CN111471801A - 检测tc07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测TC07‑2型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的反转录‑实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)试剂盒及其应用。该试剂盒包括用于检测TC07‑2型IBV的引物和探针，其中上游引物序列如SEQ ID NO.8所示，下游引物序列如SEQ ID NO.9所示，荧光探针序列如SEQ ID NO.10所示，所述荧光探针5和3’端分别标记6‑FAM基团和MGB基团。本发明定量准确，检测速度快，特异性强，灵敏度高，可鉴别检测TC07‑2型与其他基因型的IBV毒株，对TC07‑2型IBV的感染监测具有重要意义。

Description

检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定 量PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，本发明涉及一种检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒及其应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是一种由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的急性、高度接触性传染病。该病毒在世界范围内广泛分布，主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统，幼鸡以呼吸困难、咳嗽等呼吸道症状为主；产蛋鸡通常发生产蛋量下降、蛋品质降低，严重时可引起雏母鸡输卵管发育不良；肉鸡则出现生长缓慢，饲料报酬降低。自20世纪30年代首次报道以来，该病在世界范围内广泛流行，给各国养禽业带来严重的经济损失。

IBV属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ冠状病毒，其基因组为不分节段的单股正链RNA。大量研究表明，IBV易发生基因突变，导致IBV不时出现新的基因型并引起不同毒株之间存在较大的抗原差异，使病毒检测和免疫预防日益复杂化。为有效控制本病的流行，加强病毒感染的监测，科研人员开发建立了大量的血清学、分子生物学等检测方法，但这些方法普遍存在无法区分不同血清型IBV感染的不足，达不到鉴别诊断的要求，尤其是针对新出现的一些血清型的毒株，更是缺乏有效鉴别诊断的方法。实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、重复性好的优点，通过设计型特异性引物和探针，可以快速、准确地区分不同血清型病毒的感染，达到鉴别诊断的目的。

TC07-2型IBV也被称为GVI-1型(Valastro V,et al.S1 gene-based phylogenyof infectious bronchitis virus:An attempt to harmonize virusclassification.Infect Genet Evol,2016,39:349-364.)，自2007年中国首次报道TC07-2型IBV以来，该型病毒在我国的流行范围迅速扩大。根据国内多个研究团队对临床发病鸡群IBV流行病学监测结果显示TC07-2型IBV分离率目前已经位居第三，说明该型病毒感染所产生的危害日趋严重，应当引起足够重视。因此，本发明旨在提供一种定量检测TC07-2型IBV的RT-qPCR试剂盒，为监测可能出现的TC07-2型IBV的流行提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种可定量检测TC07-2型IBV的RT-qPCR试剂盒。

本发明的难点在于选择的引物和探针结合位点既要在不同基因型IBV毒株间具有较大的差异，以达到特异性区分不同基因型毒株的目的，而且相应序列的碱基组成、Tm值等条件还必须同时满足qPCR引物和探针设计的要求。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种定量检测TC07-2型IBV的RT-qPCR试剂盒，该试剂盒包括用于检测TC07-2型IBV的探针和引物。其特异性引物的序列分别为：上游引物TC07-2/F序列为5’-TAATCAGAGTGGGGCTCAACCT-3’(SEQ ID NO.8)；下游引物TC07-2/R序列为5’-ACCAGGAACAGCACTAATCTGTTG-3’(SEQ ID NO.9)；荧光探针TC07-2/Probe序列为5’-TCAAAAGGAACCTTCACC-3’(SEQ ID NO.10)，所述探针5’端标记荧光报告基团为6-FAM，3’端标记荧光淬灭基团为MGB。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括2×qPCR Probe Master Mix、ddH₂O和阳性标准品。

其中，优选的，所述的TC07-2型IBV CK/CH/JX/2018/1株由扬州大学畜禽传染病学重点开放实验室保存(李敏.检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立.扬州大学硕士学位论文，2019.)。

其中，优选的，所述的阳性标准品是含有TC07-2型IBV CK/CH/JX/2018/1株S1基因片段的质粒，所述质粒是用权利要求1中所述的引物从CK/CH/JX/2018/1株基因组反转录产物产生的cDNA模板上扩增获得的特异性片段连接到pEasyT3载体(北京全式金生物技术有限公司，产品编号：CT301)上得到的。

其中，优选的，使用所述的用于定量检测TC07-2型IBV时，按照以下步骤进行：

(1)提取样品的RNA；

(2)标准曲线的建立

将阳性标准品质粒从10⁹拷贝/μL到10¹拷贝/μL梯度稀释作为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，用于建立标准曲线；

(3)将步骤(1)中提取的RNA反转录为cDNA；

(4)以步骤(3)中的cDNA为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；

(5)PCR反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量，对数据进行处理和分析。

其中，优选的，荧光定量PCR的反应体系为20μL，包括以下组分：0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.2μL荧光探针、10μL 2×qPCR Probe Master Mix、2μL cDNA模板和7μLddH₂O。

其中，优选的，RT-qPCR的反应条件为：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

传染性支气管炎给各国养禽业带来严重危害，IBV的突变和不同毒株间的重组使得新的基因型不断出现，且IBV不同基因型之间抗原差异性较大，给IBV的监控和疫苗研制带来严峻挑战。根据国内多个研究团队的流行病学监测结果显示，TC07-2型IBV的分离率目前在国内已经升至第三位，但现有普通RT-PCR方法、RT-qPCR方法等均不能实现对TC07-2型IBV同其它基因型鉴别检测，通常需要通过S1基因测序和遗传进化分析才能对分离毒株进行准确定型，操作繁琐且周期较长，无法满足生产一线快速诊断和毒株分型的需求。

本试剂盒使用特异性荧光探针和引物，具有高度的特异性，可将TC07-2型IBV与其它基因型IBV毒株鉴别开来；灵敏度良好，可检测低至10¹拷贝/μL的病毒量；批内和批间重复性实验结果显示，本试剂盒可重复性良好，可对病毒实现准确定量。本试剂盒的发明对TC07-2型IBV的监测以及病毒早期感染的诊断分析方面有重大意义，且操作简单，反应迅速，在实践和推广上具有巨大潜力。

附图说明

图1为不同基因型IBV代表毒株S1基因比对分析结果和引物、探针结合位置示意图。

图2为IBV S1基因片段的扩增，以TC07-2型IBVCK/CH/JX/2018/1株基因组cDNA为模板，使用试剂盒中所述引物进行常规RT-PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，M为DL2000 DNA Marker，1泳道为PCR扩增S1基因片段，2泳道为阴性对照；

图3为TC07-2型IBVRT-qPCR的标准曲线(A)及敏感性实验结果(B)。

具体实施方式

为使本试剂盒的目的、使用方法和有益效果更加清楚，下面将结合具体实施例来对本试剂盒作进一步的说明。以下实施例中所用材料和实验方法如无特殊说明，均可从常规途径获得。

实施例1：TC07-2型IBVRT-qPCR检测方法的建立

1、引物和探针的设计

首先选择目前在中国流行的IBV主要基因型代表毒株和主要使用的IBV疫苗株对其S1基因序列(IBV基因组中变异程度最高的基因，也是决定IBV基因型的基因)进行序列比对，确定在不同基因型间序列差异较大的区域，然后根据qPCR引物和探针设计的基本原则进行引物和探针的设计，最后将设计出的引物和探针通过在线Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析，以确保设计出的引物和探针具有良好的型特异性。用于序列分析的IBV毒株信息见表1。

表1不同基因型IBV代表毒株信息

检测TC07-2型IBV的特异性引物TC07-2/F、TC07-2/R和荧光探针TC07-2/Probe序列及其对应于TC07-2型IBV S1基因序列的碱基位置见表2，所述探针5’端标记荧光报告基团为6-FAM，3’端标记荧光淬灭基团为MGB。

不同基因型IBV代表毒株S1基因比对分析结果和引物、探针结合位置示意图见图1。

表2荧光定量PCR引物和探针序列

2、荧光定量PCR反应体系和反应条件

荧光定量PCR的反应体系为20μL，包括以下组分：0.4μL上游引物(10μmol)、0.4μL下游引物(10μmol)、0.2μL荧光探针(10μmol)、10μL 2×qPCR Probe Master Mix、2μL cDNA模板和7μL ddH₂O。反应条件为95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环。

3、荧光定量PCR标准曲线的建立

用试剂盒中的特异性引物，以IBV的cDNA为模板扩增出相应片段连接到pEasyT3载体(北京全式金生物技术有限公司，产品编号：CT301)上用作阳性标准品，S1基因扩增产物电泳图见图2。使用紫外分光光度计对抽提的质粒进行浓度测定，并根据公式N＝(C×10^-9)/(M×660)×6.02×10²³(C为标准品浓度，M为构建质粒的碱基数)计算质粒拷贝数。将质粒标准品10倍梯度稀释为10⁹拷贝/μL到10¹拷贝/μL，在荧光定量PCR仪上扩增，得到标准曲线(如图3A)。

4、敏感性试验

以10倍梯度稀释的标准品作为模板，用本试剂盒进行检测，结果显示，荧光定量PCR的灵敏度可达到10¹拷贝/μL,在10⁹拷贝/μL到10¹拷贝/μL范围内可得到良好的动力学曲线(如图3B)。

5、重复性试验

以10倍系列稀释的3个梯度的标准质粒为模板，分别进行组内和组间平行试验。组内平行试验方法是在一次PCR检测中，每个样品做3个重复；组间平行试验方法是每个样品做3次不同批次的检测。计算组内和组间变异系数，分析试验的可重复性。实验结果(见表3)显示，该荧光定量检测方法批内重复性实验的变异系数为1.06％～2.44％，批间重复性实验的变异系数为0.45％～2.29％，均小于3％，说明该方法具有良好的重复性与稳定性。

表3重复性试验结果

6、特异性试验

用于特异性试验测试的不同基因型毒株包括：TC07-2型(CK/CH/JX/2018/1株)、QX型(QXL87株)、TW I型(CK/CH/AH/2011/3株)、Mass型(H120株)、Mass型(Ma5株)、LDT3-A型(LDT3-A株)和793/B型(4/91株)等不同基因型IBV分离株和疫苗株。其中分离株CK/CH/JX/2018/1株和CK/CH/AH/2011/3株(李敏.检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立.扬州大学硕士学位论文，2019.)由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。QXL87株、H120株、Ma5株、LDT3-A株和4/91株均为商品化疫苗毒株。QXL87株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室研制、保藏和提供(陈启稳.QX型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗的研制.扬州大学硕士学位论文，2014.)。H120株、Ma5株、LDT3-A株和4/91株为将对应商品疫苗接种10日龄SPF鸡胚所获得的含毒鸡胚尿囊液，鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)为青岛易邦生物工程有限公司产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(Ma5)株为英特威美国分公司产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)为哈尔滨维科生物技术开发公司产品、鸡传染性支气管炎活疫苗(4/91株)为MSD公司产品。

分别从含有不同毒株的鸡胚尿囊液中提取总RNA，并以其其反转录获得的cDNA为模板利用本试剂盒进行荧光定量PCR反应，验证该方法的特异性，结果显示，本试剂盒能够特异性检测出TC07-2型IBV毒株，并且不与QX型、TW I型、Mass型、LDT3-A型、793/B型等其他基因型毒株发生交叉反应(见表4)。

表4特异性试验检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR试剂盒及其

应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）CK/CH/JX/2018/1

<400> 1

atgttggaga agttactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60

tttgatgctg ataatagtta tgtgtactac taccagagtg gatttagacc tcctttaggt 120

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gttgcgatta ctacacctgt taatggcatg cgttggtcat ctattaatgg agtgtgttca 300

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cctgaagata ttaataaaaa tcgcaggttt aatcatttgt ctatatcctt atcttacggt 1080

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ataaatagta gtggttccca gttattagag gaccagtact atgttagatt aaccaatacc 1620

tcacataggc gtaagcgt 1638

<210> 2

<211> 1620

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）QXL87

<400> 2

atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaattta 60

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gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgcaggcgt 1620

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）CK/CH/AH/2011/3

<400> 3

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tatgataatg atacgtacgt ttactactac cagagcgcct tcagaccgtt tgatggttgg 120

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aatggcttgt ggtttaattc actgtcagtc tcattagctt atggccccct tcaaggtggg 1080

tgtaagcaat cagtttttca aggcagagct acttgttgtt atgcgtattc ctataacgga 1140

ccacgtatgt gtaaaggtgt ttatagtggt cagttatcac aagattttga atgtggactg 1200

ttggtttatg ttactaagag tgatggctct cgtatacaaa cagccacaaa accactggtc 1260

ataactcaac acaattataa taatattact ttaaatactt gtgttgagta caatatatat 1320

ggcagagttg gccaaggctt tattactaat gtaactgact ccgcagctag ctataattac 1380

ttagcagatg ctggattggc aattttagat acttcaggtg ccatagacac tttcgttgta 1440

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tttgtagtgt caggcggtaa gttagtaggc attctgactt ctcgtaatga aactggttct 1560

cagcctcttg aaaatcagtt ttatattaag ttaactaaag agacacgtcg ttttagacgt 1620

<210> 4

<211> 1611

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）H120

<400> 4

atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgttttg 60

tatgacagta gttcttacgt gtactactac caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg 120

catttacatg ggggtgcgta tgcggttgtt aatatttcta gtgaatctaa taatgcaggc 180

tcttcatctg ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct 240

atagttatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca 300

tactgtaact tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gttataaaca tgttgggtgt 360

cctataactg gcatgcttca acagcattct atacgtgttt ctgctatgaa aaatggccag 420

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ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt 960

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tctgtcttta gtggtagagc aacctgttgt tatgcttact catatggagg tcctttgctg 1140

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gcaggtttgg ctattttaga tacatctggt tccatagaca tctttgtcgt acaaagtgaa 1440

tatggtctta attattataa ggttaaccct tgcgaagatg tcaaccagca gtttgtagtt 1500

tctggtggta aattagtagg tattcttact tcacgtaatg agactggttc ccagcttctt 1560

gagaatcagt tttacatcaa aatcactaat ggaacacgtc gttttagacg t 1611

<210> 5

<211> 1611

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）Ma5

<400> 5

atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgctttg 60

tatgacagta gttcttacgt gtactactac caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg 120

catttacatg ggggtgcgta tgcggttgtt aatatttcta gtgaatctaa taatgcaggc 180

tcttcatctg ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct 240

atagctatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca 300

tactgtaact tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gttataaaca tggtgggtgt 360

cctataactg gcatgcttca acagcattct atacgtgttt ctgctatgaa aaatggccag 420

cttttctata atttaacagt tagtgtagct aagtacccta cttttaaatc atttcagtgt 480

gttaataatt taacatccgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgcgacc 540

acagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt 600

atgagagaag ttagagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg 660

tgtgatgggt cacctagagg cttgttagca tgccagtata atactggcaa tttttcagat 720

ggcttttatc cttttactaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa 780

aatagtgtta atactacttt tacgttacac aatttcactt ttcataatga gactggcgcc 840

aacccaaatc ctagtggtgt ccagaatatt caaacttacc aaacacaaac agctcagagt 900

ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt 960

atgtatggat cttatcaccc aagttgtaat tttagactag aaactattaa taatggtttg 1020

tggtttaatt cactttcagt ttcaattgct tacggtcctc ttcaaggtgg ttgcaagcaa 1080

tctgtcttta gtggtagagc aacctgttgt tatgcttact catatggagg tcctttgctg 1140

tgtaaaggtg tttattcagg tgagttagat cataattttg aatgtggact gttagtttat 1200

gttactaaga gcggtggctc tcgtatacaa acagccactg aaccgccagt tataactcaa 1260

cacaattata ataatattac tttaaatact tgtgttgatt ataatatata tggcagaact 1320

ggccaaggtt ttattactaa tgtaaccgac tcagctgtta gttataatta tctagcagac 1380

gcaggtttgg ctattttaga tacatctggt tccatagaca tctttgtcgt acaaagtgaa 1440

tatggtctta attattataa ggttaaccct tgcgaagatg tcaaccagca gtttgtagtt 1500

tctggtggta aattagtagg tattcttact tcacgtaatg agactggttc ccagcttctt 1560

gagaatcagt tttacatcaa aatcactaat ggaacacgtc gttttagacg t 1611

<210> 6

<211> 1620

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）LDT3-A

<400> 6

atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaaattg 60

tttgattctg ctaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120

tggcatttgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcta ctaattatac taataatgca 180

ggttctgcaa atgagtgcac tattggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240

gctatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300

gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac attgttatag tagcggtagt 360

tggtcttgtc ctataacagg catgattcca cagggtcata ttcgcatttc tgcaatgaaa 420

aatggctctt tattttataa tttaacagtt agcgtgtcta aataccctaa ttttaaatcg 480

tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttct 540

aacacaacta ctgatgttaa gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaat 600

tataatatta tgaaagaatt taaggttctg gcttattttg tcaatggtac tgtgcgagat 660

gtaattctgt gtgatgacac accgagaggc ttgcttgcat gtcaatataa taatggtaat 720

ttttcagatg ggttttaccc ttttactaat tctagtttag ttaaagaaaa gtttattgtt 780

tatcgtgaga atagtgttaa tactactctt actttaacta actatacttt ttataatgtg 840

actaatgcct cgcctaatcg aggtggtgtt cagtctattc caacttatca aacacaaaca 900

gctcagagtg gttattataa ttttaattta tcatttctga gtagttttgt gtataaagag 960

tctaattaca tgtatgggtc ttaccaccct gcatgtaatt ttagattaga aactattaat 1020

aatggcttgt ggtttaattc attgtcagtt tcgcttgctt atggaccact tcaaggtggg 1080

tgtaagcagt cggtttttag tagtagagcc acttgttgtt atgcttattc atataatggt 1140

cctcgcgcat gtaagggtgt ttacgcaggc gagttactac aaaattttga atgtggactg 1200

ttggtttatg ttactaagag cgatggctct cgtatacaaa cagccaccgt tccaccagtt 1260

gtaactcaac acaattataa taatattact ttaaatactt gtgttgatta taatatatat 1320

ggcagagttg gtcgaggttt tattactaat gtaactgact catcatctag ttataattat 1380

ttagcagatg cagggttggc tattttagat acatcaggtg ccatagacat ctttgttgta 1440

caaggtgaac atggtcttaa ttattacaag gttaatccct gtgaagatgt aaaccagcag 1500

tttgtagttt ctggtggtaa attagtaggt attcttacct cacgtaatgc aacaggttct 1560

cagcctcttg agaatcaatt ctacattaaa ctcactaaag agacacgtcg ttttagacgt 1620

<210> 7

<211> 1617

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus）4/91

<400> 7

atgttgggca aaccgctttt actagtgact ctttggtatg cactatgtag tgctttgctt 60

tatgataaaa atacttacgt ttactactac caaagtgcct ttaggcctgg tcaaggttgg 120

catctacatg ggggtgctta tgcagtagat aaggttttta atggaaccaa caatgcagtc 180

agtgtatctg attgcactgc tggtactttt tatgaaagct ataatatttc tgctgcttct 240

gtagccatga cagtaccacc tgctggtatg tcttggtcag ttgcacagtt ttgtacagct 300

cattgtaact tctcagactt tacagtgttt gttacgcatt gttttaaaag tcaacaaggt 360

agttgtccat tgacaggtat gattcctcag aatcatattc gtatttctgc tatgagatct 420

ggatttttgt tttataattt aacagttagc gtatctaaat accctaaatt taaatcgctt 480

caatgtgttg gcaattctac atctgtctat ttaaatggtg atcttgtttt cacttctaat 540

gaaacaactc acgttacggg tgcaggcgtt tattttaaaa gtggtgggcc tgtaacttat 600

aaagttatga aagaagttaa agccctagcc tactttatta atggtaccgc acaagaggtt 660

attttatgtg ataactcacc tagaggtttg cttgcatgtc agtataacac tggtaatttt 720

tcagatggat tctacccttt tactaattct tctttagtta aggataggtt tattgtatat 780

cgagaaagta gcactaacac tactttagag ttaactaatt tcacttttac taatgtaagt 840

aatgcttctc ctaattcagg tggcgttgat actttccaat tatatcaaac acatactgct 900

caggatggtt attataattt taatttatca tttctgagta gttttgtgta taaaccatct 960

gattttatgt atgggtcata ccacccaaat tgtaatttta gaccagagaa tattaataat 1020

ggcttatggt ttaattcatt atctgtgtca cttacttacg gacccattca aggtggttgt 1080

aagcaatctg tttttagtaa taaagcaact tgttgctatg cttattctta ccgaggtcct 1140

actagatgta agggtgttta tagaggggag ctaacgcaat actttgaatg tggacttcta 1200

gtttatgtaa ctaagagtga tggctctcgt atacaaacta gaagtgaacc actggtgtta 1260

actcaatata attataacaa cattacttta aataagtgtg ttgagtataa tatatatggt 1320

agagttggtc aaggttttat tactaatgta actgaagcaa ctgctaatta tagttatcta 1380

gcagatggtg gtttagctat tttagatact tcaggagcca tagacatatt tgttgttcga 1440

ggtgcatatg gtcttaatta ttataaggtt aatccctgtg aagatgttaa ccaacagttt 1500

gtagtgtctg gtggcaattt aattggcatt cttacatctc ataatgaaac agattctgaa 1560

tttattgaga accagtttta catcaaaccc actaacggaa cacgtcgctc tagacgt 1617

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 8

taatcagagt ggggctcaac ct 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 9

accaggaaca gcactaatct gttg 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 10

tcaaaaggaa ccttcacc 18

Claims (6)

1.一种定量检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括：用于检测TC07-2型鸡传染性支气管炎病毒的探针和引物，其中上游引物TC07-2/F序列为5’-TAATCAGAGTGGGGCTCAACCT-3’(SEQ ID NO.8)；下游引物TC07-2/R序列为5’-ACCAGGAACAGCACTAATCTGTTG-3’(SEQ ID NO.9)；荧光探针TC07-2/Probe序列为5’-TCAAAAGGAACCTTCACC-3’(SEQ ID NO.10)；所述探针5’端标记荧光报告基团为6-FAM，3’端标记荧光淬灭基团为MGB。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×qPCR Probe MasterMix、ddH₂O和阳性标准品。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，阳性标准品是含有TC07-2型IBV基因片段的质粒，所述质粒是用权利要求1中所述的引物以TC07-2型IBV基因组cDNA为模板扩增的片段连接到pEasyT3载体上得到的。

4.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

(1)提取样品的RNA；

(2)标准曲线的建立

将阳性标准品质粒从10⁹拷贝/μL到10¹拷贝/μL系列稀释作为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，用于建立标准曲线；

(3)将步骤(1)中提取的RNA反转录为cDNA；

(4)以步骤(3)中的cDNA为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；

(5)PCR反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量；对数据进行处理和分析。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系为20μL，包括以下组分：0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，0.2μL荧光探针，10μL2×qPCR Probe Master Mix，2μLcDNA模板和7μL ddH₂O。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环。

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