB-His(PPB-Tris中用50 mM组氨酸代替50mM Tris-HCl)稀释得到含有10¹拷贝/µL 的DIV1悬液，然后将悬液均分为100µL，保存在−80℃下。

在重复验证实验中，用PPB-His制备了浓度为3.3 拷贝/µL的 DIV1悬液。

悬液的制备

DIV1悬液取自之前人工感染DIV1分离株SHIV 20141215的凡纳滨对虾样品，经实时荧光定量PCR检测为DIV1阳性，且WSSV、IHHNV、Vp _AHPND、TSV、YHV和CMNV阴性。从DIV1感染的虾中取约2.5 g头胸部组织(去除甲壳和肝胰腺)，然后用40 mL预冷PPB-Tris(376.07 mMNaCl, 6.32 mM K₂SO₄, 6.4 mM MgSO₄, 14.41 mM CaCl₂和50 mM Tris-HCl， pH 6.5-8.0)匀浆。悬液于4 ℃，转速10000 rpm离心10 min。将获得的沉淀重悬于25 mL PPB-Tris中，匀浆后再离心。两步上清液合并后，用500目筛绢和0.45 μm滤膜过滤。使用实时荧光定量PCR方法定量悬液中的DIV1浓度。在攻毒实验中，用PPB-His(PPB-Tris中用50 mM组氨酸代替50mM Tris-HCl)稀释得到含有10¹拷贝/µL 的DIV1悬液，然后将悬液均分为100 µL，保存在−80℃。

在重复验证实验中，用PPB-His采用相同步骤制备了浓度为3.3 拷贝/µL 的DIV1悬液。

对虾热激处理及温度恢复(TT/TR)的探索性实验

将第一批对虾分为7组，每组3个重复，每个重复25尾对虾，进行热激处理和温度恢复(TT/TR)实验(图1A)。第一组为空白对照组(eC28)，分别肌肉注射10µL PPB-His后，在28℃水温下保存。第二组为常规温度组(eT28)，每只虾肌肉注射10µL DIV1悬液，置于28℃水温下饲养。第3~7组为热激处理组，分别在30℃(eT30)、32℃(eT32)、34℃(eT34)、36℃(eT36)和38℃(eT38)条件下驯化2 d，分别肌注10µL DIV1接种物。各组对虾均于腹部第二节，用50 µL的微量注射器注射。在感染后15 d (dpi)，eT30-eT38组的温度恢复到28℃，速率为0.5℃/ h，在28℃下继续保持15天，其他条件保持温度恢复期不变。具体如图1所示。

的重复性验证

为了验证TT/TR实验的重复性，我们将第二批对虾分为6组，每组4个重复(图1b)，其中rC28组、rT28组、rT36组与eC28组、eT28组、eT36组处理相同。rU36组用DIV1注射，28℃保温24小时，12小时内升温至36℃。rD28在28℃保持48 h后注射DIV1，然后保持28℃饲养。每组4个平行箱作重复，每箱20只虾，其中1个作为取样箱。15 dpi后，各组温度均恢复至28℃，保持10天。

2.6 采样

对于探索性实验TT/TR，分别在3、8、15 dpi时，各组取样3尾垂死的虾或有典型临床症状的虾进行包括-80℃低温贮藏、95%酒精固定、戴维森氏固定剂固定(DAFA)和TEM固定。第3~7组，在将温度降至28℃ 10 d后(25 dpi)采样3尾对虾。在实验结束时，对所有的虾进行取样。

对于重复性验证实验，在每组0.5、2、7、15(温度恢复前)和25 dpi的时间分别取3尾垂死或具有典型临床体征的个体。

2.7 使用TaqMan qPCR进行DIV1定量检测

使用海洋动物组织DNA试剂盒(北京天根)从所有对虾样品的肝胰脏中提取总DNA作为模板，保存于-20℃。将总DNA稀释到100 ng/µL，使用1µL，进行针对DIV1 MCP基因的TaqMan qPCR扩增（Qiu et al., 2020），使用CFX-96荧光定量仪进行。

2.8 组织病理学检测验证iDIV1

将凡纳滨对虾的头胸部固定在DAFA中24 h，然后将其转移到70%乙醇中。按照Bell & Lightner的程序，制备石蜡包埋切片，用苏木精和伊红(H&E)溶液染色。

2.9 地高辛标记的原位环介导等温扩增（ISDL）检测验证iDIV1

根据Chen等 (2019)的报道，制备了第2.8节描述的石蜡包埋切片，并针对DIV1的DdRp酶基因第二大亚基DNA进行ISDL检测。

透射电子显微镜（TEM）检测验证iDIV1

采用超薄切片对患病的凡纳滨对虾的肝胰腺和淋巴器官进行透射电镜观察。用两个交叉解剖刀片将组织切成<1 mm³的小块，然后保存在15mL的TEM固定液中(2%多聚甲醛、2.5%戊二醛、160毫米氯化钠和氯化钙4毫米200毫米PBS) (pH值7.2) ，在4°C固定至少24小时。将固定的组织用1%四氧化锇进行二次固定2 h，然后包埋在Spurr’s树脂中，再用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。超薄切片铺设在胶体涂覆的网格上，并在JEOL JEM-1200电子显微镜(JEOL Solutions for Innovation, Japan)下进行检测，该显微镜在青岛大学医学院设备中心运行，电压为80-100千伏。

2.11 TaqMan-qPCR结果计算

TaqMan-qPCR的对数模板拷贝数(copies/µL，每次扩增时总DNA为100 ng/µL，1µL)与Ct之间的标准曲线按照之前报道的方法建立。 TaqMan-qPCR结果的计算以组和感染后天数为基础。假设40个周期内未扩增反应，Ct值最低为41，以估计各组每日最终定量平均值的统计学意义，并显示所有结果。采用Microsoft Excel 365软件，根据公式(1)计算各组日平均值的标准差(SDg):

式中，SUMSQ表示二次和计算，SDsr表示组内每个样本TaqMan-qPCR重复的标准差，n_s表示样本数量，STDEV. P为计算总体标准差，Msr为组内各样本TaqMan-qPCR重复的平均值。

利用微软Excel软件的T.TEST函数，对每天组内的所有样本及其重复的数据数组进行双尾异方差t检验，分批计算各组间和天数间DIV1负荷TaqMan-qPCR结果的差异概率(P值)。P值小于0.01为极显著差异，用不同大写字母标记。

确定P/N阈值来判断动物是否死于发病

为了消除较高的采样率和各组重复中可能出现的意外死亡个体的影响，我们将感染后每天的动物计数为发病死亡数、生存数或意外死亡数，以计算累积死亡率。所有从iDIV1和DIV1负荷高于正/负阈值(P/N阈值)的临床体征组中取出的死亡、濒死或采样的虾，均计入iDIV1所致的发病死亡动物，以计算死亡率。否则，DIV1负载低于P/N阈值的死虾或采样虾应被排除在死亡率计算之外，作为意外死亡计数，这意味着由于与iDIV1无关的原因从组中删除。

通过比较给定P/N阈值下TaqMan-qPCR结果的阳性率，确定P/N阈值。非人工的P/N阈值应采用最低拷贝数，以保持相对稳定的阳性率，不低于基于临床体征计数的阳性率。

2.13 感染实验的死亡率分析

以每日为计算基础，为实验目而发病死亡的动物累计死亡率为每日发病死亡动物死亡率的总和。每日发病死亡率为当天的发病死亡个体数与当天开始时活的动物总数加上当天意外死亡动物数的比值。共有如下数值：当日前的发病累积死亡率(CM ₀)、组内所用动物总数(TN)、当日由于实验导致的发病死亡动物数(IM)、当日排除的意外死亡动物数(IE)、当日前累计排除的意外死亡动物数(CE ₀)，累积死亡率(CM)的计算基于公式(2)。

0 dpi的累积死亡率等于当日的发病死亡率。

采用最大累积发病死亡率(CMmax)、中位致死时间(LT ₅₀)和logistic指数(LE) 3个参数的logistic回归分析各组重复的CM(%)与时间(T、dpi)之间的关系。

可能需要根据三个重复的最终平均累积发病死亡率的估计值来设定CMmax的限制，以确保回归显著。结果以均数(Mean)±标准差(SD)表示。

在两个方差不等的均值之间，采用以下公式(4)的两样本t检验估计CMmax的显著性差异(Sprinthall, 2011):

其中SE为标准误差，等于

.。概率采用Microsoft Excel计算，函数P = T.DIST (T, n-2, FAULT)，其中n=3。当p值< 0.05时，表示差异显著。

3 结果：

3.1 临床症状

TT/TR方法的探索性实验持续30天，在上述TT期间，各温度处理组在不同处理温度下保温15 dpi后，均恢复至28℃。3 dpi后，eT28、eT30、eT32组的虾表现为胃、肠空，体微红，剖开的肝胰腺切面色浅。eC28组20191215001例，Ct>40为阴性；样本20191114007来自eT28组，Ct=15.5，相当于肝胰脏中DIV1载量3.34×10⁸拷贝/µg-DNA；eT34组样品20191114022，Ct=21.2，为DIV1载量4.84×10⁶拷贝/µg-DNA；eT34组样品20191126013，Ct=37.5，为阴性；eT34组20191126016样本，Ct=36.2，为DIV1负载3.12×10²拷贝/µg-DNA；eT34组20191208017样本，Ct=18.3，为DIV1负载4.17×10⁷拷贝/µg-DNA；eT36组20191126022例，Ct=37.2，为阴性。箭头表示造血组织(HM)、胃(ST)、肝胰腺(HP)、中肠(MG)和后肠(HG)。标尺=20mm。相比之下，eC28、eT36组所有的虾在30 dpi时，以及eT34组的大多数虾在15 dpi时均显示正常 (图2)。然而，温度恢复到28℃后3天(18 dpi)的TR期间, eT34组的虾也出现了上述临床症状。

TT/TR方法的重复验证实验持续25 d。在2 dpi时，rT28组、rU36组和rD28组的虾类表现出与探索性实验相同的临床症状，而rC28组和rT36组在TT期15 dpi和TR期10 天(25dpi)时，虾类均表现正常。

3.2 确定P/N阈值来判断动物是否死于发病

在探索性实验中共采集了600尾对虾，合并成271份样品，其中87份有明显的iDIV1临床症状，对其中215份进行了TaqMan-qPCR检测；重复性验证实验中采集了300尾对虾，合并成108份样品，其中55份有明显的iDIV1临床症状，对其中86份进行了TaqMan-qPCR检测。在测试样本中，两次实验中的临床体征率分别为22.1%和30.6%。将P/N阈值从1×10⁰设置为1×10⁷ copies/µg-DNA，计算阳性率从100%下降到20%以下，分别从2.5 copies/µg-DNA和25 copies/µg-DNA开始急剧下降。1.54×10² - 2.95×10² copies/µg-DNA的探索性检测阳性率下降到35.8%，2.6×10¹ - 3.27×10² copies/µg-DNA的重复性检测阳性率下降到39.5%。两者在P/N阈值快速下降后，在3个数量级以上的变化中均保持相对稳定的阳性率(图3)。因此，P/N阈值可定义为1.54×10² - 2.95×10² copies/µg-DNA，探索性和重复性实验样品的Ct值分别为35.3 - 34.4和38.1 - 37.1。由于在此范围内设置的P/N阈值对阳性率没有任何影响，我们取一个整数值作为P/N阈值，200拷贝/µg-DNA，或1拷贝/5ng-DNA，即1拷贝/10³个细胞。

3.3 生存曲线

对不同组的死虾或采样虾进行计数和DIV1定量检测。在TT/TR的探索性实验和重复验证过程中，可能会有虾因iDIV1、采样或其他原因而导致的死亡。因此，在分析中，对虾被定义为生存动物、发病死亡动物或意外死亡动物。存活虾的定义是没有明显临床症状的存活对虾。发病死亡动物是指死亡虾感染iDIV1，包括死亡或垂死的对虾表现出iDIV1的症状，或采样虾检测DIV1载量超过200拷贝/µg-DNA，或其他原因死亡的虾检测DIV1载量超过200拷贝/µg-DNA。意外死亡动物是指因采样或其他情况而导致死亡或濒死的实验动物，且其外观体征正常，检测DIV1载量少于200拷贝/µg-DNA。

图4中，实线表示在每组中，因有iDIV1临床症状或DIV1载量超过200拷贝/µg-DNA的采样而死亡的平均存活率下降情况。而虚线则显示了每一组的平均偏移量，这些偏移量是在DIV1载量低于200拷贝/µg-DNA的情况下由采样或伤亡造成的。同一颜色的实线和虚线之间的距离表示群体中剩下的实际存活数量。渐变色晕表示每条平均线的95%置信限区域。只显示牺牲线的正半部分和杂散线的负半部分。未覆盖平均值的95%置信限面积与另一平均值差异显著(P<0.01)。

如图4A所示，在探索性实验中，空白对照组eC28组无发病死亡率，但累积意外死亡数量缓慢增加，30dpi组平均存活数下降至5.0±2.4。常规温度下攻毒eT28组在4 dpi时平均发病死亡数非常高为24.7±0.5，并且在3 dpi时具有很高的DIV1载量。eT28、eT30、eT32攻毒组动物的高发病死亡率与eT28组动物相似，均在5 dpi内全部死亡。在最高温度下，攻毒组eT38的存活率迅速且持续的在14 dpi以内下降至0，这都是由于非发病因素所致。eT34攻毒组平均为7.3±1.7尾发病死亡虾，其中1.3±0.9尾发病死亡虾在34℃ 15 dpi的高温处理下，在3个重复中出现了临床症状。当温度恢复到28℃时，平均5.0±3.7尾对虾出现临床症状并死亡，2.7±0.9尾对虾呈阳性，24 dpi时，无个体存活。值得注意的是，eT36攻毒组没有发病死亡虾，只有意外死亡虾，30dpi时最终平均存活数为4.3±3.3。

为了验证36℃下TT阶段观察到的结果，消除探索性实验中高达12/25的高采样率造成的显著干扰，设置了TT/TR重复验证实验，每组共4个养殖箱，其中一个为采样养殖箱。对照组rC28在15 dpi 的TT阶段有一个稳定的生存率，并且在接下来10天的TR阶段有18±1.2尾虾（共20尾）存活。与此同时，rT36组只有1尾虾在2dpi时检测到非常低的Ct值，为34.6±0.4 dpi。该组成功存活，至实验结束时，存活率与对照组rC28无显著差异。在重复性验证实验结束时，rT36组20尾虾的最终存活数达到12.7±0.5。而常规温度组rT28由于发病死亡，存活率在4 dpi以内迅速下降至0。rU36和rD28组的快速发病死亡率与rT28组相似，均在7 dpi以内全部死亡 (图4 b)。

累计死亡率分析

探索性实验中，eT28、eT30、eT32组经过养殖期间死亡和采样后均无最终存活个体。根据累积发病死亡率函数(2) 剔除总数中的杂散和logistic回归函数(3)计算，eT28、eT30、eT32组的最大累积发病死亡率(CMmax)分别为(100.0±0.2)%、(98.6±0.3)%和(100.0±0.3)%。eT34组的死亡曲线表现为15 dpi前的34℃和15 dpi后的28℃两个阶段，logistic函数的CMmax分别为(36.3±9.0)%和(45.1±9.2)%(补充表1)。eT36组和对照组eC28组是在整个TT/TR处理中存活的两组，无发病死亡虾。

在重复性验证实验中，rT28组、rU36组和rD28组在7dpi后均无存活个体。三组的最大累积发病死亡率(CMmax)为(100.0±0.6)%。rT36组和对照组rC28组是存活于整个TT/TR处理实验的两组。rT36组CMmax为(1.8±0.5)%，rC28中没有发病死亡个体。

显著性差异分析(P < 0.05)将两轮攻毒实验的最终累积死亡率分为三个水平。对照组eC28、rC28和攻毒组eT36、eT38、rT36（在36℃以上较高温度处理下）处于同一水平，差异不显著，iDIV1造成的累积发病死亡率不明显。攻毒组eC34是唯一一个有两个阶段死亡的水平，3个重复的最终平均死亡率为78.2±12.5%。感染组中，包括无温度变化的eT28和rT28，低于32℃低温处理的eT30和eT32，注射前36℃预处理的rD28和注射后2 h 36℃处理的rU36，这些组尽管在最初几天的死亡率发展有细微的差异，但均在攻毒后的第一周内最终累积死亡率达到了相同的水平，接近100%。

3.5 TaqMan荧光定量PCR检测

在整个实验过程中，以不同组的凡纳滨对虾肝胰腺中提取的总DNA样本作为TaqMan qPCR模板，测定组织中DIV1的载量。结果表明，对照eC28组和rC28组、高温攻毒eT36组和eT38组虾在所有时间点的DIV1检测均为阴性，即DIV1载量低于P/N阈值。攻毒rT36组，在36℃下TT阶段(2 dpi)只有一尾虾的DIV1载量为10^3.13±0.11拷贝/µg-DNA，但同一组中同一时间点采集的其他两个虾样在40个PCR循环内均没有检测到阳性，表明所注射DIV1的复制被强烈抑制。而eT28、eT30、eT32、rT28、rU36和rD28组的虾攻毒后1周DIV1载量最高，分别为10^8.76±0.09、10^8.62±0.06、10^8.09±0.28、10^7.43±0.57、10^6.35±0.04和10^8.32±0.15 copies/µg-DNA，表明这些组中感染的DIV1 DNA复制速度较快。 eT34 组随机采集的样品，在4 dpi时DIV1载量最高，约为10^5.01±0.07拷贝/µg-DNA，这与其他组的数据有极显著差异(P < 0.01) ，在攻毒后2周左右P/N下降到接近阈值，表明此组DIV1 DNA的复制受到一定的抑制。更重要的是，在TR处理8天 (23 dpi)后，eT34组存活虾的DIV1载量回升至10^7.73±0.60 copies/µg-DNA，并在4天内均保持较高水平，直至组内所有虾全部死亡，表明DIV1 DNA发生明显复制。与此相反，eT36组和rT36组在28℃ TR处理期间的DIV1一直为阴性，直至实验结束，表明注射后的虾体中无DIV1感染。如图6所示，图中底部不同列共用同一字母表示无统计学差异(P≥0.01)。负值表示TaqMan-qPCR检测阴性。空列表示该组在该时间点没有样本。

3.6 组织病理学研究

DAFA固定样本的组织病理学检查显示，eT28组3 dpi时濒死个体的造血组织(图7A)，eT34组25 dpi时濒死个体的肝胰腺血窦(图7 B)以及eT30组3 dpi时濒死个体的血淋巴细胞中均存在混合有嗜碱性微粒的深色嗜酸性包涵体和核固缩(图7 C)。eT34组在3 dpi和15 dpi时采集的样品比25 dpi时采集的样品具有更少的核固缩和包涵体。此外，包涵体和核固缩也在eT32组3 dpi时垂死的样品中存在。相比之下，eC28组(30 dpi)、eT36组(30dpi)和eT38组(20 dpi)的存活个体中没有观察到典型的组织病理症状(图7 D, E, F)。

3.7 地高辛标记的原位环介导等温扩增检测

ISDL结果显示，在eT28组(4 dpi)、eT34组(3 dpi)和eT34组(25 dpi)的肝胰腺血窦、表皮上皮和造血组织中均检测到蓝紫色杂交信号(图8 A、B、C、D、E、F)。但在eC28组30dpi时(图8 G)，eT36 组3 dpi时(图8 H和I)和eT36 组30 dpi时(图8 J, K, L)的存活个体靶组织中未检测到信号。eT34组，在3 dpi(34°C)和25 dpi(28°C)时所采集样品均显示ISDL信号，但15 dpi(34°C)时采集样品没有发现ISDL信号。而3 dpi(34°C)时，信号仅在虾的表皮上皮中可见，25 dpi(28°C)时，信号在虾的肝胰小管和血淋巴中可见。eT36组在从3dpi到30 dpi期间所采集的样品均未见ISDL信号。ISDL结果提供进一步的证据表明，凡纳滨对虾在28°C，30°C和32°C仍然可以遭受iDIV1感染，在34°C时iDIV收到抑制，但温度回到28°C时感染会恢复，而在36°C和38°C时对虾没有出现感染。

3.8 透射电子显微镜观察

透射电子显微镜下，eC28组(30 dpi)、eT36组(30 dpi)、eT38组(20 dpi)对虾的超薄切片均未发现DIV1颗粒，细胞外观正常、完整(图9 A、B、C)。eT28、eT30、eT32组 (3 dpi)(图9 D、F和E)和eT34组(25 dpi，28℃) (图9 G、H和I)样品的肝胰腺细胞膜周围观察到病毒粒子。病毒粒子是六角形(即二十面体)，直径约150纳米，符合DIV1的特征。此外，在感染细胞细胞膜附近的观察到低电子密度的病毒生发基质和病毒组装(图9 D和F)，还观察到嵴肿胀的畸形线粒体 (图9 E)。

4 结果与讨论

iDIV1导致的死亡率在34°C组（eT34）被明显抑制了，死亡率较低且较慢，且死虾组织中的DIV1载量也低得多，在3 dpi时近10⁵拷贝/µg-DNA，并且在15 dpi时 P / N阈值水平下降3个数量级。由此可见，34℃下TT对凡纳滨对虾iDIV1的保护作用显著，可延长凡纳滨对虾的生存时间。但在恢复正常温度后，DIV1的死亡率和载量有明显的恢复。组织病理学、ISDL信号和透射电镜显示，虾类的死亡是由iDIV1引起的。说明，34℃持续15天，DIV1仍未从体内消除。

通过实验表明，36℃的TT处理完全抑制了病毒的复制，包括死亡率、临床症状，qPCR检测，织病理学，ISDL，TEM。只有一尾虾在2dpi时检测到非常低水平的病毒载量（10^3.10 ^±0.11拷贝/µg-DNA）, 约为4.9 ~ 8.1倍N/P阈值。更重要的是，探索性实验TR步骤的建立和可重复性验证从各个方面进一步验证了感染性DIV1从虾组织中被消除。28℃ TR时，eT36组和rT36组的DIV1也检测为阴性。综合所有结果，在36°C的TT已经成功地从虾体中清除病毒。

本发明通过整个TT/TR方法，本发明提供的方法能够从被感染个体体内消除感染性病毒的创新方法。值得注意的是，无论是在攻毒后36 h左右开始36℃ TT步骤，还是仅进行36℃热预处理而不在攻毒后保持此温度，均不能抑制注射后DIV1的感染。这一结果表明，只有在36°C时，当感染组织中DIV1载量较低时，iDIV1才可能被及时、实时的TT处理所抑制。

凡纳滨对虾的最适生长温度为22℃~ 32℃。在驯化初始温度为15°C和30°C，升温速率为0.5°C/min的连续加热过程中，凡纳滨对虾幼虾耐受的临界热最大值(CTMax)分别为35.94±1.02℃和42.20±0.63℃。然而，虾在短时间内能够耐受的CTMax温度可能不是虾在较长时间内能够适应的温度。在我们的研究中，eT38的最高温度为38°C，我们发现所有检测到的虾的DIV1载量低于P/N阈值。然而，存活个体自3 dpi后组织内DIV1载量迅速下降，并在持续下降的过程中达到了0。此外，所有的组织病理学、ISDL和TEM结果都不支持采样的虾组织中存在DIV1感染。因此，我们认为注射后的DIV1在对虾体内没有引起感染，38℃下的死亡不是由iDIV1引起的，而是由高温引起的。

正如本发明中所看到的，在较高的温度下，DIV1基因组DNA的增殖被显著抑制，且组织和细胞病理均没有发生异常。iDIV1中的发现可能为研究热激处理对甲壳类病毒感染的共同抑制机制提供了一个有价值的参考。

在对虾幼体或成体的关键控制点采用TT/TR方法是值得尝试的。因为这样操作既可以实现无DIV1状态，又不需要进行耗时且昂贵的检疫程序。

本发明提供的方案，包括在感染的非常早期阶段的TT处理和通过TT清除病毒后的TR步骤。 TT步骤在34 - 36℃之间对iDIV1的抑制作用呈温度依赖性，而TR步骤通过使未被消灭的活病毒在虾体内复活来验证其清除效果。在36°C条件下，首次发现了iDIV1能在感染虾体内被完全抑制，并通过临床症状、组织和细胞病理学和病毒DNA增殖的证据予以证实；实验进一步证实了DIV1在样品中得到了清除，且在TR处理后没有恢复感染。探索性实验和重复性验证双重证实了36℃下TT/TR方案对iDIV1的清除效果。34℃下TT步骤显著抑制了iDIV1的发展，防止了对虾的发病和死亡，但TR步骤后病毒复活。因此，TT/TR方法确立了一种消除宝贵遗传种群或濒危甲壳动物物种DIV1的创新方法，通过这种方法，可以在不需要昂贵和费力的检疫程序的情况下重建受感染群体中无DIV1的状态。

Claims

1.一种非治疗目的的降低或净化虾蟹体内感染的十足目病毒1的热激处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的热激处理方法，其特征在于，所述的活虾蟹的种类是对十足目病毒1易感的物种；所述虾蟹包括凡纳滨对虾、斑节对虾、日本对虾、中国对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾、红鳌螯虾、脊尾白虾或梭子蟹。

3.根据权利要求1所述的热激处理方法，其特征在于，步骤（1）的体温提升可以包括提升养殖水体方法，可以通过连续或分段加热其水体或将虾从低温的水体移到高温的水体的方式进行逐步或分段升温。

4.根据权利要求1所述的热激处理方法，其特征在于，步骤（1）所述的升温速率在1~10℃/天，整个过程需保证虾的存活。

5.根据权利要求1所述的热激处理方法，其特征在于，步骤（2）的热激处理的时间1~30天与热激温度呈负相关，温度越低，处理时间越长，温度越高，处理时间越短。

6.根据权利要求5所述的热激方法，其特征在于，温度与时间的关系符合(T-T0)*t=a，其中T为热激温度，T0为最低抑制温度，不同虾蟹的范围为33~35℃，t为时间（天），a为积温值，积温值不同虾蟹种类有所差异，范围在6~30度日变动。

7.根据权利要求1所述的热激处理方法，其特征在于，步骤（3）的温度恢复过程，可以是权利要求3和4的逆操作，具体速率在保持虾蟹存活的条件下可以有所差异。

8.根据权利要求1所述的热激处理方法，其特征在于，步骤（4）的病毒载量升高或有复发迹象，是指病毒核酸在靶组织中的载量比热激完成后的载量提升1个数量级以上或者虾蟹出现十足目病毒1感染的症状和死亡率上升。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的热激处理方法在用于十足目病毒1感染处于潜伏期或发病初期的虾蟹苗、仔虾蟹、稚虾蟹、次成虾蟹、成熟亲体的体内感染的十足目病毒1的净化，无特定病原SPF状态的建立，珍稀或濒危虾蟹物种或进口虾蟹的去毒的需求和生物安保体系的构建中的应用。