JP2013208121A - A型肝炎ウイルス核酸の捕捉、検出および定量のためのオリゴヌクレオチドの同定 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】A型肝炎ウイルス特異的プライマー、およびA型肝炎ウイルスゲノムの保存領域から誘導されるプローブが、開示される。捕捉オリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブを使用する、核酸ベースのアッセイもまた、開示される。長さ60ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドが開示され、この単離されたオリゴヌクレオチドは、(a)特定の配列からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列;(b)(a)のヌクレオチド配列2体して90%配列同一性を有するヌクレオチド配列;または(c)(a)の相補体および(b)の相補体;を含む。
【選択図】なし
Description
A型肝炎は、発熱、倦怠感、食欲不振、悪心、腹部不快感、および黄疸を引き起こす、腸伝達性疾患である。A型肝炎の病因因子であるA型肝炎ウイルスは、Picornaviridae科のHepatovirus属に分類される、小さく外被のない球状のウイルスである。HAVゲノムは、一本鎖で線状の7.5kb RNA分子からなり、このRNA分子は、ウイルス複製に必要な構造タンパク質および酵素活性を生じるようにプロセシングされるポリタンパク質前駆体をコードする(非特許文献1)。HAVは、細胞培養中でほとんど増殖せず、細胞傷害性ではなく、そして低収量のウイルスを生じる。ビリオンから抽出されたHAV RNAは、細胞培養中で感染性である(非特許文献2および非特許文献3)が、そのウイルスゲノムの直接操作は、そのRNA組成が原因で困難になる。
血液誘導体および血漿誘導体を介するかまたは個人的密接によるこのウイルスの伝達を防ぐために、ウイルス血症サンプル中のA型肝炎ウイルスを検出するための信頼できる診断試験を開発する必要性が、存在する。
本発明は、感染している可能性がある個体由来の生物学的サンプルにおいてHAVを検出するための、感度の良い信頼できる核酸ベースの診断試験を開発することに基づく。本明細書中に記載される技術は、PCR、転写媒介性増幅(TMA)、および5’ヌクレアーゼアッセイ(例えば、TaqManTM技術)を使用して、HAV配列の保存ゲノム領域の増幅用テンプレートとして、抽出したサンプル核酸を利用する。これらの方法は、ウイルス血症サンプルにおけるHAVの検出を可能にする。特定の実施形態において、本発明は、HAVゲノムの5’UTR領域に由来するプライマーおよびプローブを使用する。さらに、これらの方法は、捕捉されたサンプル核酸が同じ容器中で増幅および検出に供され得る、ワンポット(one−pot)分析を可能にする。本発明の方法を使用して、感染したサンプルは、輸液から、および血液誘導体調製物から、同定されて排除され得る。
従って、一実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるHAV感染を検出するための方法に関する。この方法は、
(a)固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程;
(b)上記サンプルから(a)の固体支持体を分離する工程;
(c)標的核酸が存在する場合にその標的核酸を増幅する工程;および
(d)上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含する。
(a)固体支持体を、上記生物学的サンプルと、高カオトロピック塩濃度下で、または上記固体支持体と標的核酸との間で複合体が形成されるハイブリダイズ条件下で、接触させる工程;
(b)上記サンプルから(a)の固体支持体を分離する工程;
(c)HAVのゲノムの5’ UTRに由来するプライマー(例えば、配列番号1を含む配列によって示されるプライマー、および配列番号2を含む配列によって示されるプライマー)を使用して、標的核酸鎖を増幅する工程;
を包含する。特定の実施形態において、この方法は、HAVゲノムの5’ UTRに由来するプローブ(例えば、配列番号3のプローブ)を使用して、上記増幅された標的オリゴヌクレオチドの存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程をさらに包含する。
HAVを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程;
2種のプライマーを使用して、上記核酸を増幅する工程であって、
(a)上記プライマーの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号1からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号2からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
(b)上記プライマーは、(a)のヌクレオチド配列と90%配列同一性を有し、
上記2種のプライマーの各々は、それぞれ、単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;ならびに
上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程、
を包含する。
(a)結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程;および
(b)上記サンプルから上記固体支持体を分離する工程;
を包含する方法によって、上記生物学的サンプルから単離される。
(a)固体支持体を、1種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、この捕捉核酸が上記固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、上記1種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群より選択される配列を含む、工程;
(b)(a)の固体支持体を、生物学的サンプルと、HAV由来の標的核酸鎖が存在する場合にはその標的核酸鎖が上記捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触する工程;および
(c)上記サンプルから(b)の固体支持体を分離する工程;
(d)配列番号1を含むセンスプライマーと配列番号2を含むアンチセンスプライマーとを使用して上記核酸を増幅する工程であって、上記センスプライマーおよび上記アンチセンスプライマーは、それぞれ、上記単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;ならびに
(e)上記増幅された核酸の存在を、上記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含する。
(a)配列番号1、配列番号2、および配列番号3からなる群より選択される配列からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列;
(b)(a)のヌクレオチド配列に対して90%配列同一性を有するヌクレオチド配列;または
(c)(a)の相補体および(b)の相補体;
を含む。
1種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、これらのオリゴヌクレオチドの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、かつこれらのオリゴヌクレオチドの各々は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択される配列の少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸;
少なくとも2種のプライマーであって、これらのプライマーの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号1からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号2からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー;および
HAV感染を同定するための指示書
を備える。
(項目1)
長さ60ヌクレオチド以下の単離されたオリゴヌクレオチドであって、
(a)配列番号1、配列番号2、および配列番号3からなる群より選択される配列からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列;
(b)(a)のヌクレオチド配列に対して90%配列同一性を有するヌクレオチド配列;または
(c)(a)の相補体および(b)の相補体;
を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目2)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、および配列番号3からなる群より選択される配列からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列である、オリゴヌクレオチド。
(項目3)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号1を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目4)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号2を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目5)
項目1に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号3を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目6)
項目5に記載のオリゴヌクレオチドであって、検出可能な標識を5’末端および/または3’末端にさらに含む、オリゴヌクレオチド。
(項目7)
項目6に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記検出可能な標識は、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、および2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)からなる群より選択される蛍光標識である、オリゴヌクレオチド。
(項目8)
A型肝炎ウイルス核酸を増幅するための2種のプライマーの組であって、該プライマーの組は、配列番号1からなるプライマーおよび配列番号2からなるプライマーからなる、組。
(項目9)
生物学的サンプル中のA型肝炎ウイルス(HAV)を検出する方法であって、該方法は、
HAVを含むことが疑われる生物学的サンプルから核酸を単離する工程;
該HAVのゲノムの5’ UTRに由来する少なくとも2種のプライマーを使用して、該単離された核酸を増幅する工程であって、該プライマーの各々は、長さが10ヌクレオチド〜60ヌクレオチドであり、かつ該プライマーの各々は、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;および
該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含する、方法。
(項目10)
項目9に記載の方法であって、
(a)前記プライマーのうちの一方は、配列番号1からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつもう一方のプライマーは、配列番号2からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、または
(b)前記プライマーは、(a)のヌクレオチド配列と90%配列同一性を有し、そして
前記増幅された核酸の存在を、前記サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する、方法。
(項目11)
項目9に記載の方法であって、前記核酸は、
(a)結合している捕捉核酸を含む固体支持体を、標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で生物学的サンプルと接触させる工程;および
(b)該サンプルから該固体支持体を分離する工程;
を包含する方法によって、前記生物学的サンプルから単離される、方法。
(項目12)
項目11に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
(項目13)
項目12に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
(項目14)
項目13に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
(項目15)
項目11に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、1種以上のオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、かつ該オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群より選択される配列からの少なくとも10個連続するヌクレオチドを含む、方法。
(項目16)
項目15に記載の方法であって、前記捕捉核酸は、3’末端または5’末端のいずれかに、長さが約15ヌクレオチド〜25ヌクレオチドのホモポリマー鎖をさらに含み、該ホモポリマー鎖は、ポリA、ポリT、ポリG、ポリCおよびポリUからなる群より選択される、方法。
(項目17)
項目16に記載の方法であって、前記ホモポリマー鎖は、ポリA鎖である、方法。
(項目18)
項目9に記載の方法であって、前記増幅する工程は、PCR、転写媒介性増幅(TMA)またはTaqManを含む、方法。
(項目19)
項目18に記載の方法であって、前記増幅する工程は、TMAを含む、方法。
(項目20)
項目18に記載の方法であって、検出可能な標識を含むプローブオリゴヌクレオチドを、前記増幅された配列を検出するために使用する工程をさらに包含し、ここで、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが約60ヌクレオチド以下であり、かつ該プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号3を含む少なくとも10個連続するヌクレオチドを含む、方法。(項目21)
項目20に記載の方法であって、前記プローブは、検出可能な標識を5’末端および3’末端に含む、方法。
(項目22)
項目21に記載の方法であって、前記検出可能な標識は、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、および2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)からなる群より選択される蛍光標識である、方法。
(項目23)
生物学的サンプルにおけるA型肝炎ウイルス(HAV)感染を検出するための方法であって、該方法は、
(a)固体支持体を、1種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸と、該捕捉核酸が該固体支持体と結合する条件下で接触させる工程であって、該1種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群より選択される配列を含む、工程;
(b)(a)の固体支持体を、該生物学的サンプルと、HAV由来の標的核酸鎖が存在する場合には該標的核酸鎖が該捕捉核酸とハイブリダイズするハイブリダイズ条件下で接触させる工程;および
(c)該サンプルから(b)の固体支持体を分離する工程;
(d)配列番号1を含むセンスプライマーと配列番号2を含むアンチセンスプライマーとを使用して該核酸を増幅する工程であって、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーは、それぞれ、該単離された核酸のセンス鎖の一部およびアンチセンス鎖の一部とハイブリダイズするに十分に相補的である、工程;ならびに
(e)該増幅された核酸の存在を、該サンプル中のHAVの存在または非存在の指標として検出する工程;
を包含する、方法。
(項目24)
項目23に記載の方法であって、前記固体支持体は、ビーズを含む、方法。
(項目25)
項目24に記載の方法であって、前記ビーズは、磁気ビーズである、方法。
(項目26)
項目25に記載の方法であって、前記単離する工程、増幅する工程、および検出する工程は、単一の容器中で実施される、方法。
(項目27)
生物学的サンプルにおけるA型肝炎ウイルス(HAV)感染を検出するためのキットであって、該キットは、
1種以上のオリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸であって、該オリゴヌクレオチドの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、かつ該オリゴヌクレオチドの各々は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択される配列の少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、捕捉核酸;
少なくとも2種のプライマーであって、該プライマーの各々は、長さが約60ヌクレオチド以下であり、一方のプライマーは、配列番号1からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、もう一方のプライマーは、配列番号2からの少なくとも10個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー;および
HAV感染を同定するための指示書
を備える、キット。
(項目28)
項目27に記載のキットであって、ポリメラーゼと緩衝液とをさらに備える、キット。
(項目29)
項目27に記載のキットであって、プローブオリゴヌクレオチドをさらに備え、該プローブオリゴヌクレオチドは、長さが約60ヌクレオチド以下であり、かつ配列番号3を含む少なくとも10個連続するヌクレオチドを含む、キット。
(項目30)
項目29に記載のキットであって、前記プローブは、検出可能な標識を5’末端および3’末端にさらに含む、キット。
(項目31)
項目30に記載のキットであって、前記検出可能な標識は、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、テトラメチルローダミン(TAMRA)、および2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(TET)からなる群より選択される蛍光標識である、キット。
本発明の実施は、他のように示されない限り、当業者の範囲内にある従来の化学、生化学、組換えDNA技術およびウイルス学の方法を使用する。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Fundamental Virology、第2版、第I巻および第II巻(B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,現行版);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press,Inc.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編、1984);A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照のこと。
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明らかにそうでないように示さない限り、複数の言及物を包含することが、留意されなければならない。従って、例えば、「オリゴヌクレオチド(an oligonucleotide)」に対する言及は、2つ以上のオリゴヌクレオチドの混合物を包含するなどである。
アラニン:Ala(A) アルギニン:Arg(R)
アルパラギン:Asn(N) アスパラギン酸:Asp(D)
システイン:Cys(C) グルタミン:Gln(Q)
グルタミン酸:Glu(E) グリシン:Gly(G)
ヒスチジン:His(H) イソロイシン:Ile(I)
ロイシン:Leu(L) リジン:Lys(K)
メチオニン:Met(M) フェニルアラニン:Phe(F)
プロリン:Pro(P) セリン:Ser(S)
スレオニン:Thr(T) トリプトファン:Trp(W)
チロシン:Tyr(Y) バリン:Val(V)。
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、この以下の用語は、下記に示されるように定義されることが意図される。
Cloning(前出);Nucleic Acid Hybridization(前出)を参照のこと。
ヌクレアーゼアッセイ(例えば、TaqManTM技術)において使用される場合、そのプローブは、少なくとも1つの蛍光剤と、少なくとも1つの消光剤とを含み、このプローブは、増幅されたあらゆる標的オリゴヌクレオチド配列を検出するために、その反応において使用されるポリメラーゼの5’エンドヌクレアーゼ活性によって消化される。この状況において、このオリゴヌクレオチドプローブは、その5’末端に近接する十分な数のホスホジエステル結合を有し、その結果、使用される5’→3’ヌクレアーゼ活性は、結合したプローブを効率的に分解してその蛍光剤と消光剤とを分離し得る。オリゴヌクレオチドプローブがこのTMA技術において使用される場合、そのオリゴヌクレオチドプローブは、下記に記載されるように、適切に標識される。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物にもプロセスパラメーターにも限定されず、従って、当然変化し得ることが、理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、この用語は、限定することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
UTR由来の配列を使用して、生物学的サンプルにおけるHAVの迅速かつ感度の高い検出を提供することを発見した。HAVゲノムの配列(5’ UTRを含む)は、複数のHAV単離株において公知である。例えば、NCBI登録番号K02990;AB020564;AB020565;AB020566;AB020567;AB020568;AB020569;AF268396;M16632;M14707;M20273;NC001489;X83302;Cohenら、J.Virol.(1987)61:50〜59を参照のこと。種々のHAV単離株に由来する配列を比較することによって、本発明とともに使用するためのこれらの5’ UTR配列および他の5’ UTR配列は、容易に同定され得る。簡便のために、本発明とともに使用するためのこの種々の核酸分子は、NCBI登録番号K02990に対して番号付けされている。その5’ UTR配列は、NCBI登録番号K02990の1〜723位に存在する。
Polymerase Chain Reaction,Mullisら編、Birkhauser、Boston,MA;Weeksら、Clin.Chem.(1983)29:1474〜1479;Berryら、Clin.Chem.(1988)34:2087〜2090を参照のこと。AE分子は、プローブ内の任意の位置に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学を使用して、プローブに直接結合され得る。例えば、米国特許第5,585,481号および同第5,185,439号を参照のこと。
chain reaction:basic principles and automation、PCR:A Practical Approach、McPhersonら編、IRL Press,Oxford;Saikiら(1986)Nature
324:163;ならびに米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,889,818号を参照のこと。
by Chemiluminescence」Nonisotopic Probing,Blotting and Sequencing、Kricka L.J.編、Academic Press,San Diego,CA;Nelsonら(1994)「Application of the Hybridization Protection Assay(HPA) to PCR」The Polymerase Chain Reaction,Mullisら編、Birkhauser,Boston,MA;Weeksら、Clin.Chem.(1983)29:1474〜1479;Berryら、Clin.Chem.(1988)34:2087〜2090を参照のこと。一つのAE分子が、プローブ内の任意の位置に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチドベースリンカーアーム化学を使用して、プローブに直接結合される。例えば、米国特許第5,585,481号および同第5,185,439号を参照のこと。化学発光は、アルカリ水素ペルオキシドとの反応によって誘発される。アルカリ水素ペルオキシドは、励起したN−メチルアクリドンを生じ、このN−メチルアクリドンは、その後、光子を放出して基底状態へと低下する。
下記に、本発明を実行するための具体的な実施形態の例が存在する。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することは意図されない。
生物学的サンプルからのHAV RNAの抽出)
HAV核酸陽性血清を、BioClinical Partners(Berkeley,CA)から購入した。2つのアプローチを使用して、サンプルから核酸を単離した。具体的には、RNAを、(a)シリカに結合することによって、および(b)標的特異的オリゴヌクレオチドにアニールすることによって、抽出した。
RNAを、Boom,R.ら(1990)「Rapid and simple method for purification of nucleic acids」J.Clin.Microbiol.28;495〜503により記載される方法を使用して、シリカに結合することによって抽出した。高濃度のカオトロピック塩(例えば、グアニジニウムイソチオシアネート)の存在下で、核酸は、シリカに結合する。サイズ分けした小さな核酸は、酸性pH条件下、シリカにより効率的に結合する。結合した核酸を、高温にて、低塩、アルカリpH緩衝剤中で、効率的に溶出する。通常のシリカを帯磁シリカで置換すると、核酸単離の洗浄工程および溶出工程が非常に容易になる。磁気ベースを使用して、核酸が結合したシリカ粒子を捕捉するために使用し、それにより、通常のシリカ粒子を沈降するために必要な遠心分離を排除した。
帯磁シリカを使用すると、洗浄工程および溶出工程の間の迅速かつ容易な取扱いが非常に容易になるが、核酸の単離は、なお労力がかかり、かつ時間がかかる。従って、磁気ビーズを使用して、血漿または血清からの特定の核酸標的の一工程捕捉を、使用した。これを広範な種類のウイルス核酸捕捉試験に適用可能にするために、オリゴdTに結合した包括的磁気ビーズを、使用した。約14bpの長さのオリゴdTを備える血清−Mag磁気オリゴ(dT)ビーズ(Seradyn,Indianapolis,IN)を、3’末端にHAV特異的配列と連続して(下記に特定される配列の末端にて示される)ポリAテールを含む捕捉オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用した。
(TaqManTMによるHAV RNAの検出)
TaqManTM技術を、捕捉した標的RNAを増幅するために使用した。このために、増幅オリゴヌクレオチドは、HAV特異的プライマーからなった。これらのプライマーは、以下の通りであった:
5’非翻訳領域における増幅プライマーおよび検出プローブ:
TGCAGGTCTAGCTz(配列番号19)であり、ここで、x=TETであり、z=リンカー+TAMRAである。
(増幅効率および捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせの試験)
HAVの5’ UTRヌクレオチド配列を、NCBI登録番号K02990の配列に基づいて合成によって構築した。この配列をM13プラスミド中にクローニングして、一本鎖NDAを得、このDNAを精製した。
クローニングして精製した上記のDNAの濃度を、分光光度法によって決定し、1反応当たり10,000〜0.5コピーに対応するDNAの希釈物を、TaqManTMアッセイにおいて増幅し、上記の方法、プライマー、およびプローブを使用して検出した。代表的には、>0.2の閾値にて<45サイクルにて認識したサンプルからのシグナルを、陽性であると見なした。表1が、結果を詳説する。
捕捉/プライマーの組み合わせの効率を、25コピー/反応のssDNAを使用して試験した。配列番号4、5、6、7、8、および9の配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドの組み合わせが、最も効率的であった。
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