CN115478120A - 同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，包括引物与探针设计及合成、病毒核酸提取及标准品制备、二重荧光定量PCR退火温度优化、二重荧光定量PCR检测体系优化、标准曲线建立及敏感性试验、特异性实验、复性试验和样品核酸提取与检测。本发明结合TaqMan‑MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1，且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点，可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障，实现对罗氏沼虾WTD和DIV1D的快速诊断及科学防控，为虾苗检疫、亲虾筛选及疾病诊断等提供更高效的技术手段。

Description

同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法
技术领域
本发明涉及罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒检测技术领域，特别涉及同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法。
背景技术
罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV)是一种单股正链RNA病毒，隶属于野田村病毒科(Nodavi ridae)，主要感染罗氏沼虾苗种，可造成淡化后仔虾的死亡率高达90％，患病虾以肌肉白浊、白斑或白尾的症状为临床特征，因此被称为罗氏沼虾白尾病(White tail disease，WTD)。
WTD是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疫病，自报道以来曾在多个国家和地区广泛流行，发病快、死亡率高，给罗氏沼虾养殖业的健康发展造成极大危害，我国已将其列为二类动物疫病。
十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)是近年来虾类养殖中新出现的传染性病原，隶属于虹彩病毒科(Iridoviridae)十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)，可感染罗氏沼虾、凡纳滨对虾、红螯螯虾、中国对虾及青虾等主要养殖虾品种，并造成大批量死亡，也可感染河虾、河蟹、螺蛳及浮游生物等水生生物成为传染源。由于DIV1的多宿主特征，传播迅速且广泛，DIV1疫情在我国虾类养殖各区域相继暴发，造成巨大经济损失，且疫情有进一步扩大和加剧的趋势，给我国虾类养殖业带来严峻挑战，农业农村部已将DIV1引起的虾虹彩病毒病(Decapod iridescent virus 1disease，DIV1D)定为新发疫病并暂时参照一类疫病处置。
WTD和DIV1D是目前罗氏沼虾养殖中危害最重要的2种病毒性疾病，目前尚无特效药物及治疗方法，切断病毒传播途径仍是最有效的预防措施。
目前，针对MrNV的检测方法有胶体金试纸条、ELISA、RT-PCR、荧光定量RT-PCR及RT-LAMP等，关于DIV1的检测方法已报道有套式PCR、荧光定量PCR、LAMP和RPA等。上述这些检测方法在实际检测工作中各有优缺点，如RT-PCR需要PCR和电泳分析，且敏感性较低；套氏PCR敏感性高，但需要进行两轮PCR及电泳，检测时间长，且多次开盖操作易导致交叉污染；ELISA准确性高，但操作繁琐、耗时长；LAMP灵敏、快速，但易出现假阳性。相对而言，实时荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，已成为实验室检测应用最广泛的方法。多重荧光定量PCR是在荧光定量PCR技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测；其应用于病原检测时可对多种病原进行共同检测，具有简便、高效、检测成本降低等优势，如史喜菊等建立了可用于伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2这3种病毒混合感染检测和鉴别诊断的三重荧光PCR方法，姜利霞等建立了可检测牛疱疹病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒单一或混合感染的四重荧光PCR检测方法，王然等建立了可快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌多重荧光定量PCR方法。
MrNV和DIV1是罗氏沼虾养殖中危害最严重的传染性病原，但目前主要是采用MrNV和DIV1的单重荧光定量PCR分别进行检测，操作繁琐，耗时耗力，因此亟待建立一种能同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR，实现对罗氏沼虾WTD和DIV1D的快速诊断及科学防控，为虾苗检疫、亲虾筛选及疾病诊断等提供更高效的技术手段。
发明内容
本发明的主要目的在于提供同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，包括如下步骤：
S1，引物与探针设计及合成：采用Primer Express v3.0分别在MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守区域设计多组特异性引物和TaqMan-MGB探针，并进行合成；其中，MrNV和DIV1探针的5'端分别标记HEX和FAM荧光染料、3'端均标记MGB基团，获得扩增引物和探针，并制作扩增引物及探针序列信息表，具体如下，
Figure BDA0003884468820000031
然后，对扩增引物及探针序列信息表中的扩增引物及探针进行预实验测试筛选，筛选出一套效果较好的引物及探针进行使用；
S2，病毒核酸提取及标准品制备：取阳性病料组织按1:2的比例加入生理盐水，然后，匀浆、离心收集200.0μL上清液，分别提取MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，病毒DNA置于-20℃冰箱保存，病毒RNA置于-70℃冰箱保存；制备重组质粒pGM-T-CPMrNV和pGM-T-MCPDIV1；提取pGM-T-CPMrNV质粒DNA，以Sal I单酶切使质粒线性化后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化；以线性化pGM-T-CPMrNV质粒DNA为模板，T7体外转录试剂盒体外转录获得的RNA为检测MrNV的标准品RNA，而pGM-T-MCPDIV1质粒DNA则直接作为检测DIV1的标准品DNA；使用核酸蛋白分析仪分别测定MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA的纯度和浓度，并换算成拷贝数：拷贝数(Copies/μL)＝6.02×1023×(ng/μL×10-9)÷(RNA长度×340)/(DNA长度×660)；采用10倍梯度稀释，将标准品系列稀释成1.0×101～1.0×108Copies/μL，-40℃保存备用；
S3，二重荧光定量PCR退火温度优化：参考各引物的退火温度，以1.0×108、1.0×105、1.0×101Copies/μL3个浓度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA等比例混合液为模板，按1℃的梯度在58～62℃范围内分别进行二重荧光定量PCR扩增，获得MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的扩增曲线，并将可以获得较低Ct值及较高相对荧光强度增加值时的退火温度选为最佳退火稳温度；
S4，二重荧光定量PCR检测体系优化：选择1.0×108、1.0×105、1.0×101Copies/μL3个不同浓度的标准品RNA/DNA为模板，先进行单个病毒检测体系优化，再以浓度为1.0×105Copies/μL的2种标准品等比例混合液为模板，进行二重荧光定量PCR检测体系优化，获得优化后的引物和探针浓度，且为最佳的引物和探针浓度；
S5，标准曲线建立及敏感性试验：取2.0μL的10倍梯度系列稀释MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液(1.0×101～1.0×108Copies/μL)为模板，以优化后的二重荧光定量PCR进行扩增，每个梯度设3个平行，建立MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的标准曲线和标准方程，以及获得二重荧光定量PCR检测MrNV的敏感性曲线，判断方法的敏感性；
S6，特异性实验：运用优化后的二重荧光定量PCR对MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸进行检测，观察有无出现扩增曲线及Ct值，评价方法的特异性；
S7，重复性试验：以1.0×107、1.0×106、1.0×105Copies/μL3个梯度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液为模板，分别在第1d、第7d和第14d进行重复试验，每个梯度设3个平行；计算组内及组间Ct值的变异系数(CV)，评价标准品和方法的稳定性
S8，样品核酸提取与检测：取罗氏沼虾临床样品组织按1:2的比例加入生理盐水，然后，匀浆、离心收集200.0μL上清液，提取核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，获得核酸样本，然后，使用经步骤S4优化获得的二重荧光定量PCR，在经步骤S3确定的最佳退火稳温度环境下，对核酸样本进行扩增，观察核酸样本是否有扩增曲线，判断核酸样本中是否有MrNV、DIV1的核酸。
优选的，在步骤S6中，MrNV、DIV1的核酸出现扩增曲线及Ct值，WSSV、IHHNV和EHP的核酸未出现扩增曲线及Ct。
优选的，在步骤S8中，以Ct值为35作为界限，当Ct值≤35且有扩增曲线，判定为MrNV或DIV1阳性；Ct值＞35同时有扩增曲线，需重复检测1次，若结果一致判定为MrNV或DIV1阳性，重复结果无扩增曲线则判定为MrNV或DIV1阴性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1，且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点，可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障，实现对罗氏沼虾WTD和DIV1D的快速诊断及科学防控，为虾苗检疫、亲虾筛选及疾病诊断等提供更高效的技术手段。
附图说明
图1为本发明同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法的流程图；
图2为MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的PCR扩增电泳结果；
图3为MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的扩增曲线；
图4为MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的标准曲线；
图5为二重荧光定量PCR检测MrNV的敏感性曲线；
图6为二重荧光定量PCR检测DIV1的敏感性曲线；
图7为二重荧光定量PCR对MrNV和DIV1检测的特异性曲线。
具体实施方
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1所示，同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，包括如下步骤：
S1，引物与探针设计及合成：采用Primer Express v3.0分别在MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守区域设计多组特异性引物和TaqMan-MGB探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；其中，MrNV和DIV1探针的5'端分别标记HEX和FAM荧光染料、3'端均标记MGB基团，获得扩增引物和探针，并制作扩增引物及探针序列信息表(表1)，具体如下，
表1扩增引物及探针序列信息
Figure BDA0003884468820000071
然后，对扩增引物及探针序列信息表中的扩增引物及探针进行预实验测试筛选，筛选出一套效果较好的引物及探针进行使用；
S2，病毒核酸提取及标准品制备：取阳性病料组织按1:2的比例加入生理盐水，然后，匀浆、离心收集200.0μL上清液，分别提取MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，病毒DNA置于-20℃冰箱保存，病毒RNA置于-70℃冰箱保存；然后，制备重组质粒pGM-T-CPMrNV和pGM-T-MCPDIV1；提取pGM-T-CPMrNV质粒DNA，以SalI单酶切使质粒线性化后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化；在一具体实施方式中，琼脂糖凝胶试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司，SalI购自宝生物工程(大连)有限公司；以线性化pGM-T-CPMrNV质粒DNA为模板，T7体外转录试剂盒体外转录获得的RNA为检测MrNV的标准品RNA；在一具体实施方式中，T7体外转录试剂盒购自Fermentas公司；而pGM-T-MCPDIV1质粒DNA则直接作为检测DIV1的标准品DNA；使用核酸蛋白分析仪分别测定MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA的纯度和浓度，并换算成拷贝数：拷贝数(Copies/μL)＝6.02×1023×(ng/μL×10-9)÷(RNA长度×340)/(DNA长度×660)；采用10倍梯度稀释，将标准品系列稀释成1.0×101～1.0×108Copies/μL，-40℃保存备用；
S3，二重荧光定量PCR退火温度优化：参考各引物的退火温度，以1.0×108、1.0×105、1.0×101Copies/μL3个浓度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA等比例混合液为模板，按1℃的梯度在58～62℃范围内分别进行二重荧光定量PCR扩增，获得MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的扩增曲线，并将可以获得较低Ct值及较高相对荧光强度增加值时的退火温度选为最佳退火稳温度；
S4，二重荧光定量PCR检测体系优化：选择1.0×108、1.0×105、1.0×101Copies/μL3个不同浓度的标准品RNA/DNA为模板，先进行单个病毒检测体系优化，再以浓度为1.0×105Copies/μL的2种标准品等比例混合液为模板，进行二重荧光定量PCR检测体系优化，获得优化后的引物和探针浓度，且为最佳的引物和探针浓度；
S5，标准曲线建立及敏感性试验：取2.0μL的10倍梯度系列稀释MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液(1.0×101～1.0×108Copies/μL)为模板，以优化后的二重荧光定量PCR进行扩增，每个梯度设3个平行，建立MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的标准曲线和标准方程，以及获得二重荧光定量PCR检测MrNV的敏感性曲线，判断方法的敏感性；
S6，特异性实验：运用优化后的二重荧光定量PCR对MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸进行检测，观察有无出现扩增曲线及Ct值，评价方法的特异性；MrNV、DIV1的核酸出现扩增曲线及Ct值，WSSV、IHHNV和EHP的核酸未出现扩增曲线及Ct。
S7，重复性试验：以1.0×107、1.0×106、1.0×105Copies/μL3个梯度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液为模板，分别在第1d、第7d和第14d进行重复试验，每个梯度设3个平行；计算组内及组间Ct值的变异系数(CV)，评价标准品和方法的稳定性
S8，样品核酸提取与检测：取罗氏沼虾临床样品组织按1:2的比例加入生理盐水，然后，匀浆、离心收集200.0μL上清液，提取核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，获得核酸样本，然后，使用经步骤S4优化获得的二重荧光定量PCR，在经步骤S3确定的最佳退火稳温度环境下，对核酸样本进行扩增，观察核酸样本是否有扩增曲线，判断核酸样本中是否有MrNV、DIV1的核酸；以Ct值为35作为界限，当Ct值≤35且有扩增曲线，判定为MrNV或DIV1阳性；Ct值＞35同时有扩增曲线，需重复检测1次，若结果一致判定为MrNV或DIV1阳性，重复结果无扩增曲线则判定为MrNV或DIV1阴性。
需要进一步说明的是，在步骤S2中，即在病毒核酸提取及标准品制备中，分别以MrNV-RNA和DIV1-DNA为模板进行PCR扩增，均可获得相应的目的片段(如图2所示)。PCR产物经回收纯化后克隆至pGM-T载体上，经PCR筛选、测序鉴定和BLAST同源比对，证实目的片段已正确插入pGM-T载体，表明重组质粒pGM-T-CPMrNV和pGM-T-MCPDIV1构建成功。分别提取阳性克隆质粒，其中以pGM-T-CPMrNV质粒线性化DNA为模板体外转录获得的RNA浓度为7.6ng/μL，换算成拷贝数为4.3×109Copies/μL，OD260/OD280为1.93，符合标准品的要求；pGM-T-MCPDIV1质粒的DNA浓度为113ng/μL，换算成拷贝数为3.2×1010Copies/μL，OD260/OD280为1.86，均可作为试验标准品。
需要进一步说明的是，在步骤S4中，即在二重荧光定量PCR检测体系优化中，对二重荧光定量PCR的退火温度、引物和探针使用终浓度进行优化，最终确定反应体系20.0μL：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4μL，Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，MrNV上、下游引物MrNV-qF/MrNV-qR(10μmol/L)各0.8μL和探针MrNV-qP(5μmol/L)1.2μL，DIV1上、下游引物DIV1-qF/DIV1-qR(10μmol/L)及探针DIV1-qP(5μmol/L)各0.8μL，ROX Reference DyeII(50×)0.4μL，核酸模板2.0μL，灭菌DEPC水补足至20.0μL。以健康无MrNV和DIV1感染罗氏沼虾肝胰腺组织提取的核酸为阴性对照，以灭菌DEPC水为空白对照。按照试剂盒说明进行扩增操作，反转录程序：42℃5min，95℃10s；PCR扩增程序：95℃5s，60℃45s，进行40个循环。
需要进一步说明的是，在步骤S5中的标准曲线建立中，采用优化后的二重荧光定量PCR对10倍系列梯度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液(1.0×101～1.0×108Copies/μL)进行扩增，结果(图3)显示，高浓度标准品的扩增曲线呈典型的S形，低浓度标准品的扩增曲线因扩增未达平台期而呈半S形，阴性对照和空白对照均未出现扩增曲线。利用仪器自带的软件进行分析，横坐标为起始拷贝数(x)对数、纵坐标为Ct值(y)绘制相应的标准曲线(图4)，其标准曲线方程分别为：yMrNV＝-3.558×lg(x)+41.85，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为91.0％和0.994；yDIV1＝-3.489×lg(x)+43.53，Eff.和RSq分别为93.5％和0.994。可见，应用TaqMan-MGB探针建立的二重荧光定量PCR对MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很高的扩增效率，制定的标准曲线线性关系良好，能实现同时定量分析MrNV和DIV1。
在步骤S5中的敏感性试验中，二重荧光定量PCR的敏感性试验结果表明，MrNV标准品RNA模板为100和10Copies/反应时，3个平行试验的Ct值分别为34.00、34.23、34.35和37.15、37.46、37.69；DIV1标准品DNA模板为100和10Copies/反应时，3个平行试验的Ct值分别为34.95、34.99、35.36和37.25、38.40、38.87，且均获得明显的扩增曲线(图5和图6)，说明建立的二重荧光定量PCR检测MrNV和DIV1的灵敏度均低至10Copies/反应。但在实际应用中，为保证检测结果的可靠性和准确性，建议以Ct值35为界限，当Ct值≤35且有扩增曲线，判定为MrNV或DIV1阳性；Ct值＞35同时有扩增曲线，需重复检测1次，若结果一致判定为MrNV或DIV1阳性，重复结果无扩增曲线则判定为MrNV或DIV1阴性。
需要进一步说明的是，在步骤S6中，即在特异性实验中，以建立的二重荧光定量PCR对虾类常见主要病原MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸进行检测，结果(图7)显示只有MrNV和DIV1出现扩增曲线，对应的Ct值分别为20.69和21.60，判为阳性；WSSV、IHHNV、EHP及阴性对照、空白对照均未出现扩增曲线，判为阴性。说明建立的二重荧光定量PCR对MrNV和DIV1具有较强的特异性。
需要进一步说明的是，在步骤S7中，即在重复性实验中，所得到的结果具体如下表(表2)。重复性实验的结果表明，二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验变异系数为0.31％～0.93％，组间试验变异系数为0.96％～1.33％；二重荧光定量PCR检测DIV1的组内试验变异系数为0.35％～0.81％，组间试验变异系数为0.78％～1.04％，表明以建立的二重荧光定量PCR对MrNV和DIV1检测具有较好的重复性，同时证实制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性，可作为标准品和阳性对照使用。
表2二重荧光定量PCR检测MrNV和DIV1的重复试验结果
Figure BDA0003884468820000121
为了进一步说明本发明，现用二重荧光定量PCR和套式PCR检测MrNV，获得的结果如下表(表3和表4)所示。
表3临床样品采用二重荧光定量PCR和套式PCR检测MrNV的结果比较(份)
项目 套式PCR检测呈阳性 套式PCR检测呈阴性 合计
二重荧光定量PCR检测呈阳性 6 1 7
二重荧光定量PCR检测呈阴性 0 110 110
合计 6 111 117
表4临床样品采用二重荧光定量PCR和套式PCR检测DIV1的结果比较(份)
项目 套式PCR检测呈阳性 套式PCR检测呈阴性 合计
二重荧光定量PCR检测呈阳性 11 2 13
二重荧光定量PCR检测呈阴性 1 103 104
合计 12 105 117
根据表3可知，应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份罗氏沼虾临床样品进行检测，结果显示如表3和表4所示。在MrNV检测(表3)中，有6份样品用2种方法检测均呈阳性，Ct值为19.37～34.13，根据标准曲线y＝-3.558×lg(x)+41.85计算，得知MrNV拷贝数在1.48×102～2.08×106Copies/反应，罗氏沼虾组织中的MrNV含量为3.7×101～5.2×105Copies/mg；有1份样品二重荧光定量PCR检测呈阳性而套式PCR检测呈阴性，Ct值为36.71，MrNV拷贝数为28Copies/反应，罗氏沼虾组织中的MrNV含量约7Copies/mg；有110份样品经2种方法检测均呈阴性，即2种检测方法的符合率为99.1％。
在DIV1检测(表4)中，有11份样品用2种方法检测均呈阳性，Ct值为17.12～34.89，根据标准曲线y＝-3.489×lg(x)+43.53计算，得知DIV1拷贝数在2.99×102～3.71×107Copies/反应，罗氏沼虾组织中的DIV1含量为7.5×101～9.3×106Copies/mg；有2份样品二重荧光定量PCR检测呈阳性而套式PCR检测呈阴性，Ct值分别为36.43和37.16，DIV1拷贝数为108和67Copies/反应，罗氏沼虾组织中的DIV1含量约27和17Copies/mg；有110份样品经2种方法检测均呈阴性，即2种检测方法的符合率为97.4％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，引物与探针设计及合成：采用Primer Express v3.0分别在MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守区域设计多组特异性引物和TaqMan-MGB探针，并进行合成；其中，MrNV和DIV1探针的5'端分别标记HEX和FAM荧光染料、3'端均标记MGB基团，获得扩增引物和探针，并制作扩增引物及探针序列信息表，具体如下，
Figure FDA0003884468810000011
然后，对扩增引物及探针序列信息表中的扩增引物及探针进行预实验测试筛选，筛选出一套效果较好的引物及探针进行使用；
S2，病毒核酸提取及标准品制备：取阳性病料组织按1:2的比例加入生理盐水，然后，匀浆、离心收集200.0μL上清液，分别提取MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，病毒DNA置于-20℃冰箱保存，病毒RNA置于-70℃冰箱保存；制备重组质粒pGM-T-CPMrNV和pGM-T-MCPDIV1；提取pGM-T-CPMrNV质粒DNA，以SalI单酶切使质粒线性化后采用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化；以线性化pGM-T-CPMrNV
质粒DNA为模板，T7体外转录试剂盒体外转录获得的RNA为检测MrNV的标准品RNA，而pGM-T-MCPDIV1质粒DNA则直接作为检测DIV1的标准品DNA；使用核酸蛋白分析仪分别测定MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA的纯度和浓度，并换算成拷贝数：拷贝数(Copies/μL)＝6.02×1023×(ng/μL×10-9)÷(RNA长度×340)/(DNA长度×660)；采用10倍梯度稀释，将标准品系列稀释成1.0×101～1.0×108Copies/μL，-40℃保存备用；
S3，二重荧光定量PCR退火温度优化：参考各引物的退火温度，以1.0×108、1.0×105、1.0×101Copies/μL3个浓度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA等比例混合液为模板，按1℃的梯度在58～62℃范围内分别进行二重荧光定量PCR扩增，获得MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的扩增曲线，并将可以获得较低Ct值及较高相对荧光强度增加值时的退火温度选为最佳退火稳温度；
S4，二重荧光定量PCR检测体系优化：选择1.0×108、1.0×105、1.0×101Copies/μL3个不同浓度的标准品RNA/DNA为模板，先进行单个病毒检测体系优化，再以浓度为1.0×105Copies/μL的2种标准品等比例混合液为模板，进行二重荧光定量PCR检测体系优化，获得优化后的引物和探针浓度，且为最佳的引物和探针浓度；
S5，标准曲线建立及敏感性试验：取2.0μL的10倍梯度系列稀释MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液(1.0×101～1.0×108Copies/μL)为模板，以优化后的二重荧光定量PCR进行扩增，每个梯度设3个平行，建立MrNV和DIV1二重荧光定量PCR的标准曲线和标准方程，以及获得二重荧光定量PCR检测MrNV的敏感性曲线，判断方法的敏感性；
S6，特异性实验：运用优化后的二重荧光定量PCR对MrNV、DIV1、WSSV、IHHNV和EHP的核酸进行检测，观察有无出现扩增曲线及Ct值，评价方法的特异性；
S7，重复性试验：以1.0×107、1.0×106、1.0×105Copies/μL3个梯度的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA同梯度等比例混合液为模板，分别在第1d、第7d和第14d进行重复试验，每个梯度设3个平行；计算组内及组间Ct值的变异系数(CV)，评价标准品和方法的稳定性
S8，样品核酸提取与检测：取罗氏沼虾临床样品组织按1:2的比例加入生理盐水，然后，匀浆、离心收集200.0μL上清液，提取核酸，最后加50.0μL洗脱缓冲液溶解，获得核酸样本，然后，使用经步骤S4优化获得的二重荧光定量PCR，在经步骤S3确定的最佳退火稳温度环境下，对核酸样本进行扩增，观察核酸样本是否有扩增曲线，判断核酸样本中是否有MrNV、DIV1的核酸。
2.根据权利要求1所述的同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，其特征在于，在步骤S6中，MrNV、DIV1的核酸出现扩增曲线及Ct值，WSSV、IHHNV和EHP的核酸未出现扩增曲线及Ct。
3.根据权利要求1所述的同时检测罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1的方法，其特征在于，在步骤S8中，以Ct值为35作为界限，当Ct值≤35且有扩增曲线，判定为MrNV或DIV1阳性；Ct值＞35同时有扩增曲线，需重复检测1次，若结果一致判定为MrNV或DIV1阳性，重复结果无扩增曲线则判定为MrNV或DIV1阴性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111218530A (zh) * 2020-03-19 2020-06-02 广西壮族自治区水产科学研究院 荧光定量pcr检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒
CN117512221A (zh) * 2023-12-07 2024-02-06 拱北海关技术中心 白斑综合征病毒和十足目虹彩病毒1的双重实时荧光pcr检测引物、探针、试剂盒和方法

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