CN111635953A - 基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于TaqMan‑MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。具体包括检测虾肝肠胞虫(EHP)的引物和TaqMan‑MGB探针，以及基于上述检测引物和探针的试剂盒、检测方法。本发明设计特异性的引物及TaqMan‑MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18‑T‑SSUEHP，建立检测EHP的TaqMan‑MGB探针荧光定量PCR方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点，适用于虾类样品的EHP定量检测，可为EHP快速定量检测及实时监测提供一种新的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地说是涉及基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。
背景技术
虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)属于肠胞虫科、肠胞虫属的一种专性细胞内寄生的微孢子虫，在2004年最早发现于泰国养殖的斑节对虾并于2009年首次被分离和正式命名报道，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等重要养殖虾类，是近10年危害养殖对虾的主要病原之一。EHP可通过水平和垂直传播，但主要经口摄食寄生EHP的鲜活饵料、病虾、死虾或水体中的孢子体而感染。EHP感染主要导致养殖对虾生长缓慢甚至停滞，表现为对虾消瘦、大小不均、重量离散；还可导致患病虾肝胰腺遭到破坏，免疫力降低，更容易被其他病原所侵染而死亡，给对虾养殖业造成了严重损失。
研究发现，EHP感染数量与其危害密切相关，轻度感染基本上不影响对虾的生长发育，中度感染影响对虾营养吸收，严重感染损坏对虾免疫系统；但轻度感染虾会逐渐发展到重度感染。因此，建立一种快速、准确的EHP定量检测方法，在虾苗检疫、亲虾筛选及成虾养殖疫情监测中可根据EHP定量数据结合虾的大小和养殖模式制定相应的措施，对防控由EHP引起的虾病害具有重要的意义。
EHP感染前期无明显病症，需采用组织学方法或分子生物学方法等实验室手段检测才能确诊。EHP检测方法包括原位杂交、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增(LAMP)等，但是这些方法在灵敏度和便捷程度上各有优缺点；特别是在EHP定量检测方面，目前采用的TaqMan探针定量PCR由于探针长度太长，敏感性不够理想。
目前国内尚未发布EHP检测的相关标准，而农业农村部在虾肝肠胞虫病(EHPD)监测计划中仍推荐采用套式PCR法进行检测。但在实际检测工作中，套式PCR法存在操作繁琐、检测时间长、不能定量等缺点，不能满足对EHP进行快速定量检测的需求。
因此，建立一种基于TaqMan-MGB探针的EHP荧光定量PCR检测方法，以提高EHP定量检测的灵敏度及效率是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。
荧光定量PCR相比普通PCR，其检测和分析过程在密闭的单管里由机器自动完成，具自动化程度高、有效解决PCR产物污染问题、能定量检测病原体感染的强弱等优点，在实验室检测病原体的方法选择上被认为是最理想的方法；TaqMan-MGB探针则是荧光定量PCR使用的一种荧光探针，其3′端的淬灭基团为不发光的MGB(Minor Groove Binder)结合物，可实现高Tm值的探针长度缩短易于与模板退火而利于提高方法的灵敏度，且探针3′端不发光的淬灭基团与5′端报告基团在空间的位置更接近，使荧光本底降低、实验结果分辨率更高。
本发明的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法既能发挥荧光定量PCR法的优势而克服套式PCR法的缺点，且其探针连接MGB基团相对于TaqMan探针因长度缩短易于与模板退火而更有利于提高方法的灵敏度，非常适用于对灵敏度要求高的病原体定量检测，可提高EHP检测的敏感性和效率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：
EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQ ID No.1；
EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQ ID No.2；
EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQ ID No.3；
其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
根据寄生虫的核糖体小亚基(SSU rDNA)基因序列保守性高的特点及TaqMan-MGB探针的优势，在EHP的SSU rDNA基因(KF362129)保守区域设计了特异性的引物及TaqMan-MGB探针；
TaqMan-MGB探针是在TaqMan探针的3′端连上不发光的淬灭基团MGB(MinorGroove Binder)结合物，与TaqMan探针相比具有探针长度短、稳定性好、分辨率高等特点。
本发明还提供了一种基于上述引物组的检测试剂盒，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。
优选的：反应液包括2×Probe qPCRPremix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探针EHP-qP66和灭菌ddH2O。
优选的：每剂反应液为45μL，包含2×Probe qPCRPremix Ex TaqTM25μL，ROXReference DyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3.0μL，10μmol/LTaqMan-MGB探针EHP-qP663.0μL，灭菌ddH2O 10.5μL。
优选的：工作标准品为pMD18-T-SSUEHP，浓度为1.0×104～1.0×108拷贝/μL，各200μL。
优选的：工作标准品pMD18-T-SSUEHP的制备方法为：PCR扩增EHP DNA，经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T连接，转化DH5α，得到重组质粒pMD18-T-SSUEHP，并进行PCR及测序鉴定。
优选的：阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-SSUEHP，所述阴性对照为不含EHPDNA的虾组织DNA溶液，各200μL。
重组质粒pMD18-T-SSUEHP稳定性好，可满足作为工作标准品和阳性对照的要求。
本发明还提供了上述引物组在制备检测虾肝肠胞虫的试剂盒中的应用，采用50μL反应体系，即45μL反应液加入5μL待检模板；待检样品与工作标准品、阳性对照、阴性对照、空白对照同时进行检测；荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号；质量控制：建立标准曲线，其相关系数方值RSq应≥0.980；阴性对照和空白对照的Ct值应不显示，阳性对照的EHP DNA拷贝量应为1×104～1×106拷贝/μL，否则检测视为无效。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒，取得的技术效果为基于EHP定量检测的需求及TaqMan-MGB探针应用于病原体检测的优势，在EHP的SSU rDNA基因保守序列设计了特异性的引物及TaqMan-MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18-T-SSUEHP；通过对反应体系优化，确定了检测EHP的荧光定量PCR的最佳条件；重组质粒pMD18-T-SSUEHP DNA稳定性好，浓度和纯度均可满足作为标准品和阳性对照的要求。建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法对标准品的扩增效率高，起始模板范围在2×101～2×109拷贝/反应时，建立的标准曲线线性关系好，能够准确地反映目的产物的扩增；灵敏度高，对标准品质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应，对虾组织的EHP检测灵敏度约为10个拷贝/mg，较农业农村部推荐的套式PCR法提高约10倍；特异性强，对虾类其他常见病原均无扩增反应；重复性好，组内和组间变异系数均小于1％；扩增和产物分析同步完成，无需PCR后处理，整个检测过程可在1h内完成。
采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床样品检测的结果显示，对EHP拷贝数较高的样品两个方法均能得到阳性检测结果，符合率较高；而对EHP拷贝数低(小于100拷贝/mg)的样品时，TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法比套式PCR法具有更高的灵敏度，总阳性检出率提高了2.6％(多检出了7份)。基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点，不仅能满足临床上对EHP快速定量检测的需求，且能提高EHP低感染水平如早期感染或潜伏感染的阳性检出率，对于控制该病的传播与扩散具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明待筛选引物的荧光信号强度示意图。
图2为本发明荧光定量PCR检测EHP待筛选引物扩增产物电泳示意图，其中，M：DL1000 DNA Marker；1～2、3～4、5～6、7～8、9～10：分别为1组、2组、3组、4组、5组引物探针组合扩增的PCR产物；NC：阴性对照。
图3为本发明EHP-SSU rDNA基因的PCR扩增及pMD18-T-SSUEHP的PCR鉴定结果示意图，其中，M：DL500 DNA Marker；1～3：EHP-SSU rDNA基因；4～6：pMD18-T-SSUEHP；NC：阴性对照。
图4为本发明1.0×106拷贝/μL的标准品为模板，不同引物终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μmol/L)进行荧光定量PCR扩增，荧光信号强度(敏感性)示意图。
图5为本发明1.0×106拷贝/μL的标准品为模板，不同探针终浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μmol/L)进行荧光定量PCR扩增，荧光信号强度(敏感性)示意图。
图6为本发明标准品(1.0×100～1.0×109拷贝/μL)荧光定量PCR扩增曲线示意图。
图7为本发明荧光定量PCR检测EHP的标准曲线示意图。
图8为本发明荧光定量PCR的特异性检测示意图。
图9为本发明荧光定量PCR法对临床样品EHP检测的敏感性示意图。
图10为套式PCR法对临床样品EHP检测的敏感性示意图。其中M：DL500 DNAMarker；1-6：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的EHP DNA第一轮PCR产物；7-12：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的EHP DNA第二轮PCR产物；NC：阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。
虾肝肠胞虫(EHP)、虾虹彩病毒(SIV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、哈维弧菌(V.harveyi)、创伤弧菌(V.vnlnificus)的阳性材料均由本实验室鉴定并保存，也可由市售或公开渠道获得，例如，传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)记载在《广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析》，南方农业学报，2013，44(12)：2089-2093，公众可从广西水产科学研究院获得；白斑综合征病毒(WSSV)记载在《凡纳滨对虾白斑综合征病毒广西株变异区基因的比较分析》，病毒学报，2014，30(1)：51-56，公众可从广西水产科学研究院获得，在此不再一一赘述。健康无EHP感染凡纳滨对虾采自广西水产科学研究院SPF凡纳滨对虾良种场；276份虾样品采自广西北海、钦州、防城港等地养殖场，其中2018年和2019年分别收集142份和134份。
动物组织基因组DNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL1000、DL500、氨苄青霉素购自北京艾德莱生物技术有限公司；
18-T Vector克隆试剂盒、DH5α感受态细胞、Premix Ex TaqTM(ProbeqPCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖购自英韦创津生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。荧光定量PCR仪Mx3005P为安捷伦公司产品。
未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
引物与TaqMan-MGB探针的设计与合成。
采用PrimerExpress 3.0软件按荧光定量PCR引物和MGB探针的设计原则，在EHP-SSU rDNA基因(KF362129)保守区域设计多组特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针，经Oligo7.0软件分析比较并适当修改优化获得5组评价较理想的引物探针(见表1)，并通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对验证特异性后交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中探针的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
表1初筛的引物及探针信息
应用上述5组引物探针组合对2份不同浓度的EHP DNA模板同时进行荧光定量PCR。参考试剂及仪器使用说明，采用50μL反应体系，引物和探针终浓度均为常规的0.2μmol/L；荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s、60℃退火并延伸35s、扩增40个循环，在60℃结束时收集荧光信号。
结果显示，第1组引物探针组合荧光定量PCR的荧光信号强度最强(参见图1)，PCR产物的电泳图结果也显示第1组引物探针组合的条带最亮(参见图2)。按荧光定量PCR的原理，只有在引物扩增效率高且探针也高效与模板退火结合的情况下(本发明创新采用TaqMan-MGB探针的目的就是使探针长度缩短易于与模板退火以提高探针的结合效率)，DNA聚合酶在催化引物扩增的过程中才能同时切断探针释放荧光基团，才会产生强烈的荧光信号，即荧光信号强度可同时反映引物扩增和探针结合的效率，是方法整体效果的反映；而电泳条带的亮度仅能反映引物扩增效率，本发明实施这一工作目的是对待选引物的效果从另一个角度进行验证，以进一步明确待选引物探针组合的效果。经综合比较，第1组引物探针组合的效果最好，因此选取第1组为本发明的引物探针组合。
经上述实验初筛，获得一套效果较好的引物及探针(表2)用于EHP荧光定量PCR检测方法的建立。
表2本发明引物及探针信息
实施例2
病原核酸的提取及重组质粒标准品的制备。
取30mg阳性病料组织，按照动物组织基因组DNA快速提取试剂盒说明书，提取虾常见病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、V.harveyi和V.vnlnificus的核酸DNA，最后加60μL洗脱缓冲液溶解DNA，置于–20℃保存备用。
以EHP DNA为模板，灭菌ddH2O为空白对照，进行荧光定量PCR反应。参考试剂及仪器使用说明。
在50μL反应体系中加入2×Probe qPCR Premix Ex TaqTM25μL，ROX ReferenceDyeⅡ0.5μL，上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66(10μmol/L)各1μL，TaqMan-MGB探针EHP-qP66(10μmol/L)1μL，模板DNA 5μL，用灭菌ddH2O补足至50μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T连接，转化DH5α，制备重组质粒pMD18-T-SSUEHP，并进行PCR及测序鉴定。
提取重组质粒pMD18-T-SSUEHP，用核酸蛋白分析仪测定其浓度并转换为拷贝数，并以10倍梯度稀释至1.0×100～1.0×109拷贝/μL作为标准品，–20℃保存备用。
结果表明：参见图3，以EHP DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，获得与预期目的片段大小一致的特异性条带；重组质粒pMD18-T-SSUEHP经PCR、测序鉴定，所得目的片段序列与GenBank上公布的EHP-SSU rDNA基因在本发明上下游引物之间序列的同源性为100％，说明目的基因片段正确连接入pMD18-T载体，即重组质粒pMD18-T-SSUEHP构建成功。取阳性克隆菌液提取质粒，测定浓度并转换为拷贝数，pMD18-T-SSUEHP浓度为6.83×109拷贝/μL，OD260/OD280为1.96，可满足标准品的要求。
实施例3
荧光定量PCR反应条件的优化。
分别以3个梯度(1.0×109、1.0×106、1.0×103拷贝/μL)的标准品DNA为模板，反应体系参见实施例2，其中，将上下游引物浓度以0.1μmol/L递增设置为0.1～0.8μmol/L，其他成分浓度不变，根据扩增反应的循环阈值(Cycle thresholdvalue，Ct值)和扩增曲线的荧光信号强度(ΔRn)选择最优引物浓度。
结果表明，分别以1.0×109、1.0×106、1.0×103拷贝/μL的标准品为模板，上下游引物浓度为0.1～0.8μmol/L时荧光定量PCR扩增的结果显示，随着引物浓度增大，ΔRn增大、Ct值减小，但引物终浓度在0.6～0.8μmol/L时的效果(Ct值和ΔRn)相差不大(其中以1.0×106拷贝/μL的标准品为模板的结果参见图4)。经3次重复实验，为保证引物的扩增效率又不浪费实验材料，本发明最终确定0.6μmol/L为最佳引物终浓度。
以3个梯度(1.0×109、1.0×106、1.0×103拷贝/μL)的标准品DNA为模板，反应体系参见实施例2，其中，将探针浓度以0.1μmol/L递增设置为0.1～0.8μmol/L，其他成分浓度不变，根据扩增反应的Ct值和ΔRn选择最优探针浓度。
结果表明，分别以1.0×109、1.0×106、1.0×103拷贝/μL的标准品为模板，探针浓度为0.1～0.8μmol/L时荧光定量PCR扩增的结果显示，随着探针浓度增大，ΔRn增大、Ct值减小，但探针终浓度在0.5～0.8μmol/L时的效果(Ct值和ΔRn)相差不大(其中以1.0×106拷贝/μL的标准品为模板的结果参见图5)。经3次重复实验，为保证探针的效率又不浪费实验材料，选定0.6μmol/L为最佳探针终浓度。
通过引物浓度和探针浓度优化后，确定荧光定量PCR的最佳反应体系为：2×ProbeqPCRPremix Ex TaqTM25μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66(10μmol/L)各3.0μL，TaqMan-MGB探针EHP-qP66(10μmol/L)3.0μL，模板5μL，用灭菌ddH2O补足至50μL。
实施例4
标准曲线的建立及敏感性试验。
以10倍梯度稀释的标准品DNA(1×100～1×109拷贝/μL)为模板，用优化后的荧光定量PCR方法进行检测；利用数据分析软件进行分析，建立起始模板拷贝数(X)的对数与Ct值(Y)之间的标准曲线和标准方程，并根据各标准品DNA的扩增结果来判断该方法的定量范围和敏感性。
结果参见图6，各梯度标准品扩增曲线重复性好、荧光强度增量明显、间距均匀，高浓度标准品(1.0×103～1.0×109拷贝/μL)的扩增曲线呈现典型的“S”型，低浓度标准品(1.0×100～1.0×102拷贝/μL)的扩增曲线因未达扩增平台期呈半“S”型，阴性对照和空白对照没有出现任何扩增。经数据分析建立标准曲线参见图7，起始模板拷贝数为2.0×100～2.0×109拷贝/μL时，模板浓度的对数与Ct值之间呈良好的线性关系，标准曲线方程为Y＝-3.232×LOG(X)+39.51，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为103.9％和1.000；标准品DNA为20拷贝/反应时，3个重复的Ct值分别为34.81、34.88、34.91，仍有明显的扩增曲线，且重复性好；标准品DNA为2拷贝/反应时，3个重复的Ct值分别为37.84、38.28、38.71，重复性差。
因此，为保证检测结果的准确性，在实际检测工作中以Ct值35为界限，若检测样品的Ct值小于或等于35，且有扩增曲线，则判为EHP阳性；Ct值大于35，且有扩增曲线，则重复1次，如结果一致，判为EHP阳性；Ct值大于35，重复结果未出现扩增曲线，判为EHP阴性。
上述结果表明，本发明建立的EHP荧光定量PCR检测方法对标准品具有很高的扩增效率，标准品起始模板为2.0×101～2.0×109拷贝/反应时，建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增，可用于EHP的定量分析，灵敏度为20个拷贝/反应。
实施例5
特异性试验。
采用实施例3优化后的荧光定量PCR对虾常见重要病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、V.harveyi和V.vnlnificus的核酸进行检测.
结果表明，参见图8，只有EHP出现扩增曲线，Ct值分别为22.07、22.10、22.16，判为阳性；而其他病原及阴性对照、空白对照均未出现扩增曲线，判为阴性。说明本发明建立的荧光定量PCR对EHP的检测具有很强的特异性。
实施例6
荧光定量PCR的重现性实验。
选取3个梯度(1.0×107、1.0×105、1.0×103拷贝/μL)的标准品DNA为模板，在间隔第7天和第14天分别进行重复试验，每个梯度做3个平行，记录各次试验的Ct值，分析组内及组间的Ct值变异系数，检测标准品的稳定性及方法的重现性。变异系数(CV)＝标准偏差(SD)/平均数(X)。
实验结果表明：1.0×107、1.0×105、1.0×103拷贝/μL 3组标准品在间隔第7天和第14天分别进行重复试验的结果见表3，组内实验的变异系数为0.26％～0.72％，组间实验变异系数为0.56％～0.92％，表明本发明建立的荧光定量PCR方法重现性好，检测结果稳定可靠；同时说明本发明制备的重组质粒DNA稳定性好，可作为标准品和阳性对照使用。
表3 EHP荧光定量PCR重复性试验结果
对比实验1
荧光定量PCR法与套式PCR法的敏感性比较。
采用实施例2的方法提取EHP阳性病料组织的总DNA以10倍梯度稀释(100～10-5)，取2μL各梯度DNA为模板分别采用本发明优化建立的荧光定量PCR法和农业农村部EHPD监测计划推荐的套式PCR法进行检测，比较它们的敏感性。
实验结果表明：采用荧光定量PCR法和套式PCR法分别对10倍梯度稀释的EHP阳性DNA(100～10-5)进行检测的结果显示，参见图9，荧光定量PCR法可检测到10-4稀释度的阳性DNA，而套式PCR法参见图10，可检测到10-3稀释度的阳性DNA，即荧光定量PCR法的敏感度比套式PCR法高一个数量级(10倍)。
对比实验2
荧光定量PCR法和套式PCR法检测临床样品EHP的结果比较。
按实施例2的方法提取临床样品组织的总DNA，取2μL各DNA为模板分别用荧光定量PCR法和套式PCR法对276份临床样品(凡纳滨对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾和红螯螯虾)进行检测，比较检测结果以检验荧光定量PCR法的临床实用性。
实验结果表明：参见表4，有46份样品用两种方法检测均为阳性，Ct值为15.73～32.91，根据标准曲线方程Y＝-3.232×LOG(X)+39.51计算，其EHP拷贝数在1.10×102～2.28×107拷贝/反应之间，虾组织中的EHP含量约为1.10×102～2.28×107拷贝/mg；有8份样品经荧光定量PCR检测呈阳性而经套式PCR检测呈阴性，Ct值为33.16～36.49，其EHP拷贝数在9.2×101～8.6×100拷贝/反应之间，虾组织中的EHP含量约为9.2×101～8.6×100拷贝/mg；有221份样品用两种方法检测均为阴性。说明在实际检测工作中采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法进行40个循环的反应，可提高EHP低拷贝数样品的检出率，其对虾组织EHP的检测灵敏度约为10拷贝/mg。2018年和2019年广西虾样品的EHP阳性率分别为16.2％(23/142)和30.6％(41/134)，主要检出品种为凡纳滨对虾。
表4临床样品采用荧光定量PCR法和套式PCR法检测结果比较
实施例7
一种荧光定量PCR检测虾肝肠胞虫的检测试剂盒，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。
反应液包括2×Probe qPCRPremix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探针EHP-qP66和灭菌ddH2O。
引物组，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：
EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQ ID No.1；
EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQ ID No.2；
EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQ ID No.3；其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
检测时，配置每剂反应液为45μL，包含2×Probe qPCRPremix Ex TaqTM25μL，ROXReference DyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3μL，10μmol/LTaqMan-MGB探针EHP-qP663μL，灭菌ddH2O10.5μL。
工作标准品为pMD18-T-SSUEHP，浓度为1.0×104～1.0×108拷贝/μL，各200μL。
阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-SSUEHP，所述阴性对照为不含EHP DNA的虾组织DNA溶液，各200μL。
检测时，采用50μL反应体系，即45μL反应液加入5μL待检模板；待检样品与工作标准品、阳性对照、阴性对照、空白对照同时进行检测。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号。
质量控制：(将五个工作标准品的浓度输入分析软件)建立标准曲线，其相关系数方值(RSq)应大于等于0.980(本发明建立的标准曲线RSq为1.000)；阴性对照和空白对照的Ct值应不显示，阳性对照的EHP DNA拷贝量应为1×104～1×106拷贝/μL，否则检测视为无效。
结果分析与判定：检测样本中1×103拷贝/mg≤EHP DNA≤1×109拷贝/mg，测定结果有效，可直接报告阳性及相应的拷贝量；检测样本中EHP DNA＞1×109拷贝/mg，即可直接报告为＞1×109拷贝/mg，也可用灭菌ddH2O按10倍梯度做相应稀释，使其拷贝量落在1×105～1×108拷贝/mg范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正；检测样本EHP DNA的拷贝量为1×101～1×103拷贝/mg时，建议对该样本进行双份重试，如双份样本重试结果仍在1×101～1×103拷贝/mg，则按实际值计算；如双份或一份重试结果＜1×101拷贝/mg，则判断为EHP DNA阴性；Ct值不显示时或EHP DNA的拷贝量＜1×101拷贝/mg，则该样本EHPDNA为阴性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区水产科学研究院
<120> 基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggtaatt ccaactccaa 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctacgacta cggacccttt aactg 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgtctatg gtggatgct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attggagggc aagttttggt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctatccgt tccgctact 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgtctatg gtggatgct 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attggagggc aagttttggt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcatctacg actacggacc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtgtctatg gtggatgct 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attggagggc aagttttggt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcaacaaac tcaatggctt 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtgtctatg gtggatgct 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaacgtgag tagaagggtc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctcaacaaac tcaatggctt 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtgtctatg gtggatgct 19
Claims (8)
1.一种基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组，其特征在于，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：
EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQ ID No.1；
EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQ ID No.2；
EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQ ID No.3；
其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。
2.一种基于权利要求1所述引物组的检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液包括2×Probe qPCRPremix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探针EHP-qP66和灭菌ddH2O。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液共2.3mL；每剂反应液为45μL，包含2×Probe qPCR Premix Ex TaqTM25μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3.0μL，10μmol/L TaqMan-MGB探针EHP-qP66 3.0μL，灭菌ddH2O 10.5μL。
5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品为pMD18-T-SSUEHP，浓度为1.0×104～1.0×108拷贝/μL，各200μL。
6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品pMD18-T-SSUEHP的制备方法为：PCR扩增EHP DNA，经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T连接，转化DH5α，得到重组质粒pMD18-T-SSUEHP，并进行PCR及测序鉴定。
7.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为1.0×105拷贝/μL的pMD18-T-SSUEHP，所述阴性对照为不含EHP DNA的虾组织DNA溶液，各200μL。
8.权利要求1所述的引物组在制备检测虾肝肠胞虫的试剂盒中的应用，其特征在于，采用50μL反应体系，即45μL反应液加入5μL待检模板；待检样品与工作标准品、阳性对照、阴性对照、空白对照同时进行检测；荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号；质量控制：建立标准曲线，其相关系数方值(RSq)应≥0.980；阴性对照和空白对照的Ct值应不显示，阳性对照的EHP DNA拷贝量应为1×104～1×106拷贝/μL，否则检测视为无效。
Priority Applications (1)
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